KR101943141B1

KR101943141B1 - Ｎａｄｐｈ 옥시다제 4 억제제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101943141B1
Application number: KR1020147015435A
Authority: KR
Inventors: 랄프 브란데스; 카트린 슈뢰더; 패트릭 파쥐; 브누와 라레; 프란세스카 가지니
Original assignee: 겐쿄텍스 스위스 에스아
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2019-01-28
Also published as: JP2014533263A; EP2776027A1; JP6228921B2; CA2855004A1; EP2591782A1; KR20140089591A; RU2014123672A; WO2013068972A1; AU2012335148A1; HK1200029A1; ES2638596T3; US20140323500A1; CN103945844A; IL232515A0; MX2014005440A; EP2776027B1; SG11201401949YA; BR112014011400A2

Abstract

본 발명은 Nox4 억제제, 그들의 약제학적 조성물 및 골다공증 또는 파골세포분화 기능장애, 특히 골다공성 및 전-골다공성 파골세포분화 기능장애의 치료 및/또는 예방을 위한 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

ＮＡＤＰＨ 옥시다제 4 억제제 및 그의 용도{NADPH OXIDASE 4 INHIBITORS AND USE THEREOF}

본 발명은 골다공증(osteoporosis) 및/또는 골다공성 또는 전-골다공성 파골세포분화 기능장애와 같은 파골세포분화 기능장애(osteoclastogenesis dysfunction)의 치료 및/또는 예방용 약제에 관한 것이다.

골(bone, 뼈)은 성인기에서도 조직의 필요에 따라 영구적으로 재구성을 일으키는 동력적 기관이다. 골 형성은 조골세포(osteoblasts)에 의하여 중재되고, 한편 파골세포(osteoclasts)는 골수계통에 의해 유도되며, 뼈를 흡수한다. 생체내와 마찬가지로 배양모델에서도 파골세포분화는 TNF-슈퍼패밀리인 "핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성 인자 (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand; RANKL)" 및 대식세포집락자극인자(macrophage colony stimulating factor; M-CSF)의 분화인자가 필요하다. M-CSF는 골수세포에 대한 RANKL 수용체인 RANK의 발현을 유도하고, 반면 RANK 리간드 결합은 파골세포분화 프로그램 및 타르트레이트-저항성 산 포스파타제 (TRAP) 및 카셉신 K와 같은 파골세포 유전자의 도입을 일으킨다.

성숙된 파골세포일지라도 RANKL에 의해 활성화되며, 그들의 생사를 촉진하고 뼈의 흡수로 유도된 구조적 변화를 일으킨다. 나아가 파골세포분화는 TGFp와 같은 사이토킨에 의해 촉진될 수 있다. TGFP는 반응성 산소종의 형성을 증가시키고, NADPH 옥시다제 Nox4의 발현을 유도하는 것과 같은 산화스트레스에 연관되어있다. (Sturrock et al, 2006, Am. J. Physiol Lung Cell Mol. Physiol, 290:L661-L673).

파골세포분화 기능장애는 뼈의 진행성 손실을 유도하는 조건으로 광범위하게 기재되어 있는바 (Silvestris et al, 2011, Adv. Exp. Med. Biol, 714:113-28; Maruotti et al, 2011, Clin. Exp. Med., 11 (3): 137-45; Wang et al, 2011, Oral Dis., 17(2): 129-42), 특히 미란성 관절파괴, 치근 흡수 또는 원발성 발진 기능상실 및 골다공증의 발전 전제와 같은 파골세포-유도질환이 기재되어 있다. 따라서, 불능의 파골세포분화과정은 이들 질환을 일으키는데 영향을 주는 반면, 증가된 조골세포기능은 단지 임상결과에 영향을 줄 것이지만 유발된 바람직스럽지 못한 부작용은 골 대사를 증가시키며, 그 잠재적 결과로 골 구성에 낮은 친화성을 보인다.

NADPH 옥시다제 (NOX)는 단백질로 생물의 막을 가로질러 전자(electrons)를 전이시키는 역할을 한다. 일반적으로 전자수용체는 산소이고, 전자전이반응의 산물은 슈퍼 산화물 (superoxide)이다. 따라서 NOX 효소의 생물학적 기능은 산소로부터 반응성 산소종 (reactive oxygen species : ROS)의 생성이다. 반응성 산소종 (ROS)는 산소로부터 유도된 작은 분자물로, 산소라디칼 (슈퍼-산화물 음이온 [*0₂], 히드록실 [HO*], 퍼옥실 [ROO*], 알콕실 [RO*] 및 히드로퍼옥실 [HOO*])을 포함하며, 다른 산화제 및/또는 쉽게 과산화수소 (H₂O₂)와 같은 라디칼로 전환되는 비라디칼 화합물도 포함된다.

질소산화물과 같은 질소-함유 산화제는 또한 소위 반응성 질소 종 (reactive nitrogen species : RNS)으로 불리워진다. ROS 생성은 일반적으로 반응의 종속이며, 슈퍼옥사이드 또는 과산화수소의 생산과 함께 시작된다. 또한 슈퍼옥사이드는 또한 자동적으로 특히 낮은 pH에서 과산화수소로 역돌연변이를 일으키며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제로 촉진화된다. ROS 세대화의 종속에서 다른 요소는 슈퍼옥사이드와 산화질소를 반응시켜 퍼옥시니트리트 (peroxynitrite)를 얻으며, 과산화수소로부터 차아 염소산을 퍼옥시다제-촉매로 형성하고 히드록실 라디칼로 유도하는 철-촉매 펜톤 반응을 포함한다.

ROS는 다른 적은 무기분자물과 마찬가지로 DNA, 단백질, 지질, 탄수화물 및 핵산을 포함하는 대다수 분자물과 상호작용을 하려한다. 이런 초기반응은 부수적 2차 라디칼을 생성하기 때문에 잠재적 손해를 증대시킨다. ROS는 세포손상 및 병원균사멸뿐만 아니라 모든 세포와 조직을 운명적으로 역상정규 공정의 대다수에도 영향을 준다. 그러나, 기초적인 생리학적 공정의 규정 중 ROS의 중요도에도 불구하고, ROS 생산은 또한 목적하는 분자물의 기능을 취소할 수 없는 파괴 또는 변경을 가져온다. 결론적으로, ROS는 소위 "산화적 스트레스(oxidative stress)"라고 하는 생물학적 유기체에 손상을 주는 주요 공헌자로 확인되었다.

Nox 단백질의 유일하게 알려진 기능은 반응성 산소종 (ROS)의 생산일지라도, Nox4는 다른 NADPH와는 차이가 있는데, 슈퍼옥사이드 발현 평균수치까지 조절되고, 보다는 히드로겐 퍼옥시다제를 생산하고, 구성적인 활성효소의 급성작용을 보이는 경로의 산호가 없는 점에서 상이하다. (Takac et al, 2011, J. Biol. Chem., 286:13304-13313; Helmcke et al, 2009, Antioxid. Redox. Signal, 11:1279-1287). NADPH 옥시다제 Nox4는 편재하여 분화 세포에서도 발현되며, Nox4의 도입은 심장근육세포, 지방세포 및 평활근세포와 같은 중간엽세포 (mesenchymal cells)에서의 분화공정과 연계되어 있다.

파골세포의 증가된 작용에 의하여, 산화 스트레스 (Oxidative stress)는 세포배양 모델 중 증가된 골 흡수와 골다공증과 파골세포분화에 연루됨을 보여주고 있다. (Lee et al, 2005, Blood, 106:852-859; Sasaki et al, 2009, J. Med. Invest, 56:33-41). 그러나, NADPH 옥시다제는 파골세포 분화동안 상향조절을 보여주고, 모든 Nox 단백질 중, p22phox 화합물의 억제는 파골세포분화를 예방하는 것을 보여줄지라도 (Sasaki et al, 2009, 상기 문헌), 촉매적 활성 Nox 이성체의 각각의 역할은 불명료하고 또는 논쟁의 여지가 있다. Sasaki 등의, 2009, Free Radical Biology & Medicine, 47, 189-199에는 Nox1과 Nox2는 파골세포분화를 제한적으로 억제하고 Nox4 억제는 ROS 생산 및 파골세포 형성을 차단하는데 충분치 못함을 보여주고 있으며, Lee et al., 2005 상기 문헌에는 Nox2 또는 Nox4 보다 Nox1이 골수 단세포-대식세포 가족세포 중에서 RANKL-유발된 ROS 생산에 중요한 역할을 한다고 결론되어 있다.

따라서, 파골세포, 골 흡수 및 파골세포분화에 대한 그들의 작용에 중점을 두고 신규의 골다공증 치료제를 개발하는 것이 크게 열망되어 왔다.

본 발명은 유전성 Nox4 결손은 파골세포 마커 단백질 파골세포관련 수용체 (OSCAR)의 발현저조와 관련이 있으며, 그리고 골중 조골세포 마커 단백질인 오스테오폰틴 (osteopontin)의 발현성장과 관련이 있으며, 결국 Nox4는 파골세포분화의 조절로 골 덩어리를 조절할 수 있다는 예기치 못한 점을 발견하였음에 기초되었다. 특히, 본 발명은 생체내 Nox4의 억제는 골 손실을 예방할 수 있다는 얘기치 못한 상실에 기초되었다. 특히, 본 발명은 NOX4 상승조절의 연속성을 방지할 수 있음에 기초를 둔 것으로, 주로 본 발명에 따른 NOX4 억제제의 사용을 통한 파골세포 분화 기능장애에 따른 경우이다.

본 발명은 골다공증의 치료 및/또는 예방에 유용한 Nox4 억제제에 관한 것으로 특히, 골다공성 또는 전-골다공성 파골세포분화 기능장애에 관한 것이다. 현저히 본 발명은 Nox4 활성의 억제 또는 환원에 유용한 새로운 분자물에 관한 것이다.

본 발명의 첫번째 관념은 파골세포분화 기능장애 및/또는 골다공증의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있는 Nox4 억제제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 두번째 관념은 골다공증의 치료 및/또는 예방을 약제조성물의 제조용 하나 또는 그 이상의 Nox4 억제제의 용도를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 세번째 관념은 신규의 Nox4 억제제뿐만 아니라, 호변이성체, 기하이성체, 광학활성체, 및 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 네번째 관념은 약제용 신규의 Nox4 억제제뿐만 아니라, 호변이성체, 기하이성체, 광학적 활성체, 및 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다섯번째 관념은 본 발명에 따른 Nox4 억제제뿐만 아니라 호변이성체, 기하이성체, 광학활성체 및 그들의 약제학적으로 허용가능한 염 중 적어도 1종과 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 그들의 부형제를 포함하는 약제조성물에 관한 것이다.

본 발명의 여섯번째 관념은 골다공증 치료 및/또는 예방에 유용한 보조 약물 1종 이상과 함께 조합된 Nox4 억제제 1종 이상과, 적어도 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체로 구성된 약제조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일곱번째 관념은 필요한 경우 환자에게, Nox4 억제제 1종 이상의 유효량을 투여하는 것을 포함한 파골세포분화 기능장애 및/또는 골다공증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 여덟번째 관념은 필요한 경우 환자에게, Nox4 억제제 1종 이상 또는 그의 약제학적 제형의 유효량을 투여하는 것을 포함한 환자의 골 중 파골세포분화를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 아홉번째 관념은 파골세포분화 기능장애 및/또는 골다공증의 예방 및/또는 치료용 약제학적 제형을 제조하는 Nox4 억제제의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 열번째 관념은 골다공성 파골세포분화와 전-골다공성 파골세포분화의 예방 및/또는 치료용 약제학적 제형의 제조용 Nox4 억제제의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 열한번째 관념은 파골세포분화의 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특징이나 장점은 다음의 발명의 상세한 설명란에 기재내용으-로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 Nox4 억제제, 그들의 약제학적 조성물 및 골다공증 또는 파골세포 분화 기능장애, 특히 골다공성 및 전-골다공성 파골세포분화 기능장애의 치료 및/또는 예방을 위한 그들의 용도에 관한 것이다.

도 1은 쥐의 골밀도, 파골세포수, 분화 및 ROS 형성에 대한 Nox4의 유전적 녹아웃의 효과를 보여주고 있으며, A: 실시예 2에 측정된 바와 같은 섬유주 골 무기질밀도에 관한 도이고; B: 코사, 1901, Beit. Path. Anat., 29:163 중에 기재된 바와 같이 코사(Kossa) 기술로 염색된 말단 대퇴골의 석회질이 제거되지 않은 (undecalcified) 사진이며; C: 실시예 2에서 측정된 종극적힘(Ultimate force; Fmax)에 관한 도이고; D: 실시예 2에서 측정된 조직형태계측 분석으로 측정된 TRAP 양성 파골세포 수 (osteoclasts; N.Oc)에 관한 도이며; E: 프로토콜 387A-1KT; 시그마-알드리히 (www.sigma-aldrich.com)를 사용한 Mukherjee et al, 2008, J. Clin. Invest. ,118:491-504에 기재된 메이어스 헤마라운(Mayer's hemalaun)으로 대조염색된 TRAP-염색부분의 대표도이고; F: Shen et al, 2005, J. Biol. Chem., 280, 40589-98에 기재된 파골세포 마커 단백질 파골세포-연관 수용체 (OSCAR)에 대한 대퇴골 용해질, 조골세포 마커 오스테오폰틴 및 하중 대조군 GADPH로부터의 웨스턴 블롯 분석도이며; G, H: 실시예 3에 기재된 TRAP 염색에 의해 확인된 바와 같은 골수세포 유래 생체외 분화된 파골세포의 수 (G)와 대표도 (H)이고; I: 실시예 3에서 측정된 전 분화된 비장세포 중 ROS 퍼센티지를 보인 도이다; n≥3; *p<0.05.
도 2는 야생타입 및 Nox4-/- 쥐에서 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된 골 형성 마커 (프로콜라겐 1N-말단 펩타이드, PINP) (A) 혈청 농도를 골 흡수의 마커의 혈청농도 (TRAP 5b) (B) 및 카복시-말단 교차연결 혈청농도 (CTX) (C)와 비교하여 보여주는 도이다.; n≥3; *p<0.05.
도 3은 섬유주 폭 (A)과 섬유주 두께 (B)에 대한 야생타입 및 Nox4-/- 쥐 유래 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정된 말단 대퇴골의 조직형태 계측(histomorphometry)을 보여준다; n≥3; *p<0.05.
도 4는 실시예 4에 기재된 바와 같이 30 분간 (RANKL)로 전처리되거나 RANKL (ctl)처리 없이 M-CSF로 프라임된 골수유래 단일핵 세포 중에서 Fura2 형광색으로 내세포 Ca² ⁺를 측정하여 그중에 Nox4 억제제의 효과와, 신호에서 발생된 Nox4의 역할을 보여주는 도이다. A: 쥐에서 야생타입과 Nox4-/- 유래 세포들의 비교도이고; B: 야생타입 세포 중 칼슘 농도에 대한 Nox4 억제제 (화합물 (1) 또는 용매)의 효과를 보여주는 도이다; n≥3; *p<0.05.
도 5는 실시에 5 중 기재된 바와 같은 골 손실에 대한 Nox4 역할을 보여 주는 도이다. A: 건강한 사람으로부터 및 골다공증 또는 파젯트병 n=3-4이 있는 환자 중 인간 골 재료 중에서 Nox4 염색 강도를 통계적 분석한 도이고; *p<0.05; B,C: 난소 수술 후 6주 경과 말단 대퇴골의 섬유주 골 밀도이다. WT 동물 (라벨 없음), 타목시펜(WT)으로 처리된 WT 동물 및 타목시펜 (N4-Cre*/*)으로 처치된 쥐의 Nox4-Flox-Flox-ERT2-Cre+/0를 비교하였다. n=8-12; *p<0.05 (C); 용매 (ctl) 또는 Nox4 억제제 n=11-14 6 주 동안 처리된 (D) WT 동물의 비교도이다.
통계적 분석: 모든 값은 평균 ± SEM 값이다. 통계적 분석을 ANOVA로 수행하였고, 다음 LSD 포스트 호크 시험을 하였다. p-값이 0.05 미만으로 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다. WT: 야생타입 쥐; N4-/-: Nox4 녹아웃 쥐.
도 6은 Nox4 억제제로 처리된 WT 동물, 샴 수술된 동물, 대조군 (즉, 자궁수술 후 용매 (ctl)) 및 파미드로넷 군과 비교하기 위하여 역할을 보여주고 있는 도로서, 즉, 자궁수술 후 파미드로넷을 10 mg/kg 1 주일에 한번 치료받은 군과 실시예 5에 기재된 바와 같이 생체내 골소실에 대한 Nox4 억제제의 역할을 보여주는 도이다. A, B: 자궁수술 6 주 경과 후 말단 대퇴골의 총 골밀도 (A)와 섬유주 골밀도 (B)를 보여준 도이다.; *p<0.05; C, D: 눈금이 있는 마이크로 CT 기술로 측정된 자궁수술 6 주 후 말단 대퇴골의 총 골밀도 (C)와 섬유주 골밀도 (D)의 회복율을 보여주는 도이다; E: 총 파괴강도 (도 1의 개요와 유사하다).
통계적 분석: 모든 값은 평균 ± SEM 값이다. 통계분석은 ANOVA로 수행 후 LSD 포스트 호크 시험을 하였다. p-값은 0.05 미만으로 통계적 유의가 고려되었다.

[발명의 상세한 설명]

다음 내용은 여러 가지 화학작용기의 정의를 제공하고자 하는 것으로, 본 발명에 따른 화합물을 구성하고, 다른 특별한 폭넓은 정의를 제공하는 표현이 없는 한, 출원명세서와 특허청구범위를 통하여 통일적으로 적용된다.

여기서 사용된 "NOX4 억제제"란 직접 NOX4를 전체적으로 또는 부분적으로 억제, 차단, 약화, 또는 간섭하는 약제를 뜻한다. 용어는 직접적으로 효소의 효소작용, 세포 국소화, 단백질의 안정성, 메신저 RNA 또는 Nox4 단백질의 발현에 영향을 주는 화합물로서 정의된다. 특히, Nox4 억제제는 효소활성을 감소시킬 수 있으며, 재조합 단백질 NOX4와 같은, NOX 이성체인 NOX4 단백질을 단지 발현하는 막을 사용하는 세포유지 분석에서 ROS 생산을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 용어 "억제제"는 제한이 없는 한 NADPH 옥시다제 4의 활성을 완전히 또는 부분적으로 억제하는 분자물을 뜻한다. 특별한 태양에 따르면, Nox4 억제제는 다른 Nox 단백질, 예를 들면 Nox2와 비교시 중요한 Nox 억제작용 성분을 갖는다.

예를 들면, NOX4 억제제에는 골 퇴화의 기원인 파골세포의 분화를 예방 또는 감소시키고, 또한 대골세포인구를 감소시키는 약물들이 포함되는바, 따라서, 파골세포분화 기능장애를 예방, 감소 또는 폐지되는 약물이다. 예를 들면, NOX4 억제제에는 적은 분자화합물, 유사 펩타이드, 키메랄성 단백질, 천연 또는 인조단백질, 핵산유도폴리머(DNA 및 RNA 압타머, siRNAs, shRNAs, PNAs, 또는 LNAs와 같은 물질), NOX4 길항제 작용을 갖는 퓨전 단백질, 항-NOX4 항체를 중화시키는 항체 길항제, 또는 NOX4 길항제 발현을 유도하는 유전자 치료 벡터가 포함된다.

특히, NOX4 길항제는 Gaggini et al., 2011, Bioorganic and Medicinal chemistry, Vol. 19(23), 6989-6999에 기재되어 있는 기능적 ROS 생산 분석으로 5 마이크로몰 미만 억제항수 Ki를 갖는 약제이다. 예를 들면, NOX4 억제제는, 제조합 단백질 NOX4와 같은 NOX 이성체 NOX4 단백질을 단지 발현하는 막을 사용하여 세포유지분석으로 1 내지 2 마이크로몰의 범위로 ROS 생산을 억제하는 약제이다.

"siRNA"는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)을 뜻하며, 표적유전자로부터 표적된 mRNA를 녹다운 시키거나 침묵시킬 수 있는 이중가닥 RNA이다(약 19-23 뉴클레오티드). 조립된 siRNAs는 화학적으로 올리고뉴클레오티드류로 합성되거나 또는 세포타입 중 일과성 또는 안정한 형질주입을 시키기 위하여 짧은 헤어핀 RNAs인 프라스미드 또는 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스) 중에서 클론화시켜 얻을 수 있다 {Martin et al., 2007, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet, 8:81-108; Huang et al., 2008, Expert. Opin. Ther. Targets, 12(5), 637-645).

"효력(efficacy)"은, 본 발명에 따른 치료와 방법에 있어서, 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 응당한 일련의 질환 또는 증상을 변화시키는데 기초되어 측정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 치료 또는 방법의 "효력(efficacy)"은 골 손상의 감소, 및/또는 골 무기질밀도의 증가에 의해 측정될 수 있으며 (이는 단층촬영술 또는 밀도계측분석 또는 이중에너지 x-선 흡광광도 분석으로 측정된다), 콜라겐 단편과 같은 골전환의 혈장표지자에서 변화하고, 및/또는 골다공증 환자 중 골다공성 팩쳐의 위험감소 또는 골다공증으로 발전 위험상태에 있는 환자를 감소하고, 특히 폐경 후 여인 중 파골세포 분화 기능장애, 또는 개별적으로 음식섭취장애, 또는 경구용 크로티코스테로이드류 (즉, 히드로코르티손) 또는 항-에스트로젠제와 같은 약제의 과다사용으로 나타날 수 있다. 다른 관점에서, 본 발명에 따른 치료 도는 방법의 "효력(efficacy)"은 골밀도, 골 무기질 도는 알카리 포스파타제, 타입 I 콜라겐의 C-텔로펩타이드 (CTX) 및 오스테오칼신과 같은 혈액 중 골대사물의 표지자 섹션의 측정으로 측정될 수 있다.

여기서 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은 본 발명에 따른 적어도 1종의 NOX4 억제제 또는 그들의 약제학적 제형으로, 파골세포의 분화 및/또는 파골세포수 또는 파골세포분화를 측정할 수 있는 감소를 유도해낼 수 있는 량(amount)을 의미한다.

여기서 사용된 용어 "파골세포분화 기능장애(osteoclastogenesis dysfunction)"는 고정, 골 용해성 골 전이 및 골종양결과로 생기는 파젯트씨 질환, 골 손실과 같은 2차 요인인 골 전환 또는 골 흡수를 증가시키는 것에 관련된 증상을 의미한다. 또 다른 태양에서, 파골세포분화 기능장애는(류마티스 성) 관절염에서 볼 수 있는 부식성 조인트파괴, 당뇨병성 골전이, 치근 흡수 또는 1차 발생장애, 불활성으로 인한 골 손실과 골 위축증을 갖는 2차 부갑상선 기능항진증을 포함한다. 보통, 환자에서 파골세포분화 기능장애는 타르트레이트-저항 알카리 포스파타제와 같은 파골세포 효소의 혈장측정의 조직 또는 측정을 수행하여 골밀도를 측정하여 결정할 수 있다.

여기서 사용된, 용어 "치료(treatment)" 및 "치료하는(treating)"는 일반적으로 바람직한 약리학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 뜻한다. 효과는 질환, 그들의 증상 또는 상태를 예방 또는 부분적 예방 면에서의 예방하고, 및/또는 질환, 질환에 기인한 사태, 증상 또는 부작용을 부분적 도는 완전한 치유 면에서의 치료하는 것을 뜻한다. 여기서 사용된 용어 "치료(treatment)" 동물, 특히 인체에서 생기는 질환의 치료를 의미하고: (a) 그런 질병을 갖는 것으로 진단된 것이 없는 질환에 걸린 환자 중에서 발생된 질환을 예방하고; (b) 질환을 억제하고, 즉 질환의 발전을 억제하며; 또는 질환을 경감시키고; 즉 질환 및/또는 그의 증상 또는 상태의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다.

여기서 사용된 용어 "환자(subject)"는 동물을 의미한다. 예를 들면 본 발명에서 숙고된 동물에는 인간, 영장류, 소, 양, 돼지, 말과 같은 가축이 포함된다.

용어 "약제학적으로 허용가능한 염 또는 착체(pharmaceutically acceptable salts or complexes)"는 본 발명에서 하기와 같이 특정된 화합물의 염 또는 착체를 의미한다. 이와 같은 염의 예로는, 제한을 없지만, 본 발명의 화합물을 알카리금속(소디움, 포타슘 도는 리튬), 알카리토금속(예를 들면, 칼슘 또는 마그네슘) 중에서 선택된 금속양이온의 히드록시드, 카보네이트, 또는 비카보네이트, 또는 유기 1급, 2급 또는 3급 알킬아민과 같은 무기 또는 유기 염기와 반응시켜 형성된 염기부가염을 포함한다. 이런 염의 다른 예로는 제한은 없지만, 본 발명의 화합물을 염산, 옥살산 등과 같은 유기 또는 무기산으로 반응시켜 얻은 산부가염을 포함한다.

용어 "약제학적으로 활성 유도체(Pharmaceutically active derivative)"는, 여기서 밝힌 바 있는 활성은 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 부형제와 함께 투여할 수 있는 화합물을 의미한다. "간접적(indirectly)"이란 용어는 또한 내분비성 효소 또는 대사를 통하여 약물을 활성형태로 전환될 수 있는 전구체(prodrugs)를 망라한다. 전구체는 본 발명에 따른 화합물로, 화학적 또는 대사적으로 분해할 수 있는 그룹을 갖는 NADPH 옥시다제 4 억제작용을 나타내며, 생리적 조건하 가용매 분해로 생체내에서 약제학적으로 활성인 화합물로 전환될 수 있는 화합물이다. 본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 화합물의 호변이성체(tautomers)를 망라하여 포함한다.

본 발명에 따른 Nox4 억제제( Nox4 inhibitors according to the invention ).

하나의 태양에서, 본 발명은 ROS 생산 기능분석으로 10 nM에서 또는 500 nM이하 범위의 NOX4 억제 효능을 억제상수 (inhibitory constant; Ki)를 보이는 Nox4 억제제를 제공한다.

다른 특이 태양에서, 제공된 NOX4 억제제는 siRNA이다.

다른 특이 태양에서, 제공된 NOX4 억제제는 anti-NOX4 항체이다.

다른 특이 태양에서, 제공된 NOX4 억제제는 하기 그룹화합물 중에서 선택된다:

4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(4-클로로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일) 메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-5-[(2-메톡시피리딘-4-일)메틸]-4-메틸-1H-피라졸로[4,3 -c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-메톡시페닐)-4-메틸-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-5-[(6-메톡시피리딘-3-일)메틸]-4-메틸-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-메틸-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-메톡시페닐)-4-(3-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-메톡시페닐)-4-(3-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-[(2-메톡시피리딘-4-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2,6-디플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-메틸-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-5-메틸-4-[3-(메틸아미노)페닐]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2,5-디플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(1,3-티아졸-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(3,5-디클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2,6-디플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;

2-(2-클로로페닐)-4-(2,5-디플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온; 그리고

2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온.

다른 특이 태양에서, 약제로 사용하는 본 발명에 따른 NOX4 억제제를 제공하는 것이다.

조성( Compositions ) .

본 발명은 조성물로서 약제학적 또는 치료적 약제를 제공하고자 하는 것이며, 골다공증, 특히 파골세포분화 기능장애로 고통받는 환자, 특히 포유동물 환자, 및 가장 바람직하게는 인체를 치료하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 여기 기재된 형체로 하나 또는 그 이상의 Nox 4 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 추가로 백반, 안정화제, 항생제, 완충제, 색소제, 향료, 보조제 등과 같은 1종 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 부가성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은, 통상적으로 응용될 수 있는 보조제, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 약제학적 조성물로 될 수 있고, 여러 형태의 그들의 단일투여형으로 정제 또는 충진된 캡슐로 고형제로 응용될 수 있으며, 동일하게 채워진 액제, 현탁액, 에멀젼, 엘릭서 또는 캡슐과 같은 액상제로 응용될 수 있으며, 모두 경구적으로, 또는 비경구용(피하 포함) 용도의 무균주사액제로 응용될 수 있다. 이와 같은 약제조성물과 그들의 단일 투여 제형은 통상적인 비율의 주성분과 추가적인 활성 화합물 또는 원료를 포함하며, 이와 같은 단일 투여 제형은 응용될 수 있는 일일투여량으로 상응하는 활성유효성분의 적당한 유효량을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 주사용이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 또한 액상 제형일 수 있으며, 제한은 없지만, 수용성 또는 유상 현탁제, 용액, 에멀젼, 시럽제 및 엘릭서가 포함될 수 있다. 경구 투여를 위한 적당한 액상 제형은 완충제, 현탁제, 확산제, 색소, 향료 등을 갖는 적당한 수용성 또는 비수용성 비히클을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 물과 함께, 또는 사용전 적당한 비히클로 재조합용 건조제품으로 제형화 될 수 있다. 이와 같은 액상제제에는 부가제를 포함하며, 제한은 없지만, 현탁화제, 유화제, 비수용성 비히클 및 보존제를 포함할 수 있다. 현탁화제로는, 제한은 없지만, 솔비톨 시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코스/서당 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용지방을 포함한다. 유화제로는, 제한은 없지만, 레시틴, 솔비탄 모노올레에이트, 및 아카시아를 포함한다. 비수용성 비히클로는, 제한은 없지만 식용유, 아몬드유, 분류된 코코넛유, 유성 에스텔류, 프로필렌 글리콜, 및 에틸 알콜을 포함한다. 보존제에는 제한은 없지만, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 솔빈산이 포함된다. 추가적인 재료와 마찬가지로 진행 공정 등은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st 판, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 제5부에 소개되어 있어 여기서는 참고적으로 구체화할 수 있다. 본 발명의 상기 조성물은 통상적인 방법을 제형화된 정제 또는 로젠즈 제형일 수 있다. 예를 들면, 경구투여용 정제 및 캅셀제는 관용적인 부형제를 포함할 수 있으며, 제한은 없지만, 결합제, 충진제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 포함할 수 있다. 결합제로는 제한은 없지만, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트, 전분풀 및 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 충진제로는 제한은 없지만, 유당, 서당, 미결정 셀룰로오스, 옥수수전분, 칼슘 포스페이트, 및 솔비톨이 포함된다. 윤활제로는, 제한은 없지만, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카가 포함된다. 붕해제로는 제한은 없지만, 감자전분 및 소디움 전분 글리콜레이트를 포함한다. 습윤제로는 제한은 없지만, 소디움 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 이 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.

주사제 조성물은 통상 이 분야에서 알려진 주사용 무균생리식염수 또는 인산염 완충 생리식염수 또는 다른 주사용 담체에 기초되어 질 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 비경구 투여 제형으로 제형화 할 수 있는데, 제한은 없지만, 주사, 연속주사를 포함한다. 주사제 제형으로는 현탁제, 액제, 또는 유상 또는 수성 비히클 중 에멀젼 제형을 제형화 할 수 있으며, 제형화제에는 제한은 없지만, 현탁, 안정 및 분산제가 포함될 수 있다. 조성물은 또는 적당한 비히클과 재조합한 분말형태를 제공할 수 있으며, 제한은 없지만, 여기서는 무균, 파이로젠이 없는 물이 포함된다.

본 발명의 조성물은 또한 저장제제(depot preparation)로 제형화 될 수 있으며, 이식주사 근주주사로 투여될 수 있다. 이 조성물은 적당한 중합체 또는 친수성 재료(예를 들면, 허용가능한 유상 에멀젼), 이온교환수지, 또는 녹는 유도체(예를 들면, 녹는 염)으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 지속방출형 제제나 지속방출 약물전달시스템 제형으로 투여될 수 있다. 지속방출재료에 대한 기재는 또한 Remington's Pharmaceutical Sciences 중에 기재된 혼합재료들을 참고할 수 있다.

투여방식( Mode of administration ) .

본 발명의 조성물은 여러 방법으로 투여될 수 있으며, 제한은 없지만, 경구, 비경구, 설하, 구강투여, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 비경구 투여에는 제한은 없지만, 정맥, 동맥내, 복강내, 피하, 근육, 경막내(intra-thecal) 및 관절내(intra-articular) 투여를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 이식형으로 투여될 수 있으며, 조성물의 서방출과 마찬가지로 서서히 방출조절된 정맥주입이 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 특별한 태양에 있어서, 1종 또는 그 이상의 Nox4 억제제가 경구적으로 투여될 수 있다.

투여용량은 단일 또는 다용량으로 다양한 요인에 따라 의존적으로 개인에게 투여될 수 있으며, 약물동력학적 성질, 환자조건 및 특징(성, 연령, 체중, 건강, 규격 등) 증상의 정도, 치료빈도 및 바라는 효과에 따라 투여될 수 있다.

조합( Combination ) .

본 발명의 하나의 태양에 따르면, Nox4 억제제와 그들의 약제학적 제형은 골다공증 또는 파골세포분화 기능장애의 예방 및/또는 치료시 단독 또는 비포스페이트, 에스트로젠, 또는 비타민 D와 같은 유용한 보조제와 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명은 Nox4 억제제 또는 그들의 약제학적 제형의 투여를 포함하며, 여기서 Nox4 억제제 또는 그들의 약제학적 제형은 골다공증(예를 들면, 다종약물요법), 치료시 유용한 보조제 또는 다른 치료요법제를 치료유효량으로 동시에 또는 연속적으로 개인에게 앞서서 투여될 수 있다. Nox4 억제제 또는 그들의 약제 제형은 동시에 보조제와 함께 투여될 수 있으며, 동일 또는 상이한 조성물로, 동일 또는 상이한 투여량으로 투여될 수 있다.

환자( Patients ) .

하나의 태양에서, 본 발명에 따른 환자는 골다공증으로 고통받는 환자들이다. 특별한 태양에서, 본 발명에 따른 환자는 파골세포분화 기능장애로부터 고통받는 환자들이다.

또 다른 특별한 태양에서, 본 발명에 따른 환자는 증가된 파골세포형성 또는 증가된 세포활성의 결과 파골세포 과잉효능으로부터 생기는 골 손실로 고통받는 화자들이다.

또 다른 특별한 태양에서, 본 발명에 따른 환자는 부동화, 골 용해성 골 전이 및 골종양으로 생기는 골 손실, 파젯트씨병 중에서 선택된 2차 원인의 골 흡수로 고통받는 환자들이다.

또 다른 특별한 태양에서, 본 발명에 따른 환자는 류마티스성 관절염에서 발견되는 미란성 관절염 파괴, 당뇨병성 골 관절병증, 골 전이, 치근 흡수 또는 1차 발진부전, 2차 골 손실에 의한 부갑상선 기능항진과 불활성으로 인한 골 위축을 포함한 파골세포분화 기능장애로 고통받는 환자들이다. 또 다른 특히 태양에서, 본 발명의 환자는 발전하는 골다공증의 위험이 있는 환자들이다.

발명에 따른 용도( Use according to the invention ) .

다른 태양에서, 본 발명은 골다공증의 치료 또는 예방용 약제조성물 제조용 Nox4 억제제와 마찬가지로 상호변이체, 기하이성체, 광학활성체 및 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

특이 태양에서, 본 발명은 파골세포분화 기능장애의 치료 또는 예방용 약제조성물 제조용 Nox4 억제제를 제공하는 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 골다공증의 치료 또는 예방용 Nox4 억제제를 제공하는 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은 파골세포분화 기능장애의 치료 또는 예방용 Nox4 억제제를 제공하는 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은 골다공증으로 고통받고 있는 환자의 치료방법, 그 치료방법은 투여를 필요로 하는 환자에게 Nox4 억제제 또는 그들의 약제학적 제제의 유효량은 투여하는 것을 포함하는 치료방법이다.

다른 태양에서, 본 발명은 파골세포분화 기능장애로 고통받고 있는 환자의 치료방법, 그 치료방법은 투여를 필요로 하는 환자에게 Nox4 억제제 및 그들의 약제학적 제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한 치료방법이다.

다른 태양에서, 본 발명은 필요시 파골세포분화 기능장애를 억제하는 방법을 제공하는 것이며, 여기서, 억제방법은 필요시 Nox4 억제제 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 다음 단계로 구성된 파골세포분화 억제제를 확인하는 방법을 제공한다:

(i) 검색물질을 Nox4용 암호화 또는 발현시스템에 접촉하고;

(ii) 상기 시스템으로 Nox4 활성 또는 Nox4 발현능력을 분석하며;

(iii) 단계 (ii)에서의 Nox4 활성 또는 Nox4 발현능력을 물질 부재하 시스템의 Nox4 활성 또는 Nox4 발현능력과 비교한 다음;

(iv) 단계 (iii)에서 Nox4 활성 또는 Nox4 발현능력을 감소시키는 것이 관찰된 물질을 선택한다.

특이 태양에서, 파골세포분화 기능장애 및/또는 골다공증의 예방 및/또는 치료용 파골세포분화 억제제를 확인하는 방법을 제공한다.

또 다른 특이 태양에서, 본 발명에 따른 파골세포분화 억제제를 확인하는 방법은 효소분석, 면역분석, 웨스턴 블로팅 분석, ROS 형성분석과 같은 분석법을 사용한다.

또 다른 특이 태양에서, 본 발명에 따른 파골세포분화 억제제를 확인하는 방법은 NFATlc 또는 AP-1과 같은 Nox4에 의해 조절된 유전자의 발현 또는 능력을 분석하여 Nox4 발현능력을 분석하는 것과 같은 방법이다.

또 다른 태양에서 본 발명에 따른 파골세포분화 억제제를 확인하는 방법은 노던 블로팅, 미세분석(microarray) 또는 RT-PCR에 의해 분석된 Nox4 발현 능력에 따른 방법이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 1종의 Nox4 억제제와 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 그들의 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.

특별한 태양으로, 본 발명의 화합물, 약제학적 제형 및 방법은 파골세포분화 기능장애 및/또는 골다공증 환자의 예방 및/또는 치료시 용도로 숙고되었다.

특별한 태양에서, 본 발명은 발명에 따른 Nox4 억제제 또는 그들의 용도 및 방법을 제공하고자 하는 것이며, 여기서 Nox4 억제제는 골다공증 또는 파골세포분화 기능장애 치료시 유용한 보조제와 조합물로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 프로그램 ACD/Name (제품버전 10.01) 중에서 사용된 IUPAC standards 따른 명명으로 이루어졌다.

여기서 인용된 참고문헌은 전적으로 참고용일 뿐이다. 본 발명은 여기 제시된 특이 태양에 의해 보호범위가 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 개별관점의 단지 예시일 뿐이며, 기능적으로 균등한 방법이나 성분은 본 발명의 보호범위 내에 있다. 실제, 본 발명의 여기서 기재되고 보여준 것의 여러 변형과 부가는 이 분야의 숙련자에게 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 명백해질 것이다. 이와 같은 변형들은 부가된 청구항의 보호 범위내 속하게 될 것이다.

본 발명을 기재하였으며, 다음 실시예들은 예시를 나타낼 뿐, 제한이 있는 것은 아니다.

실시예( EXAMPLES )

골다공증 치료시 Nox4 억제 효력은 다음 실험에 따라 지지될 수 있다.

다음의 약어들이 개별적으로 다음 정의를 뜻한다.:

eq. (당량, equivalent), nm (나노미터, nanometer), BMNC (골수단핵세포, bone marrow mononuclear cells), BSA (소혈청알부민, Bovine serum albumin), DCF (2,7-디클로로디히드로플루오레센, 2,7-dichlorodihydrofluorescein), DCM (디클로로메탄, dichloromethane), DMEM (둘베코 보정 이글 배지, Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMSO (디메틸 설폭시드, Dimethyl Sulfoxide), DAPI (4,6-디아미디노-2-페닐인돌, 4,6-Diamidino-2-phenylindole), DPI (디페닐-요도니움, Diphenyl-iodonium), EA (에틸 아세테이트, Ethyl Acetate), EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산, ethylenediamine tetraacetic acid), EGF (표피성장인자, Epidermal Growth Factor), EGTA (에틸렌 글리콜 테트라아세트산, ethylene glycol tetraacetic acid), FCS (태반 송아지혈청, Foetal Calf Serum), GADPH (글리셀알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), HBSS (한스 완충염 용액, Hank's Buffered Salt Solution), HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), H2DCF-DA (2',7'-디클로로디히드로 플루오레신 디아세테이트, 2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate), M-CSF (대식세포 집락 자극인자, macrophage colony stimulating factor), MEM (최소 필수 배지, minimal essential medium), NADPH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 디포스페이트 환원형, Nicotinamide adenine dinucelotide diphosphate reduced form), NBT (니트로블루 테트라졸리움, Nitroblue tetrazolium), PE (석유 에텔, petroleum ether), TLC (박층 크로마토그래피, Thin Layer Chromatography), TGF-β (종양 성장인자-베타, Tumor Growth Factor beta), ROS (반응성 산소종, Reactive oxygen species), SOD (슈퍼옥사이드 디스뮤타제, Superoxide dismutase), SYBR (Sybr Green™ Ν',Ν'-디메틸-N-[4-[(E)-(3-메틸-1,3-벤조티아졸-2-일리덴)메틸]-1-페닐퀴놀린-1-이움-2-일]-N-프로필프로판-1,3-디아민, Sybr Green™ Ν',Ν'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine).

실시예 1: 상이한 세포배양액 중 반응성 산소종의 수치 측정 .

본 발명에 따른 Nox4 억제제의 Nox4 효능을 무세포 분석으로 산소로부터 반응성 산소종 (reactive oxygen species; ROS) 형성을 억제하거나 또는 감소하는 그들의 효능을 실험하였다. Nox4 억제제를 충분히 특징되도록, Nox 서브유닛-특이 무세포, 세포막-기초된 시스템을 발전시키고, 특정 재조합 단백질을 그들의 특정 이성체를 이종구조적으로 과-표현하는 막에 첨가하였다. Nox 효소는 첫째 산물로 슈퍼옥사이드 (0₂ ^.-)를 생산하며, 그러나 자연적으로 과산화수소(H₂0₂)로 디스뮤트하는 (dismutate) 분자물의 높은 불안정과 반응성 때문에, 따라서 H₂0₂를 측정하는 소식자(probes)를 포함한 판독기술이 사용되었다 (예를 들면, 일관성이 있고 정확한 측정을 용이하게 하기 위하여 소식자로서 앰플렉스 레드 (Amplex Red)를 사용한다). 화합물의 활성은 하기 기재된 기술을 사용하여 다음의 무세포 분석법으로 실험했다.

재료(Materials).

NADPH (A1395.0100) 액손랩사제이다. 앰플렉스 레드 (Amplex red) (A22177)은 인비트로젠사로부터 구매하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) (10108090001)는 로슈사로부터 구매하였다.

플라스미드 구조(Plasmid Construction).

인간 Noxl (NM_007052.4), 인간 NOX2 (NM_000397), 및 인간 NOX5 (NM_0245052244) cDNAs를 pcDNA5/TO (인비트로겐사)에 클론시켰다. 인간 p22 (NM_000101.2)를 pcDNA3.1/Zeo (+) (인비트로겐사)에 클론시키고, 인간 NOXA1 (AY255769.1)과 인간 NOXO1 (AB097667)를 비-시스트론닉 pVITRO1-neo-mcs 플라스미드 (인비보젠사)에 클론시켰다.

세포 배양(Cell Culture).

형질주입된 T-REx™-CHO 세포 (R718-07)를 인비트로젠사에서 구입하였고, hNOX4 (hNOX4 T-REx™-293)(Serrander et al, 2007, Biochem. J., 406, 105-114)으로 발현하는 T-REx™-293 세포선을 DMEM 및 햄 F12 배지 중에서 각각 배양시켰다. 두 배지에 10 % FBS, 2 mM 글루타민, 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml)를 보충시켰다. 선택압력을 블라스티시딘 (5 μg/ml), 및/또는 G418 (0.25 mg/ml), 및/또는 히그로마이신 (0.25 mg/ml) 및/또는 제오신 (0.025 mg/ml)을 계속 포함시키며 유지시켰다.

안정한 형질주입 세포선 세대(Stable Transfected Cell Line Generation).

세포를 FuGENE 6 방법을 사용하여 형질주입시켰다. 인간 Nox1 (hNOX1 T-REx™-CHO)을 기능적으로 안정하게 발현하는 세포가, T-REx™-CHO 세포를 인간 Nox1, 인간 p22, 인간 NOXA1 및 인간 NOXO1으로 보조-형질주입시켜 얻어졌다. 기능적 인간 Nox2 (hNOX2 T-REx™-CHO)를 안정하게 발현하는 세포가 T-REx™-CHO 세포를 인간 nox2, 인간 p22 및 인간 보조요인으로 보조-형질주입시켜 얻어졌다. 기능적 인간 Nox5 (hNOX5 T-REx™-CHO)를 안정하게 발현하는 세포가 T-REx™-CHO 세포를 인간 Nox5로 형질주입시켜 얻어졌다. 보조-형질주입된 세포가 10 일 동안 적당한 항생제를 사용하여 선택되었다. 선택을 위하여 히그로마이신(hygromycin)과 G418이 2 mg/ml 및 제오신 0.1 mg/ml 용량이 사용되었다. 각각 안정한 형질주입된 세포선을 얻기 위하여, 항생제-저항성 세포의 층을 세대화 시켰다. 세포들은 희석을 제한시켜 클론화 시켰다. 몇몇 클론은 얻어졌고 세포 AR 분석법을 이용하는 테트라싸이클린-유도 hNox 발현에 따라 ROS 생산을 위해 연구되었다. NOXes의 발현은 분석전 24 시간동안 테트라싸이클린 (1 μg/ml)으로 이루어졌다

막 제조(Membrane Preparation).

인간 Nox1, Nox2, Nox4, 및 Nox5 발현이 막 제조 24 시간 전 테트라싸이클린 (1 μg/ml)로 유발되었다. Nox1, Nox2, Nox4 또는 Nox5를 과발현하는 형질주입된 세포유래 막이 Palicz 등, 2001, J. Biol. Chem., 76, 3090-3097에 앞에 기재된 바와 같이 제조되었다. 초음파 분해 완충제 (11 % sucrose, 120 mM NaCl, 1 mM EGTA in PBS, pH 7.4에 Nox4- 또는 NOX5-발현세포) 또는 완화 완충제 (10 mM Pipes, 3 mM NaCl, 3.5 mM MgCl₂, 0.1 M KCl, pH 7.4) 중에서 재현탁시킨 다음, 세포를 초음파 분해와 원심분리 (200 g, 10 분)로 절단시켰다. 상등액은 17/40 % (w/v) 불연속 슈크로스 경사도 층에 모이고 원심분리한다 (150,000 X g, 60 분). 막 분획물을 17/40 % 경계면에서 모으고 -80 ℃로 저장하였다. 단백질 농도를 블래드포드 시약(Bradford reagent)으로 측정하였다.

ROS 생산측정(ROS production measurement).

인간 Nox1, 또는 인간 Nox2 또는 인간 Nox4 또는 인간 Nox5 중 하나 또는 잔틴/잔틴 옥시다제를 발현하는 막으로 반응성 산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS)이 제조자의 소개 매뉴얼 (인비트로젠사)의 간단한 발현방법인 앰플렉스 레드 (Amplex Red; AR) 방법을 이용하여 측정되었다. 간단히, 막 또는 잔틴이 앰플렉스 레드, 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (Horse Radish Peroxidase; HRP) 및 적당한 보조요소를 포함하는 PBS 중에서 인큐베이션 시켰다. ROS 생산은 Nox 발현 막에 NADPH를 첨가함으로써, 또는 잔틴 옥시다제에 잔틴을 가함으로써 유도된다. 비특이신호(Non-specific signal)를 잔틴 부재하 또는 막 부재하 측정하였다.

화합물의 길항효과를 1 nM에서 100 μM까지의 범위에서 농도를 증가시키면서 측정하였다. 평판 교반기와 인큐베이터 (Titramax 1000, VWR)에서 37 ℃에서 약하게 저어주며(300 rpm) 20 분간 배양한 후, ROS 값을 자극과 방사 파장 544 nm와 590 nm 각각을 갖는 BMG 플루오스타 마이크로플레이트 해독기로 10 분간 측정하였다.

실험데이터를 프리즘 (그래프패드 소프트웨어 인크, 샌디에고, CA)을 사용하여 분석하였다. Ki 값을 Cheng-Prusoff 평등기를 사용하여 측정하였다. 적어도 3회 실험하여 얻어진 3개 개별값의 평균으로 나타내었다 (표 1). Nox4 억제를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 심바스타틴 (엔조 라이프 사이언스, CAS Number 79902-63-9)에 대한 값과 비교하였다. 인간 Nox4를 발현하는 막으로 반응성 산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS) 생산을 앰플렉스 레드 (Amplex Red; AR)을 사용하여 측정하였다.

표 1

Ki 값은 심바스타틴(Simvastatin)은 본 발명에 따른 직접적인 NOX4 억제제는 아니며, 스타틴류(statins)는 이미 일찌기 기재된 문헌 (Williams et ah, 2007, J. Cardiovasc. Pharmacol, 50(1), 9-16)에서와 같이 NADPH 억제제로서 사용될 수 없음이 밝혀졌다. 스타틴류는 Rac 활성억제를 통하여 ROS 생산을 방지하여 항산화제 작용을 갖는 것으로 알려졌지만 NOX4 작용은 완전히 유전자 (Rac) 작용에 의존적임을 알게 되었다.

실시예 2: 쥐 실험에서 골의 파골세포 함량의 증가에 따른 골 밀도에 대한 Nox4의 부정적 효과

골 항상성에 대한 NADPH 옥시다제의 역할을 측정하기 위하여, 하기 기재된 바와 같이 주변 정량 컴퓨터 단층촬영법으로 측정된 섬유주 골밀도를, 녹아웃 쥐에서 WT 리터 메이트들과 비교하였으며, Nox4-/-는 말단 대퇴골의 30 % 더 높은 섬유주 골밀도를 나타내었고 (도 1A와 B 참조), 반면 이 효과는 Nox2y/- (Nox2y/+: 345.3 ± 12.5; Nox2y/- 329.0 ± 18.9 mg/m³) 또는 Nox1y/- (Nox1y/+: 262.2 ± 19.7; Nox1: 268.7 ± 11.0 mg/m³) 쥐에서는 관찰되지 않았으며, 처음으로 단지 Nox4만이 지지되었지만 다른 Nox 동족체는 골다공증에 연관은 없었다. Nox4-/- 쥐의 더 높은 골밀도가 WT 쥐와 비교시 폭과 두께가 더 큰 섬유주로 또한 검증되었고, 반면, 섬유주 수 (4.3 ± 0.4 대 4.4 ± 0.3 No/mm²; WT 대 Nox4-/-) 및 분리 (217 ± 23 대 207 ± 14 mm; WT 대 Nox4-/-)는 WT와 Nox4-/- 쥐 사이에서 유사하였다. 기능적 결과로서 Nox4-/- 쥐의 골 안정성 (하기 기재된 바와 같은 3개 결합점 실험(three point binding tests)에서 측정된바 같은)은 WT 쥐 안정성보다 현저히 더 높았다 (도 1C 참조).

WT 리터 메이트와 비교할 때 Nox4-/-의 골 밀도가 더 높다는 것은 Nox4가 골 흡수를 촉진하거나 골 형성을 억제한다는 것을 암시하는 것이다. 아래 기재된 바와 같은 칼세인 라벨링으로 평가된 바와 같이, 골 형성 비율은 WT와 Nox4-/- 쥐 사이에서 유사했으며, 또한 무기질 동일 비율과 이중 라벨표면은 WT와 Nox4-/- 쥐 사이에서 차이가 없었다. 항상, 조골세포 활성의 표식자 (하래 기재된 바와 같은 ELISA 분석법으로 측정된)인, 푸로콜라겐 1N-말단펩타이드의 혈장수치는 WT와 Nox4-/- 쥐에서 유사하였다 (도 2A 참조). 이 실험자료는 Nox4-/- 쥐의 증가된 골 밀도와 파골세포의 효과를 위해서 기초적인 기전으로 조골세포의 Nox4-의존성 억제를 제외한다.

실제, TRAP 5b와 카복시-말단 콜라겐 교차연결 (CTX)와 같은 골 흡수의 표식자는 WT 쥐와 비교시 Nox4-/-의 혈장에서 현저히 더 낮게 나타났으며 (도 2B와 C 참조), 이는 WT 동물에서 더 높은 파골세포 효능이나 풍부함을 보인다는 점이다. 실제, 골에서 아래 기재된 바와 같이 TRAP 양성세포에 대한 면역조직학적 분석은 Nox4-/- 쥐는 WT 동물과 비교시 파골세포 (N. Oc)의 수를 약 50 % 감소시켰음을 나타내었다 (도 1D/E). 따라서, 골 단백질의 비교로 파골세포의 표식자 단백질인 파골세포-관련 수용체(osteoclast-associated receptor; OSCAR)의 더 낮은 발현이 드러났고 WT 동물과 비교시 Nox4-/-의 골 중에서 조골세포 단백질인 오스테오폰틴(osteopontin)의 더 높은 발현이 드러났다 (도 1F).

이와 같은 관찰은 Nox4의 유전적 삭제가 파골세포의 감소된 현상 또는 증가된 세포자멸사(apoptosis) 결과임을 암시하는 것이다.

쥐와 동물의 절차 (Mice and animal procedures).

Nox4-눌 쥐를 장 등 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 107:18121-18126에 기재된 바와 같이 Nox4 유전자 (제노웨이)의 엑손 1과 2 및 번역개시 부위의 표적삭제로 세대화 시켰다. 간략하게 말하면, 5' 뮤린 Nox4 게놈성 DNA 단편을 129sv DNA BAC 도서관에서 분리되었고, 이는 록스P 부위로 측면에 위치한 엑손 1과 2를 포함한 표적구조물을 세대화 하는데 사용되었으며, Flippase Recognition Target 부위에 의해 음성선택 디프테리아 톡신 A 카세트와 양성 선택 네오마이신 카세트가 측면에 위치한다. 목적하는 구조물을 129sv 태아 줄기세포로 전기영동 시켰고, 재조합 클론을 PCR과 서던 블롯 분석법으로 확인하였으며, C57BL/6 배반포에 주입했다. 생식계열 키메라에서 얻은 이형집합성 쥐를 C57BL/6 Cre-deletor 쥐와 자라게하고 Flp-deletor 쥐가 이형집합성 녹아웃 쥐로 세대화 시켰다. Nox4-눌 동물을 이중교배 자손으로 얻었으며, C57BL/6 쥐로 10 세대이상 역교배 시켰다.

골 조성물을 6 주 후 연구하였다, 골 형성은 칼세인 방법으로 측정되었고, 동물은 피하로 칼세인 (20 mg/kg 체중)을 주사하였으며, 2 일째 주사였고 쥐를 죽이기 1 일전 주사하였다.

생화학(Biochemistry)

프로콜라겐 1N-말단 단백질 펩타이드 PINP (DRG 시약), TRAP-5b (DRG 시약) 및 CTX (USCNK, 라이프 사이어스 인크)의 혈청농도를 제조자의 지시에 따라 마우스-특이 효소 연결된 면역흡착제 분석법(ELISA)으로 평가하였다.

골 무기질밀도 측정(Bone mineral density (BMD) measurements)

좌측 대퇴골의 BMD를, QCT 기기 XCT 보고서 (스트라텍 메드진테크닉, 포자임, 독일)를 사용하여 주변정량 컴퓨터 단층촬영법 (peripheral quantitative computed tomography; QCT)로 측정하였다. 대퇴골의 중앙골단 1 조각 (0.2 mm 두께)와 무릎 관절의 관절 표면에 1.5, 2, 및 2.5 mm 인접해 있는 원위 대퇴골 골간단에서 3 조각을 측정하였다. BMD 값은 원위 대퇴골 간단의 3 조각의 평균치를 계산한 것이다. 0.070 mm 복셀 크기(voxel size)와 710 mg/cm³ 역치(threshold)가 호프바이어 등, 2009, Arthritis Rheum., 60(5):1427-1437에 기재된 바와 같이 BMD를 계산하는데 사용하였다.

골 조직(Bone histology)과 조직측정(histomorphometry)

원위 대퇴골 골간단 중 골 견본과 해면상의 골 조직의 진행이 원위 대퇴골 간단의 칼슘화된 골 부위에 대하여 수행되었고, Reim 등, 2008, J. Bone Miner. Res., 23 (5): 694-704에 기재된 바와 같은 영상분석용 OsteoMeasure 3.0 (Osteometries, Atlanta, GA) 및 Axio Vision 4.6 (Carl Zeiss, Oberkochen, 독일) 소프트웨어를 사용하여 그 양을 측정하였다.

골 생물역학의 분석(Analysis of bone biomechanics)

대퇴골을 1 kN 포스 디텍터, 및 포스 용액 0.01 N를 갖는 Zwick Z020/TN2A 재료실험기기 (Zwick, Ulm, 독일)를 사용하여 3-점검정법으로 기능상실에 부하시켰다. 검정법으로 낮은 지지점 사이의 거리는 5 mm이었다. 실험동안 교차 속도는 모든 측정치에서 0.2 mm/분이었다. 변위력 데이터(force-displacement data)에서, 최후 힘(ultimate force; Fmax; in N)을 Binder 등, 2009, Nature Medicine, 15: 417-424에 기재된 바와 같이 계산하였다.

실시예 3: Nox4 -의존적 방법에서 파골세포 분화동안 ROS 형성

파골세포 형성에 대한 Nox4 역할을 연구하기 위하여, Nox4 발현을, 하기에 기재된 바와 같은 쥐 생체외 분화분석법으로 분화과정에 대한 Nox4의 유전적 녹아웃 효과와 함께 분화과정을 측정하였다. 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMC)가 파골세포로 분화될 때, Nox1과 Nox4의 발현에 대한 시간의존성 증가가 연구계획 21에 걸쳐 관찰되었다 (도 3 참조).

생체외 파골세포 분화는 하기 기재된 바와 같이 골수단핵세포 (BMNC)를 M-CSF와 RANKL로 자극하여 실행되었으며, 분화된 파골세포를 프로토콜 387A-1KT; 시그마 알드리히 (www.sigma-aldrich.com)를 사용하여 Mukherjee 등, 2008, J. Clin. Invest., 118:491-504에 기재된 바와 같이 TRAP 염색시켜 확인하였다. 이런 접근으로 WT 그룹과 비교시 Nox4-/- 세포 중에서 대략 50 % 이하의 파골세포형성이 이루어졌음을 결론지었다 (도 1G, H 참조). 이는 골 섹션의 파골세포수가 더 낮았음은 손상된 분화 때문임을 제시하고 있다. Nox4의 역할을 기능적으로 입증하기 위하여 ROS 형성을 측정하였다. 인간 PBMCs의 분화동안 Nox4 발현 중 증가로 이미 제시된 바와 같이, 기초된 BMNC를 RANKL로 자극 후 ROS 형성은 증가되었다 (도 11 참조).

중요하게도, 이런 효과는 많지 않게 알려져 있으며, Nox4-/- 쥐에서 유도된 세포 중 통계적 유의점에는 도달하지 못한 것이며, Nox4는 분화과정에서 RANKL에 응답하여 ROS 형성에 증가를 중재하였음이 분명히 나타나있다.

세포배양(Cell culture)

인간 파골세포는 Rauner 등, 2011, Endocrinology 2011;152(1):103-112에 기재된 바와 같이 세대화 되었다. 간략하면, 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)를 피콜 (Ficoll) (1.077 g/ml, 95 비오크롬) 원심분리를 사용하여 지역 혈액은행에서 제공된 버피코트에서 수집하였다. 다음 10 % FCS (PAA)와 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM (인비트로젠) 중에 첨가하고, 배지를 25 ng/ml M-CSF (R&D 시스템)을 3 일 동안 보충한 기초 배지로 대체하였다. 그 후, 세포를 파골세포분화를 위하여 25 ng/ml M-CSF와 50 ng/ml RANKL (R&D 시스템)을 포함하는 분화 배지에서 21일 동안 배양하였다. 조골세포의 분화를 유도하기 위하여 세포를 L-아스콜베이트 포스페이트 (100 μΜ), β-글리콜 포스페이트 (10 mM), 및 덱사메타손 (10 nM)으로 보충한 성장배지에서 배양하였다.

쥐의 생체외 파골세포 분화(Murine osteoclast differentiation ex vivo)

대퇴골과 경골의 골단 말단을 제거하고, 골수를 10 % FCS를 포함하는 DMEM으로 흐르게 하였다. 골수기질세포를 모으고, 10 % FCS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM 중에 2 x 10⁶세포수/cm²의 밀도로 펼쳤다. 다음 첨부된 배지를 25 ng/ml M-CSF (R&D 시스템)으로 2 일간 보충된 기초 배지로 대체시켰다. 그 후 세포들을 25 ng/ml M-CSF와 50 ng/ml RANKL (R&D 시스템)를 포함하는 분화배지 중에서 추가적으로 6 일 동안 배양시켰다. TRAP 염색을 Mukherjee 등, 2008, 상기 문헌에 따라 제조자가 지시한 백혈구 산 포스파타제 키트 (시그마)를 사용하여 수행하였다.

과산화수소 생산에 대한 앰플렉스 레드 분석(Amplex Red assay for H₂O₂ production)

ROS 생산에 대하여 Schroder 등, 2006, Circ. Res., 105(6):537-544 방법을 조금 변형하여 평가하였다. 세포를 12 웰 평판에서 성장시키고 위에서 기재된 바와 같이 RANKL의 존재 또는 부재하 분화시켰다. 다음 세척한 세포를 앰플렉스 레드 (50 μmol/L, 인비트로젠), 호스-레디쉬 퍼옥시다제 (2 U/mL)을 포함하는 (BSA는 없이) HEPES 티로드와 함께 배양하였다. 45 분 후 상등액을 96개의 웰 평판에 이전시키고, 앰플렉스 레드의 H₂O₂ 의존 산화량을 미세평판 형광광도계 (여기 540 nm, 발광 580 nm)로 측정하였다. 실험은 카타라제 (50 U/mL) 존재 및 부재하 수행되었다. H₂O₂ 생성은 앰플렉스 레드 산화의 카타라제-감수성 부분으로 측정되었다.

정량 PCR(Quantitative PCR)

RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 로슈사의 HighPure RNA 추출키트를 사용하여 분리하였다. 오백(500) ng RNA를 슈퍼스크립트 II (인비트로젠)을 사용하여 역전사 시켰고, 다음 표준 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템)을 사용하여 SYBR™ 녹색-기초 실시간 PCR 반응을 시켰다. 프라이머 서열은 다음과 같다 (5'-3'):

mouse β-actin-forward: gatctggcaccacaccttct, reverse: ggggtgttgaaggtctcaaa;

nox4-forward: tctcaggtgtgcatgtagcc, reverse: ttctgggatcctcattctgg;

Nox1-forward: 5' aaagccattggatcacaacc 3'

Nox1-reverse: 5' cagaagcgagagatccatcc 3'.

PCR 조건은 10 분간 95 ℃ 유지하였고, 다음 10 초간 95 ℃ 및 60 초간 56 ℃로 30 사이클 시켰다. 발현수치는 β-액틴으로 정상화시켰다.

실시예 4: RANK 신호에 대한 Nox4 역할

Nox4-/- 쥐에서 감소된 파골세포 분화하는 근본적인 기전을 확인하기 위하여, RANK 신호 중 NADPH 옥시다제의 역할을 조사하였다. RANK 수용체의 발현은 야생타입 M-CSF 프라임 BMNC와 Nox4-/- 쥐 사이에 차이는 없었으며, 야생타입과 Nox4-중재 차이면에서 그렇다.

시토졸 Ca² ⁺ 중에서 RANKL-유도증가를 위한 Nox4의 역할을 하기 기재된 바와 같이 FURA2 형광계로 조사되었다. 쥐의 RANKL (30 시간)로 M-CSF-프라임 BMNC의 배양은 WT 쥐에서 유래된 세포 중 시토졸 Ca² ⁺ 중에서 현저한 증가를 유도하였다. 대조적으로, 이와 같은 효과를 Nox4 불안전한 동물 유래에서 얻어진 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 4A 참조).

Nox4의 약리학적 억제는 NOX4 억제제인, 2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-메틸-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6 (2H,5H)-디온에 의해 이루어지며, 이 화합물은 Nox2보다 Nox4에 대해 약 10 배나 높은 IC₅₀ 수치를 나타내며, 실시예 1 (60 mg/kg/일)의 분석법에 따른 측정에서와 같이 항산화작용이 없었으며, 이때 6 주간 매일 위관을 통하여 투여하였고 그 반면 Nox4의 유전적 삭제는 타목시펜 주입으로 유발되었다 (위에서 기재된 바와 같이 난소 수술 후 연속 3 일 동안 40 mg/kg을 복강내로 주었다). 대조군은 매일 위관을 통하여 용매를 주었다.

NOX4 억제제 (20 μmol/L)에 의한 Nox4의 약리학적 억제는, 시토졸 Ca² ⁺ 중 증가율을 유도한 RANKL의 자극을 예방하는 동안 RANKL을 보조적용할 때 (도 4B 참조), Nox4의 유전적 삭제로 유사하고, 분명 Nox4 효능은 부족하지만 Nox4-/- 쥐의 분명치 않은 유전적 특성이 아니어서 Nox4-/- 세포에서 신호하는 RANKL의 결핍임을 알았다.

칼슘에 대한 응답에서 파골세포의 분화는 전사요소인 NFATlc에 의해 중재되며, 칼슘-감수성 포스파타제 칼시뉴린(calcineurin)으로 활성화 후 또는 칼슘-활성화된 푸로테아제 μ-Calpain에 의한 부분 분열 후 핵으로 이동된다. 웨스턴 블롯 분석은 하기 기재된 바와 같이 활성 μ-Calpain이 풍부함이 M-CSF 프라임 쥐 BMNC에서 RANKL에 응답시 증가되었음을 나타내었으며, NFATlc의 핵 축적에 의해 평형이 되었다. 중요하게는 이런 효과는 Nox4-/- 쥐에서 얻은 세포 사이에서는 유사성을 보였다. 이런 자료는 Nox4는, RANK 신호의 중간 중재자인 세포내 칼슘작용을 통해 NFATlc-유발된 유전자 발현을 위해서 필요함을 나타내는 것이다.

Ca² ⁺ 측정(Ca² ⁺ measurement)

세포를 96개 웰 평판에서 성장시키고 위에서 기재한 바와 같이 RANKL 존재 또는 부재하 분화시켰다. 다음 세척 후 세포를 60 분 동안 1.5 μΜ Fura-2 (인비트로젠)로 처리하였다. 한번 더 세척 후 세포내 없는 Fura-2와 Ca² ⁺-바운드 Fura-2를 100 μl HEPES 티로드 중에서 ELISA 판독기 En Vision (PerkinElmer)으로 파장 340 nm과 380 nm에서 측정하였다. 측정을 3회 반복적으로 수행하였으며, 다음 공정 차례대로 40 μL의 20 μΜ 이노마이신, 100 mM EGTA 및 포화 MnCl₂를 부가하였다. 최종적으로, 세포내 Ca2+를 Grynkiewicz 등, 1985, J. Biol. Chem., 260(6):3440-3450에 기재된 대로 계산하였다.

면역블롯팅법(Immunoblotting)

웨스턴 블롯 분석이 자외선-기초 확인 시스템(Odyssey, Licor, Bad Homburg, 독일)으로 수행되었다. 모든 기본 항생제들은 Cell 시그널사에서 구매했고 자외선-형광-염색-콘쥬케이트 2차 항생제는 리코(Licor) (Bad Homburg)에서 얻었다. 다음 세포용해 완충액이 사용되었다 (pH 7.4, mmol/1 중 농도): 트리스-염산 (50), NaCl (150), 소디움 피로포스페이트 (10), 소디움 플루오리드 (20), 노니데트(nonidet) P40 (1 %), 소디움 데스옥시콜레이트 (0.5 %), 단백질 분해효소 억제제 혼합물(proteinase inhibitor mix), 페닐메틸설포닐 플루오리드 (1), 오르토바나데이트 (2), 오카나인산 (0.00001).

실시예 5: 인간 골다공증에서 Nox4 의 증가 및 쥐에서 골다공증 예방에 대한 NOX4 억제제 효과

골다공증(Osteoporosis)은 조골세포와 파골세포 효과 사이의 불균형의 결과물이다. 위의 실험데이터에서 파골세포 작용에서 Nox4 역할이 지지되며, 인간 골다공증 중 이 NADPH 옥시다제의 역할 가능성이 연구되었다. 건강한 환자와 골다공증 환자 또는 파젯트 병(Paget's disease) 환자의 인간골 견본 (뒤 후자 둘의 장애는 높은 파골세포 효능과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다)을 Nox4에 대해 염색하고 계속하여 하기에 기재된 바와 같이 분석을 실시하였다.

Nox4에 대한 염색 강도는 건강한 환자의 골에 대하여 골다공증 환자 골에서 확연히 더 높았고, 건강한 그룹보다 파젯트 병 환자에서 더 높았다 (도 5A 참조). 이런 실험자료는 Nox4 역시 인간의 골 손실에 기여하고 있으며 골다공증의 중재자임을 제시하는 것이다.

후자 효과를 연구하기 위하여, 암컷 쥐의 골다공증을 유도하기 위하여 난소 제거를 수행하였고, Nox4 억제제로 Nox4의 약리학적 억제 효과와 함께 단백질의 급성유전적 녹다웃 효과를 연구하였다. 여기서, 쥐들은 출생 후 8 주된 것에 난소수술을 하였고, 본 발명의 Nox4 억제제 60 mg/kg으로 수술 후 2 일째 처치하였고 계속 모든 연구를 수행하였다 (6 주).

예상과 같이, 난소제거 후 6 주에서 골 밀도는 대조쥐보다 감소되었다. 약리학적으로 억제를 받은 쥐는 용매처리 받은 쥐보다 현저히 높은 골 밀도를 나타내었다 (도 5C 참조).

도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명(화합물 1)에 따른 Nox4 억제제 20 및 60 mg/kg으로 치료된 주로 위에서와 같이 동일조건으로 수행한 결과 역시 더 좋은 골 특징을 나타내었다: 양성군으로 medac GmbH, Fehlandstr. 3, Hamburg 사에서 얻은 비스포스포네이트 파미드로넷(bisphosphonate pamidronat)을 파골세포 효력을 완전히 차단하기 위하여 사용하였다. 모든 화합물들은 절대골밀도 (도 6A 참조) 뿐만 아니라 절대 섬유주 골밀도 (도 6B 참조)을 증가시켰으며, 결론적으로, 환산된 미세 CT 기술로 측정된 바와 같이, 난소제거술로 유도된 총 골 손실의 거의 50 % 상대억제를 (도 6C), 섬유주 골손실의 거의 60 % 상대억제를 보인다 (도 6D). 이를 위하여, 골을 스카이스캔 1176으로 스캔하고, 참고적으로 0.25 g/cm³와 0.75 g/cm³를 두가리 모형을 사용하는 융합된 소프트웨어로 골밀도를 분석하였다. 경골 플레이튜에서 대퇴골 2 mm 부위를 기기 제조자가 제공한 소프트웨어로 총 골밀도와 섬유주 골밀도를 측정하였다. 골 파괴강도는 난소절제술로 감소되었고, 화합물 1로 치료시, 도 1C에서와 유사히 수행하며, 3점 검정법 (도 6E 참조)으로 확인되듯이 골 파괴강도에서 현저한 증가를 가장 높은 농도에서 얻어졌다. 이와 같은 방법으로 대퇴골을 1 kN 포스 검출기와 0.01 N의 포스 용액을 갖는 Zwick Z020/TN2A 재료 실험기기 (Zwick, Ulm, 독일)를 사용하여 3점 검정법으로 실패를 보였다. 검정실험에서 낮은 지지 사이에서 거리는 5 mm이었다. 실험하는 동안 교차 두 속도는 모든 측정에서 0.2 mm/분이었다. 포스-대체자료로부터 최고 포스(ultimate force; Fmax; in N)를 계산하였다.

Nox4 효능에서의 변화는 골다공증에 치료적 유용함을 확인시키기 위해서, Nox4는 다음과 같이 하기에 기재된 바와 같이 ERT2-Cre-타목시펜 유해 쥐로 교배시킨 Nox4-Flox-Flox 쥐 중에서 정확히 녹다운시켰다.: 동물을 난소절제하고 수술 2 일 전 타목시펜의 3 가지 주사제로 치료하였으며 (무균 옥수수유 중에 40 mg/kg을 용해시켰다.) 골을 6 주 후 분석하였다. 앞에서 보고한 바와 같이, 에스트로젠 수용체에 대한 타목시펜의 부분 작용제로서의 효능 결과로서, 타목시펜 그 자체가 섬유주 골밀도의 손실을 약화시켰다. 이럼에도 불구하고 Nox4의 부가적 녹아웃은 부수적인 유익한 효과를 갖는다 (도 5C 참조).

상기 모든 결과는 Nox4 발현은 인간의 골다공성 골 섹션에서 높이는 것을 보여주고, Nox4 (약리학적으로 또는 유전적으로)의 생체내 억제는 쥐 난소 제거수술 모델에서 골 손실을 예방했음을 보여줌으로써 예상치 못한 Nox4와 골 손실 사이의 직접연결이 있음을 지지받을 수 있게 되었다. 따라서, 골다공증의 골 덩어리의 손실(loss of bone mass)은 Nox4 억제로 예방되거나 적어도 감소시킬 수 있음이 지지되었다.

골 면역염색(Bone Immuno staining)

진단 목적으로 얻어진 익명의 인간 골 생검 조직 섹션을 항-Nox4 항체 (Szocs et al., 2002, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol, 22:21-7)를 사용하여 면역조직 화학법에 따라 염색하였다. 이를 위하여, 탈칼슘화된 골의 파라핀 섹션을 5μmeter 크기로 섹션하고, 탈파라핀 시킨 다음, 재수화시키고, 구연산 완충액 (시그마-알드리히) 중에서 냉각시켜 항원을 탈마스킹 후, 60 분 동안 실온에서 기본 항체 (1:300 희석시키고, 0.5 % 트윈을 포함한 포스페이트-완충생리식염수에서 용해시켰다)와 함께 배양하였다. 계속하여, 항체를 세척하고 샘플로 한 후 염색을 ABC-벡터 염색 HRP-키트 (VECTOR)로 수행하고, 헤마라운(hemalaun)으로 대조염색 시켰다.

쥐와 동물의 선택 절차(Mice and animal procedures).

Nox4-눌 쥐를 번역 개시 부위와 Nox4 유전자 엑손 1과 2 (Genoway)의 표적 결실로 세대화 시켰다 (Zhang et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 107:18121-18126 참조). 간략하면, 5' 뮤린 Nox4 게놈 DNA 단편을 129sv DNA BAC 라이브러리에서 분리시킨 후, loxP 부위에 측면에 위치한 엑손 1과 2를 포함하고 표적구조물을 세대화시키고, Flippase Recognition Target 부위 근처에 위치한 유성선택 디프테리아 톡신 A 카세트와 양성 선택 네오마이신 카세트를 함께 포함시켜 세대화 시켰다. 표적구조물을 129sv 태아줄기세포 중에서 전기영동시키고, 재조합 클론을 PCR과 서던 블롯 분석법으로 확인하였으며, C57BL/6 배반포 중에 주입하였다. 생식계열 키메라에서 얻은 이형집합된 쥐를 C57BL/6 Cre-deletor 쥐와 Flp-deletor 쥐와 함께 자라게 하여 이형집합 녹아웃 쥐로 세대화 하였다. Nox4-눌 동물은 이종교배 자손에 의해 얻어지며 C57BL/6 쥐로 10 대이상 역교배 시켰다.

실시예 6: NOX4 억제제

하기 표 2에 목록화된 다음 화합물들은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 Nox4 억제제의 예시이다:

표 2

NOX4 억제제의 합성

상기 NOX4 억제제는 하기 상세히 기재된 화합물 (1)의 다음의 제조방법을 사용하여 기히 이용할 수 있는 출발물질로부터 제조될 수 있다.

통상의 또는 바람직한 실험조건(즉, 반응온도, 시간, 시약의 몰수, 용매 등)을 기재하였으며, 또한 다른 실험조건을 다른 언급이 없는 한 사용될 수 있다. 최적의 반응조건은 사용된 반응물 또는 용매가 다양하지만 이전 반응조건은 경로 최적의 방법을 사용하여 이 분야의 숙련자에게 결정될 수 있다. 만약 하기 합성방법이 화합물 합성용으로 적합하거나 및/또는 필요 중간체가 아니라면, 이 분야에서 숙련자에게 알려진 적당한 제조방법이 사용될 수 있다. 일반적으로, 개개의 화합물을 위한 합성경로는 각 분자화합물의 특이 치환체에 의존되거나 필요한 중간체의 준비된 유용성에 따라 의존되며; 이와 같은 요소는 이 분야 숙련자의 필요성에 따를 것이다.

모든 보호방법과 탈보호 방법은 Philip J. Kocienski의 "Protecting Groups", Georg Thieme Verlag Stuttgart, 2005과 Theodora W. Greene과 Peter G. M. Wuts의 "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley Interscience, 4th Edition 2006에 기재된 방법을 참조할 수 있다. 본 발명의 화합물은 용매화합물과 연합하여 분리될 수 있으며, 적당한 용매의 증발로 재결정시켜 얻는다.

4-(2- 플루오로 -4- 메톡시페닐 )-2-(2- 메톡시페닐 )-5-(피리딘-3- 일메틸 )-1H- 피 라졸로[ 4,3-c]피리딘 -3,6(2H,5H)- 디온 (화합물 1)

a) 2- 플루오로 -4- 메톡시벤조일 클로라이드 (화합물 B)

SOCl₂ (2500 ml)에 용해시킨 출발화합물 A (2-플루오로-4-메톡시벤조인산, 알드리히) (350 g, 2.06 vmol)를 질소기류하 밤새 환류시켰다. 반응을 TLC로 모니터하였다 (72 시간). 바람직한 중간체 B를 반응성 혼합물로부터 증발시켜 (140 ℃, 10 mmHg) 백색결정 (365 g, 수율: 94 %)으로 얻었다.

b) 메틸[5-히드록시-1-(2- 메톡시페닐 )-1H- 피라졸 -3-일]아세테이트 (화합물 D)

메탄올 (2 L)에 용해시킨 출발화합물 C (2-메톡시 페닐 히드라진 염산염, 알드리히) (350 g, 1 eq.) 용액에 3-옥소-페탄디온산 디메틸 에스텔 (알드리히) (1.2 eq.)를 질소기류하 첨가하였고, 이 용액을 1 시간동안 환류시키고, TLC로 STM이 없음을 보여주었다. 증발시켜 용매를 제거하고, 잔사는 실리카 컬럼 (DCM/MeOH 200: 1-50:1)로 정제하여 백색고체의 바람직한 중간체 D를 얻었다 (360 g, 수율 68 %).

c) 메틸{4-[(2- 플루오로 -4- 메톡시페닐 ) 카보닐 ]-5-히드록시-1-(2- 메톡시페 닐)-1H- 피라졸 -3-일}아세테이트 (화합물 E)

위에서 얻은 중간체 D (20 g, 1 eq.)를 디옥산 (1200 ml) 중에 현탁시킨 다음, Ca(OH)₂ (15 eq.)를 질소기류하 첨가하였다. 반응혼합물을 110 ℃ 이상까지 가열한 다음, 위에서 얻은 2-플루오로-4-메톡시벤조일 클로라이드 (화합물 B, 0.9 eq.)를 디옥산 (100 mL) 중에 용해시킨 다음 혼합물에 방울방울 첨가시킨다. 반응을 110 ℃에서 교반한 다음 출발물질 (t=4h)이 사라질 때까지 LCMS로 모니터한다. 혼합물을 여과하고, 잔사를 에틸아세테이트 (5*150 mL)로 세척하였다. 모은 여액을 농축시키고, 재결정하여 조중간체 제품 E를 황색분말로 추가정제 없이 얻었다 (11.3 g, 수율: 36.9 %).

d) 메틸[(4E)-4-{(2- 플루오로 -4- 메톡시페닐 )[(피리딘-3- 일메틸 )아미노] 메틸 리덴}-1-(2- 메톡시페닐 )-5-옥소-4,5- 디히드로 -1H- 피라졸 -3-일]아세테이트 (화합물 F)

위에서 얻은 중간체 E (20 g, 1 eq.)를 톨루엔 (500 mL) 중에 용해시키고, TiCl₄ (2 mL)와 AcOH (100 ml)를 90 ℃에서 질소기류하 첨가시켰다. 1-피리딘-3-일메탄아민 (2.0 eq.) (알드리히) 첨가 후, 반응혼합물을 100 ℃에서 교반하고, 출발물질 (1.5 h) 사라짐을 보여주는 LCMS로 모니터하였다. 반응혼합물을 증발시켜 건조시켰다. 잔사를 EA (500 ml) 중에 용해시키고, 포화된 NaHC0₃ 용액으로 세척하고, Na₂S0₄ 상에서 건조시키며 농축시켰다. 화합물 F의 백색고체를 DCM과 PE로 재결정하여 얻었다 (9.5 g, 수율: 37.9 %).

e) 4-(2- 플루오로 -4- 메톡시 페닐 )-2-(2- 메톡시 페닐 )-5-(피리딘-3- 일메틸 )-1H-피 라졸로[4,3-c]피리 딘-3,6(2H,5H)- 디온 (화합물 1)

위에서 얻은 에나민 중간체 F를 MeOH (2 M, 1000 ml) 중에 용해시킨 신선하게 제조된 MeONa로 처리하였으며, 출발물질인 에나민 (t=1H)이 사라질 때까지 용액을 실온에서 교반하였다 (160 g, 1 eq.). 반응혼합물을 MeOH를 제거하기 위하여 농축시키고, 조원료는 물 (800 ml) 중에 용해시킨 다음, DCM (300 ml*6)으로 추출하였다. 다음 물상을 염산으로 산성화시킨 다음 (pH=5~6), DCM (300 ml*3)으로 추출하였다. 모은 유기층을 Na₂S0₄ 상에서 건조시키고 진공하 농축시켜 황색고체의 최종목적 화합물 (1)을 얻는다 (110 g, 수율: 68 %).

Claims

약효유효성분으로 하기 그룹 중에서 선택된 화합물, 또는 그들의 호변이성체, 기하이성체, 광학적 활성체 또는 약제학적으로 허용가능한 염 중에서 선택한 1종의 Nox4(NADPH 옥시다제 4) 억제제를 포함하는 골다공성 또는 전-골다공성 파골세포 형성 부전(osteoclastogenesis dysfunction) 또는 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 치료용 약제:
4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(4-클로로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일) 메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-5-[(2-메톡시피리딘-4-일)메틸]-4-메틸-1H-피라졸로[4,3 -c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-메톡시페닐)-4-메틸-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-5-[(6-메톡시피리딘-3-일)메틸]-4-메틸-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(5-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-메틸-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-메톡시페닐)-4-(3-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-메톡시페닐)-4-(3-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-[(2-메톡시피리딘-4-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로-4-메톡시페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2,6-디플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-메틸-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-5-메틸-4-[3-(메틸아미노)페닐]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2-플루오로페닐)-5-(피리딘-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2,5-디플루오로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(4-클로로페닐)-5-(1,3-티아졸-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(3,5-디클로로페닐)-5-(피리딘-4-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(3-클로로-2-플루오로페닐)-2-(2-클로로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2,6-디플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
4-(2-플루오로-5-메톡시페닐)-2-(2-메톡시페닐)-5-(피라진-2-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온;
2-(2-클로로페닐)-4-(2,5-디플루오로페닐)-5-(피리딘-3-일메틸)-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온; 그리고
2-(2-클로로페닐)-4-[3-(디메틸아미노)페닐]-5-[(1-메틸-1H-피라졸-3-일)메틸]-1H-피라졸로[4,3-c]피리딘-3,6(2H,5H)-디온.
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청구항 1에 있어서, 상기 부전은 파젯트 병(Paget' s disease), 고정 (immobilization)으로 인한 골 손실, 골 용해성 골 전이(osteolytic bone metastasis) 및 골 종양(bone tumours) 중에서 선택된 2차 원인의 골 흡수인 약제.
청구항 1에 있어서, 상기 부전은 미란성 관절파괴(erosive joint destruction), 당뇨병의 골 관절질환(osteoarthropathy in diabetes), 골 전이(bone metastases), 치근 흡수(tooth root resorption) 또는 1차 발진 장애(primary eruption failure), 골 손실에 의한 2차 부갑상선 항진증(secondary hyperparathyroidism with bone loss) 및 불활성에 기인한 골 위축증(bone atrophy due to inactivity)인 약제.
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청구항 1에 있어서, 추가로 1종 이상의 보조제(co-agent)를 포함하는 약제.
청구항 11에 있어서, 상기 보조제(co-agent)가 비스포스포네이트(bisphosphonate), 에스트로젠(estrogen) 또는 비타민 D 중에서 선택된 약제.
청구항 1에 기재된 1종 이상의 Nox4 억제제 및 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 그들의 부형제를 포함하는 골다공성 또는 전-골다공성 파골세포 형성 부전(osteoclastogenesis dysfunction) 또는 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 치료용 약제 조성물.
청구항 13에 있어서, 추가로 1종 이상의 보조제(co-agent)를 포함하는 약제 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 보조제(co-agent)는 비스포스포네이트(bisphosphonate), 에스트로젠(estrogen) 또는 비타민 D 중에서 선택된 약제 조성물.
하기 단계로 구성된 파골세포 형성 억제제의 확인 방법 :
(하 기)
(i) Nox4를 위한 암호화 또는 발현 시스템을 사용하여 검색할 물질을 접촉하고;
(ii) 상기 시스템으로 Nox4 활성 또는 Nox4 발현 능력을 평가하며;
(iii) 단계 (ii)에서 Nox4 활성 또는 Nox4 발현 능력을 물질 부재하 시스템의 Nox4 활성 또는 Nox4 발현능력과 비교하고;
(iv) 단계 (iii)에서 Nox4 활성과 Nox4 발현능력을 감소시키는 것이 관찰된 물질을 선택한다.
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