KR101935668B1 - 신규 돼지 tlr2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TLR2와 높은 친화력으로 결합하는 표적 펩타이드인 NAGHLSQ 및 그 동정 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법 {A novel TLR2 target peptide and the isolation method of the same}
본 발명은 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TLR2와 높은 친화력으로 결합하는 신규한 표적 펩타이드 NAGHLSQ 및 그 동정 방법에 관한 것이다.
"Toll-like receptor (TLR)"는 병원균을 포함한 다양한 미생물 성분을 인지하여 세포 내 여러 신호전달 경로를 활성화함으로써 선천성 면역반응 및 후천성 면역반응을 유도하는 역할을 하는 수용체이다. 여러 TLR 중에서도 TLR2는 수지상 세포, 대식 세포 등 다양한 면역 세포의 표면에 발현되어 있으며 광범위한 미생물 성분과 결합하여 체내 면역반응을 유도한다. 선행연구에 따르면 돼지 TLR2의 경우 다른 동물과는 다르게 면역 세포 이외에도 장내 점막면역기구 중의 하나인 Peyer's patch에서 매우 높은 수준으로 발현되어 있으며 외부 항원을 포집하여 점막 면역반응을 개시하는 M세포에서도 50%의 높은 발현율을 보이는 것으로 알려져 있다. 따라서 돼지 TLR2 표적 작용기를 동정하는 것은 구제역(FMD), 돼지 유행성 설사(PED) 등 점막을 통해 침투하는 질병을 효과적으로 방어할 수 있는 점막 백신의 백신 전달 효율 증가 및 백신 항원에 의한 면역반응 증진 효과를 가져올 것으로 기대된다.
"파지 디스플레이"는 1985년에 개발된 기술로서 박테리오 파지가 외부에서 도입된 펩타이드를 자신의 외피 단백질 표면에 발현시킬 수 있다는 원리를 이용하여 랜덤한 펩타이드 라이브러리를 발현하는 파지 라이브러리를 이용함으로써 특정 세포, 조직, 기관 등 생물학적 물질을 표적하는 펩타이드 작용기를 동정할 수 있는 기술로, 표적형 약물 개발, 항체 공학, 단백질 공학 등 여러 분야에서 널리 사용되고 있다. 파지 디스플레이의 기본 진행 과정은 다음과 같다. 먼저 랜덤 펩타이드를 발현하는 파지 라이브러리를 특정 표적 물질에 결합시키고 그 후 세척, 용출 과정을 거치는데 이러한 일련의 과정을 바이오패닝이라고 하며 일반적으로 바이오패닝을 3회 내지 4회 정도 반복하여 특정 표적 물질에 높은 결합력을 가지는 파지만을 최종적으로 획득할 수 있으며 최종적으로 파지의 염기 서열을 분석함으로써 펩타이드 서열을 확보하게 된다.
본 발명에서는 파지 디스플레이의 다양한 방법 중에서 "세포 기반 파지 디스플레이"를 이용하였는데 이는 특정 표적 물질을 발현하고 있는 세포 자체에 파지를 결합시키는 기술이다. 본 발명의 표적 물질은 TLR2는 막통과 수용체로서 친수성 부분과 소수성 부분을 모두 가지고 있기 때문에 단백질을 본래의 형태로 정제할 수 없다는 단점을 가지고 있다. 따라서 돼지 TLR2를 과발현하는 세포 자체를 이용함으로써 원래의 단백질 구조를 유지하고 정상적인 post-translational modification을 거친 TLR2를 이용할 수 있다.
또한 본 발명에서는 파지 디스플레이에 차세대 시퀀싱 기술인 "일루미나 시퀀싱"을 도입하였다. 기존의 시퀀싱 방법은 대량의 파지 서열을 분석하는데 있어 시간이 많이 소요되고 전체 파지가 아닌 일부 파지 서열만을 분석할 수 있다는 단점을 가지고 있다. 그러나 차세대 시퀀싱 기술을 이용하면 대량의 파지 서열들을 신속하게 분석할 수 있고 특정 펩타이드를 발현하는 특정 파지들이 얼마나 증가하는지 수량화할 수 있다는 장점이 있다. 또한 여러 선행 연구들에 따르면 파지 디스플레이에 차세대 시퀀싱 기술을 적용하게 되면 여러 번의 바이오패닝을 거치치 않고도 높은 결합력을 가진 파지들을 동정할 수 있다.
"렌티바이러스(Lentivirus)"는 RNA 바이러스인 레트로바이러스(Retrovirus)의 일종으로, 호스트의 핵으로 이동하여 Genomic DNA에 삽입되어 유전자를 발현시켜 Virus particle을 만든다. 아데노바이러스, 레트로바이러스와 함께 Vector로써 Knock out 유전자 발현 등에 이용되고 있고 직접 vector에 원하는 유전자를 삽입하여 사용할 수 있다.
"GFP (녹색형광단백질)"은 최근 10년 동안 생화학과 분자 생물학 분야에서 가장 흥미로운 단백질의 하나로 여겨진다. GFP는 발광하는 특성 때문에 정량적인 측정이 쉬워서 박테리아에서 형체 전이 마우스에 이르기까지 광범위한 생명체내에서 우리가 연구하고자 하는 유전자가 언제 어디서 얼마나 많이 발현되고 소멸되는지 알아볼 수 있는 표지로서 이용된다. 세포에 이 GFP를 암호화하고 있는 DNA나 mRNA가 존재할 경우, 이내 GFP 단백질이 세포 내에서 합성되어 강한 형광을 발한다. 발현 정도를 조사하고 싶은 유전자에 GFP를 암호화하는 서열을 연결하면 실제 조사하길 원하는 유전자가 발현하는 장소에서 GFP가 형광을 발현하게 되므로, 유전자의 발현을 조사하는데 많이 사용한다. 특히 관찰이 용이하고 독성을 지니고 있지 않다는 장점으로 인해, 유전자의 발현의 유무와 장소, 시간 측정 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.
본 발명 관련 선행기술로서 등록특허 제10-0856511은 본 발명자의 선출원 등록특허로서, 파지-펩타이드 라이브러리를 이용해 DNA 염기서열을 분석하여 펩타이드 작용기를 동정하고 소장상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 이를 이용한 경구투약 시스템을 개시한 것이나, 대량의 파지 서열을 분석하는데 많은 시간이 소요되고 전체 파지가 아닌 일부 파지 서열만을 분석할 수 있다는 단점 외에도 대량의 파지 서열들을 신속하게 분석하고 특정 파지들의 증가량을 수량화할 수 없다. 또한 등록특허 제10-1698884는 pIX에서 유래하는 융합 단백질을 통해 사상 파지에 표시되는 펩타이드에 대한 대안의 스캐폴드, 파지미드 및 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이나, 돼지 구제역, 유행성 설사 등 점막을 침투하는 질병에 대한 면역력 증진 및 백신 항원의 전달 효율 등과는 무관하다. 한편 등록특허 제10-101382661 는 TLR2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적 서열을 갖는 프로브나 프라이머를 포함하는 섭식장애의 진단용 조성물, 키트 및 마이크로어레이에 관한 것으로 유전자의 발현을 억제하거나 발현되는 단백질의 활성을 억제할 수 있는 억제제를 포함하는 섭식장애의 예방 또는 치료용 조성물 해당 스크리닝 방법에 관한 것에 불과하다. 따라서 본 발명 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드와 그 동정 방법, 더욱 상세하게는 TLR2와 높은 친화력으로 결합하는 표적 펩타이드인 NAGHLSQ와 그 동정 방법에 대하여는 지금까지 상기 문헌 어디에도 개시되거나 암시된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 상기 목적은 돼지 TLR2를 발현하는 렌티 바이러스를 생산하는 단계; 상기 단계에서 얻은 렌티 바이러스를 돼지 장 세포주 IPEC-J-2에 처리하여 돼지 TLR2 과발현 세포주를 구축하는 단계; 상기 단계에서 얻은 돼지 TLR2 과발현 세포주에 세포 기반 파지 디스플레이를 이용하여 돼지 TLR2와 결합하는 파지를 바이오패닝으로 수득하는 단계; 상기 단계에서 얻은 파지의 DNA를 추출하여 일루미나 시퀀싱으로 빈도수가 높은 펩타이드를 스크리닝하는 단계; 상기 단계에서 스크리닝한 펩타이드 중 가장 빈도수가 높은 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ를 선정하는 단계를 통하여 이루어지고,
상기 신규한 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ의 검증은 결합실험 및 리간드 경합실험을 통하여 평가함으로써 달성하였다.
본 발명은 신규한 돼지 TLR2의 표적 펩타이드 및 그 동정 방법을 제공하는 효과가 있고, 나아가 TLR2와 높은 친화력으로 결합하는 신규 표적 펩타이드 NAGHLSQ 및 그 동정 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도1은 본 발명에 따른 돼지 TLR2를 과발현하는 세포주를 구축하는 과정을 1) TLR2 유전자를 운반하는 렌티바이러스 생성, 2) 과발현시키고자 하는 세포(IPEC-J-2)에 생산된 바이러스 감염의 두단계로 나타내는 모식도이다.
도2는 본 발명에 따른 돼지 TLR2와 결합하는 파지를 수득하기 위하여 세포 기반 파지 디스플레이를 수행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도3은 본 발명에 따른 돼지 TLR2와 결합하는 파지의 DNA 시퀀싱을 위하여 Illumina Hiseq 2000 기계를 이용한 일루미나 시퀀싱의 과정을 나타내는 모식도이다.
도4는 본 발명에 따라 돼지 TLR2 유전자가 녹색형광단백질(Green Fluorescent Peptide, GFP)과 함께 발현되어 알 수 있는 렌티 바이러스 유전자 도입 효율을 대조군과 비교하여 나타내는 그래프이다.
도5는 본 발명에 따라 렌티 바이러스에 의해 발현된 돼지 TLR2-GFP 단백질의 사이즈 측정 및 검출결과를 나타내는 전기영동 사진 결과이다.
도6은 본 발명에 따른 돼지 TLR2와 결합하는 Zymosan 리간드를 함께 처리한 형광현미경 사진도이다.
도7은 본 발명에 따른 세포 기반 파지 디스플레이 과정에서 바이오패닝 라운드가 증가에 따른 파지 농도(titer, pfu/ml)를 나타내는 그래프이다.
도8은 본 발명에 따른 일루미나 시퀀싱 과정에서 바이오패닝 라운드 증가에 따라 가장 높은 빈도수를 보이는 펩타이드를 나타내는 그래프이다.
도9는 본 발명에 따른 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ의 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포 및 과발현 전 IPEC-J-2 세포와의 결합력을 각 나타내는 그래프이다.
도10은 본 발명에 따른 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ의 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포 및 과발현 전 IPEC-J-2 세포와의 결합력이 TLR2 리간드 Zymosan의 농도에 따라 변화하는 것을 각 나타내는 그래프이다.
본 발명은 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법을 개시한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예 1] 돼지 TLR2 과발현 세포주 구축
돼지 TLR2 를 발현하는 렌티 바이러스 생산
본 발명 돼지 TLR2 과발현 세포주 구축을 위해 도입할 렌티 바이러스를 생산하기 위하여, 80% 정도 자란 인간 배아 신장 세포주(Human embryonic kidney cell line (HEK 293 LTV))에 돼지 TLR2 유전자를 포함한 플라스미드 26.5μg, 바이러스를 조립하기 위한 플라스미드 9.2 μg, 바이러스 막을 생산하는 플라스미드 5 μg을 칼슘인산 침전법을 이용하여 도입한 후 12시간 마다 생산된 렌티 바이러스 수거하고, 수거된 렌티 바이러스를 모아 농축하여 저장하였다 (도 1의 1)).
돼지 TLR2 과발현 세포주 구축
돼지 장세포주 (IPEC-J-2)에 생산된 상기 렌티 바이러스를 처리하여 돼지 TLR2 과발현 세포주를 구축하였다 (도 1의 2)).
[실험예 1] 생산된 렌티바이러스의 유전자 도입 효율
본 발명의 상기 실시예 1에 따라 구축된 돼지 TLR2 과발현 세포주(IPEC-J-2)로의 렌티 바이러스의 유전자 도입 효율을 평가하기 위해 flow cytometry 분석을 실시하였다. 본 발명의 돼지 TLR2 유전자는 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)과 함께 발현되었는데 아무것도 처리하지 않은 대조군(도 4, (가))에 비하여 렌티 바이러스를 처리한 세포주(도 4, (나))에서 GFP 신호가 약 83%가 감지되었다.
[실험예 2] 발현된 돼지 TLR2 단백질 사이즈 측정
본 발명의 상기 실시예 1에 따라 구축된 돼지 TLR2 과발현 세포주(IPEC-J-2)에서 발현된 TLR2를 검출하기 위하여 western blot 분석을 이용하였다. 실험 결과 생산된 렌티 바이러스의 의해 발현된 돼지 TLR2-GFP 단백질이 예상 크기 115kDa에서 검출되었다 (도 5).
[실험예 3] 발현된 돼지 TLR2 기능 검증
본 발명의 상기 실시예 1에 따라 구축된 돼지 TLR2 과발현 세포주(IPEC-J-2)의 발현된 돼지 TLR2가 정상적인 기능을 수행하는지 검증하기 위해 TLR2의 리간드인 zymosan을 이용하여 공초점주사현미경 분석을 수행하였다. 실험은 (가) IPEC-J-2 세포주에 zymosan을 처리한 그룹, (나) 돼지 TLR2 과발현IPEC-J-2 세포주에 zymosan 을 처리하지 않은 그룹, (다) 돼지 TLR2 과발현IPEC-J-2 세포주에 zymosan 을 처리한 그룹의 세 그룹으로 나누어 진행하였다.
실험 결과, 돼지 TLR2 과발현IPEC-J-2 세포주에 zymosan을 처리한 경우 GFP 형광과 zymosan 형광이 같이 위치하는 것이 확인되어 발현된 돼지 TLR2가 정상적인 기능을 수행함을 검증하였다 (도 6).
[실시예 2]세포 기반 파지 디스플레이를 이용한 파지의 수득
본 발명의 상기 실시예 1에 따라 구축된 돼지 TLR2 과발현 세포주 IPEC-J-2에 발현되어 있는 TLR2와 결합하는 동시에 TLR2가 아닌 다른 단백질과 결합하지 않는 파지를 수득하기 위하여, 우선 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포가 아닌 일반 IPEC-J-2 세포 1x106개에 2x1011 pfu (plaque forming unit)에 해당하는 파지 라이브러리를 첨가 후 4℃에서 30분 동안 정치하였다. 원심분리를 통해 IPEC-J-2 세포와 결합한 파지는 제거하고 상층액만 취하여 돼지 TLR2 과발현 세포주에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 정치 후 원심분리를 통해 세포와 결합하지 않은 파지는 제거하고 세포와 결합한 파지는 0.1M glycine-HCl (pH 2.0)을 이용하여 용출하였다. 용출액은 2M Tris base로 중화시키고 용출된 파지를 대장균에 감염시켜 증폭시킨 후 상기와 마찬가지로 2x1011 pfu의 파지를 이용하여 두번째 바이오패닝을 수행하였다. 바이오패닝은 총 세 번 진행하였으며(도 2), 바이오패닝의 라운드가 증가할수록 회수된 파지의 Titer 값이 증가하였다(도 7).
[실시예 3] 일루미나 시퀀싱 및 NAGHLSQ 펩타이드의 선정
상기 실시예 2 에 따라 각 바이오패닝 라운드별로 용출된 파지 샘플들로부터 파지의 단일사슬 DNA를 추출하였다. 그 후 파지 DNA 내 랜덤한 펩타이드 서열 주위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 일루미나 시퀀싱을 위한 DNA 샘플을 준비하였다. 최종 시퀀싱은 Illumina Hiseq 2000 기계를 이용하였다(도 3).
시퀀싱의 라운딩이 진행될수록 라운드별 가장 높은 빈도수를 보인 펩타이드의 빈도는 점차 증가하였고, 이 중 NAGHLSQ가 가장 높은 빈도수를 보인 펩타이드로써 돼지 TLR2의 표적 펩타이드로 선정하였다 (도 8).
[실험예 4] NAGHLSQ 펩타이드 검증 실험
상기 실시예 3에 따라 표적 펩타이드로 선정된 NAGHLSQ의 펩타이드를 검증하기 위하여 결합 실험 및 리간드 경합 실험을 수행하였다.
펩타이드 결합 실험
펩타이드 결합 실험의 경우 형광으로 표지된 각 합성 펩타이드(대조군, NAGHLSQ, VPSKPGL)를 농도별로 (가) 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포와 (나) 과발현 전의 일반 IPEC-J-2 세포에 결합시킨 후 세 번의 세척과정을 거쳐 펩타이드 형광 신호 강도를 flow cytometry를 통해 분석하였다. 실험 결과, NAGHLSQ의경우 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포에 가장 높은 결합력을 보였지만 과발현 전의 IPEC-J-2 세포에서는 낮은 결합력을 보였다 (도 9).
리간드 결합 실험
리간드 결합 실험의 경우 형광으로 표지된 각 합성 펩타이드(대조군, NAGHLSQ, VPSKPGL) 2μM을 (가) 돼지 TLR2 과발현 IPEC-J-2 세포와 (나) 과발현 전의 일반 IPEC-J-2 세포에 4℃에서 30분 결합시킨 후 TLR2 리간드인 zymosan을 농도별로 처리하여 펩타이드와 경합시킨 후 펩타이드 형광 신호 강도를 flow cytometry를 통해 분석하였다. 실험 결과, NAGHLSQ의 경우 TLR2 과발현 세포주에서 TLR2 리간드의 농도에 의존적으로 결합 능력이 감소하였으며 이는 NAGHLSQ가 TLR2에 높은 친화력으로 결합하는 것을 확인한 것이다 (도 10).
본 발명은 신규 돼지 TLR2 표적 펩타이드 및 그 동정 방법에 관한 것으로, 특히 TLR2와 높은 친화력으로 결합하는 표적 펩타이드인 NAGHLSQ 및 그 동정 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로, 동물 의약학 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> TLR2 target peptide <130> P5986 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 target peptide <400> 1 Asn Ala Gly His Leu Ser Gln 1 5

Claims (4)

  1. 돼지 TLR2를 발현하는 렌티 바이러스를 생산하는 단계; 상기 단계에서 얻은 렌티 바이러스를 돼지 장 세포주 IPEC-J-2에 처리하여 돼지 TLR2 과발현 세포주를 구축하는 단계; 상기 단계에서 얻은 돼지 TLR2 과발현 세포주에 세포 기반 파지 디스플레이를 이용하여 돼지 TLR2와 결합하는 파지를 바이오패닝으로 수득하는 단계; 상기 단계에서 얻은 파지의 DNA를 추출하여 일루미나 시퀀싱으로 빈도수가 높은 펩타이드를 스크리닝하는 단계; 상기 단계에서 스크리닝한 펩타이드 중 가장 빈도수가 높은 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ를 선정하는 단계로 이루어진 돼지 TLR2 표적 펩타이드의 동정 방법.
  2. 제1항의 방법에 의하여 동정된 돼지 TLR2 표적 펩타이드 NAGHLSQ.

  3. 삭제
  4. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2006083706A2 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Vaxinnate Corporation Method to identify polypeptide toll-like receptor (tlr) ligands

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Viral Immunology.,23(2):135-149(2010.4.30.)

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