KR101928684B1 - 세포벽 결합 세라미드 유사 당지질을 갖는 박테리아 백신 및 이의 용도 - Google Patents

세포벽 결합 세라미드 유사 당지질을 갖는 박테리아 백신 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세라미드 유사 당지질이 물리적으로 결합된 박테리아 세포와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 박테리아 백신에 의해 감염된 동일한 세포에 세라미드 유사 당지질 면역보강제의 직접적인 전달을 허용한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

세포벽 결합 세라미드 유사 당지질을 갖는 박테리아 백신 및 이의 용도{BACTERIAL VACCINES WITH CELL WALL-ASSOCIATED CERAMIDE-LIKE GLYCOLIPIDS AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 면역학 분야에 관한 것이다.
마이코박테리아는 포유동물에서 결핵, 한센병, 나병, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 또는 파종성 질환과 같은 심각한 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 바실 칼멧 게랭(BCG) 백신이 75년 이상 동안 이용 가능하였더라도, 매년 세계 인구의 ⅓이 마이코박테리아 튜버쿨로시스에 감염되고, 200만명의 사람들이 결핵(TB)으로 사망한다. Hoft DF, Lancet 372: 164-175 (2008). 결핵은 현재 HIV/AIDS에 이어 세계에서 감염성 질환으로 인한 사망의 두 번째 높은 원인이다. Young DB et al., Journal of Clinical Investigation 118: 1255-1265 (2008).
여러 연구는 MHC 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ형 제한 T 세포 둘 다 M. 튜버쿨로시스 감염의 효과적인 조절에 필요하다고 제시하고 있다. Mogues T et al., J Exp Med 193: 271-280 (2001); Flynn JL et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 12013-12017 (1992). 그러나, 지질 항원 제시 분자인 CD1d가 결핍된 마우스는 M. 튜버쿨로시스 감염에 야생형 마우스보다 더 감수성이 아니고, 이는 CD1d 제한 NKT 세포가 보호 면역에 절대적으로 필요한 것이 아니라는 것을 나타낸다. Behar SM et al., J Exp Med 189: 1973-1980 (1999). 자연 살해 T(NKT) 세포는 T 세포 수용체 및 NK 세포 수용체 둘 다를 발현하는 T 림프구의 부분집합을 나타내고, 선천성 면역을 후천성 면역에 연결하는 데 중요한 역할을 한다. Kronenberg M and Gapin L, Nat Rev Immunol 2: 557-568 (2002). 활성화시, NKT 세포는 L. 모노사이토제네스(L. monocytogenes), M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 및 리슈마니아 메이져(Leishmania major)를 비롯한 다양한 병원균에 초기 및 지연 면역에 뚜렷한 영향을 가질 수 있다. Kronenberg (2002); Behar SM and Porcelli SA, Curr Top Microbiol Immunol 314: 215-250 (2007); Emoto M et al., Eur J Immunol 29: 650-659 (1999); Ishikawa H et al., Int Immunol 12: 1267-1274 (2000); Ranson T et al., J Immunol 175: 1137-1144 (2005). NKT 세포 활성화는 증강된 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 야기하여, 수지상 세포 성숙을 유도하는 것으로 보고되고 있다. Nishimura T et al., Int Immunol 12: 987-994 (2000); Silk JD et al., J Clin Invest 114: 1800-1811 (2004).
MHC 결합 펩티드를 인식하는 통상의 T 세포와 달리, NKT 세포는 MHC 클래스 Ⅰ 유사 단백질 CD1d에 의해 제시되는 지질 항원에 특이적이다. NKT 세포를 활성화하기 위해 CD1d에 의해 제시될 수 있는 자가 유래 및 박테리아 유래 당지질을 비롯한 몇몇 당지질 항원이 현재까지 확인되었다. Tsuji M Cell Mol Life Sci 63: 1889-1898 (2006). 불변의 Vα14-Jα18 재배열을 갖는 T 세포 수용체를 갖는 NKT 세포(iNKT 세포)는 CD1d에 의해 제시될 때 글리코스핑고리피드, α-갈락토실세라미드(αGalCer)에 대한 반응성을 보유한다. Kronenberg M and Gapin L, Nat Rev Immunol 2: 557-568 (2002); Kronenberg M, Annu Rev Immunol 23: 877-900 (2005). 최근의 연구는 면역보강제로서의 αGalCer의 병용 투여를 통해 iNKT 세포를 활성화함으로써 플라스모디아(Plasmodia), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovanii), 리스테리아 모노사이토제네스 및 HIV에 대한 백신이 개선될 수 있다는 것을 보여준다. Gonzalez-Aseguinolaza G et al., J Exp Med 195: 617-624 (2002); Dondji B et al., European Journal of Innunology 38: 706-719 (2008); Huang YX et al., Vaccine 26: 1807-1816 (2008); Enomoto N et al., FEMS Immunol Med Microbiol 51: 350-362 (2007).
치료제로서, αGalCer은 마우스에서 말라리아 기생충 부하를 감소시키고 M. 튜버쿨로시스 감염 마우스의 생존을 연장시키는 것으로 나타났다. Gonzalez-Aseguinolaza G et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 8461-8466 (2000); Chackerian A et al., Infection and Immunity 70: 6302-6309 (2002). 따라서, CD1d 제한 T 세포가 최적의 면역에 절대적으로 필요하지 않더라도, 이의 특이적 활성화가 감염성 질환에 대한 숙주 저항을 증강시킨다.
마우스에서 αGalCer를 단일 주사하면 혈청에서 사이토카인 발작이 유발되어 IFNγ, IL-12 및 IL-4가 분비된다. Fujii S et al., Immunol Rev 220: 183-198 (2007). 또한, αGalCer에 의해 CD1d 제한 iNKT 세포를 자극하면 NK 세포, 수지상 세포, B 세포 및 통상의 T 세포가 신속히 활성화된다. Nishimura T et al., Int Immunol 12: 987-994 (2000); Kitamura H et al., J Exp Med 189: 1121-1128 (1999); Fujii S et al., J Exp Med 198: 267-279 (2003). iNKT 세포는 다량의 IFNγ를 생성하고 이러한 생성은 CD40-D40 리간드 상호작용을 통한 iNKT 세포와 DC 사이의 직접 접촉을 요한다. Nishimura T et al., Int Immunol 12: 987-994 (2000). iNKT 세포에 의해 생성된 IFNγ는 쥐과 종양 모델에서 αGalCer의 전이 억제 효과에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. Hayakawa Y et al., Eur J Immunol 31: 1720-1727 (2001); Smyth MJ et al., Blood 99: 1259-1266 (2002). 따라서, iNKT 세포의 활성화가 초기 사이토카인 환경에 영향을 미쳐 후천성 면역 반응을 조절할 수 있는 것이 제안되었다.
최근에, α-C-GalCer로서 공지된 αGalCer의 C-글리코시드 유사체가 마우스에서 αGalCer과 비교하여 더 우수한 항암 및 항말라리아 활성을 갖는 주요 Th1 변형 화합물로서 입증되었다. 이 화합물은 또한 마우스에서 더 높은 수치의 Th1 사이토카인 IL-12 및 IFNγ를 유도한다. Schmieg J et al., Journal of Experimental Medicine 198: 1631-1641 (2003). IL-12 및 IFNγ의 이 2개의 사이토카인은 마우스 및 인간에서 TB 조절에 필수적인 것으로 입증되었다. Freidag BL et al., Infect Immun 68: 2948-2953 (2000).
결핵에 대한 마우스 모델에서 BCG 백신과의 면역보강제의 사용에 대해 매우 적은 연구만이 존재한다. 이 연구 중 하나는 CpG ODN을 BCG 백신 접종과 함께 사용할 때 M. 튜버쿨로시스 공격에 대한 보호 증강을 보고하고 있다. Freidag BL et al., Infect Immun 68: 2948-2953 (2000). 다양한 감염성 질환에 대한 백신과 함께 αGalCer의 면역보강제 효과에 대한 초기 연구의 대부분은 αGalCer과 각각의 백신과의 별개의 병용 투여를 이용하여 이의 면역보강제 활성을 이용한다. Gonzalez-Aseguinolaza G et al. (2002); Dondji B et al. (2008); Huang YX et al. (2008); Enomoto N et al. (2007). 따라서, 박테리아 항원, 예를 들면 마이코박테리아 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 효과적인 조성물 및 백신에 대한 수요가 존재한다.
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도 1: M. 보비스(M. bovis) BCG 세포벽으로 aGalCer의 안정한 통합. (A) CHCl3 + CH3OH(2:1), 인산염 완충 식염수(PBS) + 0.05% Tween 80 또는 0.05% 티록사폴 중에 14C-aGalCer의 용해도를 보여주는 그래프. (B) 0.05% 티록사폴을 갖는 단백질 비함유 Middlebrooks 7H9 배지에서 여러 농도의 14C-aGalCer의 존재 하에 배양된 M. 보비스 BCG로의 14C-aGalCer의 통합을 보여주는 그래프. (C) 0.05% 티록사폴을 갖는 단백질 비함유 Middlebrooks 7H9 배지에서 14C-aGalCer: 클로로포름-메탄올(2:1) 중에 직접 용해된 14C-aGalCer(1 레인): M. 보비스 BCG로부터 추출된 14C-aGalCer(2 레인)의 존재 하에 배양된 M. 보비스 BCG로부터 추출된 세포벽 지질의 박층 크로마토그래피 밴드.
도 2: M. 보비스 BCG에 결합된 αGalCer은 시험관내 생물학적으로 활성이다. (A) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG로 감염된 골수 유래 수지상 세포(BMDC)와 항온처리될 때 NKT 세포 하이브리도마 DN3A4-1.2의 활성화시 24시간 IL-2 생성을 보여주는 용량 반응 곡선. (B) 및 (C) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG 감염된 BMDC에 의한 마우스 비장세포의 활성화시 24시간 IFNγ(B) 및 IL-4(C) 생성을 보여주는 용량 반응 곡선. (D), (E) 및 (F) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG로 감염된 단핵구 유래 인간 수지상 세포에 의한 인간 iNKT 세포 클론의 활성화시 IFNγ(D), TNFα(E) 및 IL-13(F) 생성을 보여주는 용량 반응 곡선. (G) 및 (H) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG 감염된 BMDC와 항온처리될 때 미접종 C57BL/6 마우스로부터 얻은 간 단핵 세포의 활성화시 IFNγ(G) 및 IL-4(H) 생성을 보여주는 용량 반응 곡선.
도 3: M. 보비스 BCG에 결합된 αGalCer은 생체내 생물학적으로 활성이다. (A), (B) 및 (C) 비히클(Veh), BCG, αGalCer 또는 αGalCer/BCG(5×106 CFU) 4.8 nmol을 투여받은 마우스에서 주사 1 내지 50시간 후 여러 시점에서 IFNγ(A), IL-12p70(B) 및 IL-4(C)의 혈청 수치(ng/㎖)를 보여주는 그래프.
도 4: αGalCer 및 α-C-GalCer은 M. 보비스 BCG와 병용 투여될 때 DC 성숙 및 공동 자극 마커의 신속한 상향 조절을 유발한다. (A) 및 (B) 비장(A) 및 간(B) CD11c+ 수지상 세포에서 비히클, BCG, αGalCer/BCG 및 α-C-GalCer/BCG의 IP 주사 20시간 후 DC 성숙 마커에 대한 막대 그래프 프로파일. MHC Ⅱ 및 공동 자극 분자: CD80, CD86, CD70 및 41BB의 상향 조절. (C) 및 (D) 비장(C) 및 간(D) 세포에서의 MHC Ⅱ, CD80, CD86, CD70 및 41BB 수치의 증가 배수를 보여주는 그래프를 αGalCer/BCG 및 α-C-GalCer/BCG에 대해 도시하였다.
도 5: 면역보강제로서의 BCG-OVA 및 αGalCer에 의한 백신 접종은 마이코박테리아 항원에 대한 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다. (A) αGalCer/BCG-Ova, BCG-Ova에 의한 예방접종 이후의 또는 백신 비접종(Unvac.) 마우스의 비장에서 3주에 OVA 펩티드, SIINFEKL(서열 번호 1)에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정으로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프. (B) αGalCer/BCG-Ova, α-C-GalCer/BCG-Ova, BCG-Ova에 의한 예방접종 이후의 또는 백신 비접종 마우스의 비장에서 2달에 SIINFEKL에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정으로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프. (C) αGalCer/BCG, BCG 단독에 의한 예방접종 이후의 또는 백신 비접종 BALB/c 마우스에서의 2주에 Mtb 펩티드, TB10.3/4 MHC-I(H-2Kd) 에피토프 GYAGTLQSL(서열 번호 2)에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정으로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프. (D) CFSE 표지 Thy1.2+ OT-I 비장세포가 주사되고 αGalCer/BCG-Ova, α-C-GalCer/BCG-Ova 또는 BCG-Ova로 감염된 대표적인 Thy1.1+ B6.PL 마우스를 보여주는 점 도면. (E) (D)에 기재된 세포에 대한 비분할 세포(%)를 보여주는 그래프.
도 6: BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의한 백신 접종 이후의 마우스에서 악성 M. 튜버쿨로시스 공격에 대한 보호 면역. (A) 및 (B) 미접종(Unvac.) 또는 백신 접종(BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG)된 7마리의 마우스 군에 대한 악성 M. 튜버쿨로시스 H37Rv 균주에 의한 공격 3주 및 6주 후에 C57BL/6 마우스의 폐(A) 및 비장(B)에서의 M. 튜버쿨로시스의 평균 CFU(및 표준 편차)를 보여주는 그래프. (C) 미접종(Unvac.) 또는 백신 접종(BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG)된 4마리의 마우스 군에 대한 악성 M. 튜버쿨로시스 H37Rv 균주에 의한 공격 6주 후에 CD1d-KO 마우스의 폐 및 비장에서 M. 튜버쿨로시스의 평균 CFU를 보여주는 그래프. (D) 미접종(Unvac.) 또는 백신 접종(BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG)된 4마리의 마우스 군에 대한 공격 6주 후에 Jα-18KO 마우스의 폐 및 비장에서 M. 튜버쿨로시스의 평균 CFU를 보여주는 그래프. *p < 0.05; **p < 0.007(1방향 ANOVA, Turkey 사후 검증 시험).
도 7: 악성 M. 튜버쿨로시스에 의해 백신 접종되고 공격된 마우스의 폐를 공격 6주 후에 조직학적으로 검사하였다. (A) BCG(B), αGalCer/BCG(C) 또는 α-C-GalCer/BCG(D) 중 어느 하나에 의해 백신 접종된 마우스와 비교하여 백신 비접종 마우스에서의 과도한 육아종성 폐렴 및 강화를 갖는 보다 심각한 표재된 폐 병변의 이미지. 오리지널 20배 확대.
도 8: αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의한 백신 접종은 BCG와 비교하여 마이코박테리아 항원에 대한 CD4 T 세포 반응을 상당히 증강시키지 않는다. (A) BCG, αGalCer/BCG, α-C-GalCer/BCG에 의한 예방접종 이후의 또는 백신 비접종 C57BL/6 마우스에서 2달에 Ag85B의 p25에 특이적인 IFNγ 생성 비장 CD4 T 세포에 대한 ELISPOT 검정을 보여주는 그래프. (B) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의한 예방접종 2달 후에 비장에서 IFNγ, IL-2 및 TNFα를 생성하는 다기능 CD4 T 세포의 빈도를 보여주는 그래프. (C) 및 (D) BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의한 백신 접종 2달 후에 C57BL/6 마우스에서 비장(C) 및 폐(D)에서 조절 T 세포의 빈도를 보여주는 그래프. (E) 점 도면은 CFSE 표지 Thy1.2+ P25TCR-Tg 비장세포가 주사되고 BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG로 감염된 대표적인 Thy1.1+ B6.PL 마우스를 보여준다. (F) (E)에 기재된 세포에 대한 비분할 세포(%)를 보여주는 그래프.
도 9: αGalCer이 BCG로 통합된 백신 접종(Incorp)은 별개 투여(Sep = 상이한 부위에서 별개로 투여되는 BCG-OVA 및 αGalCer) 또는 혼합(Mix = 주사 직전 동일 주사기에서 함께 혼합된 BCG-OVA 및 αGalCer) 투여와 비교하여 마이코박테리아 항원에 대한 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다. (A) 및 (B) BCG-OVA(마우스당 5×106개 BCG-OVA), 0.1 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Sep), 0.1 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Mix), 4 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Sep), 4 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Mix) 및 αGalCer/BCG(Incorp)에 의한 피내 주사에 의한 예방접종 이후의 마우스(풀 형성된 비장 및 서혜 림프절 세포)에서 17일에 SIINFEKL(서열 번호 1)(A) 또는 TB10.4 MHC 클래스 I(H-2Kb) 제한 에피토프 QIMYNYPAM(서열 번호 3)(B)에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정으로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프.
도 10: αGalCer이 BCG로 통합된 백신 접종(Incorp)은 별개 투여(Sep = Sep = 상이한 부위에서 별개로 투여되는 BCG-OVA 및 αGalCer) 또는 혼합(Mix = 주사 직전 동일 주사기에서 함께 혼합된 BCG-OVA 및 αGalCer) 투여와 비교하여 마이코박테리아 항원에 대한 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다. (A) 및 (B) BCG-OVA(마우스당 5×106개 BCG-OVA), 0.1 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Sep), 0.1 ㎍ αGalCer + BCG-OVA(Mix) 및 αGalCer/BCG-OVA(Incorp)에 의한 예방접종 이후의 마우스에서 TB10.4 MHC 클래스 I(H-2Kb) 제한 에피토프 QIMYNYPAM(서열 번호 3)(A) 또는 SIINFEKL(서열 번호 1)(B)에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정으로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프.
도 11: iNKT 세포 활성화 당지질은 CD8 T 세포 프라이밍의 최적 증강을 얻기 위해 살아 있는 마이코박테리아로 직접 통합된다. αGalCer 또는 α-C-GalCer이 BCG로 통합된 백신 접종(Inc)은 별개 부위(Sep)에서 주사되는 비변형(BCG), 비변형 BCG + 당지질(표시된 αGalCer 또는 α-C-GalCer) 0.1 ㎍ 또는 동일 부위에 주사되고 주사 직전 당지질(표시된 αGalCer 또는 α-C-GalCer)과 혼합된 비변형 BCG 0.1 ㎍에 의한 백신 접종과 비교하여 마이코박테리아 항원에 대한 CD8 T 세포 반응을 상당히 증강시킨다. 예방접종 3주 후에 마우스로부터 얻은 비장 세포 현탁액에서 마이코박테리아 항원 TB10.4 MHC 클래스 I(H-2Kb) 제한 에피토프 QIMYNYPAM(서열 번호 3)의 MHC 클래스 I 제시 펩티드에 특이적인 IFNγ 생성 CD8 T 세포에 대한 ELISPOT 검정의 결과를 보여주는 그래프, *** p < 0.01(ANOVA).
본 발명은 박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질을 포함하는 변형 박테리아로서, 세라미드 유사 당지질이 박테리아 세포와 물리적으로 결합된 변형 박테리아에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 글리코실세라미드 또는 α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체를 포함한다.
일 실시양태에서, 글리코실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅰ을 포함한다:
화학식 Ⅰ
Figure 112017074270754-pat00001
[상기 식 중,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이고, 여기서 (ⅰ) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, (ⅱ) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이고;
R4는 α 결합 또는 β 결합 모노사카라이드이거나, R1이 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸일 때, R4는
Figure 112017074270754-pat00002
이고,
A는 O 또는 -CH2이다].
일 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅱ를 포함한다:
화학식 Ⅱ
Figure 112017074270754-pat00003
[상기 식 중,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이다].
일 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅲ을 포함한다:
화학식 Ⅲ
Figure 112017074270754-pat00004
[상기 식 중,
R은 H 또는 -C(O)R1이고, 여기서 R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이고, 여기서 (ⅰ) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, (ⅱ) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하거나; R1은 -(CH2)nR5이고, 여기서 n은 0∼5 범위의 정수이고, R5는 -C(O)OC2H5, 임의로 치환된 C5-C15 사이클로알칸, 임의로 치환된 방향족 고리 또는 아랄킬이고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이다].
일 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 박테리아 세포의 세포벽으로 통합된다. 추가의 실시양태에서, 박테리아 세포는 마이코박테리아 세포, 리스테리아 세포, 살모넬라(Salmonella) 세포, 예르시니아(Yersinia) 세포, 프란시셀라(Francisella) 세포 및 레지오넬라(Legionella) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 박테리아 세포는 살아 있거나, 죽거나, 약독화된다.
일 실시양태에서, 변형 박테리아는 항원에 대한 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다. 추가의 실시양태에서, 항원은 마이코박테리아 항원이다.
일 실시양태에서, 변형 박테리아는 이종 항원을 발현한다. 추가의 실시양태에서, 이종 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원 또는 종양 특이적 항원이다. 다른 실시양태에서, 이종 항원은 면역원성 펩티드이다.
일 실시양태에서, 박테리아 세포는 재조합 박테리아 세포이다.
또한, 본 발명은 변형 박테리아 및 약학적 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 약학적 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 면역보강제를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 백신 조성물이다.
또한, 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 동물에게 변형 박테리아를 투여하는 것을 포함하는 동물에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 질환의 진행을 변경하기에 충분한 양으로 변형 박테리아를 투여한다. 다른 실시양태에서, 동물에서 질환에 대한 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 변형 박테리아를 투여한다.
일 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질과 결합되지 않은 박테리아 세포에 의해 생성되는 면역 반응에 비해 면역 반응은 증강 또는 변형된다. 일 실시양태에서, 상기 질환은 바이러스 질환, 박테리아 질환, 진균 질환, 기생충 질환 및 증식성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 상기 질환은 결핵, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환, 선 페스트, 폐 페스트, 야토병, 레지오렐라병(Legionairre's disease), 탄저병, 장티푸스, 파라티푸스, 식품 매개 질환, 리스테리아증, 말라리아, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인플루엔자, 간염(HAV, HBV 및 HCV) 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 동물에게 변형 박테리아를 투여하는 것을 포함하는 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 동물에서 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 증강시키거나, 자연 살해 T(NKT) 세포의 활성을 증강시키기에 충분한 양으로 변형 박테리아를 투여한다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 항체 반응을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 CD8 T 세포 반응을 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 CD8 T 세포 반응 및 항체 반응을 포함한다.
또한, 본 발명은 동물에게 유효량의 변형 박테리아를 투여하는 것을 포함하는 동물에서 BCG에 대한 CD8 T 세포 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 변형 박테리아를 근육내, 정맥내, 기관내, 비강내, 경피, 피내, 피하, 안내, 질내, 직장내, 복강내, 장내, 흡입 또는 상기 경로 중 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여한다.
또한, 본 발명은 변형 박테리아를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 변형 박테리아를 동결건조시킨다. 추가의 실시양태에서, 키트는 변형 박테리아를 투여하기 위한 수단을 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 마이코박테리아 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 세라미드 유사 당지질이 상기 마이코박테리아 세포의 세포벽에 통합되는 조건 하에 세라미드 유사 당지질을 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 (a) 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체를 분리하는 단계 및 (b) 약학적 담체를 (a)의 분리된 복합체에 첨가하는 단계를 포함하는 항원에 대한 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 양태 및 다른 양태를 하기에 추가로 자세히 기재하였다.
본 발명은 면역 반응을 증강, 즉, 야기, 자극 또는 증가시키는 데 유용한 조성물, 분리된 세포, 백신 및 방법을 제공한다. 마이코박테리아 세포벽과 같은 박테리아 세포벽으로 안정하게 통합된 세라미드 유사 당지질과 같은 박테리아 세포와 물리적으로 결합된 세라미드 유사 당지질을 포함하는 변형 박테리아가 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체는 CD1d 제한 자연 살해 T("NKT") 세포의 활성에 영향을 미쳐 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 백신 조성물과 같은 본 발명의 조성물은 M. 보비스 바실 칼멧-게랭(BCG)의 세포벽에 통합된 α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체를 포함한다. 본원에 기재된 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체는 마이코박테리아 항원에 대한 면역 반응과 같은 원하는 면역 반응을 자극하는 데 유용하다. 면역 반응은 인간에서 TB를 야기하는 마이코박테리아 튜버쿨로시스와 같은 마이코박테리아와 같은 박테리아 병원균에 의해 야기되는 질환을 예방, 치료 또는 경감시키는 데 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이점은 박테리아, 예를 들면 살아 있는 약독화된 박테리아에 의해 감염된 동일한 세포에 직접적으로 세라미드 유사 당지질 면역보강제를 전달하여, 훨씬 더 적은 용량이 사용되도록 허용하는 방식으로 면역보강제의 초점을 맞추는 것을 포함한다. 이에 의해 국소 및 전신 독성이 감소하고 제조 비용이 절감된다. 또한, 특히 전달 및 저장 문제가 있는 제3 세계에서의 인간을 표적으로 하는 백신에 대해 물리적 결합, 예를 들면 직접 통합은 실질적인 이점을 갖는다. 동결건조되고 이후 용시제조되는 세라미드 유사 당지질과 물리적으로 결합된, 예를 들면 직접 통합된 박테리아는 면역보강제 활성이 온전히 회수되도록 허용해야 한다. 따라서, 동결건조 백신을 투여 분야에서 재수화하고 현탁시켜야 한다.
정의
단수 용어는 그 용어의 하나 이상을 의미하는 것에 유의하고; 예를 들면 "벡터"는 하나 이상의 벡터를 나타내는 것으로 이해된다. 그러므로, 단수 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환되어 사용될 수 있다.
하기 더 자세히 기재된 바대로, 본 발명은 박테리아 세포와 물리적으로 결합된, 예를 들면 마이코박테리아 세포벽과 같은 박테리아 세포벽에 통합된 당지질, 통상적으로 세라미드 유사 당지질, 예를 들면 α-갈락토실세라미드(본원에서 α-GalCer이라고도 칭함) 또는 이의 유사체, 예컨대 α-C-GalCer을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 비공유 상호작용을 통해 물리적으로 결합된다. 본원에서 칭해지는 "세라미드 유사 당지질"은 α 결합 갈락토스 또는 글루코스를 갖는 당지질을 포함한다. 세라미드 유사 당지질의 예는 본원에 기재되어 있고 또한, 예를 들면 미국 공개 특허 출원 제2006/0052316호(Porelli), 미국 공개 특허 출원 제2006/0211856호(Tsuji), 미국 공개 특허 출원 제2006/0116331호(Jiang), 미국 공개 특허 출원 제2006/0074235호(Hirokazu 등), 미국 공개 특허 출원 제2005/0192248호(Tsuji 등), 미국 특허 출원 제2004/0127429호(Tsuji) 및 미국 특허 출원 제2003/0157135호(Tsuji 등)(이들 모두 그 전문이 참조문헌으로 본원에 포함됨)에서 확인할 수 있다.
백신
"백신"이란 용어는, 동물에게 투여될 때, 예를 들면 마이코박테리아 감염과 같은 감염에 대해 면역 반응을 자극하는 데 유용한 조성물을 의미한다. 본 발명은 살아 있고/있거나, 죽고/죽거나, 약독화될 수 있는 마이코박테리아 세포와 같은 박테리아 세포를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이고, 예를 들면 BCG는 살아 있는 약독화된 박테리아 백신이다. 살아 있는 박테리아 백신, 죽은 박테리아 백신 또는 약독화된 박테리아 백신과 같은 박테리아 백신이 당해 분야에 공지되어 있거나, 일상적인 실험을 이용하여 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 박테리아 백신은 또한 재조합 마이코박테리아와 같은 재조합 박테리아를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질을 병용 투여한다. 일 실시양태에서, 당지질이 박테리아 세포에 물리적으로 결합되도록 "변형된 당지질"과 같이 박테리아 세포는 변형되고, 예를 들면 세라미드 유사 당지질은 마이코박테리아 세포와 같은 박테리아 세포의 세포벽에 통합된다.
다른 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드와 같은 이종 항원의 전달을 위한 담체로서 본 발명의 당지질 변형 박테리아 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 당지질 변형 박테리아 세포, 예를 들면 다른 병원균으로부터 얻은 항원(예를 들면, 박테리아(예를 들면, 살모넬라, 리스테리아, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis) 및 쉬겔라(Shigella) 항원), 진균, 기생충(예를 들면, 플라스모듐(Plasmodium)으로부터 얻은 말라리아 항원)) 또는 바이러스 항원(예를 들면, HIV, SIV, HPV, RSV, 인플루엔자 또는 간염(HAV, HBV 및 HCV)으로부터 얻은 바이러스 항원) 또는 종양 특이적 항원의 전달을 위한 담체로서 세라미드 유사 당지질이 세포벽으로 통합된 재조합 박테리아 세포를 사용할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 변형 박테리아는 α-GalCer이 안정하게 비공유로 통합된 M. 보비스 바실 칼멧-게랭(BCG) 세포와 같은 변형된 마이코박테리아 세포를 포함한다. BCG는 살아 있는 약독화된 박테리아 백신이다. 파스퇴르 연구소의 알버트 칼멧 및 카미유 게랭은 M. 튜버쿨로시스와 밀접하게 관련된 마이코박테리아 보비스에 관련된 마이코박테리아를 약독화시켜, 마이코박테리아 보비스 바실루스 칼멧-게랭(BCG)을 13년 동안 배양 배지 중에 배양하고, 이 기간 동안 동물에서 이의 독력 감소를 모니터링하여 이것을 생성하였다. BCG는 모든 백신 중 가장 널리 사용되는 것 중 하나가 되었고, 저렴하고, 안정하다. 그러나, BCG 백신은 개발도상국에서 TB 확산에 대해 제한된 효과를 갖는다. Doherty T and Anderson P, Clinical Microbio Reviews 18(4):687-702 (2005). 다른 실시양태에서, 마이코박테리아 세포는 질환을 야기함이 없이 포유동물에게 투여될 수 있는 마이코박테리아의 다른 비병원균 균주인 M. 스메그마티스 세포이다.
변형된 마이코박테리아 세포 이외에, 본 발명의 다른 변형 박테리아로는 바실루스 종(예를 들면, 탄저병을 유발하는 바실루스 안트라시스), 살모넬라 종(예를 들면, 장티푸스, 파라티푸스, 식품 매개 질환 유발), 스타필로코커스 종, 스트렙토코커스 종, 리스테리아 종(예를 들면, 리스테리아증 유발), 쉬겔라 종, 예르시니아 종(예를 들면, 선 페스트 및 폐 페스트 유발), 프란시셀라 종(예를 들면, 야토병 유발) 및 레지오넬라 종(예를 들면, 리저넬라병 유발)으로부터 유도되는 당지질 변형 박테리아를 들 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 "항원"이란 용어 및 "항원성"이란 관련 용어는 항체 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 "면역원"이란 용어 및 "면역원성"이란 관련 용어는 포유동물과 같은 동물에서 항체 및/또는 세포 면역 반응을 비롯한 면역 반응을 유발하는 능력에 관한 것이다. 면역원은 또한 항원이겠지만, "항원"은 이의 크기 또는 배열로 인해, 반드시 "면역원"은 아닐 것이다. "면역원성 조성물"은 피험체에서 그 "면역원성 조성물" 내 함유된 하나 이상 항원을 특이적으로 인식하는 항체와 같은 면역 반응을 유발한다.
"면역 반응"이란 용어는 항원 또는 면역원에 대한 반응에서 면역계 세포의 활성을 포함하도록 의도된다. 이러한 활성으로는 항체 생성, 세포독성, 림프구 증식, 사이토카인 배출, 염증, 식균작용, 항원 제시 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특이적 항체 생성 또는 특이적 T 림프구 생성과 같은 소정의 항원 또는 면역원에 고도로 특이적인 면역 반응을 "후천성 면역 반응"이라 칭한다. NK 및 NKT 세포에 의한 사이토카인 배출과 같은 소정의 항원에 특이지 않은 면역 반응을 본원에서 "선천성 면역 반응"이라 칭한다. 면역 반응의 예로 항체 반응 또는 세포 반응, 예를 들면 세포독성 T 세포 반응을 들 수 있다.
"보호성 면역 반응" 또는 "치료학적 면역 반응"이란 용어는 질환 증상, 부작용 또는 진행을 일부 방식으로는 예방 또는 적어도 부분적으로는 저지하는 면역원에 대한 면역 반응을 의미한다. "보호성"이란 질환에 걸리지 않은 피험체 동물에서 면역 반응이 유발된다는 것을 의미하고, 이때 면역 반응은, 동물이 후에 M. 튜버쿨로시스에의 노출과 같이 질환에 걸리거나 이에 감수성인 경우, 그 질환 증상을 경감, 완화, 조절 또는, 일부 경우에 완전히 예방한다. "치료학적"이란 결핵을 앓는 인간과 같이 질환을 앓는 피험체 동물에서 면역 반응이 유발된다는 것을 의미하고, 이때 면역 반응은 질환 증상을 경감, 완화, 조절 또는 일부 경우에 완전히 제거한다.
"면역 반응 조절"이란 용어는 그 조성물 또는 치료가 없는 면역 반응에 비해 소정의 면역 반응이 조성물 또는 치료에 의해 증가, 감소 또는 변경되는 임의의 방식을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 면역보강제를 사용하여 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 것은 그 면역 반응의 조절인 것으로 생각된다. 자가면역의 예방과 같은 면역 반응의 감소도 또한 조절이다. 또한, 면역 반응, 예를 들면 1차 TH2 반응으로부터 1차 TH1 반응으로의 변경은 면역 반응의 조절이다. 본 발명은 세라미드 유사 당지질이 마이코박테리아 세포벽과 같은 세포벽에 통합된 박테리아 세포와 같은 변형 박테리아를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하여 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
"면역보강제"란 용어는 (1) 특정한 항원에 대한 면역 반응을 변경 또는 증가시키는 능력 또는 (2) 약리 제제의 효과를 증가 또는 보조하는 능력을 갖는 물질을 의미한다. 특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은, 예를 들면 세라미드 유사 당지질이 BCG 세포벽으로 통합될 때 박테리아 세포, 예를 들면 BCG와 동시 투여시 면역보강제로서 작용한다. 다른 실시양태에서, 제2 면역보강제가 포함된다. 다른 적합한 면역보강제로는 LPS 유도체(예를 들면, 모노포스포릴 지질 A(MPL)), TLR9 효능제(예를 들면, CPG ODNS), TLR7/8 효능제(예를 들면, 이미퀴모드), 사이토카인 및 성장 인자 박테리아 성분(예를 들면, 내독소, 특히 초항원, 외독소 및 세포벽 성분); 알루미늄계 염; 칼슘계 염; 실리카; 폴리뉴클레오티드; 톡소이드; 혈청 단백질, 바이러스 및 바이러스 유래 물질, 독, 독액, 이미다조퀴닐린 화합물, 폴록사머 및 양이온성 지질을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
매우 다양한 물질이 다양한 메커니즘을 통해 면역보강제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 면역원의 발현, 항원성 또는 면역원성을 증가시킬 수 있는 임의의 화합물이 잠재적 면역보강제이다. 본 발명의 다른 잠재적 면역보강제로는 당지질; 케모카인; 사이토카인 및 케모카인의 생성을 유도하는 화합물; 인터페론; 불활성 담체, 예컨대 백반, 벤토나이트, 라텍스 및 아크릴 입자; 플루로닉 블록 중합체, 예컨대 TiterMax®(블록 공중합체 CRL-8941, 스쿠알렌(대사성 오일) 및 마이크로미립자 실리카 안정화제); 데포 형성제, 예컨대 프로인트 면역보강제; 계면 활성 물질, 예컨대 사포닌, 리소레시틴, 레티날, Quil A, 리포솜 및 플루로닉 중합체 제제; 대식세포 자극물질, 예컨대 박테리아 리포폴리사카라이드; 대체 경로 보체 활성물질, 예컨대 인슐린, 지모산, 내독소 및 레바미솔; 비이온성 계면활성제; 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌) 트리-블록 공중합체; mLT; MF59™; SAF; 리비(Ribi)™ 면역보강제 시스템; 트레할로스 디미콜레이트(TDM); 세포벽 골격(CWS); 데톡스(Detox)™; QS21; 스티물론(Stimulon)™; 완전 프로인트 면역보강제; 불완전 프로인트 면역보강제; 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF); 종양 괴사 인자(TNF); 3-O-탈아실화 MPL; CpG 올리고뉴클레오티드; 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 1종 이상의 면역보강제의 조합을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 면역보강제는 사이토카인이다. 본 발명의 조성물은 1종 이상의 사이토카인, 케모카인, 또는 사이토카인 및 케모카인의 생성을 유발하는 화합물을 포함할 수 있다. 예로는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 에리쓰로포이에틴(EPO), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 18(IL-18), 인터페론 알파(IFNα), 인터페론 베타(IFNβ), 인터페론 감마(IFNγ), 인터페론 오메가(IFNω), 인터페론 타우(IFNτ), 인터페론 감마 유발 인자 I(IGIF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), RANTES(regulated upon activation, normal T cell expressed and presumably secreted), 대식세포 염증성 단백질(예를 들면, MIP-1 알파 및 MIP-1 베타), 리슈마니아 신장 개시 인자(LEIF) 및 Flt-3 리간드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 다른 성분, 예를 들면 면역학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 더 포함한다. 예를 들면, 면역학적 활성을 갖는 단백질은 공동 자극 분자, 예컨대 톨양 수용체("TLR"), B7.1 또는 B7.2이다. "B7"은 유전적으로 B7.1 또는 B7.2 중 하나를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 공동 자극 분자, 예를 들면 T 세포 및 NK 세포 상에 CD28과 상호작용하는 B7-1(CD80) 또는 B7-2(CD86)의 세포외 도메인을 본 발명에서 사용하기 위한 가용성 CD1d 복합체의 구조로 통합되는 β2-마이크로글로불린에 대한 아미노 말단 융합으로서 투여할 수 있다. 예를 들면, 1999년 12월 16일자에 공개된 WO 제9964597호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물과 함께 B7 신호전달 분자와 같은 공동 자극 분자를 통합하면 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체에 의해 NKT 세포의 활성화가 더 효과적이고 연장된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 추가의 면역보강제 성분, 예를 들면 상기 기재된 면역보강제 중 어느 하나, 예컨대 LPS 유도체(예를 들면, MPL), TLR9 효능제(예를 들면, CPG ODNS), TLR7/8 효능제(예를 들면, 이미퀴모드), 사이토카인 및 성장 인자; 박테리아 성분(예를 들면, 내독소, 특히 초항원, 외독소 및 세포벽 성분); 알루미늄계 염; 칼슘계 염; 실리카; 폴리뉴클레오티드; 톡소이드; 혈청 단백질, 바이러스 및 바이러스 유래 물질, 독, 독액, 이미다조퀴닐린 화합물, 폴록사머, 양이온성 지질 및 톨양 수용체(TLR) 효능제를 더 포함한다. 효과적일 수 있는 TLR 효능제 면역보강제의 예로는 N-아세틸무라밀-1-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리사카라이드(LPS), 유전 변형 및/또는 분해된 LPS, 백반, 글루칸, 콜로니 자극 인자(예를 들면, EPO, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, PEG화 G-CSF, SCF, IL-3, IL6, PIXY 321), 인터페론(예를 들면, γ-인터페론, α-인터페론), 인터류킨(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18), 사포닌(예를 들면, QS21), 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL), 탈메틸화 CpG 서열, 1-메틸 트리토판, 아르기나제 억제제, 사이클로포스파미드, 면역억제 작용을 차단하는 항체(예를 들면, 항CTLA4 항체), 지질(예컨대, 팔미트산 잔기), 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인 리세릴-세린(P3 CSS) 및 프로인트 면역보강제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 조성물은 면역 세포 활성화를 조절하는 림포카인 또는 사이토카인, 예컨대 형질전환 성장 인자(TGF, 예를 들면 TGFα 및 TGFβ); α 인터페론(예를 들면, IFNα); β 인터페론(예를 들면, IFNβ); γ 인터페론(예를 들면, IFNγ) 또는 림프구 작용 관련 단백질, 예컨대 LFA-1 또는 LFA-3; 또는 세포간 접착 분자, 예컨대 ICAM-1 또는 ICAM-2를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역원성 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 당지질 변형 재조합 박테리아 세포를 이종 항원 또는 면역원의 전달을 위한 담체로서 사용할 수 있다. 이종 항원 또는 면역원으로는 면역원성 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 본 발명의 당지질 변형 재조합 박테리아 세포에 의해 발현시킬 수 있고, 예를 들면 이종 병원균의 면역원성 폴리펩티드를 세라미드 유사 당지질이 마이코박테리아 세포벽으로 통합된 재조합 마이코박테리아 세포에 의해 발현시킬 수 있다.
"면역원성 폴리펩티드"는 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 예를 들면 에피토프 또는 에피토프의 조합을 갖는 폴리-아미노산 물질을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 면역원성 폴리펩티드는, 척추동물에 도입될 때, 척추동물의 면역계 분자와 반응하고/하거나(즉, 항원성), 척추동물에서 면역 반응을 유발하는(즉, 면역원성) 폴리펩티드이다. 면역원성 폴리펩티드는 또한 항원성이겠지만, 항원성 폴리펩티드는, 이의 크기 또는 배열로 인해, 반드시 면역원성은 아닐 수 있을 것이다. 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균과 같은 감염성 물질, 고양이 털, 식물, 먼지 및 다른 환경원과 같은 알레르겐으로부터 얻은 폴리펩티드, 및 몇몇 자가 폴리펩티드, 예를 들면 종양 관련 항원을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염성 질환을 예방 또는 치료, 예를 들면 이의 중증도를 치유, 경감, 감소시키거나, 또는 이 질환의 전염을 예방 또는 감소시키고, 또한 알레르기 및 증식성 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해 본 발명의 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
또한, 구강 및 인두(예를 들면, 혀, 입, 인두), 소화계(예를 들면, 식도, 위, 장, 결장, 직장, 항문, 항문관, 항문직장, 간, 담낭, 췌장), 호흡계(예를 들면, 후두, 폐), 골, 관절, 연조직(예컨대, 심장), 피부, 흑색종, 유방, 생식 기관(예를 들면, 자궁경부, 자궁내막, 난소, 외음부, 질, 전립선, 고환, 음경), 비뇨기계(예를 들면, 방광, 신장, 수뇨관 및 다른 비뇨 기관), 눈, 뇌, 내분비계(예를 들면, 갑상선 및 다른 내분비), 림프종(예를 들면, 호치킨병, 비호치킨성 림프종), 다발성 골수종, 백혈병(예를 들면, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병)의 암(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 암을 예방 또는 치료, 예를 들면 이의 중증도를 치유, 경감 또는 감소시키기 위해 본 발명의 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
바이러스 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 아데노바이러스 폴리펩티드, 알파바이러스 폴리펩티드, 칼리시바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 칼리시바이러스 캡시드 항원, 코로나바이러스 폴리펩티드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩티드, 에볼라 바이러스 폴리펩티드, 엔테로바이러스 폴리펩티드, 플라비바이러스 폴리펩티드, 간염 바이러스(AE) 폴리펩티드, 예를 들면 간염 B 코어 또는 표면 항원, 포진 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 단순 포진 바이러스 또는 바리셀라 조스터 바이러스 당단백질, 면역 결핍 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 인간 면역 결핍 바이러스 봉입체 또는 프로테아제, 감염성 복막염 바이러스 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 인플루엔자 A 혈구응집소, 뉴라미니다아제, 또는 핵단백질, 백혈병 바이러스 폴리펩티드, 마버그(Marburg) 바이러스 폴리펩티드, 오소믹소바이러스 폴리펩티드, 유두종 바이러스 폴리펩티드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 혈구응집소/뉴라미니다아제, 파라믹소바이러스 폴리펩티드, 파르보바이러스 폴리펩티드, 페스티바이러스 폴리펩티드, 피코르나 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, 폭스 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 관경병 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면 관경병 바이러스 당단백질 G, 레오바이러스 폴리펩티드, 레트로바이러스 폴리펩티드 및 로타바이러스 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
박테리아 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 악티노마이세스(Actinomyces) 폴리펩티드, 바실루스 폴리펩티드, 예를 들면 바실루스 안트라시스로부터 얻은 면역원성 폴리펩티드, 박테로이데스(Bacteroides) 폴리펩티드, 보르데텔라(Bordetella) 폴리펩티드, 바르토넬라(Bartonella) 폴리펩티드, 보렐리아(Borrelia) 폴리펩티드, 예를 들면 B. 부르그도르페리(B. burgdorferi) OspA, 브루셀라(Brucella) 폴리펩티드, 캄필로박터(Campylobacter) 폴리펩티드, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 폴리펩티드, 클라미디아(Chlamydia) 폴리펩티드, 클로스트리듐(Clostridium) 폴리펩티드, 코리네박테리움(Corynebacterium) 폴리펩티드, 콕시엘라(Coxiella) 폴리펩티드, 더마토필루스(Dermatophilus) 폴리펩티드, 엔테로코커스(Enterococcus) 폴리펩티드, 에를리히아(Ehrlichia) 폴리펩티드, 에스체리치아(Escherichia) 폴리펩티드, 프란시셀라 폴리펩티드, 푸소박테리움(Fusobacterium) 폴리펩티드, 헤모바르토넬라(Haemobartonella) 폴리펩티드, 헤모필루스(Haemophilus) 폴리펩티드, 예를 들면 H. 인플루엔자 b형 외부 막 단백질, 헬리코박터(Helicobacter) 폴리펩티드, 클레브시엘라(Klebsiella) 폴리펩티드, L형 박테리아 폴리펩티드, 렙토스피라(Leptospira) 폴리펩티드, 리스테리아 폴리펩티드, 마이코박테리아 폴리펩티드, 마이코플라스마(Mycoplasma) 폴리펩티드, 네세리아(Neisseria) 폴리펩티드, 네오리케치아(Neorickettsia) 폴리펩티드, 노카르디아(Nocardia) 폴리펩티드, 파스퇴렐라(Pasteurella) 폴리펩티드, 펩토코커스(Peptococcus) 폴리펩티드, 펩토스트렙토코커스 폴리펩티드, 뉴모코커스(Pneumococcus) 폴리펩티드, 프로테우스(Proteus) 폴리펩티드, 슈도모나스(Pseudomonas) 폴리펩티드, 리케치아(Rickettsia) 폴리펩티드, 로칼리마에아(Rochalimaea) 폴리펩티드, 살모넬라 폴리펩티드, 쉬겔라 폴리펩티드, 스타필로코커스 폴리펩티드, 스트렙토코커스 폴리펩티드, 예를 들면 S. 피오게네스(S. pyogenes) M 단백질, 트레포네마(Treponema) 폴리펩티드 및 예르시니아 폴리펩티드, 예를 들면 Y. 페스티(Y. pestis) F1 및 V 항원을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
기생충 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 발란티디움 콜라이(Balantidium coli) 폴리펩티드, 엔타모에바 히스토리티카(Entamoeba histolytica) 폴리펩티드, 파씨올라 헤파티카(Fasciola hepatica) 폴리펩티드, 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia) 폴리펩티드, 리슈마니아 폴리펩티드 및 플라스모듐 폴리펩티드(예를 들면, 플라스모듐 팔시파룸 폴리펩티드)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
진균 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 아스퍼질루스(Aspergillus) 폴리펩티드, 칸디다(Candida) 폴리펩티드, 콕시디오이데스 이미티스(Coccidiodes immitis) 또는 C. 포사다시(C. posadasii) 폴리펩티드, 크립토코커스(Cryptococcus) 폴리펩티드, 히스토플라스마(Histoplasma) 폴리펩티드, 뉴모시스티스(Pneumocystis) 폴리펩티드 및 파라콕시디오데스(Paracoccidiodes) 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
종양 관련 항원성 폴리펩티드 및 면역원성 폴리펩티드의 예로는 종양 특이적 면역글로불린 가변 구역, GM2, Tn, sTn, 톰슨-프리덴라이히 항원(TF), Globo H, Le(y), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, 발암배아성 항원, 인간 융모성 고나도트로핀의 베타 쇄(hCG 베타), C35, HER2/neu, CD20, PSMA, EGFRvIII, KSA, PSA, PSCA, GP100, MAGE 1, MAGE 2, TRP 1, TRP 2, 티로시나제, MART-1, PAP, CEA, B연령, MAGE, RAGE 및 관련 단백질을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 다른 치료제를 더 포함할 수 있다. 치료제의 예로는 대사 길항 물질, 알킬화제, 안스라싸이클린, 항생제 및 항유사분열제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대사 길항 물질로는 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진을 들 수 잇다. 알킬화제로는 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(Ⅱ)(DDP) 시스플라틴을 들 수 있다. 안스라싸이클린으로는 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신(본원에서 아드리아마이신이라고도 칭함)을 들 수 있다. 추가의 예로는 미토잔트론 및 비스안트렌을 들 수 있다. 항생제로는 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신 및 안스라마이신(AMC)을 들 수 있다. 항유사분열제로는 빈크리스틴 및 빈블라스틴(통상 빈카 알카로이드라 칭함)을 들 수 있다. 다른 세포독성 물질로는 프로카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론을 들 수 있다. 세포독성 물질의 추가의 예로는 리신, 독소루비신, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에토포사이드, 테노포사이드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온, 1-데하이드로테스토스테론 및 글루코코르티코이드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 치료제의 유사체 및 동족체는 본 발명에 포함된다.
박테리아 세포
본 발명의 변형 박테리아는 박테리아 세포의 본래 형태로부터 유래할 수 있거나 재조합 박테리아 세포일 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 박테리아 세포는 또한 비변형되고 별개의 세라미드 유사 당지질 항원과 제제화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 세라미드 유사 당지질은 박테리아 세포와 물리적으로 결합되고, 예를 들면 박테리아 세포벽에 통합되고, 예를 들면 박테리아에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 면역보강제로서 사용된다.
박테리아를 그람 양성 또는 그람 음성으로서 기재할 수 있다. Beveridge TJ, Biotech Histochem 76(3): 111-118 (2001); Gram HC, Fortschritte der Medizin 2: 185-189 (1884). 그람 양성 박테리아는 그람 염색에 의해 다크 블루 또는 바이올렛 염색된 것이다. 그람 양성 박테리아는 일반적으로 이의 세포벽 구조 펩티도글리칸 및 폴리사카라이드 및/또는 테이코산의 일부를 갖는 것을 특징으로 한다. 때때로 무레인으로도 불리는 펩티도글리칸은 짧은 펩티드를 통해 상호 연결된 글리칸 스트랜드의 헤테로중합체이다. 그람 음성 박테리아는 일반적으로 2개의 막에 의해 둘러싸인다. 외부 막은 리포폴리사카라이드(LPS) 및 포린을 포함하고, 투과 장벽으로서 작용한다. 마이코박테리아는 효과적인 장벽으로서 작용하는 두꺼운 미콜레이트 농후 외부 외피를 생성한다. 마이코박테리아는 항산성 염색시키고 그람 양성 박테리아와 계통 발생적으로 관련된다.
질환 또는 증상을 야기할 수 있고, 본 발명의 변형 박테리아 또는 조성물 또는 백신 조성물에 의해 치료, 예방 및/또는 진단될 수 있는 박테리아 또는 진균 물질로는 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 및 박테리아 패밀리 및 진균: 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노마이세스(Actinomycetes)(예를 들면, 코리네박테리움, 마이코박테리움, 노카르디아(Norcardia)), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus Neoformans), 아스퍼질루스, 바실라세아(Bacillaceae)(예를 들면, 바실루스 안트라시스), 박테로이다세아(Bacteroidaceae), 블라스토마이세스(Blastomyces), 보르데텔라, 브루셀라, 칸디디아(Candidia), 캄필로박터, 클로스트리듐, 콕시디오이데스, 코리네박테리움, 크립토코커스, 데르마토피테스(Dermatophytes), 엔테로박테리아세아(E. 콜라이(예를 들면, 장독소원성 E. 콜라이 및 장출혈성 E. 콜라이) 클레브시엘라, 살모넬라(예를 들면, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및 살모넬라 파라티피(Salmonella paratyphi)), 세라티아(Serratia), 쉬겔라, 예르시니아 등), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 프란시셀라, 헬리코박터, 레지오넬라세아, 스피로카에타세아(Spirochaetaceae)(예를 들면, 보렐리아(예를 들면, 보렐리아 부르그도르페리)), 렙토스피라세아, 리스테리아, 마이코플라스마탈레스(Mycoplasmatales), 마이코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae), 비브리오나세아(Vibrionaceae)(예를 들면, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)), 네세리아세아(예를 들면, 네세리아 메닌지티디스(네세리아 메니지티디스(Neisseria meningitidis), 네세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)), 악티노바실루스(Actinobacillus), 헤모필루스(예를 들면, 헤모필루스 인플루엔자 B형), 파스퇴렐라, 슈도모나스, 리케치아세아, 클라미디아세아, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 스타필로코카세아(Staphylococcaceae)(예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코카세아(예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 그룹 B 스트렙토코커스)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이 박테리아 또는 진균 패밀리는 균혈증, 심내막염, 눈 감염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염(예를 들면, AIDS 관련 감염), 손톱주위염, 보철 관련 감염, 라이터병(Reiter's Disease), 기도 감염, 예컨대 백일해 또는 농흉, 패혈증, 라임병, 고양이 찰과상 질환(Cat-Scratch Disease), 이질, 파라티푸스, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 뇌수막염(예를 들면, A형 및 B형 뇌수막염), 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 파라튜버쿨로시스, 결핵(TB), 한센병, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 또는 파종성 질환, 낭창, 보툴리눔 식중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류머티스 열, 성홍열, 성 전염성 질환, 피부 질환(예를 들면, 봉와직염, 피부진균병), 중독증, 요로 감염 및 상처 감염(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 질환 또는 증상을 야기할 수 있다.
이러한 증상 또는 질환 중 임의의 증상 또는 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하기 위해 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 사용할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 결핵, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환, 선 페스트, 폐 페스트, 야토병, 레지오렐라병, 탄저병, 장티푸스, 파라티푸스, 식품 매개 질환, 리스테리아증, 말라리아, HIV, SIV, HPV, 인플루엔자, 간염(HAV, HBV 및 HCV) 및 암을 치료하기 위해 본 발명의 조성물을 사용한다.
마이코박테리아
마이코박테리아 속으로는 포유동물에서 예를 들면 결핵 및 나병을 비롯한 심각한 질환을 야기하는 것으로 알려진 병원균을 들 수 있다. 마이코박테리움(마이코박테리아라고도 칭함)는 내생포자 또는 캡슐을 포함하지 않고, 일반적으로 그람 양성인 것으로 생각된다. 막 지질에서 발견되는 일반적인 지방산 이외에, 마이코박테리아는 광범위한 매우 긴 쇄의 포화(C18-C32) 및 1불포화(C26 이하) n-지방산을 갖는다. α-알킬 β-하이드록시의 매우 긴 쇄의 지방산, 즉 미콜산의 존재는 마이코박테리아 및 관련 종의 특징이다. 마이코박테리아 미콜산은 큰 α-브랜치(C20-C25)를 갖는 큰 (C70-C90)이다. 주쇄는 1개 또는 2개의 이중 결합, 사이클로프로판 고리, 에폭시 기, 메톡시 기, 케토 기 또는 메틸 브랜치를 포함한다. 이 산은 아라비노갈락탄이라 불리는 주요 세포벽 폴리사카라이드의 말단 헥사아라비노푸라노실 단위에서 4개의 클러스터 중에 주로 에스테르화가 발생하는 세포벽의 주요 성분이다. 이것은 또한 트레할로스의 6 및 6' 위치에 에스테르화되어 '코드 팩터'를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 소량의 미콜레이트는 또한 배양 배지 중에 존재 하는 당에 따라 글리세롤 또는 트레할로스, 글루코스 및 프럭토스와 같은 당에 에스테르화하는 것으로 밝혀졌다. 마이코박테리아는 또한 광범위한 메틸-분지형 지방산을 포함한다. 이것은 10-메틸 C18 지방산(포스파티딜 이노시타이드 만노사이드에서 에스테르화하는 것으로 밝혀진 투베르쿨로스테아르산), 트레할로스 함유 리포올리고사카라이드에서 발견되는 2,4-디메틸 C14 산 및 모노-, 디- 및 트리메틸-분지형 C14 내지 C25 지방산, 트리메틸 불포화 C27 산(프티엔산), 테트라메틸-분지형 C28-C32 지방산(미코세로신산) 및 페놀 당지질 및 프티오세롤 에스테르에서 발견되는 더 짧은 동족체 및 설포리피드에서 발견되는 다발성 메틸-분지형 프티오-세란산, 예컨대 헤파메틸-분지형 C37 산 및 산화 다발성 메틸-분지형 산, 예컨대 17-하이드록시-2,4,6,8,10,12,14,16-옥타메틸 C40 산을 포함한다. 또한, 미코세로신산 및 다른 분지형 산은 프티세롤 및 페놀프티세롤 및 이의 유도체로 에스테르화된다. Kolattukudy et al., Mol. Microbio. 24(2):263-270 (1997). 증거로 Mtb 발병에서 특이적 세포 봉입체 지질을 보여준다. Rao, et al., J. Exp. Med., 201(4):535-543 (2005).
마이코박테리움 종으로는 M. 압세수스(M. abscessus); M. 아프리카눔; M. 아그리(M. agri); M. 아이키엔세(aichiense); M. 알베이(M. alvei); M. 아루펜세(M. arupense); M. 아시아티쿰(M. asiaticum); M. 아바그넨세(M. aubagnense); M. 아우룸; M. 오스트로아프리카눔; 마이코박테리아 아비움 복합체(MAC); M. 아비움; M. 아비움 파라튜버쿨로시스(인간에서의 크론씨병 및 양에서의 요네병과 연루됨); M. 아비움 실바티쿰(M. avium silvaticum); M. 아비움 "호미니수이스(M. avium hominissuis)"; M. 콜롬비엔세(M. colombiense); M. 보에니케이(M. boenickei); M. 보헤미쿰(M. bohemicum); M. 볼레티(M. bolletii); M. 보트니엔세(M. botniense); M. 보비스; M. 브란데리(M. branderi); M. 브리스바넨세(M. brisbanense); M. 브루마에(M. brumae); M. 카나리아센세(M. canariasense); M. 카프라(M. caprae); M. 셀라툼(M. celatum); M. 켈로나(M. chelonae); M. 키마에라(M. chimaera); M. 키타(M. chitae); M. 클로로페놀리쿰; M. 추부엔세(M. chubuense); M. 콘셉티오넨세(M. conceptionense); M. 콘플루엔티스(M. confluentis); M. 콘스피쿰(M. conspicuum); M. 쿡키(M. cookii); M. 코스메티쿰(M. cosmeticum); M. 디에른호페리(M. diernhoferi); M. 도리쿰(M. doricum); M. 두발리(M. duvalii); M. 엘레판티스(M. elephantis); M. 팔락스(M. fallax); M. 파르시노제네스(M. farcinogenes); M. 플라베센스(M. flavescens); M. 플로렌티눔(M. florentinum); M. 플루오로안테니노반스(M. fluoroanthenivorans); M. 포르투이툼(M. fortuitum); M. 포르투이툼 아종 아세트아미돌티쿰(M. fortuitum subsp . acetamidolyticum); M. 프레데릭스베르게네세(M. frederiksbergense); M. 가디움(M. gadium); M. 가스트리(M. gastri); M. 제나벤세(M. genavense); M. 길붐(M. gilvum); M. 굿디(M. goodii); M. 고르도나(M. gordonae); M. 헤모필룸(M. haemophilum); M. 하시아쿰(M. hassiacum); M. 헤커스호르넨세(M. heckeshornense); M. 헤이델베르겐세(M. heidelbergense); M. 히데르니아(M. hiberniae); M. 호들레리(M. hodleri); M. 홀사티쿰(M. holsaticum); M. 하우스토넨세(M. houstonense); M. 이뮤노제눔(M. immunogenum); M. 인터젝툼(M. interjectum); M. 인터메디움(M. intermedium); M. 인트라셀룰라레(M. intracellulare); M. 칸사시(M. kansasii); M. 코모센세(M. komossense); M. 쿠비카(M. kubicae); M. 쿠마모토넨세(M. kumamotonense); M. 라쿠스(M. lacus); M. 렌티플라붐(M. lentiflavum), M. 레프라(나병 야기); M. 레프라무리움(M. lepraemurium); M. 마다가스카리엔세(M. madagascariense); M. 마제리텐세(M. mageritense); M. 말모엔세(M. malmoense); M. 마리눔(M. marinum); M. 마실리엔세(M. massiliense); M. 마이크로티(M. microti); M. 모나센세(M. monacense); M. 몬테피오렌세(M. montefiorense); M. 모리오카엔세(M. moriokaense); M. 무코제니쿰(M. mucogenicum); M. 무랄레(M. murale); M. 네브라스켄세(M. nebraskense); M. 네오아우룸; M. 네워렌센세(M. neworleansense); M. 몬크로모제니쿰(M. nonchromogenicum); M. 노보카스트렌세(M. novocastrense); M. 오부엔세(M. obuense); M. 팔루스트레(M. palustre); M. 파라포르투이툼(M. parafortuitum); M. 파라스크로풀라세움(M. parascrofulaceum); M. 파르멘세(M. parmense); M. 페레그리눔(M. peregrinum); M. 플레이(M. phlei); M. 포카이쿰(M. phocaicum); M. 피니페디(M. pinnipedii); M. 포르시눔(M. porcinum); M. 포리페라(M. poriferae); M. 슈도슛시(M. pseudoshottsii); M. 풀베리스(M. pulveris); M. 사이코톨레란스(M. psychrotolerans); M. 피레니보란스(M. pyrenivorans); M. 로데시아(M. rhodesiae); M. 사스카췌와네세(M. saskatchewanense); M. 스크로풀라세움(M. scrofulaceum); M. 세네갈렌세(M. senegalense); M. 서울렌세(M. seoulense); M. 셉티쿰(M. septicum); M. 쉬모이데이(M. shimoidei); M. 슛시(M. shottsii); M. 시미아(M. simiae); M. 스메그마티스; M. 스파그니(M. sphagni); M. 스줄가이(M. szulgai); M. 테라(M. terrae); M. 테르모레시스티빌레(M. thermoresistibile); M. 토카이엔세(M. tokaiense); M. 트리플렉스(M. triplex); M. 트리비알레(M. triviale); 마이코박테리움 튜버쿨로시스 복합체(MTBC)(구성원이 인간 및 동물 결핵의 유발 물질임)(M. 튜버쿨로시스, 인간 결핵의 주원인; M. 보비스; M. 보비스 BCG; M. 아프리카눔; M. 카네티; M. 카프라; M. 핀니페디); M. 투시아(M. tusciae); M. 울세란스(M. ulcerans)("부루리(Buruli)" 또는 "베언즈데일(Bairnsdale), 궤양"을 야기함); M. 바카(M. vaccae); M. 반발레니(M. vanbaalenii); M. 울린스키(M. wolinskyi); 및 M. 제노피(M. xenopi)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
마이코박테리아를 진단 및 치료의 목적상 몇몇 군으로 분류할 수 있고, 예를 들면: M. 튜버쿨로시스 복합체(MTB)(결핵을 야기할 수 있음): M. 튜버쿨로시스, M. 아프리카눔, M. 보비스, M. 보비스 BCG, M. 카프라, M. 미크로티, M. 피니페디, 다시에 바실루스 및 M. 카네티(제안명)(Somoskovi, et al., J. Clinical Microbio 45(2):595-599 (2007)); M. 레프라(한센병 또는 나병을 야기); 비결핵성 마이코박테리아(NTM)는 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 또는 파종성 질환을 야기할 수 있는 모두 다른 마이코박테리아이다. MTB 구성원은 높은 정도의 유전적 등질성을 나타낸다. Somoskovi (2007). 본 발명의 마이코박테리아로는 재조합 마이코박테리아, 예를 들면 재조합 마이코박테리아 세포, 예를 들면 재조합 BCG 세포, 예를 들면 rBCG30 세포를 들 수 있다.
재조합 박테리아
본 발명의 변형 박테리아는 또한 재조합 박테리아 세포, 예를 들면 재조합 마이코박테리아 세포를 포함할 수 있다. 재조합 박테리아 세포의 비제한적인 예로 rBCG30를 들 수 있고, 이것은 BCG의 백신 균주로부터 유래하고 유전적으로 변형되어 면역우성 항원 Ag85B를 과발현한다. 문헌[Doherty and Anderson, Clinical Microbio Review 18(4): 687-702 (2005)] 참조. 본 발명의 당지질 변형 박테리아를 제조하기에 적합한 재조합 박테리아 세포의 다른 예로는 BCG-HIV; BCG-SIV; BCG-HCV; rBCG/IL-2 및 HIV 펩티드를 발현하는 재조합 M. 스메그마티스를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, 문헌[Aldovini and Young, Nature 351: 479-482 (1994); Yasutomi et al., J. of Immunol. 150(7):3101-3107 (1993); Uno-Furuta et al., Vaccine 21(23): 3149-3156 (2003); Matsumoto et al., J. Exp. Med. 188(5): 845-854 (1998); Yamada et al., J. of Urology 164(2): 526-531 (2000); Cayabyab et al., J. of Virology 80(4): 1645-1652 (2006); Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991)]; 미국 특허 제5,504,005호(Bloom 등) 참조).
일 실시양태에서, 변형 박테리아는 BCG-HIV와 같은 비천연 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 재조합 박테리아 세포를 포함하고, 재조합 박테리아 세포는 세라미드 유사 당지질과 물리적으로 결합된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 변형 박테리아를 포함하는 조성물 또는 백신 조성물로서, 박테리아 세포가 천연 또는 재조합인 조성물 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 이종 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 재조합(유전 조작된) 변형 박테리아, 예를 들면 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체에 관한 것이다. DNA를 박테리아 게놈에 통합하거나 표준 유전자 조작 기법을 이용하여 염색체 외로 존재할 있다. 관심 있는 DNA, 예를 들면 이종 항원 또는 면역원을 코딩하는 DNA를 박테리아, 예를 들면 마이코박테리아에 도입하기 위한 벡터를 사용하여 본 발명의 재조합 박테리아를 조작할 수 있다.
본원에서 사용되는 "벡터"란 용어는 결합되는 다른 핵산을 운송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 일 유형은 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 몇몇 벡터는 도입되는 숙주 세포(예를 들면, 복제의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 본 발명의 벡터는 작동적으로 결합된 폴리펩티드, 예를 들면 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 "발현 벡터"라 칭할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 이용되는 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 본 발명에서 예를 들면 재조합 박테리아, 예를 들면 당지질 변형 재조합 마이코박테리아로부터 면역원성 폴리펩티드의 발현에 유용할 수 있다. 이러한 핵산이 작동적으로 결합되는 벡터 및 발현 조절 서열의 선택은 원하는 기능 특성, 예를 들면 단백질 발현 및 형질전환하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라진다.
작동적으로 결합된 코딩 서열의 발현을 조절하는 데 유용한 발현 조절 성분은 당해 분야에 공지되어 있다. 예로는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 분비 신호 및 다른 조절 성분을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유도성 프로모터를 사용할 경우, 예를 들면 숙주 세포 배지의 영양 상태의 변화 또는 온도 변화에 의해 이것을 조절할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 구역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가의 코딩 구역과 결합될 수 있다.
일 실시양태에서, 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 박테리아 발현은, 예를 들면 플라스미드로부터(예를 들면, 에피솜에 의해) 염색체 외로 발생한다. 예를 들면, 관심 있는 유전자를 플라스미드로 클로닝하고 배양된 마이코박테리아 세포, 예를 들면 BCG 또는 M. 스메그마티스에 도입하고, 관심 있는 유전자는 관심 있는 폴리펩티드, 예를 들면 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다. 숙주 세포, 예를 들면 마이코박테리아 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래하는 조절 서열 및 리플리콘을 포함하는 플라스미드 벡터를 사용한다. 벡터는 복제 부위 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 보유할 수 있다.
본 발명의 벡터로는 원핵 리플리콘, 즉 박테리아 숙주 세포에서 염색체 외로 자가 복제 및 재조합 DNA 분자의 유지를 지시하는 능력을 갖는 DNA 서열을 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 이 리플리콘은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 또한, 원핵 리플리콘을 포함하는 벡터는 발현이 검출 가능한 마커, 예컨대 약물 내성을 부여하는 유전자를 또한 포함할 수 있다. 박테리아 약물 내성 유전자의 비제한적인 예로는 암피실린 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 것을 들 수 있다.
원핵 리플리콘을 포함하는 벡터로는 또한 박테리아 숙주 세포에서 코딩 유전자 서열의 발현을 지시하기 위한 원핵 또는 박테리오파지 프로모터를 들 수 있다. 박테리아 숙주와 상용성인 프로모터 서열은 통상적으로 발현하고자 하는 DNA 분절의 삽입에 편리한 제한 부위를 포함하는 플라스미드 벡터에 제공된다. 원핵 숙주 세포, 예를 들면 마이코박테리아 숙주 세포에서 발현에 사용할 수 있는 프로모터의 예로는 열 쇽 프로모터, 스트레스 단백질 프로모터, pMTB30 프로모터, B-락타마제(페니실리나제) 프로모터, 락토스 프로모터, 카나마이신 내성을 발현하는 프로모터, 클로람페니콜 내성을 발현하는 프로모터 및 시스 프로모터를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(또한 Sambrook 등 참조). 다양한 원핵 클로닝 벡터를 본 발명에서 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드 벡터의 예로는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(BioRad® Laboratories), pPL, pEMBL 및 pKK223(Pharmacia)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(또한 Sambrook 등 참조).
벡터 DNA를 종래 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 세포에 도입할 수 있다. 본원에서 사용되는 "형질전환" 및 "형질감염"이란 용어는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기영동을 비롯하여 외래 핵산(예를 들면, DNA)을 숙주 세포에 도입하기 위한 각종의 분야에서 인정되는 기법을 의미하도록 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기에 적합한 방법은 Sambrook 등의 문헌(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y., 1989) 및 다른 실험실 매뉴얼에서 확인할 수 있다. 숙주 세포, 예를 들면 박테리아 세포, 예컨대 마이코박테리아 세포 또는 당지질 변형 마이코박테리아 세포의 형질전환을 이용되는 벡터 및 숙주 세포에 적합한 종래 방법에 의해 수행할 수 있다. 원핵 숙주 세포, 예를 들면 마이코박테리아 세포의 형질전환을 위해, 전기영동 및 염 치료 방법 및 당해 분야에 공지된 다른 기법을 이용할 수 있다(Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972)).
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"란 용어는 단일의 "폴리펩티드" 및 복수의 "폴리펩티드들"을 포함하도록 의도되고 (펩티드 결합으로도 공지된) 아미드 결합에 의해 직선으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 의미한다. "폴리펩티드"란 용어는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 의미하고, 생성물의 구체적인 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 의미하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, "폴리펩티드"란 용어는 이러한 용어 중 어느 것 대신에 또는 이와 상호 교환하여 사용될 수 있다. "폴리펩티드"란 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 의미하도록 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래하거나 재조합 기법에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이것을 화학 합성에 의한 것을 비롯하여 임의의 방식으로 생성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산의 크기를 가질 수 있다.
"분리된 폴리펩티드" 또는 단편, 변이체 또는 이의 유도체에 의해 이의 자연 환경에 있지 않은 폴리펩티드가 의도된다. 특정한 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들면, 분리된 폴리펩티드를 이의 자연 또는 천연 환경으로부터 제거할 수 있다. 재조합으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질 또는 재조합 박테리아 백신의 성분은 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주되고, 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분별화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제되는 천연 또는 재조합 폴리펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드로서 상기 폴리펩티드 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 임의의 이들의 조합이 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드를 언급할 때 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"란 용어는 상응하는 천연 폴리펩티드의 생물학적, 항원성 또는 면역원성 특성의 적어도 몇몇 특성을 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"란 용어는 단수의 핵산 및 복수의 핵산을 포함하도록 의도되고, 분리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들면 메신저 RNA(mRNA), 바이러스 유도 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. "핵산"이란 용어는 폴리뉴클레오티드에 존재 하는 임의의 1개 이상의 핵산 분절, 예를 들면 DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"분리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 이의 자연 환경으로부터 제거되는 핵산 분자, DNA 또는 RNA가 의도된다. 예를 들면, 벡터에 함유된 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적상 분리로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예로는 이종 숙주 세포, 예를 들면 재조합 박테리아 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사 및 본원에 개시된 페스티바이러스 벡터의 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 추가로 합성으로 제조된 이러한 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 성분, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "이종 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종 핵산" 또는 "이종 유전자" 또는 "이종 서열" 또는 "외생 DNA 분절"은 특정한 숙주 세포에 대해 외래인 공급원으로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 DNA 분절 또는, 만일 동일한 공급원으로부터 유래하는 경우, 이의 원래 형태로부터 변형된 것을 의미한다. 숙주 세포 내 이종 유전자는 특정 숙주 세포에 내생이지만, 변형된 유전자를 포함한다. 따라서, 이 용어는 세포에 외래 또는 이종이거나, 성분이 보통 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에 위치에서를 제외하고 세포에 동종인 DNA 분절을 의미한다.
본원에서 사용되는 "코딩 구역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 부분이다. "중지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지 않더라도, 코딩 구역의 일부인 것으로 간주할 수 있지만, 존재 하는 경우, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 구역 등은 코딩 구역의 일부가 아니다. 본 발명의 2개 이상의 코딩 구역은, 예를 들면 단일 벡터 상에 단일 폴리뉴클레오티드 작제물에서 또는, 예를 들면 분리(상이한) 벡터 상에 분리 폴리뉴클레오티드 작제물에서 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 구역을 포함할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 구역을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 융합 또는 비융합의 2개 이상의 이종 코딩 구역을 코딩할 수 있다. 이종 코딩 구역은 특수 성분 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능 도메인을 제한함이 없이 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 통상 1개 이상의 코딩 구역과 작동적으로 결합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 성분을 포함할 수 있다. 작동성 결합은 유전자 생성물에 대한 코딩 구역일 때이고, 예를 들면 폴리펩티드는 유전자 생성물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 조절 하에 위치시키는 방식으로 1개 이상의 조절 서열과 결합된다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 코딩 구역 및 이와 결합된 프로모터)는, 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 코딩하는 mRNA를 전사시키는 경우 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력과 상호작용하지 않거나, DNA 주형이 전사되는 능력과 상호작용하지 않는 경우, "작동적으로 결합"된다. 따라서, 프로모터 구역은, 프로모터가 그 핵산의 전사를 수행할 수 있을 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동적으로 결합할 것이다. 프로모터는 소정의 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에, 예를 들면 인핸서, 작동자, 전사 억제 인자 및 전사 종결 신호와 같은 다른 전사 조절 성분은 세포 특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합될 수 있다.
"기준 아미노산 서열"이란 임의의 아미노산 치환의 도입 없이 특정 서열을 의미한다. 당업자라면, 치환이 존재 하지 않는 경우, 본 발명의 "분리된 폴리펩티드"가 기준 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 다양한 변형, 예컨대 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 폴리펩티드에서 치환될 수 있는 아미노산의 예로는 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트리토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트리토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 들 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 기준 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리펩티드의 상응하는 단편은 또한 상보적이다.
당해 분야에서 공지된 바대로, 2개의 폴리펩티드 사이의 "서열 동일성"은 1개의 폴리펩티드에 대한 제2 폴리펩티드의 서열의 아미노산 서열을 비교하여 결정한다. 본원에 기재된 바대로, BESTFIT 프로그램(위스콘신 서열 분석 팩키지, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group[미국 53711 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브 유니버시티 리서치 파크])과 같은 당해 분야에서 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 임의의 특정한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지를 결정할 수 있다. BESTFIT는 스미스와 워터만의 지역 상동성 알고리즘[Advances in Applied Mathematic 2:482-489 (1981)]을 이용하여 2개의 서열 사이의 상동성의 최고의 분절을 찾는다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과, 예를 들면 95% 동일한지를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 동일성의 백분율을 기준 폴리펩티드 서열의 전체 완전 길이에 대해 계산하고 기준 서열에서 아미노산의 전체 수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.
세라미드 유사 당지질 항원
본 발명에서 유용한 세라미드 유사 당지질 항원은, 예를 들면 세라미드 유사 당지질을 박테리아 세포의 세포벽으로 통합하여 박테리아 세포와 제시될 때, 동물에서 면역 반응을 조절할 수 있는 세라미드 유사 당지질을 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 항원은 외래 항원 또는 자기 항원으로부터 유래할 수 있다. 추가로, 세라미드 유사 당지질 항원은 합성일 수 있다. 적합한 항원은, 예를 들면 미국 공개 특허 출원 제2006/0052316호(Porcelli), 미국 공개 특허 출원 제2006/0211856호(Tsuji), 미국 공개 특허 출원 제2006/0116331호(Jiang), 미국 공개 특허 출원 제2006/0074235호(Hirokazu 등), 미국 공개 특허 출원 제2005/0192248호(Tsuji 등), 미국 특허 출원 제2004/0127429호(Tsuji) 및 미국 특허 출원 제2003/0157135호(Tsuji 등)에 개시되어 있고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 α-GalCer 또는 이의 유사체이다. 다른 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 α-C-GalCer 또는 이의 유사체이다.
본원에서 사용되는 "임의로 치환된"이란 용어는 비치환되거나, 할로겐(F, Cl, Br, I), 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴 또는 알콕시를 비롯한 1개 이상의 치환기로 치환된다는 것을 의미한다.
본원에서 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 "알킬"란 용어는 통상적으로 1개 내지 18개의 탄소 또는 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 이러한 일 실시양태에서, 알킬은 메틸이다. 알킬 기의 비제한적인 예로는 에틸, n-프로필, 이소프로필 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "치환 알킬"이란 용어는 1개 이상의 할로겐(F, Cl, Br, I) 치환기를 갖는 상기 정의된 알킬을 의미한다.
본원에서 사용되는 "이종원자 고리"란 용어는 4개 이하의 이종 원자를 포함하는 포화 또는 불포화의 비방향족 또는 방향족인 3원 내지 10원 단환식 또는 이환식 이종 환식 고리를 의미한다. 각각의 이종 원자는 독립적으로 질소(4급화될 수 있음); 산소; 및 황(설폭사이드 및 설폰 포함)으로부터 선택된다. 이종원자 고리는 질소, 황 또는 탄소 원자를 통해 연결될 수 있다. 대표적인 이종원자 고리로는 피리딜, 푸릴, 티오페닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 타아졸릴, 티아디아졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 이소타아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 히단토인일, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 퀴놀리닐, -이소퀴놀리닐, -크로모닐, -쿠마리닐, -인돌릴, -인돌리지닐, -벤조[b]푸라닐, -벤조[b]티오페닐, -인다졸릴, -푸리닐, -4H-퀴놀리지닐, -이소퀴놀릴, -퀴놀릴, -프탈라지닐, -나프티리디닐, -카르바졸릴 등을 들 수 있다. 이종원자 고리란 용어는 또한 헤테로아릴을 포함한다.
본원에서 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 "아릴"이란 용어는 통상적으로 페닐, 1-나프틸 등과 같은 6개 내지 14개의 탄소 원자(즉, C6-C14 아릴)를 갖는 단환식 및 이환식 방향족 고리계를 의미한다.
본원에서 사용되는 "치환 아릴"이란 용어는 할로겐(F, Cl, Br, I) 또는 알콕시를 비롯한 1개 이상의 치환기를 갖는 상기 정의된 아릴을 의미한다.
본원에서 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 "아랄킬"이란 용어는 1개 이상의 아릴 치환기를 갖는 상기 정의된 알킬을 의미한다. 아랄킬 기의 비제한적인 예로는 벤질, 페닐에틸, 디페닐메틸 등을 들 수 있다.
본원에서 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 "알콕시"란 용어는 말단 산화 원자에 연결된 알킬을 의미한다. 알콕시 기의 비제한적인 예로는 메톡시, 에톡시 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "알칸"이란 용어는 직쇄 또는 분지쇄 비사이클릭 포화 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 알칸으로는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 들 수 있다. 대표적인 분지쇄 알칸으로는 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, -네오펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-메틸헥실, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 1,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,2-디메틸헥실, 1,3-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 1,2-디메틸헵틸, 1,3-디메틸헵틸 및 3,3-디메틸헵틸을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "알켄"이란 용어는 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알켄으로는 -비닐, -알릴l, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3 -디메틸-2-부테닐, -1-헥세닐, -2-헥세닐, -3-헥세닐, -1-헵테닐, -2-헵테닐, -3-헵테닐, -1 -옥테닐, -2-옥테닐, -3-옥테닐, -1 -노네닐, -2-노네닐, -3-노네닐, -1-데세닐, -2-데세닐, -3-데세닐 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 "사이클로알칸"이란 용어는 3개 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 포화 환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 사이클로알칸으로는 사이클로프로필, 사이클로펜틸 등을 들 수 있다.
본원에서 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 "알킬사이클로알켄"이란 용어는 상기 정의된 사이클로알칸에 부착된 상기 정의된 알킬을 의미한다.
본원에서 사용되는 "사이클로알켄"이란 용어는 고리계에서 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 5개 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 단환식 비방향족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 사이클로알켄으로는 -사이클로펜테닐, -사이클로펜타디에닐, -사이클로헥세닐, -사이클로헥사디에닐, -사이클로헵테닐, -사이클로헵타디에닐, -사이클로헵타트리에닐, -사이클로옥테닐, -사이클로옥타디에닐, -사이클로옥타트리에닐, -사이클로옥타테트라에닐, -사이클로노네닐 -사이클로노나디에닐, -사이클로데세닐, -사이클로데카디에닐 등을 들 수 있다. "사이클로알켄"이란 용어는 또한 비사이클로알켄 및 트리사이클로알켄을 포함한다. 본원에서 사용되는 "비사이클로알켄"이란 용어는 고리 중 하나에서 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 8개 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 이환식 탄화수소 고리계를 의미한다. 대표적인 비사이클로알켄으로는 -인데닐, -펜탈레닐, -나프탈레닐, -아줄레닐, -헵탈레닐, -1,2,7,8-테트라하이드로나프탈레닐 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 "트리사이클로알켄"이란 용어는 고리 중 하나에서 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합 및 8개 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 삼환식 탄화수소 고리계를 의미한다. 대표적인 트리사이클로알켄으로는 -안트라세닐, -페난트레닐, -페날레닐 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 "방향족 고리"란 용어는 단환식, 이환식 및 삼환식 고리계를 비롯한 5원 내지 14원 방향족 탄소환식 고리를 의미한다. 대표적인 방향족 고리는 페닐, 나프틸, 안트릴 및 페난트릴이다.
본원에서 사용되는 "옥소"라는 구문은 산소에 대한 이중 결합, 즉 C=O를 의미한다.
본원에서 사용되는 "모노사카라이드"란 용어는 탄수화물에 대한 빌딩 블록으로서 작용하는 임의의 단순 당을 의미한다. 모노사카라이드의 예로는 글루코스, 푸코스, 갈락토스 및 만노스를 들 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 다른 세라미드 유사 당지질은 표 1에서의 세라미드 유사 당지질 항원을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
Figure 112017074270754-pat00005
Figure 112017074270754-pat00006
본 발명의 변형 박테리아에서, 세라미드 유사 당지질 항원은 박테리아 세포와 "물리적으로 결합"되어 "변형 박테리아를 생성한다". "물리적으로 결합"이란 당업자에게 공지된 표준 방법에 의한 마이코박테리아 세포벽과 같은 박테리아 세포벽의 지질 풍부 표면 또는 혈장 막에 세라미드 유사 당지질의 개재와 같은 박테리아 세포와 직접 상호작용을 의미한다. 특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 비공유 수단을 통해 박테리아 세포벽과 물리적으로 결합한다. 예를 들면, 세라미드 유사 당지질의 존재 하에 배양된 박테리아 세포는 세라미드 유사 당지질을 이의 세포벽에 통합시킨다. 본 발명의 일 양태에서, 비공유 상호작용을 통해 박테리아 세포에 물리적으로 결합된 세라미드 유사 당지질은 박테리아 세포벽으로부터 추출 가능하게 잔류하고, 세라미드 유사 당지질은 추출 후에 이의 화학 구조 및 생물학적 활성을 보유한다. 세포벽에 물리적으로 결합된 세라미드 유사 당지질의 검출을 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 세라미드 유사 당지질 항원을 박테리아 세포벽에 안정하게 결합시킴으로써, 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체를 제조할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 항원 제시 세포에 대한 당지질 변형 마이코박테리아 세포의 제시와 같은 세라미드 유사 당지질 항원 및 박테리아 세포의 동시 투여를 허용한다. 특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 마이코박테리아 세포벽으로 통합된다. 박테리아 세포, 예를 들면 마이코박테리아 세포는 죽고/죽거나, 살아 있고/있거나 약독화된 박테리아 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 박테리아 세포는 재조합일 수 있다.
본 발명의 변형 박테리아는 단일 세라미드 유사 당지질 항원을 포함할 수 있거나, 세라미드 유사 당지질 항원의 불균일한 혼합물을 포함할 수 있다. 즉, 박테리아 세포의 집단은 단일 세라미드 유사 당지질 항원과 물리적으로 결합될 수 있거나, 세라미드 유사 당지질 항원의 혼합물과 물리적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 변형 박테리아, 예를 들면 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체 또는 이를 포함하는 조성물 또는 백신 조성물을 직접 검출 가능하도록 표지할 수 있거나, 예를 들면 검출 또는 진단 목적을 위해 상기 화합물에 특이적으로 결합하는 2차 표지 면역시약과 조합하여 사용할 수 있다. 관심 있는 라벨로는 염료, 효소, 화학발광자, 입자, 방사선 동위원소 또는 다른 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 물질을 들 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물의 구성성분 중 하나에 지시되는 표지 항체와 같은 2단계 라벨을 사용할 수 있다.
적합한 효소 라벨의 예로는 말레이트 탈수소효소, 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 탈수소효소, 알파-글리세롤 포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
적합한 방사선 동위원소 라벨의 예로는 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등을 들 수 있다. 적합한 비방사선활성 동위원소 라벨의 예로는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe를 들 수 있다.
적합한 형광 라벨의 예로는 152Eu 라벨, 플루오레세인 라벨, 이소티오시아네이트 라벨, 로다민 라벨, 피코에리트린 라벨, 피코시아닌 라벨, 알로피코시아닌 라벨, o-프탈알데하이드 라벨 및 플루오레사민 라벨을 들 수 있다.
화학발광 라벨의 예로는 루미날 라벨, 이소루미날 라벨, 방향족 아크리디늄 에스테르 라벨, 이미다졸 라벨, 아크리디늄염 라벨, 옥살레이트 에스테르 라벨, 루시페린 라벨, 루시퍼라제 라벨 및 에쿼린 라벨을 들 수 있다.
핵 자기 공명 조영제의 예로는 Gd, Mn 및 Fe와 같은 중금속 핵을 들 수 있다.
상기 기재된 라벨을 본 발명의 세라미드 유사 당지질 또는 폴리펩티드에 결합시키기 위한 통상적인 기법은 문헌[Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976); Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977)]에 제공된다. 상기 뒤의 문헌에 언급된 커플링 기법은 글루타르알데하이드 방법, 페리오데이트 방법, 디말레이미드 방법, m-말레이미도벤질-N-하이드록시-숙신이미드 에스테르 방법이고, 이들 방법 모두는 본원에 참조문헌으로 포함된다.
특정 실시양태에서, 세라미드 유사 당지질은 글리코실세라미드 또는 이의 유사체 또는 α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 글리코실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅰ을 포함한다:
화학식 Ⅰ
Figure 112017074270754-pat00007
[상기 식 중,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이고, 여기서 (ⅰ) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, (ⅱ) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이고;
R4는 α 결합 또는 β 결합 모노사카라이드이거나, R1이 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸일 때, R4는
Figure 112017074270754-pat00008
이고,
A는 O 또는 -CH2이다].
다른 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅱ를 포함한다:
화학식 Ⅱ
Figure 112017074270754-pat00009
[상기 식 중,
R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이다].
다른 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 하기 화학식 Ⅲ을 포함한다:
화학식 Ⅲ
Figure 112017074270754-pat00010
[상기 식 중,
R은 H 또는 -C(O)R1이고, 여기서 R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; R1은 -C(OH)-R3이고, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이고, 여기서 (ⅰ) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, (ⅱ) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하거나; R1은 -(CH2)nR5이고, 여기서 n은 0∼5 범위의 정수이고, R5는 -C(O)OC2H5, 임의로 치환된 C5-C15 사이클로알칸, 임의로 치환된 방향족 고리 또는 아랄킬이고;
R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
(b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
(c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
(d) -CH=CH(CH2)xCH3,
(e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
중 하나이고, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이다].
추가의 실시양태에서, R1은
Figure 112017074270754-pat00011
Figure 112017074270754-pat00012
Figure 112017074270754-pat00013
Figure 112017074270754-pat00014
Figure 112017074270754-pat00015
Figure 112017074270754-pat00016
Figure 112017074270754-pat00017
Figure 112017074270754-pat00018
Figure 112017074270754-pat00019
Figure 112017074270754-pat00020
Figure 112017074270754-pat00021
및
Figure 112017074270754-pat00022
(여기서, ( )는 화학식 Ⅲ의 화합물에 대한 R1의 부착점을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(KRN7000) 또는 (2S,3S)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3-옥타데칸디올)을 포함한다.
다른 실시양태에서, α-갈락토실세라미드 또는 이의 유사체는 (2S,3S,4R)-1-CH2-(α-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(α-C-GalCer)을 포함한다.
세라미드 유사 당지질의 다른 비제한적인 예는 미국 특허 제7,273,852호(Tsuji 등); 미국 특허 제6,531,453호(Taniguchi 등); 및 미국 특허 제5,936,076호(Higa 등)에 기재되어 있고, 이들 모두 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함된다.
자연 살해 T(NKT) 세포
천연 면역계는 외래 병원균에 대해 매우 공격적인 보호성 면역 반응 사이의 복합한 균형을 공격하고 정상 조직에 대해 내성을 유지할 필요가 있다. 근년에, 많은 상이한 세포 유형 중에서 상호작용이 이러한 균형을 유지하는 데 공헌한다는 인식이 증가하고 있다. 이러한 상호작용은, 예를 들면 TH1 유형 T 세포에 의한 전염증성 사이토카인(예를 들면, 인터페론-감마) 생성 또는 TH1 활성을 억제하는 TH2 유형 T 세포에 의한 인터류킨-4(IL-4) 생성과의 양극화 반응을 발생시킬 수 있다. 다수의 상이한 동물 모델에서, TH1에 대한 T 세포 양극화는 종양 또는 감염성 병원균에 대한 보호 면역력을 선호하는 것으로 보이지만, TH2에 대한 T 세포 양극화는 세포 매개 자가 면역 질환의 발생을 예방하는 데 있어서 중요한 인자일 수 있다. 면역 자극이 공격적인 세포 매개 면역력 또는 이러한 반응의 하향 조절을 발생시키는지를 결정하는 조건은 각각의 조직이 상이한 면역 반응을 선호하도록 상호작용하는 림프구 계통 및 항원 제시 세포(APC)의 독특한 세트로 이루어진다는 점에서 매우 국한된다. 예를 들면, 최적 조건 하에, 정상 조직에 국한된 수지상 세포(DC)가 관용원성 상호작용을 선호하고 세포 매개 자가면역에 대한 장벽을 제공하는 성숙의 단계 및 계통을 주로 나타내지만, 종양 또는 감염 부위는 강력한 세포 매개 면역 반응을 자극하는 성숙 골수성 수지상 세포를 공격한다.
CD1d 제한 NKT 세포는 국소 환경에서 면역 자극의 결과를 결정짓는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 비통상적인 T 세포의 독특한 종류이다. 이것은 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 계통 둘 다의 마커의 NKT 세포 발현의 더 많은 종류를 공유한다. 그러므로, NKT 세포는 선천성 면역 유사 NK 세포의 일부로서 간주되고 인간에서 정상 개체에서 그 빈도가 전체 T 림프구의 2.0% 높을 수 있다(Gumperz et al., J Exp Med 195:625 (2002); Lee et al., J Exp Med 195:637 (2002)).
CD1d 제한 NKT 세포는 단일형 MHC Ib급 분자인 CD1d에 의해 제시되는 당지질 항원 및 지질에 대한 그 특이성에 의해 다른 NKT 세포로부터 구별된다(Kawano et al., Science 278:1626-1629 (1997)). CD1d은 β2-마이크로글로불린와 결합한 비MHC 코딩 분자이고, 구조적으로 전형적인 MHC 클래스 I 분자와 관련된다. CD1d는 지질 꼬리의 탄화수소 쇄 또는 소수성 펩티드와 결합하기 위해 특수화된 소수성 항원 결합 포켓을 갖는다. Zeng et al., Science 277: 339-345, (1997). CD1d는 해면 동물 유래 α-글리코실화 스핑고지질, α-갈락토실세라미드(α-GalCer) 및 관련 분자, 예컨대 세라미드 유사 당지질 항원을 만노스가 아닌 α 결합 갈락토스 또는 글루코스와 결합시키는 것으로 알려져 있다. Kawano et al., Science 278:1626-1629 (1997); Zeng et al., Science 277: 339-345 (1997). 본원에 기재된 바대로, α-GalCer 또는 항원 제시 세포의 CD1d에 결합한 관련 분자에 의한 자극에 의해 CD1d 제한 NKT 세포를 활성화시키는 능력은 이러한 비통상적인 T 세포 부분집합의 기능 분석을 매우 촉진한다. 염증의 부재 하에, CD1d 제한 NKT 세포는 갑상선, 간 및 골수와 같은 특정 조직에서 우선적으로 국지화되는 것으로 보이고(Wilson et al., Trends Mol Med 8:225 (2002)), NKT 세포의 항암 활성은 주로 마우스 간 전이에서 조사되었다.
NKT 세포는 TH1 및 TH2 사이토카인 둘 다를 분비하는 특이한 능력 및 강력한 세포독성을 갖고 조절 작용은 염증, 자가면역 및 종양 면역력에서 입증되었다(Bendelac et al., Science 268:863 (1995); Chen and Paul, J Immunol 159:2240 (1997); Exley et al., J Exp Med 186:109 (1997)).
CD1d 제한 NKT 세포 중에서 고도로 보존된 αβT 세포 수용체(TCR)를 발현하는 "iNKT 세포"라 본원에서 칭하는 부분집합이 있다. 인간에서 이러한 비변이 TCR은 Vβ11과 결합된 Vα24Jα15로 구성되지만, 마우스에서 수용체는 고도로 상동성인 Vα14Jα18 및 Vβ8.2를 포함한다. 다른 CD1d 제한 NKT 세포는 더 가변적인 TCR을 발현한다. CD1d 제한 T 세포의 TCR 비변이체 및 TCR 변이체 종류 둘 다 α-GalCer로 로딩된 CD1d-4합체의 결합에 의해 검출할 수 있다(Benlagha et al., J Exp Med 191:1895-1903 (2000); Matsuda et al., J Exp Med 192:741-754 (2000); Karadimitris et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3294-3298 (2001)). CD1d 제한 NKT 세포는, 본 출원에서 정의된 바대로(CD1d 제한 NKT), 비변이체 또는 변이체 TCR 중 어느 하나를 발현하고 α-GalCer 또는 관련 세라미드 유사 당지질 항원 중 어느 하나로 로딩된 CD1d에 의해 결합하거나 활성화되는 세포를 포함한다. CD1d 제한 NKT 세포는, 본 출원에서 정의된 바대로(CD1d-NKT), 비변이체 또는 변이체 TCR 중 어느 하나를 발현하고 α-GalCer 또는 관련 스핑고지질(짧아진 장쇄 스핑고신 염기(C5 대 C14) 및 아실 쇄(C24 대 C26)를 가져 α-GalCer과는 다른 OCH와 같은 분자를 포함하는 α 결합 갈락토스 또는 글루코스를 가짐) 중 어느 하나로 로딩된 CD1d에 의해 결합하거나 활성화되는 세포를 포함한다(Miyamoto et al., Nature 413:531-4 (2001)).
CD1d 제한 NKT는 CD1d를 발현하는 표적에 대해 직접적인 세포독성 활성을 갖는 것으로 보인다. 그러나, 면역 반응에 대한 CD1d 제한 NKT의 효과는 직접 상호작용 또는, 아마도 훨씬 더 중요하게는, DC와의 상호작용을 통한 간접 동원 중 어느 하나에 의한 다른 림프구의 동원을 통해 증폭될 것이다. CD1d 제한 NKT는 면역 반응 초기에 다량의 IL-4 및 IFNγ를 분비하는 독특한 능력을 갖는다. IFNγ의 분비는 인터류킨-12(IL-12)을 생성하는 DC의 활성화를 유도한다. IL-12는 NKT 세포에 의한 IFNγ 분비를 추가로 자극하고 또한 더 많은 IFNγ를 분비하는 NK 세포의 활성화를 발생시킨다.
CD1d 제한 NKT가 IL-4 및 IFNγ 둘 다를 다량 신속히 분비시킬 수 있으므로, 면역 반응의 양극화는 전염증성 IFNγ 또는 항염증성 IL-4 사이토카인의 효과가 우세한지에 따라 달라진다. 이는 부분적으로 CD1d 제한 NKT의 여러 부분집합의 상대 빈도의 함수인 것으로 보고되고 있다. 이 부분집합은 (ⅰ) CD4 및 CD8 둘 다에 음성이고 전염증성 IFNγ 및 TNF-α의 분비를 비롯한 TH1 유형 반응을 주로 발생시키는 비변이체 CD1d 제한 NKT 집단 및 (ⅱ) CD4+이고 항염증성 Th2-유형 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 분비를 비롯한 TH1 유형 및 TH2 유형 반응 둘 다를 발생시키는 CD1d 제한 NKT의 별개의 집단을 포함한다(Lee et al., J Exp Med 195:637-41 (2002); Gumperz et al., J Exp Med 195:625-36 (2002)). 또한, NKT 세포 활성은 CD1d에 결합된 특정한 세라미드 유사 당지질에 따라 별도로 조절된다(예를 들면, US 특허 출원 공보 제2006/0052316호 참조). CD1d 제한 NKT 부분집합의 활성화에 영향을 미치는 국소 인자는 사이토카인 환경 및, 중요하게는, 그 환경에 동원된 DC를 포함한다.
세라미드 유사 당지질의 패밀리(즉, α-갈락토실세라미드(α-GalCer) 및 관련 α-글리코실 세라미드)는 쥐과 NKT 세포에 의한 강한 CD1d 제한 반응을 자극하는 것으로 보인다(Kawano et al., 1997). 이 화합물은 α-아노머 6탄당(갈락토스 또는 글루코스는 NKT 세포 인식에 활성임)을 포함하여, 이들을 β-아노머 당만을 포함하는 포유동물 조직에서 통상 나타나는 세라미드로부터 구별시킨다. 이 화합물이 원래 분리되고 종양 보유 마우스에서 주입될 때 면역 활성화의 결과로서 α-GalCer이 극적인 종양 거부를 유도한다는 것을 보여줄 때 면역학자에게 중요해지는 공급원인 해면 동물에서 이 화합물이 자연적으로 존재 하는 것으로 공지되어 있다(Kobayashi et al., Oncol. Res. 7:529-534 (1995)). 이후, 이 활성은 CD1d 의존 메커니즘을 통해 NKT 세포를 신속히 활성화하는 α-GalCer의 능력과 연결된다. α-GalCer이 CD1d에 결합하여, NKT 세포의 TCR에 대해 측정 가능한 친화도를 갖는 분자 복합체를 발생시키는 것으로 밝혀졌다(Naidenko et al., J Exp. Med. 190:1069-1080 (1999); Matsuda et al., J Exp. Med. 192:741 (2000); Benlagha et al., J Exp. Med. 191:1895-1903 (2000)). 따라서, α-GalCer은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 대부분의 NKT 세포의 활성화를 가능하게 할 수 있는 강력한 물질을 제공한다.
문헌에서 KRN7000이라 불리는 α-GalCer을 활성화하는 가장 광범위하게 연구되는 NKT는 설치류에서 이의 항암 활성에 기초하여 해면 동물로부터 원래 분리된 α-GalCer의 천연 형태와 유사한 구조를 갖는 합성 분자이다(Kawano et al., Science 278:1626-1629 (1997); Kobayashi et al., 1995; Iijima et al., Bioorg. Med. Chem. 6:1905-1910 (1998); Inoue et al., Exp. Hematol. 25:935-944 (1997); Kobayashi et al., Bioorg. Med. Chem. 4:615-619 (1996a) 및 Biol. Pharm. Bull. 19:350-353 (1996b); Uchimura et al., Bioorg. Med. Chem. 5:2245-2249 (1997a); Uchimura et al., Bioorg. Med. Chem. 5:1447-1452 (1997b); Motoki et al., Biol. Pharm. Bull. 19:952-955 (1996a); Nakagawa et al., Oncol. Re. 10:561-568 (1998); Yamaguchi et al., Oncol. Re. 8:399-407 (1996)). 절두형 스핑고신 염기를 갖는 KRN7000의 하나의 합성 유사체는 실험 알레르기 뇌척수염(EAE)의 마우스 모델에서 자가면역을 억제하는 증강된 능력을 나타냈다(Miyamoyo et al., Nature 413:531-534 (2001)). α-GalCer 스핑고신 염기가 변형된 다른 변이체가 미국 특허 제5,936,076호에서 동종되었다.
1997년 11월로부터 현재에 이르는 여러 문헌이 KRN7000가 포유동물의 면역계를 활성화하는 메커니즘을 연구하였다(Kawano et al., Science 278:1626-1629 (1997); Benlagha et al., J Exp. Med. 191:1895-1903 (2000); Burdin et al., Eur. J Immunol. 29:2014-2025 (1999); Crowe et al., J. Immunol. 171:4020-4027 (2003); Naidenko et al., J Exp. Med. 190:1069-1080 (1999); Sidobre et al., J. Immunol. 169:1340-1348 (2002); Godfrey et al., Immunol. Today 21:573-583 (2000); Smyth and Godfrey, Nat. Immunol. 1:459-460 (2000)). 이 연구는 균일하게 KRN7000의 효과에 대한 근위 메커니즘은 대부분의 조혈 세포 및 몇몇 상피 및 다른 세포 계통에서 발현되는 CD1d 단백질에 대한 이 화합물의 결합이라는 것을 보여준다. CD1d에 대한 KRN7000의 결합은 자연 살해 T 세포(NKT 세포)라 불리는 T 림프구의 부분집합의 T 세포 항원 수용체(TCR)에 의해 높은 친화도로 인식되는 분자 복합체를 생성시킨다. KRN7000/CD1d 복합체의 인식은 간, 비장 및 다른 림프성 기관에 잔류하고 가능하게는 임의의 조직에 정체 가능성을 갖는 NKT 세포의 신속한 활성화를 발생시킨다. 활성화된 NKT 세포는 신속하게 광범위한 케모카인 및 다른 사이토카인을 분비하고, 또한 수지상 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 다른 세포 유형을 활성화하는 능력을 갖는다. KRN7000/CD1d 복합체에 의한 NKT 세포의 활성화에 후행하는 일련의 사건은 면역계에 많은 잠재적인 하향 효과를 갖는 것으로 보인다. 예를 들면, 특정 유형의 감염의 설정에서 이것은 감염에 대한 후천성 면역을 증강하고 치유를 촉진하는 면역보강제 효과를 발생시킬 수 있다. 또는, 특정 유형의 자가 면역 질환의 설정에서, KRN7000에 의한 NKT 세포의 활성화는 조직 파괴를 억제하고 질환을 경감시키는 방식으로 자가 면역 반응의 과정을 변경시킬 수 있다.
NKT 림프구의 기능은 불완전하게 해소된 채 남아 있지만, 각종 연구는 면역 반응의 조절에서 이 T 세포에 대한 중요한 역할을 지적한다. NKT 세포의 특징은 이의 α-βTCR을 통한 자극시 IL-4 및 IFNγ 둘 다의 다량 분량의 이의 신속한 생성이다(Exley et al., J. Exp. Med. 186:109 (1997). 사실, 아마도 면역 활성화 동안 IL-4의 초기 생성을 책임지는 주요 세포로서의 이의 확인은, 이것이 2형(Th2) T 세포 반응을 양극화하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제시한다. 이와 관련하여, NKT 세포가 마우스에서의 각종 상이한 병원균에 의한 감염의 결과를 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다는 것은 놀라운 것이 아니다.
다수의 간접 메커니즘은 CD1d 제한 NKT 세포의 보호 효과에 기여한다. 생체내 α-GalCer의 투여에 의한 NKT 세포의 활성화는 NK 세포의 동시 활성화를 발생시킨다(Eberl and MacDonald, Eur. J. Immunol. 30:985?92 (2000); Carnaud et al., J. Immunol. 163:4647-4650 (1999)). NKT 세포가 결핍된 마우스에서, α-GalCer은 NK 세포에 의한 세포독성 활성을 유발할 수 없다. NKT 세포는 또한 전형적인 MHC 클래스 I 제한 세포독성 T 세포의 유발을 증강시킨다(Nishimura et al., Int Immunol 12:987-94 (2000); Stober et al., J Immunol 170:2540-8 (2003)).
CD1d 제한 NKT 세포를 특이적으로 활성화하도록 이용될 수 있는 정의된 항원, 예를 들면 α-GalCer 및 관련 항원의 이용 가능성은 각종 면역 반응에서 이 비종래 T 세포의 역할을 검사할 수 있게 한다.
α-GalCer 투여는 쥐과 말라리아, 진균 및 간염 B 바이러스 감염에서의 보호 효과를 비롯하여 다수의 상이한 미생물 감염에 효과를 가진다. Kakimi et al., J Exp Med 192:921-930 (2000); Gonzalez-Aseguinolaza et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:8461-8466 (2000); Kawakami et al., Infect Immun 69:213-220 (2001). α-GalCer의 투여의 극적인 효과가 또한 종양 면역력의 동물 모델에서 관찰되었다. 예를 들면, α-GalCer에 의한 자극은 NKT 의존 방식에서 폐 및 간 전이를 억제한다(Smyth et al., Blood 99:1259 (2002)). 또한, α-GalCer은 1형 당뇨병 및 실험적인 자가 면역 뇌척수염(EAE, 다발성 경화증에 대한 널리 공지된 쥐과 모델 시스템)을 비롯한 특정한 자가 면역 질환에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 보인다. Hong S et al. Nat. Med. 7:1052?056 (2001); Miyamoto K. et al., Nature 413:531-534 (2001).
NKT 활성 검정
면역 반응을 조절하는 본 발명의 조성물의 능력을 시험관내 검정에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 검정에서 사용하기 위한 NKT 세포로는 포유동물, 예를 들면 인간 또는 설치류, 예컨대 마우스로부터 분리된 형질전환된 NKT 세포주 또는 NKT 세포를 들 수 있다. NKT 세포를 CD1d:α-GalCer 4합체에 결합하는 세포를 분류하여 포유동물로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Benlagha et al., J Exp Med 191:1895-1903 (2000); Matsuda et al., J Exp Med 192:741-754 (2000); Karadimitris et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3294-3298 (2001)] 참조. NKT 세포 및 항원 제시 세포를 동시 배양하고, 특정한 관심 있는 화합물 또는 조성물을 항원 제시 세포 또는 NKT 세포 중 어느 하나를 직접적으로 표적으로 하는 배양 배지에 첨가하고, IL-4 또는 IFNγ 생성을 측정하여 본 발명의 화합물 또는 조성물이 NKT 세포의 활성을 조절할 수 있는지를 결정하기 위한 적합한 검정을 수행한다. 비표적화 항체와 함께 본 발명의 화합물 또는 조성물의 부재 하에 또는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 존재 하에 세포의 동일한 동시 배양에 비해 IL-4 또는 IFNγ 생성의 상당한 증가 또는 감소는 NKT 세포의 자극 또는 억제를 나타낸다.
검정에서 이용된 NKT 세포를 증식에 적합한 조건 하에 항온처리한다. 예를 들면, NKT 세포 하이브리도마를 완전 배양 배지(10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 5×10-5 M 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640) 중에 약 37℃ 및 5% CO2에서 적합하게 항온처리한다. 화합물의 연속 희석액을 NKT 세포 배양 배지에 첨가할 수 있다. NKT 세포에 첨가되는 적합한 농도의 화합물은 통상적으로 10-12 내지 10-6 M 범위일 것이다. 약간 준최대 NKT 세포 활성화를 발생시키는 항원 용량 및 APC 수를 사용하여 본 발명의 화합물에 의한 NKT 세포 반응의 자극 또는 억제를 검출할 수 있다.
대안적으로, IL-4 또는 IFNγ와 같은 발현된 단백질의 측정보다도, NKT 세포 활성화의 조절은 당해 분야에서 인정되는 방사선 표지 기술에 의해 측정되는 항원 의존 T 세포 증식의 변화에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 표지된(예를 들면, 삼중수소화) 뉴클레오티드를 배양 배지를 검정하기 위해 도입할 수 있다. 이러한 표지 뉴클레오티드의 DNA로의 도입은 T 세포 증식의 측정치로서 작용한다. 이러한 검정은 성장에 항원 제시를 요하지 않는 NKT 세포, 예를 들면 NKT 세포 하이브리도마에 적합하지 않다. 본 발명의 화합물 또는 조성물과의 접촉 후의 T 세포 증식의 수준의 차이는 T 세포의 복합한 조절 활성을 나타낸다. 예를 들면, NKT 세포 증식의 감소는 상기 화합물 또는 조성물이 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. NKT 세포 증식의 증가는 상기 화합물 또는 조성물이 면역 반응을 자극할 수 있다는 것을 나타낸다.
추가로, 51Cr 배출 검정을 이용하여 세포독성 활성을 결정할 수 있다.
이러한 시험관내 검정을 이용하여 면역 반응을 적절하게 조절할 수 있는 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 조성물을 선택하고 확인할 수 있다. 상기 기재된 검정, 예를 들면 IL-4 또는 IFNγ 생성 또는 NKT 세포 증식의 측정을 이용하여 상기 화합물과의 접촉이 T 세포 활성화를 조절하는지를 결정할 수 있다.
또한, 또는 대안적으로, 동물, 예를 들면 마우스, 토끼, 비인간 영장류에서의 예방접종 공격 실험은 면역 반응을 적절하게 조절할 수 있고 인간에서의 결핵과 같은 박테리아 질환의 치료 및/또는 예방에 효과적일 수 있는 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 조성물을 확인하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 마우스를 BCG/αGalCer 또는 BCG/α-C-GalCer(예를 들면, 5×106 CFU/마우스)과 같은 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체로 백신 접종하고, 감염성 박테리아, 예를 들면 악성 균주 M. 튜버쿨로시스 H37Rv로 공격한다.
치료 방법
본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 사용하여 질환을 예방하고, 또한 바이러스 질환, 박테리아 질환, 진균 질환, 기생충 질환, 알레르기 질환 또는 증식성 질환, 예를 들면 암과 같은 질환을 치료학적으로 치료할 수 있다. 이미 질환을 앓고 있는 개체에서, 본 발명을 이용하여 동물의 면역계를 추가로 자극 또는 조절하여, 질환 또는 장애와 관련된 증상을 감소 또는 제거한다. 본원에 정의된 "치료"는 동물에서 소정의 질환 증상의 중증도를 예방, 경감, 지연 또는 감소시키고/시키거나, 질환에 이미 걸리고 따라서 치료를 필요로 하는 동물에서 특정 시간 기간에 걸쳐 질환의 악화를 발생시키지 않는 하나 이상의 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
"예방" 또는 "예방한다"란 용어는 동물이 차후 그 질환을 발생시킬 소인이 있는 경우 아직 질환에 걸리지 않은 동물에서 면역력을 생성하여, 질환 증상을 예방 또는 감소시키는 하나 이상의 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물의 사용을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법은 치료 방법 또는 예방 또는 방지 방법을 의미할 수 있다. 임의의 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물이 질환 물질에 전체 면역력을 제공하거나 또는 모든 질환 증상을 완전히 치유 또는 제거하는 것을 요하지 않는다.
본원에서 사용되는 "치료 및/또는 예방 면역력을 필요로 하는 동물"은 특정 질환 증상의 중증도를 치료, 즉 예방, 치유, 지연 또는 감소시키고/시키거나 특정 시간 기간에 걸쳐 질환의 악화를 발생시키지 않는 것이 요구되는 개체를 의미한다.
"유효량"은 단일 용량 또는 시리즈의 부분으로서 개체에 대한 투여가 치료 및/또는 예방에 효과적인 양이다. 그 양은, 예를 들면 이의 투여가 감염성 M. 튜버쿨로시스에 의한 공격 약 2주 후 결정되는 비치료 개체에 비해 M. 튜버쿨로시스와 관련된 질환 증상의 발생률 또는 중증도를 감소시킬 때 효과적이다. 그 양은 치료하고자 하는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료하고자 하는 개체의 분류군(예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 영장류 등), 개체의 면역계의 반응 능력, 원하는 보호 정도, 백신 제제, 의학 환경의 전문적 평가 및 다른 관련 인자에 따라 달라진다. 유효량은 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 해당하는 것으로 예상된다.
"척추동물"이란 용어는 단수의 "척추동물" 및 복수의 "척추동물들"을 포괄하는 것으로 의도되고, 포유동물 및 조류 및 어류, 파충류 및 양서류를 포함한다.
"포유동물"이란 용어는 단수의 "포유동물" 및 복수의 "포유동물들"을 포괄하는 것으로 의도되고, 인간; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이(예를 들면, 부엉이, 다람쥐, 꼬리 감는 원숭이, 붉은 털 원숭이, 아프리카 녹색 원숭이, 파타스 원숭이, 사이노몰거스 원숭이 및 긴 꼬리 원숭이), 오랑우탄, 개코 원숭이, 긴팔 원숭이 및 침팬지; 개과, 예컨대 개 및 늑대; 고양이과, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 말과, 예컨대 말, 당나귀 및 얼룩말, 식용 동물, 예컨대 소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 곰과, 예컨대 곰; 및 다른, 예컨대 토끼, 마우스, 흰담비, 바다표범, 고래를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, 포유동물은 인간 피험체, 식용 동물 또는 반려 동물일 수 있다.
"조류"란 용어는 단수의 "조류" 및 복수의 "조류들"을 포괄하는 것으로 의도되고, 돌아다니는 물새, 예컨대 오리, 거위, 제비갈매기, 슴새 및 갈매기; 및 가정용 조류, 예컨대 칠면조, 닭, 메추라기, 꿩, 거위 및 오리를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. "조류"란 용어는 또한 연작류 새, 예컨대 찌르레기 및 앵무새를 포괄한다.
본 발명은 그 질환을 앓거나 또는 그 질환에 걸리기 쉬운 동물에게 박테리아 세포, 예를 들면 마이코박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질 항원을 포함하는 조성물(여기서, 상기 세라미드 유사 당지질은 본원에 기재된 박테리아 세포의 세포벽으로 통합됨)을 투여하는 단계를 포함하는 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 동물에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 박테리아 세포를 다른 병원균 또는 종양 특이적 항원으로부터 항원의 전달을 위한 담체로서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 박테리아 세포, 예를 들면 마이코박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질을 포함하는 조성물(여기서, 상기 세라미드 유사 당지질은 본원에 기재된 박테리아 세포의 세포벽으로 통합됨)의 유효량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 조절하는 방법, 즉 자극 또는 억제하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 조성물, 예를 들면 박테리아, 예를 들면 변형 마이코박테리아, 예를 들면 세라미드 유사 당지질이 물리적으로 결합된, 예를 들면 그 세포벽으로 비공유 방식으로 통합된 BCG 세포를 상기 질환의 진행을 변경시키기에 충분한 양으로 질환을 앓는 동물에게 투여하여 질환을 앓는 동물에서 마이코박테리아 질환과 같은 질환을 치료하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 조성물, 예를 들면 박테리아, 예를 들면 변형 마이코박테리아, 예를 들면 세라미드 유사 당지질이 물리적으로 결합된, 예를 들면 그 세포벽으로 비공유 방식으로 통합된 BCG 세포를 세라미드 유사 당지질이 결핍된 비변형 박테리아 세포의 투여와 관련하여 박테리아에 의해 코딩된 항원 또는 박테리아에 대해 면역 반응을 증강하기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 동물에게 질환의 예방을 필요로 하는 동물에서 마이코박테리아 질환과 같은 질환을 예방하는 것을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 치료 또는 예방되는 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 감염성 질환, 알레르기 또는 증식성 질환, 예컨대 암일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 더 구체적으로, 질환은, 예를 들면 결핵, 한센병, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환, 선 페스트, 폐 페스트, 야토병, 리저넬라병, 탄저병, 장티푸스, 파라티푸스, 식품 매개 질환, 리스테리아증, 말라리아, HIV, SIV, HPV, RSV, 인플루엔자, 간염(HAV, HBV 및 HCV)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 변형 박테리아, 예를 들면 박테리아 세포의 세포벽으로 통합된 세라미드 유사 당지질을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 마이코박테리아 세포와 같은 박테리아 세포에 대한 면역 반응을 증강하는 것을 포함하고; 여기서 변형 박테리아를 상기 동물에서 항원에 대한 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 증강시키고 자연 살해 T(NKT) 세포의 활성을 증강시키기에 충분한 양으로 투여한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세라미드 유사 당지질 면역보강제를 박테리아 세포의 세포벽에 안정하게 결합시켜 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체를 만들고; 이후 세라미드 유사 당지질/박테리아 복합체를 항원 제시 세포에 투여함으로써 세라미드 유사 당지질 면역보강제 및 박테리아 세포, 예를 들면 마이코박테리아 세포의 항원 제시 세포에의 동시 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 "이를 필요로 하는 피험체"는 박테리아 감염과 같은 질환의 증상의 중증도를 치료, 즉 예방, 치유, 지연 또는 감소시키고/시키거나 특정 시간 기간에 걸쳐 질환의 악화를 발생시키지 않는 것이 요구되는 개체를 의미한다.
이 방법에 따르면, 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 질환의 진행을 변경시키기에 충분한 양으로 투여할 수 있다.
"예방접종"(백신 투여)은 통상적이고 보편적인 절차이고, 사용되는 본 발명의 백신은 본질적으로 악성 균주의 죽어 있는 미생물 및 약독화된 균주의 살아 있는 미생물의 제제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 활성 면역학적 예방에 의도되는 임의의 제제일 수 있다. Stedman's Illustrated Medical Dictionary (24th edition), William & Wilkins, Baltimore, p. 1526 (1982). 몇몇 경우에, 효과적인 보호를 유발하기 위해 백신을 1회 이상 투여해야 하고; 예를 들면 공지된 항독소 백신은 다회 용량으로 제공되어야 한다.
본원에서 사용되는 "프라이밍(priming)" 또는 "프라이밍시킨다" 및 "부스팅한다" 또는 "부스팅(boosting)"이란 용어는 각각 초기 예방접종 및 후속 예방접종을 의미하고, 즉 정의에 따르면 이 용어는 통상 면역학에서 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 예를 들면 프라이밍 성분 및 부스팅 성분이 단일 제제 내에 있는 경우, 초기 예방접종 및 후속 예방접종이 "프라이밍" 및 "부스팅" 조성물이 둘 다 동시에 투여될 필요가 없을 수 있다. 또한, 문헌[McShane H, Curr Opin Mol Ther 4(1):13-4 (2002); Xing Z and Charters TJ, Expert Rev Vaccines 6(4):539-46 (2007)]을 참조하고, 둘 다 참조문헌으로 본원에 포함된다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 조성물을 "프라이밍 부스팅" 요법에서 사용한다. 이 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 백신 조성물을 척추동물에게 전달하여, 마이코박테리아 항원과 같은 박테리아 항원에 대한 척추동물의 면역 반응을 프라이밍하고, 이후 제2 면역원성 조성물을 부스팅 백신 접종으로서 사용한다. 본 발명의 하나 이상의 백신 조성물을 사용하여 면역력을 프라이밍하고, 이후 제2 면역원성 조성물, 예를 들면 재조합 박테리아 백신을 사용하여 항박테리아 면역 반응을 부스팅한다. 백신 조성물은 본원에 기재된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 위한 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 치료학적 및/또는 예방학적 면역력을 필요로 하는 척추동물에게 본원에 기재된 하나 이상의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 척추동물에서 병원균, 예를 들면 박테리아, 진균, 바이러스 또는 기생충 병원균 또는 종양 항원에 대한 보호성 및/또는 치료학적 면역 반응을 생성, 증강 또는 조절하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 상기 조성물은 세포벽에 통합된 세라미드 유사 당지질을 포함하는 마이코박테리아와 같은 변형 박테리아를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물, 예를 들면 BCG/αGalCer 또는 BCG/α-C-GalCer을 사용하여 백신에 유리한 반응을 얻기 위해 필요한 용량을 줄일 수 있다. 이것은 국소 및 전신 독성을 감소시켜, 백신의 안정성 프로파일을 증가시키는 잠재적인 이익을 가질 것이다. 또한, 이것은 제조 비용 감소를 허용하는 이점을 가질 것이다.
본 발명의 특정 실시양태는 홀로 투여되는 (따라서 박테리아 세포벽과 관련하여 NKT 세포에 제시되는) 세라미드 유사 당지질 항원의 다발성 투여에 대한 NKT 세포의 면역원성 결여 반응을 감소 또는 제거하는 방법을 포함한다. 홀로 투여되는 α-GalCer의 다발성 투여는 NKT 세포가 연장된 시간 기간 동안 비반응성이 되게 하는 것으로 보인다. α-GalCer과 같은 당지질이 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 일부로서 투여되는 본 발명은 항원에 대한 반응에서 NKT 세포를 면역원성 결여로부터 보호할 수 있고, 다발성 투여시 연장된 반응을 허용한다. 따라서, NKT 세포는 본 발명의 세라미드 유사 당지질 항원이 로딩된 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체에 의한 자극에 대한 반응에서 활성화되고, 더욱이, NKT 세포는 본 발명의 세라미드 유사 당지질 항원이 로딩된 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체에 의한 재자극에 대한 반응에서 재활성화된다.
본 발명의 방법에 따르면, 본원에 기재된 박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질 항원을 포함하는 조성물을 투여하여 동물, 예를 들면 척추동물, 예를 들면 포유동물, 예를 들면 인간에서 면역 반응을 조절한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 전에, 후에 또는 동시에 전달되는, 예를 들면 면역원에 대한 면역 반응을 증강시킨다. 예를 들면, 면역원과의 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 투여로 통상적으로 면역 세포, 예를 들면 NKT 세포 또는 NK 세포로부터 사이토카인이 배출될 수 있다. 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물의 투여에 대한 반응으로 배출되는 사이토카인은 TH1-유형 면역 반응과 관련되는 것, 예를 들면 인터페론 감마 및 TNF-α일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물의 투여로 TH2-유형 면역 반응과 관련된 사이토카인, 예를 들면 IL-4, IL-5, IL-10 또는 IL-13이 배출될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물의 투여로 다른 사이토카인, 예를 들면 IL-2, IL-1Ζβ, IL-12, IL-17, IL-23, TNF-β/LT, MCP-2, 온코스타틴-M 및 RANTES가 배출될 수 있다. 배출되는 사이토카인의 유형을 조절하는 방법은 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 세라미드 유사 당지질 항원을 변경하는 것을 포함한다. NKT 또는 다른 면역 세포로부터 사이토카인 배출에 대한 이의 효과에 대해 다양한 세라미드 유사 당지질 항원을 선택하고 시험하는 것을 본원에서 다른 곳 및 미국 공개 특허 출원 제2006/0052316호(Porcelli)에 기재된 시험관내 검정을 이용하여, 그리고 당업자에게 널리 공지된 추가 방법에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 백신 조성물의 투여는 추가로 NKT 세포의 증식을 유발하고, 또한 NK 세포, CTL, 다른 T 림프구, 예를 들면 CD8+ 또는 CD4+ T 림프구, 수지상 세포, B 림프구 및 다른 것(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 다른 면역 세포의 동원 및 또는 활성화를 유발함으로써 면역 반응을 조절할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 조성물의 투여는 하나 이상의 NKT 세포 활성, 예컨대 세포 증식, 하나 이상의 사이토카인 생성 또는 NK 세포, CTL, 다른 T 림프구, 예를 들면 CD8+ 또는 CD4+ T 림프구, 수지상 세포, B 림프구 및 다른 것(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 비NKT 면역계 세포의 동원 및/또는 활성화(이들로 제한되지는 않음)에 영향을 미친다.
본 발명의 특정 실시양태는 박테리아 세포/세라미드 유사 당지질 복합체에 의해 발현되는 면역원, 예를 들면 병원균 항원 또는 종양 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 재조합 백신으로서 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명은 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체에 존재 하는 면역원을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 면역원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 이 실시양태에 따르면, 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체가 없는 면역원의 투여에 비해 재조합 박테리아에 의해 발현되는 면역원, 예를 들면 박테리아 병원균 또는 면역원에 대한 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 투여한다. 백신으로서 사용하기 위한 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체는 특정 실시양태에서 재조합 항원을 제시하는 재조합 박테리아 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 박테리아 세포에 대한 것이다. 다른 실시양태에서, 백신으로서 사용하기 위한 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체는, 예를 들면 미국 공개 특허 출원 제2006/0269540호(Bruno 등)에 기재된 특정 기관, 조직, 세포 또는 세포 표면 마커를 표적으로 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 조성물을, 예를 들면 결핵과 같은 질환을 이미 앓는 동물에게 치료 백신으로서 투여한다. 이 방법에 따르면, 본 발명의 변형 박테리아에 의해 야기되는 면역 반응은 증상을 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시킴으로써 질환을 치료하는 데, 예를 들면 그 결과에 영향을 미치는 데 효과적이고, 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 부재 하의 면역원의 투여에 비해 면역원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 충분한 양으로 투여한다. 대안적으로, 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 및 이를 포함하는 조성물을 예방 백신으로서, 즉 장래에 그 동물에 의해 걸릴 수 있는 감염성 질환과 같은 질환에 대한 증상을 예방 또는 감소시키기 위해 투여한다. 이 방법에 따르면, 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체에 의해 야기되는 면역 반응은 증상을 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시킴으로써 질환을 예방하는 데, 예를 들면 그 결과에 영향을 미치는 데 효과적이고, 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체의 부재 하의 면역원의 투여에 비해 면역원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 충분한 양으로 투여한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본원에서 다른 곳에 기재된 박테리아 세포 및 세라미드 유사 당지질을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체 조성물은 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 세포 복합체, 예를 들면 αGalCer/BCG 및 α-C-GalCer/BCG를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법, 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물은 또한 감염성 물질, 예를 들면 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체에 대한 면역 반응을 상승시키는 데 유용하고, 여기서 복합체의 박테리아 세포는 이종 항원, 예를 들면 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원 또는 기생충 항원을 발현한다. 본 발명의 방법, 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 야기할 수 있는 감염성 물질로는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 물질을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바이러스의 예로는 다음의 DNA 및 RNA 바이러스 패밀리: 아르보바이러스, 아데노비리대, 아레나비리대, 아르테리바이러스, 비르나비리대, 분야비리대, 칼리시비리대, 시르코비리대, 코로나비리대, 플라비비리대, 헤파드나비리대(간염), 헤르페스비리대(예컨대, 사이토메갈로바이러스, 단순 포진, 헤르페스 조스터), 모노네가바이러스(예를 들면, 파라믹소비리대, 모르빌리바이러스, 라브도비리대), 오소믹소비리대(예를 들면, 인플루엔자), 파포바비리대, 파르보비리대, 피코르나비리대, 폭스비리대(예컨대, 천연두 또는 백시니아), 레오비리대(예를 들면, 로타바이러스), 레트로비리대(HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스) 및 토가비리대(예를 들면, 루비바이러스)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 패밀리에 속하는 바이러스는 관절염, 축농증, 뇌염, 눈 감염(예를 들면, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A, B, C, E, 만성 활성, 델타), 뇌수막염, 기회 감염(예를 들면, AIDS), 폐렴, 버킷 림프종, 수두, 출혈열, 홍역, 볼거리, 파라인플루엔자, 관경병, 감기, 폴리오, 백혈병, 풍진, 성 전염성 질환, 피부 질환(예를 들면, 카포시, 사마귀) 및 바이러스 혈증(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 각종 질환 또는 증상을 야기할 수 있다.
유사하게, 질환 또는 증상을 야기할 수 있는 박테리아 또는 진균 물질을 본 발명의 방법, 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물에 의해 치료 또는 예방할 수 있다. 이것으로는 다음의 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 패밀리 및 진균: 악티노마이세탈레스(예를 들면, 코리네박테리움, 마이코박테리아, 노카르디아), 아스퍼질로시스, 바실라세아(예를 들면, 탄저병, 클로스트리듐), 박테로이다세아, 블라스토마이코시스(Blastomycosis), 보르데텔라, 보렐리아, 브루셀로시스(Brucellosis), 칸디디아시스(Candidiasis), 캄필로박터, 콕시디오이도마이코시스(Coccidioidomycosis), 크립토콕코시스(Cryptococcosis), 더마토사이코세스(Dermatocycoses), 엔테로박테리아세아(클레브시엘라, 살모넬라, 세라티아, 예르시니아), 에리시펠로트릭스, 헬리코박터, 레지오넬로시스(Legionellosis), 렙토스피로시스(Leptospirosis), 리스테리아, 마이코플라스마탈레스(Mycoplasmatales), 네세리아세아(예를 들면, 아시네토박터, 임질, 메닝고콕칼(Menigococcal)), 파스퇴렐라세아(Pasteurellacea) 감염(예를 들면, 악티노바실루스, 헤모필루스(Heamophilus), 파스퇴렐라), 슈도모나스, 리케치아세아, 클라미디아세아, 시필리스(Syphilis) 및 스타필로코칼을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 박테리아 또는 진균 패밀리는 균혈증, 심내막염, 눈 감염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염(예를 들면, AIDS 관련 감염), 손톱주위염, 보철 관련 감염, 라이터병, 기도 감염, 예컨대 백일해 또는 농흉, 패혈증, 라임병, 고양이 찰과상 질환, 이질, 파라티푸스, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 뇌수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 파라튜버쿨로시스, 결핵, 한센병, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환, 낭창, 보툴리눔 식중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류머티스 열, 성홍열, 성 전염성 질환, 피부 질환(예를 들면, 봉와직염, 피부진균병), 중독증, 요로 감염, 상처 감염(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 질환 또는 증상을 야기할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 방법, 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 사용하여 기생충 물질에 의해 야기되는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 화합물에 의해 치료할 수 있는 것으로는 다음의 패밀리: 아메비아시스(amebiasis), 바베시오시스(babesiosis), 콕시디오시스(coccidiosis), 크립토스포리디오시스(cryptosporidiosis), 디엔타모에비아시스(dientamoebiasis), 도우린(dourine), 엑토파라시틱(ectoparasitic), 지아르디아시스(giardiasis), 헬민티아시스(helminthiasis), 리슈마니아시스(leishmaniasis), 테일레리아시스(theileriasis), 톡소플라스모시스(toxoplasmosis), 트리파노소미아시스(trypanosomiasis) 및 트리코모나스(trichomonas)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
개시된 방법에 따르면, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 변형 박테리아, 조성물 또는 백신 조성물을 예를 들면 근육내(i.m.), 정맥(i.v.), 피하(.c.) 또는 폐내 경로에 의해 투여할 수 있다. 다른 적합한 투여 경로로는 기관내, 경피, 안내, 비강, 흡입, 공동내, (예를 들면, 췌장으로) 관내 및 (즉, 임의의 조직으로) 뇌실질내 투여를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 경피 전달로는 (예를 들면, 진피 또는 표피로의) 피내, (예를 들면, 경피적) 경피 및 (즉, 피부 또는 점막 조직으로 또는 이를 통한) 경점막 투여를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 공동내 투여로는 경구, 질, 직장, 비강, 복막 또는 장 공동으로의 투여 및, (즉, 척추관으로) 척추강내, (즉, 뇌실 또는 심실로) 심실내, (즉, 심방으로) 심방내 및 (즉, 뇌의 지주막하 공간으로) 지주막하 투여를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 추가로 적합한 담체를 포함한다. 상기 조성물은 치료학적 유효량의 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 면역보강제를 포함한다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
약학 조성물
"약학적으로 허용되는"이란 용어는, 타당한 의학적 판단 범위 내에, 합당한 이익/위험 비에 어울리는 과도한 독성 또는 다른 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 조성물을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 백신은 약학적으로 허용된다.
본 발명의 세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 약학 조성물, 예를 들면 백신 조성물을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 면역보강제, 담체 또는 희석제와 조합하여 투여할 수 있다. 인간 환자에게 투여될 때, 본 발명의 약학 조성물의 전체 단일 또는 일일 용량은 타당한 의학적 판단 범위 내에 주치의가 결정할 수 있는 것으로 이해된다. 임의의 특정한 환자에 대한 구체적인 치료학적으로 유효 용량 수준은 성취하고자 하는 반응의 유형 및 정도; 이용되는 경우, 이용되는 다른 물질의 구체적인 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 배출 속도; 치료 기간; 구체적인 조성물과 조합으로 또는 동시에 사용되는 약물(예컨대, 화학치료제); 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자를 비롯한 각종 인자에 따라 달라진다. 당해 분야에 공지된 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (최종판), Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 확인할 수 있다.
소정의 예방적 또는 치료학적 치료에서 사용하고자 하는 조성물을 개별적인 환자의 임상 상태(특히 화합물 단독에 의한 예방 또는 치료의 부작용), 화합물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 실행자에게 공지된 다른 인자를 고려하여, 우수한 의학적 실행과 일치하는 방식으로 제제화하고 투여한다. 본원에서의 목적을 위한 본 발명의 화합물을 따라서 이러한 고려사항에 의해 결정한다.
환자에게 투여하고자 하는 본 발명의 백신 조성물과 같은 조성물의 적절한 용량을 임상의가 결정할 것이다. 그러나, 가이드로서, 본 발명의 조성물의 적합한 양은 면역학적으로 불활성 담체, 예를 들면 의학 담체 0.05 내지 0.1 ㎖ 중에 현탁된 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 CFU와 같은 용량당 약 101 내지 1012 CFU일 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 질환의 예방 또는 치료, 즉 그 질환의 중증도를 치유, 경감, 감소시키거나, 그 질환을 예방 또는 감소시키기에 충분한 면역력을 유발하기 위한 본 발명의 백신의 유효량은 약 103 내지 약 107 집락 형성 단위(CFU)/kg 체중이다. 본 발명의 조성물을 단일 용량 또는 다회 용량으로서 투여할 수 있다. 본 발명의 백신 제제를 경구 투여를 위한 캡슐, 액체 용액, 현탁액 또는 엘릭시르와 같은 제형 또는, 예를 들면 비경구, 비강 또는 국소 투여를 위한 용액 또는 현탁액과 같은 제제를 위한 무균 액체에서 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 경구로, 정맥내, 직장내, 비경구로, 낭내로, 피내, 질내, 복강내, (분말, 연고, 겔, 크림, 드롭 또는 경피 패치에 의해) 국소로, 협측 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비경구"란 용어는 정맥, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 비롯한 투여 방식을 의미한다.
본 발명의 백신 조성물과 같은 조성물을 공지된 방법에 따라 제제화할 수 있다. 적합한 제조 방법은, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, eds., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980); Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th edition, A.R. Gennaro, eds., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에 기재되어 있고, 이들 둘 다 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 상기 조성물을 수용액으로서 투여할 수 있더라도, 이것을 또한 에멀션, 겔, 용액, 현탁액, 동결건조 형태 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 형태로서 제제화할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 희석제, 결합제, 안정화제 및 보존제를 비롯한 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 일단 제제화되면, 본 발명의 조성물을 피험체에 직접 투여할 수 있다. 치료하고자 하는 피험체는 동물일 수 있고; 특히, 인간 피험체를 치료할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 발현하는 벡터를 갖는 박테리아 세포와 같은 숙주 세포를 조성물에서 도입한다. 본 발명의 조성물에서 본 발명의 폴리펩티드의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.1 중량% 미만, 일반적으로 약 2 중량% 이상에서 20% 내지 50 중량% 이상 변할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등에 의해 선택한다.
본 발명의 조성물을 통상, 예를 들면 밀봉 앰플 또는 바이알과 같은 단위 또는 다회 용량 컨테이너에서, 용시제조를 위한 수용액 또는 동결건조 제제로서 저장한다. 직접 통합된 당지질 면역보강제를 갖는 마이코박테리아 조성물을 동결건조시킬 수 있고, 주사를 위해 조성물을 재수화시키고 현탁시킬 때 면역보강제 활성을 온전히 회수한다. 동결건조 제제의 예로서, 10 ㎖ 바이알에 무균 여과 1%(w/v) 수용액 5 ㎖를 채우고, 얻은 혼합물을 동결건조시킨다. 정균 주사용수와 같은 물을 사용하여 동결건조 조성물을 용시제조하여 주입 용액을 제조한다.
본 발명의 조성물은 임의의 동물, 예를 들면 포유동물(예컨대, 유인원, 소, 말, 돼지, 수퇘지, 양, 설치류, 염소, 개, 고양이, 닭, 원숭이, 토끼, 흰담비, 고래 및 돌고래) 및 인간에 대한 투여에 유용하다.
인간 질환에 우수한 상관관계가 있는 것으로 보이는 동물 모델로는 기니아 피그 및 비인간 영장류를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, 문헌[Balasubramanian V et al., Immunobiology 191(4-5):395-401 (1994); Barclay WR et al., Infect. Immun. 2(5):574-582 (1970)]을 참조하고, 이들 둘 다 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다).
본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분이 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 의약품 또는 생물학적 의약의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 기술하는 형태의 안내문은 상기 컨테이너와 관련될 수 있고, 그 안내문은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 조성물을 다른 치료학적 조성물과 조합하여 사용할 수 있다.
상기 백신의 적합한 제제로는 액체 용액 또는 현탁액로서의 주사액을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않고; 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 상기 제제는 또한 유화될 수 있거나 또는 폴리펩티드는 리포솜 중에 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 대개 약학적으로 허용되는 면역보강제와 혼합되고 활성 성분과 상용성이다. 적합한 면역보강제는, 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이다. 또한, 원하는 경우, 백신 제제는 또한 습윤 또는 유화 물질, pH 완충 물질 및/또는 백신의 유효성을 증강시키는 면역보강제와 같은 보조제 물질을 소량 포함할 수 있다.
세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 추가로 추가 면역보강제를 포함할 수 있다. 효과적일 수 있는 면역보강제의 예는 상기 기재되어 있고, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-1-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-1-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-1-알라닐-D-이소글루타미닐-1-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민, GM-CSF, QS-21(조사 약물, Progenics Pharmaceuticals, Inc.), DETOX(조사 약물, Ribi Pharmaceuticals), BCG 및 CpG 풍부 올리고뉴클레오티드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
세라미드 유사 당지질/박테리아 세포 복합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 추가로 또한 톨양 수용체(TLR) 효능제인 추가 면역보강제를 포함할 수 있다. 효과적일 수 있는 TLR 효능제 면역보강제의 예로는 N-아세틸무라밀-1-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리사카라이드(LPS), 유전 변경되고/되거나 분해된 LPS, 백반, 글루칸, 콜로니 자극 인자(예를 들면, EPO, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, PEG화 G-CSF, SCF, IL-3, IL6, PIXY 321), 인터페론(예를 들면, γ감마-인터페론, α-인터페론), 인터류킨(예를 들면, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 사포닌(예를 들면, QS21), 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL), 탈메틸화 CpG 서열, 1-메틸 트리토판, 아르기나제 억제제, 사이클로포스파미드, 면역억제 기능을 차단하는 항체(예를 들면, 항CTLA4 항체), 지질(예컨대, 팔미트산 잔기), 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인 리세릴-세린(P3 CSS) 및 프로인트 면역보강제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 면역보강제 예로는 화합물, 예컨대 이사토리빈 및 이의 유도체(Anadys Pharmaceuticals) 또는 이미다조퀴놀린아민, 예컨대 이미퀴모드 및 레시퀴몹(Dockrell & Kinghom, J. Antimicrob. Chemother., 48:751-755 (2001); Hemmi et al., Nat. Immunol., 3:196-200 (2002), 구아닌 리보뉴클레오사이드, 예컨대 C8-치환 또는 N7,C-8-이치환 구아닌 리보뉴클레오사이드(Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:6646-6651 (2003)) 및 공개 특허 제JP-2005-089,334호; WO 제99/32122호; WO 제98/01448호, WO 제05/092893호; 및 WO 제05/092892호에 개시된 화합물 및 문헌[Lee et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(6):1828-1833 (2006)]에 개시된 TLR-7 효능제 SM360320(9-벤질-8-하이드록시-2-(2-메톡시-에톡시)아데닌)을 들 수 있다.
이사토리빈 이외에, 다른 TLR 효능제 면역보강제는 9-벤질-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)아데닌(SM360320), Actilon™(Coley Pharmaceutical Group, Inc.) 및 Sumitmo Pharmaceutical Co, Ltd에 의한 하기 화합물을 포함한다:
Figure 112017074270754-pat00023
Figure 112017074270754-pat00024
Figure 112017074270754-pat00025
또는
Figure 112017074270754-pat00026
본 발명의 조성물과 조합하여 사용할 수 있는 다른 면역보강제는 PCT 공보 WO 제2005/000348호, 미국 공개 특허 제2007/0292418호 및 미국 공개 특허 제2007/0287664호에 개시되어 있다.
상기 조성물은, 원하는 경우, 또한 습윤 또는 유화 물질 또는 pH 완충 물질을 소량 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환제, 캡슐, 서방 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 약학 등급을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 추가로 면역 반응을 조절하는 다른 화합물, 예를 들면 사이토카인을 포함할 수 있다. "사이토카인"이란 용어는 인터류킨(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 및 IL-18), α 인터페론(예를 들면, IFN-α), β 인터페론(IFN-β), γ 인터페론(예를 들면, IFNγ), 콜로니 자극 인자(CSF, 예를 들면 CSF-1, CSF-2 및 CSF-3), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), 형질전환 성장 인자(TGF, 예를 들면 TGFα 및 TGFβ 및 인슐린양 성장 인자(IGF, 예를 들면 IGF-I 및 IGF-II)(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명은, 달리 기재되지 않은 한, 당해 분야 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 마이크로생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기술을 이용한다. 상기 기술을 문헌에 충분히 설명하였다. 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., eds., Cold Springs Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); 미국 특허 제4,683,195호(Mullis 등); Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins ed. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins ed. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vol. 154 and 155(Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]을 참조한다.
항체 조작의 일반적인 원칙은 문헌[Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995)]에 기재되어 있다. 단백질 조작의 일반적인 원칙은 문헌[Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995)]에 기재되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원칙은 문헌[Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984)]에 기재되어 있다. 추가로, 당해 분야에서 공지되어 있고 구체적으로 기재되지 않은 면역학의 표준 방법은 일반적으로 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stite et al. (eds), Basic and Clinical - Immunology (8th ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) and Mishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980)]에서처럼 전개된다.
면역학의 일반적인 원칙을 기재하는 표준 참조문헌 작품은 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" in Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4th ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Biology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003)]을 포함한다.
상기 인용된 참조문헌 모두 및 본원에 인용된 참조문헌 모두 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함된다.
[실시예]
물질 및 방법
마우스. Jackson Laboratories(Bar Harbor, Maine)로부터 6주령 내지 8주령 암컷 야생형 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 얻었다. M. Exley 및 S. Balk(Beth Israel-Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston)에 의해 CD1d-/- 마우스를 제공하였다. M. Taniguchi 및 T. Nakayama(Chiba University, Chiba, Japan)로부터 V14i NKT 세포 결핍 Jα18-/- 마우스를 기증받았다. 특정한 병원균 비함유 조건 하에 생물안정성 수준 3개 시설에 모든 마우스를 하우징하고 기관이 승인한 프로토콜에서 사용하였다.
세포 및 세포주. C57BL/6 및 BALB/c 마우스로부터 얻은 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 공개 프로토콜에 기초하여 제조하였다. Lutz MB, et al, J Immunol Methods 223: 77-92 (1999). 간단히 말하면, 대퇴골 및 정강이뼈로부터 골수 세포를 얻고 세균 페트리 접시에서 2×106개 세포/플레이트로 평편 배양하였다. Lutz 등이 기재한 바대로 비접착 수지상 세포를 수확하기 전에 10일 동안 GM-CSF 배양 배지에서 세포를 항온처리하였다. M. Kronenberg(La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA)가 Vα14i NKT 하이브리도마 DN3A4-1.2를 제공하였다. 5% CO2를 갖는 37℃ 습윤 인큐베이터에서 10% 열 불활성화 FCS(Gemini Biological Products, Calabasa, CA), 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 55 μM 2-머캅토에탄올, 100 단위/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO)이 보충된 RPMI-1640 배지(GIBCO)에서 세포를 배양하였다. 시린지 플런저로 분쇄하고 70 μM 세포 여과기를 통해 통과시켜 비장 세포를 제조하였다. 적혈구 용해 완충제(SIGMA)에 의해 적혈구 용해를 수행하였다. 다음의 절차를 이용하여 간 단핵 세포를 분리하였다. 리버라제(Roche) 0.014 Wunsch 단위/㎖로 간을 30분 동안 처리하였다. 균질액을 70 μM 세포 여과기를 통해 통과시키고, 단핵 세포를 45%, 67.5% Percoll 구배를 사용하여 펠렛으로부터 분리하였다.
당지질. αGalCer을 공개 방법(Yu, K.O.A. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 102:3383 (2005))에 따라 합성하고, NIH Tetramer Core Facility(www.niaid.nih.gov/reposit/tetramer/genguide.html)로부터 α-C-GalCer을 얻었다. -20℃에서 당지질을 건조 저장하였다. 스톡으로부터 얻은 분취량을 시험관내 작업을 위해 DMSO 중에 100 μM으로 또는 생체내 연구를 위해 PBS 중 0.5% Tween-20 중에 500 μM으로 용시제조하였다.
박테리아 균주. Statens Serum Institute(덴마크)로부터 M. 보비스 BCG(Danish)를 얻고, 재조합 BCG-Ova(파스퇴르 균주)는 Subash Sad, 생명 과학에 대한 미국 국립 학술 연구원(Ottawa, Ontario, Canada)(문헌[Dudani R et al., J. Immunol. 168(11): 5737-45 (2002)] 참조)로부터 기증받은 종류이다. 0.05% 티록사폴 및 αGalCer 또는 α-C-GalCer 20 ㎍/㎖를 갖는 단백질 비함유 Middlebrook 7H9 배지(Difco) 중에 이 균주를 배양하였다. (Trudeau Institute로부터 얻은) 악성 M. 튜버쿨로시스 균주 H37Rv을 올레산-알부민-덱스트로스 복합체(Difco)가 보충된 Middlebrook 7H9 배지 중에 배양하였다.
살아 있는 BCG로의 14 C 표지 αGalCer의 통합. M. 보비스 BCG를 0.05% 티록사폴 및 14C 표지 αGalCer 20 ㎍/㎖를 포함하는 단백질 비함유 Middlebrook 7H9 배지 중에 0.5 내지 1.0의 OD로 배양하였다. 박테리아를 완전히 세척하고, 건조시키고, 지질 통합을 β-섬광 계수에 의해 평가하였다. TLC 검정에 사용되는 세포벽 지질 추출에 건조된 박테리아를 사용하였다.
BCG로 통합된 αGalCer 및 α-C- GalCer(각각 αGalCer-BCG 및 α-C- GalCer -BCG)의 시험관내 활성. NKT 하이브리도마 검정을 위해, BMDC를 10:1의 MOI에서 BCG, αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG로 감염시키고, Vα14i NKT 하이브리도마 세포(50,000개 세포)를 12시간 동안 첨가하였다. ELISA에 의해 상청액 IL-2를 평가하였다. 비장세포 또는 간 세포 자극을 위해, 벌크 비장세포를 500,000개 세포로 평편 배양하거나, 간 단핵 세포를 C57BL/6 BMDC가 BCG, αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG로 감염된 96웰 환저 조직 배양 플레이트에서 웰당 400,000개 세포로 평편 배양하였다. 비장세포 활성화를 위해, 25,000개 세포/웰로부터 출발하여 3,125개 세포/웰에 4배까지 희석된 세포수로 감염된 BMDC를 사용하였다. 간 세포를 웰당 105개 감염 BMDC로 자극하였다. 37℃에서 48시간 후, 사이토카인 측정을 위해 상청액 150 ㎕를 제거하였다. IL-4 및 IFNγ의 상청액 수준을 TMB-Turbo 기질(Pierce)과 함께 포획 및 비오티닐화 검출 항체 쌍(BD PharMingen) 및 스트렙타비딘-겨자무과산화효소(Zymed)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다.
인간 NKT 세포 클론 활성화. 인간 단핵구 유도 수지상 세포를 5:1의 MOI로 감염시키고, 24시간 동안 NKT 세포 클론(50,000개 세포)과 항온처리하고, IFNγ 및 IL-13에 대해 상청액을 평가하였다.
BCG로 통합된 생체내 활성 αGalCer. 마우스에 PBS 0.2 ㎖ 중 αGalCer-BCG + 0.05% 티록사폴 또는 비히클 단독의 복강내(i.p.) 주사하였다. 혈청을 수집하고 문헌[Yu KO et al, Proc Natl Acad Sci U S A 102: 3383-3388 (2005)]에 기재된 바대로 포획 ELISA에 의해 IL-4, IL-12p70 및 IFNγ에 대해 시험하였다.
αGalCer - BCG의 복강내 주사에 후행하는 생체내 수지상 세포 성숙 검정. C57BL/6 마우스 또는 CD1d-/- 마우스에 αGalCer-BCG를 i.p. 주사하고, 20시간 및 40시간 후 비장세포 및 간 단핵 세포를 수거하였다. CD11c, CD80, CD86, MHC Ⅱ(IA/IE), CD70, 41BB 및 OX40에 대한 형광색소 표지 항체로 세포를 염색하였다. LSR II 유세포 분석기에서 샘플을 분석하였다.
T 세포 IFNγ ELISPOT 검정. ELISPOT를 이용하여 시험관내 OVA 257-264 펩티드(SIINFEKL(서열 번호 1)), TB10.3/4 MHC-I(H-2Kd) 제한 펩티드(GYAGTLQSL(서열 번호 2)) 또는 TB10.3/4 MHC-I(H-2Kb) 제한 펩티드(QIMYNPAM(서열 번호 3))에 의한 자극 후 감염된 마우스로부터 개별적인 CD8+ T 세포에 의해 IFNγ 분비를 검출하였다. ELISPOT 플레이트(Milipore)를 실온(RT)에서 16시간 IFNγ 포획 항체(BD Biosciences)로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 RT에서 2시간 동안 1% BSA로 차단하였다. RBC 용해 완충제(Sigma-Aldrich)에 의한 처리 후, Dynal 마우스 T 세포 음성 분리 키트(Invitrogen)를 사용하여 T 세포를 분리하였다. 분리된 T 세포를 37℃에서 나이브 마우스로부터 얻은 비장세포 및 펩티드(5 ㎍/㎖)로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 제거한 후, 플레이트를 PBS, 이어서 PBS와 0.05% Tween-20(PBST)으로 세척하였다. 비오티닐화 항-IFNγ 검출 항체(BD Biosciences)를 37℃에서 2시간 동안 첨가한 후, PBST로 세척하였다. 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제(Sigma-Aldrich)를 플레이트에 1시간(37℃) 동안 첨가한 후, 세척하고 BCIP/NBT 기질(Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 물로 웰을 세척하여 반응을 중지시키고 ELISPOT 판독기(Autoimmun Diagnostika)를 사용하여 점을 계수하였다. CD4+ T 세포 반응을 또한 M. 튜버쿨로시스 Ag85B의 펩티드-25(FQDAYNAAGGHNAVF(서열 번호 4))(5 ㎍/㎖) 아미노산 240 내지 254로 평가하였다.
생체내 항원 제시 검정. Rag1 결핍 OT-1 TCR 형질전환 마우스(타코닉(Taconic)/알레르기 및 감염성 질환의 국제 기관[NIAID])로부터 공여자 비장세포를 분리하였다. RBC 용해 후, 세포를 PBS + 0.1% BSA 중에 5×107개 세포/㎖의 농도로 RT에서 5분 동안 10 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하였다. 세포를 PBS + 0.1% BSA로 1회 세척하고 PBS로 2회 세척한 후, B6.PL(Thy1.1+) 수혜 마우스(Jackson Laboratory)에 주사하였다. 마우스는 측면 꼬리 정맥을 통해 5×106개 또는 1×107개 표지 세포를 투여받았고, 이후 BCG-OVA/αGalCer, BCG-OVA 또는 BCG의 5×106 CFU로 피하로 예방 주사하였다. 5∼7일 후 비장세포를 수거하고, 항Thy1.2, 항CD8 및 항B220 항체(BD Biosciences)로 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 이동 집단(Thy1.2+)에서 수집하고 이 집단 내 비분할(CFSEhigh) 세포의 백분율을 측정하여 팽창을 정량화하였다.
백신 접종 및 공격 연구. 알버트 아인슈타인 의과 대학의 실험 동물 운영 위원회가 모든 동물 연구를 승인하였다. C57BL/6 마우스에 BCG 단독 또는 당지질(5×106 CFU/마우스) 중 하나로 배양된 BCG 중 어느 하나로 피내 예방 주사하였다. 가스 발생 공격을 Glas-Col 흡입 챔버를 사용하여 2달 후 수행하여 악성 균주 M. 튜버쿨로시스 H37Rv의 동물당 50∼100 CFU를 전달하였다. 마우스를 공격 3주 및 6주에 희생하였다. 개별 마우스의 폐 및 비장을 무균 제거하고 Seward Stomacher 80 블렌더(Tekmar)를 사용하여 5 ㎖ 노르말 식염수 + 0.05% Tween-80 중에 별개로 균질화하였다. 균질액을 연속하여 희석하고 히그로마이신(50 ㎍/㎖)을 갖는 Middlebrook 7H10 한천에서 편평 배양하였다. 표준 파라핀 고정, 분할 및 H&E 염색을 이용하여 조직병리학을 위해 폐 조직을 처리하였다.
실시예 1
살아 있는 마이코박테리아의 세포벽으로의 αGalCer의 안정한 통합
이 실시예는 마이코박테리아의 세포벽으로의 예시적인 세라미드 유사 당지질, αGalCer의 안정한 통합을 입증하는 것이다. 마이코박테리아 세포, M. 보비스 BCG는 APC가 활발히 섭취하고 항원 제시에 처리된 살아 있는 약독화된 박테리아 백신이다. (1) 폴리소르베이트 Tween-80(0.05%) 및 (2) 티록사폴(0.05%) 중의 14C 표지 αGalCer의 용해도를 시험하였다. 14C 표지 αGalCer에 대한 티록사폴에 의한 용해도는 tween-80 중의 용해도보다 높았다(도 1a). 단백질 비함유 Middlebrook 7H9 배지 중에 티록사폴(0.05%)과 함께 14C 표지 αGalCer의 존재 하에 BCG 세포를 배양하였다. 이후, 세포를 PBS-티록사폴(0.05%)로 완전히 세척하고 섬광 계수는 방사선 표지 αGalCer이 BCG 세포벽과 결합된다는 것을 보여주었다(도 1b).
14C 표지 αGalCer의 존재 하에 배양된 BCG로부터 세포벽 지질을 추출하고, 박층 크로마토그래피 처리하였다. 지질 추출물로부터 얻은 방사선 표지 지질은 유리 14C 표지 αGalCer의 이동성과 유사한 이동성을 가졌고 이것은 이 세라미드 유사 당지질이 세포벽에 안정하게 결합하고 화학적으로 온전하다는 것을 보여주었다(도 1c). TLC 밴드의 정량화는 방사선 표지 세라미드 유사 당지질의 약 21.4%가 박테리아 세포벽으로 통합된다는 것을 보여주었다. 따라서, 세라미드 유사 당지질, αGalCer은 마이코박테리아 세포벽으로 안전하게 통합되어 당지질 면역보강제 및 BCG 백신 둘 다의 동시 투여를 허용하였다.
실시예 2
BCG 세포벽에 결합된 αGalCer 또는 α-C- GalCer은 마우스 및 인간 검정에서 시험관내 생물학적으로 활성이다
이 실시예는 마이코박테리아 세포벽으로 통합된 세라미드 유사 당지질(세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체)이 생물학적으로 활성이라는 것을 입증하는 것이다. αGalCer 및 이의 유사체는 시험관내 NKT 세포를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 이 생물학적 활성을 시험하여 마이코박테리아 세포벽으로 통합된 세라미드 유사 당지질이 시험관내 NKT 세포를 활성화하는 능력을 보유하는지를 결정하였다. α-GalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG로 감염된 마우스 BMDC를 NKT 세포 하이브리도마와 항온처리하였다. IL-2는 용량 의존 방식으로 상청액에서 용이하게 검출 가능하였고, 이것은 BCG 세포벽에 결합된 세라미드 유사 당지질 각각에 의한 시험관내 NKT 세포의 매우 효과적인 활성화를 보여주었다(도 2a). 모든 도 2 값을 3회 배양의 평균으로 나타냈다.
αGalCer-BCG 감염 BMDC에 의한 마우스 비장세포의 활성화는 도 2b 및 도 2c에 도시된 바대로 IFNγ 및 IL-4 생성을 유발하였다. αGalCer-BCG 감염 BMDC에 의한 간 단핵 세포 자극은 IFNγ 및 IL-4를 유발하였고(각각 도 2g 및 도 2h), α-C-GalCer-BCG 감염 BMDC는 IFNγ를 유발하였지만, 간 단핵 세포로부터 IL-4는 검출 가능하지 않았다(도 2g 및 도 2h). α-GalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG의 활성을 또한 감염된 단핵구 유도 인간 수지상 세포에 의해 NKT 세포 클론을 자극하여 인간 시스템에서 시험하였다. α-GalCer-BCG 복합체는 용량 의존 방식으로 IFNγ, TNFα 및 IL-13을 강하게 유발하였고, 이것은 백신 세포의 세포벽으로의 세라미드 유사 당지질 면역보강제를 통합하는 전략을 인간에게 적용할 수 있다는 것을 보여주었다(각각 도 2d, 도 2e 및 도 2f).
인간 NKT 세포 클론을 활성화하는 αGalCer-BCG 감염 인간 단핵구 유도 수지상 세포의 능력은 이 백신 전략을 결핵에 대해 인간의 백신 접종에 적용할 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 3
αGalCer-BCG는 생체내 검출 가능한 사이토카인 반응을 유발하였다
이 실시예는 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체가 생체내 활성을 보유한다는 것을 입증하는 것이다. 마우스에 αGalCer의 투여는 혈청 사이토카인 반응을 유발하였다. 세라미드 유사 당지질에 결합된 BCG 세포의 생체내 활성을 시험하였다. αGalCer-BCG 세포(5×106)를 C57BL/6 마우스에 복강내 주사하고, 여러 시점에서 사이토카인에 대해 혈청을 시험하였다. αGalCer/BCG 복합체는 유리 당지질에서 보여지는 것과 유사한 동력학으로 IFNγ, IL-12 및 IL-4의 상당한 혈청 수준을 유발하였다(도 3a, 도 3b 및 도 3c). 따라서, αGalCer/BCG 복합체는 생체내 활성인 것으로 보였다. αGalCer/BCG가 주사된 CD1d KO 또는 Jα18 KO 마우스(둘 다 NKT 결핍)에서 혈청 사이토카인은 검출되지 않았고(데이터 도시 안 함), 이것은 αGalCer/BCG 복합체에 의한 사이토카인 유발이 CD1d와의 결합을 통한 것이고 NKT 세포 활성화를 포함한다는 것을 보여주었다.
실시예 4
α-GalCer은 활동적으로 생체내 수지상 세포에서 공동 자극 분자를 유발한다
이 실시예는 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체가 CD11c+ 수지상 세포(DC)에서 공동 자극 분자의 발현을 유발하는 능력을 보유한다는 것을 입증하는 것이다. αGalCer 및 α-C-GalCer 단독이 CD11c+ 수지상 세포에서 공동 자극 분자의 발현을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. C57BL/6 마우스에 αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG를 i.p 주사하였다. 비장 및 간에서의 CD11c+ DC에서 공동 자극 분자 및 MHC Ⅱ의 발현 수준을 시험하였다. 세라미드 유사 당지질/마이코박테리아 복합체 둘 다 BCG 단독에 비해 비장 및 간에서 공동 자극 분자 CD80, CD86, CD70 및 4-1BB의 상향 조절을 유발하였다(도 4a 및 도 4b). MHC Ⅱ 및 공동 자극 분자에 의한 증가 배수를 도 4c 및 도 4d에 도시하였다. 통합된 α-C-GalCer 면역보강제는 간에서 CD86, CD70 및 41BB 분자의 보다 뚜렷한 상향 조절을 유발하였다(도 4d). MHC Ⅱ 상향 조절은 비장 또는 간에서 BCG에 의해 유발된 것과 유사하였다. 또한, 이 효과가 유전적으로 CD1d가 결핍된 마우스를 시험함으로써 비변이체 NKT 세포 활성화에 의존한다는 것이 확인되었다(데이터 도시 안 함).
이 결과는 세라미드 유사 당지질의 생물학적 활성이 BCG 세포벽으로의 통합 후 온전하는 것을 보여주었다. 특히, αGalCer-BCG 및 α-C-GalCer-BCG는, DC에서 CD80 및 CD86 및 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 포함하는 공동 자극 분자의 발현 증가에 의해 측정되는 것처럼 DC의 완전 성숙을 유발하였다. 세라미드 유사 당지질-복합체화 BCG에 비해 BCG 백신 단독이 제공된 마우스에서 성숙 및 공동 자극 마커의 상향 조절을 지연시켰고, 마찬가지로 마이코박테리아 항원에 대해 개선된 T 세포 반응에 기여하였다. 따라서, 세라미드 유사 당지질 통합된 BCG 세포가 주사된 마우스는 BCG 세포 단독과 비교하여 개선된 백신 영향을 가졌다.
실시예 5
세라미드 유사 당지질 면역보강제의 동시 투여에 의한 항원 특이적 CD8 T 프라이밍의 증강
이 실시예는 αGalCer 및 α-C-GalCer이 세포벽으로 안정하게 통합된 마이코박테리아가 BCG에 의해 발현된 마이코박테리아 항원에 대해 개선된 CD8 T 세포 반응을 나타낸다는 것을 입증하는 것이다. C57BL/6 마우스에 BCG-OVA와 복합체화된 α-GalCer 또는 BCG-OVA와 복합체화된 α-C-GalCer을 예방 주사하고, IFNγ ELISPOT에 의해 비장에서 SIINFEKL(서열 번호 1) OVA 펩티드 반응성 CD8 T 세포에 대해 분석하였다. 3주 또는 2달 동안 BCG-OVA 단독을 예방 주사한 마우스와 비교하여 BCG-OVA 백신과 복합체된 당지질이 투여된 마우스에서 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포의 상당히 증강된 프라이밍이 관찰되었다(각각 도 5a 및 도 5b). 내생 마이코박테리아 항원 TB10.4의 MHC-I 에피토프 GYAGTLQSL(서열 번호 2)에 대한 CD8 T 세포 프라이밍을 증강시키는 BCG와 복합체화된 αGalCer의 면역보강제 효과를 IFNγ ELISPOT에 의해 예방 주사된 BALB/c 마우스에서 분석하였다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE) 희석에 의해 CD8+ T 세포 활성화를 감염 5∼7일 후 평가하였다. αGalCer-복합체화 BCG 백신을 투여한 마우스는 예방 주사되지 않거나 BCG 단독으로 백신 주사된 것과 비교하여 증가된 GYAGTLQSL(서열 번호 2) 특이적 CD8 T 세포 반응을 나타냈다(도 5c). 이 결과는 세라미드 유사 당지질 및 BCG-OVA에 의한 예방접종 동안 NKT 세포를 활성화함으로써 마이코박테리아 항원 특이적 CD8 T 세포 반응이 증강된다는 것을 입증하였다.
SIINFEKL/H-2Kb 반응성 TCR 형질전환 OT-I 마우스로부터 얻은 CFSE 표지 나이브 T 세포의 입양 전달을 이용하여 백신 접종과 관련하여 SIINFEKL과 반응성인 MHC 클래스 I 제한 CD8+ T 세포의 프라이밍을 보여주었다. Hinchey J, et al., J Clin Invest 117: 2279-2288 (2007). Thy1.1+ B6.PL 마우스에 OT-I 마우스로부터 얻은 CFSE 표지 Thy1.2+ 비장세포를 주사한 후, BCG-OVA 단독, αGalCer/BCG-OVA 복합체 또는 α-C-GalCer/BCG-OVA 복합체로 백신 접종하였다. CD8+ T 세포 활성화 및 증식을 감염 5∼7일 후 이동 집단에서 CFSE의 희석에 의해 평가하였다(도 5d). (개별 세포의 백분율로서 나타낸) BCG-OVA로 감염된 마우스에서 이동된 OT-I T 세포의 부분 증식을 관찰하였다. 반대로, αGalCer/BCG-OVA 또는 α-C-GalCer/BCG-OVA 감염은 이동 T 세포의 증식의 상당한 증가를 유발하였다(도 5e).
실시예 6
세라미드 유사 당지질을 활성화하는 NKT 세포의 세포벽 통합은 M. 보비스 BCG 백신에 의해 유발된 보호 면역력을 증강시킨다
예방접종 및 공격 연구를 이용하여, 이 실시예는 마우스에 αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG 중 어느 하나로 백신 접종할 때 관찰되는 증강된 T 세포 프라이밍이 또한 BCG 백신의 보호 효과를 개선한다는 것을 입증하는 것이다.
나이브(식염수) 또는 5×106개의 살아 있는 BCG(Danish), αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG에 의한 피내 경로에 의해 2달 전 면역화된 C57BL/6 마우스를 악성 M. 튜버쿨로시스 H37Rv에 의한 저용량(50∼100 CFU) 에어로졸 감염에 의해 공격하였다. 나이브 마우스에서, 실질적인 폐 성장 및 비장으로의 확산이 공격 3주 및 6주 후 관찰되었다. 그러나, BCG(Danish), α-GalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG에 의한 백신 접종은 나이브 대조군과 비교하여 에어로졸 공격된 마우스의 폐 및 비장 둘 다에서 M. 튜버쿨로시스 박테리아 로드를 상당히 감소시켰다(도 6a 및 도 6b). α-C-GalCer-BCG 백신 접종은 폐 및 비장 둘 다에서 3주 시점에서 BCG보다 상당히 훌륭히 보호하였다. α-C-GalCer-BCG에 의한 예방접종은 또한, 공격 6주 후 기관 둘 다에서 CFU 감소에 의해 측정되는, BCG 예방접종과 비교하여 M. 튜버쿨로시스 감염의 조절에 더 연장된 효과를 보였다. 아마도 이 유사체가 뚜렷한 Th1 사이토카인 반응을 유발하기 때문에, C-글리코시드는 폐 및 비장에서 BCG 둘 다의 개선된 보호 효과를 개선하는 것처럼 αGalCer에 더 우수하였다. αGalCer-BCG 및 α-C-GalCer-BCG 예방접종에 의해 야기된 보호는 폐 및 비장에서서 6주 시점에서 BCG 백신 접종에 의해 얻은 것보다 상당히 컸다.
BCG, αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG 중 어느 하나에 의해 면역화된 마우스로부터 얻은 폐의 병리조직학적 검사는 광범위한 빈약하게 조직화된 육아종성 병변을 갖는 나이브 마우스와 비교하여 소형 및 촘촘한 림프구 풍부 육아종을 갖는 비교적 중등도 염증을 나타냈다(도 7a, 도 7d, 도 7c 및 도 7d). BCG 백신 접종된 마우스에서 관찰된 혼합된 조직구 및 림프구 침윤과 비교하여 αGalCer/BCG에 의해 백신 접종된 마우스에서 압도적인 림프구성 침윤이 관찰되었다.
따라서, αGalCer 또는 α-C-GalCer 통합된 BCG에 의한 단일 피내 예방접종은 M. 튜버쿨로시스 균주 H37Rv에 의한 에어로졸 공격에 대해 보호 면역력을 상당히 증강시켰다.
실시예 7
통합된 세라미드 유사 당지질의 면역보강제 활성은 CD1d를 필요로 하고, NKT 세포 활성화 특이적이다
이 실시예는 통합된 세라미드 유사 당지질에 의해 제공된 면역보강제 활성이 NKT 세포의 특이적 활성화에 의한 것이라는 것을 입증하는 것이다. 당지질에 의해 활성화된 비변이체 NKT 세포가 둘 다 결핍된 CD1d 넛아웃(KO) 마우스 또는 Jα18 KO 마우스에 의한 예방접종 및 공격 실험을 이용하였다. BCG 면역화 및 당지질 복합체화 BCG 면역화 CD1d KO 마우스(도 6c)와 Jα18 KO 마우스(도 6d) 사이에 보호의 차이가 관찰되지 않았다. 따라서, 비변이체 NKT 세포의 존재는 마이코박테리아 세포벽으로 통합된 세라미드 유사 당지질에 의한 야생형 마우스에서 제공되는 증강된 보호에 중요하다.
실시예 8
세라미드 유사 당지질 면역보강제에 의한 항원 특이적 CD4 T 세포 프라이밍
이 실시예는 αGalCer-BCG 및 α-C-GalCer-BCG가 Ag85B 마이코박테리아 항원의 p25에 대해 CD4 T 세포 반응을 증강시키지 않는다는 것을 입증하는 것이다. C57BL/6 마우스를 αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG로 백신 접종하고, IFNγ ELISPOT에 의해 비장에서 마이코박테리아 항원-85B의 P25 펩티드에 대한 CD4 T 세포 반응에 대해 분석하였다. BCG 단독으로 백신 접종된 마우스와 비교하여 당지질 복합체화 BCG 백신을 투여받은 마우스에서의 이 CD4 T 세포의 프라이밍에 있어서 차이가 관찰되지 않았다(도 8a, 도 8b 및 도 8c). CD4+ T 세포 활성화를 CFSE 희석에 의한 감염 7일 후 평가하였다. BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의한 백신 접종 2달 후 C57BL/6 마우스에서 폐에서의 림프구의 백분율은 αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG에 의해 상당한 증강이 없다는 것을 나타냈다(도 8d).
백신 접종과 관련하여 항원85B의 p25에 반응성인 MHC 클래스 Ⅱ 제한 CD4 T 세포의 프라이밍이 관찰되었다. p25-반응성 TCR 형질전환 마우스로부터 얻은 CFSE 표지 나이브 T 세포의 입양 전달을 이용하였다. Wolf AJ et al., J. Immunol. 179(4):2509-19 (2007). Thy1.1+ B6.PL 마우스에 p25 마우스로부터 얻은 CFSE 표지 Thy1.2+ 비장세포를 주사한 후, BCG 단독, αGalCer-BCG 또는 α-C-GalCer-BCG 중 어느 하나에 의해 백신 접종하였다. CD4+ T 세포 활성화 및 증식을 감염 7일 후 이동 집단에서 CFSE의 희석에 의해 평가하였다(도 8e). 이동 p25 T 세포의 상당한 증식이 BCG, αGalCer/BCG 또는 α-C-GalCer/BCG로 감염된 마우스에서 관찰되지 않았다(도 8f). BCG 단독 또는 BCG와 함께 세라미드 유사 당지질 면역보강제 중 어느 하나로 면역화된 마우스 사이에서 p25 CD4 T 세포의 활성화 및 증식이 유사하였다.
따라서, 당지질 면역보강제는 CD4 T 세포 반응에 영향을 갖는 것으로 보이지 않았다.
실시예 9
별개 투여 또는 BCG 단독과 비교하여 BCG로 통합된 세라미드 유사 당지질의 투여에 의한 항원 특이적 CD8 T 세포 프라이밍의 증강
이 실시예는 BCG 세포벽으로 통합된 세라미드 유사 당지질에 의한 백신 접종이 BCG-OVA + αGalCer의 별개 투여(상이한 부위에서 분리하여 주사됨), BCG-OVA + αGalCer의 혼합 투여(주사 직전 동일 주사기에서 함께 혼합됨) 또는 BCG-OVA 단독과 비교하여 마이코박테리아 항원에 대해 CD8 T 세포 반응을 증강시킨다는 것을 입증하는 것이다. 투여는 피내 주사에 의한다. 3마리 마우스를 군마다 면역화하였다. 별개, 혼합 또는 세포벽 통합 αGalCer 및 BCG에 의한 예방접종 이후 마우스에서 17일에 OVA 펩티드의 SIINFEKL(서열 번호 1) 잔기에 특이적인 CD8 T 세포를 생성하는 IFNγ에 대한 ELISPOT 검정은 BCG 세포벽으로 통합된 αGalCer에 의한 증강된 T 세포 프라이밍을 나타냈다(도 9a). αGalCer-BCG에 의한 예방접종 이후 마우스에서 TB10.3/4 Mtb 펩티드의 GYAGTLQSL(서열 번호 2) 잔기에 특이적인 CD8 T 세포를 생성하는 IFNγ에 대한 ELISPOT 검정은 또한 별개 또는 혼합 투여와 비교하여 증강된 활성을 나타냈다(도 9b). αGalCer/BCG에 의한 예방접종 이후 마우스에서 TB10.4에 특이적인 CD8 T 세포를 생성하는 IFNγ에 대한 ELISPOT 검정 및 (별개 또는 혼합 투여된) αGalCer + BCG-OVA에 의한 예방접종 이후 마우스에서 SIINFEKL에 특이적인 CD8 T 세포를 생성하는 IFNγ에 대한 ELISPOT 검정은 통합된 세라미드 유사 당지질이 별개 또는 혼합 투여와 비교하여 활성을 증강시킨다는 것을 나타냈다(도 10a 및 도 10b). αGalCer 대신에 α-C-GalCer을 사용하여 유사한 결과를 얻었다(도 11). 따라서, 물리적으로 결합된 세라미드 유사 당지질 면역보강제 및 마이코박테리아 세포는 CD8 T 세포의 개선된 증강을 나타냈고, 이것은 BCG와 같은 마이코박테리아 백신의 면역보강제 효과에 대한 기초인 것으로 생각된다.
이 결과는 마이코박테리아에 감염된 동일한 세포에 면역보강제를 직접적으로 전달함으로써, 세라미드 유사 당지질 면역보강제가 증강된 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 통합된 면역보강제는 사용하고자 하는 백신의 더 적은 용량을 허용할 뿐만 아니라, 국소 및 전신 독성을 감소시키고, 백신 제조 비용을 감소시킬 것으로 예상된다.
본원에 인용된 모든 공보(예컨대, 특허, 특허 출원, 저널 논문, 실험실 매뉴얼, 도서 또는 다른 문헌)의 전체 개시내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
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Claims (14)

  1. 박테리아 세포 및 상기 박테리아 세포에 대해 이종(heterologous)인 글리코실세라미드를 포함하는 변형 박테리아로서, 상기 글리코실세라미드는 상기 박테리아 세포의 세포벽으로 통합되고, 상기 변형 박테리아는 배양 배지에 박테리아 세포를 배양하고, 박테리아 세포의 세포벽으로 글리코실세라미드가 통합되는 조건하에 배양 배지에 글리코실세라미드를 첨가함으로써 수득가능하며, 상기 박테리아 세포는 마이코박테리아(Mycobacterial) 세포, 리스테리아(Listeria) 세포, 살모넬라(Salmonella) 세포, 예르시니아(Yersinia) 세포, 프란시셀라(Francisella) 세포 및 레지오넬라(Legionella) 세포로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 글리코실세라미드는 자연 살해 T(NKT) 세포를 자극하는 것인 변형 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리코실세라미드는 α-갈락토실세라미드를 포함하는 것인 변형 박테리아.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글리코실세라미드는 하기 (i) 내지 (xiii) 중 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 것인 변형 박테리아:
    (i)
    Figure 112017074270754-pat00027
    (화학식 I)
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; 또는 R1은 -C(OH)-R3이며, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; 또는 R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이며, 여기서 (a) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, 또는 (b) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하고;
    R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
    (b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
    (c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
    (d) -CH=CH(CH2)xCH3,
    (e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
    중 하나이며, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수이고;
    R4는 α 결합 또는 β 결합 모노사카라이드이거나, 또는 R1이 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸일 때, R4는
    Figure 112017074270754-pat00028
    이며,
    A는 O 또는 -CH2인, 화학식 I;
    (ii) R1은 -(CH2)22CH3 또는 -(CH2)24CH3인, 화학식 I;
    (iii) R2는 -CH(OH)-(CH2)13CH3인, 화학식 I;
    (iv) R4는 갈락토실, 만노실, 푸코실 또는 글루코실인, 화학식 I;
    (v)
    Figure 112017074270754-pat00029
    (화학식 Ⅱ)
    R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; 또는 R1은 -C(OH)-R3이며, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이고;
    R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
    (b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
    (c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
    (d) -CH=CH(CH2)xCH3,
    (e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
    중 하나이며, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수인, 화학식 II;
    (vi) R2는 -CH(OH)(CH2)xCH3이며, 여기서 X는 4∼13 범위의 정수인, 화학식 II;
    (vii) R1은 (CH2)9CH=CH-CH2-CH=CH(CH2)4CH3, (CH2)8CH=CH-CH2-CH=CH(CH2)4CH3, (CH2)7CH=CH-CH2-CH=CH(CH2)4CH3, (CH2)3CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)4CH3, (CH2)3CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH3, (CH2)7CH=CH-CH2-CH=CH=(CH2)4CH3, (CH2)7CH=CH-CH=CH(CH2)5CH3, (CH2)8CH=CH-CH=CH(CH2)4CH3, (CH2)9CH=CH-CH=CH(CH2)5CH3, (CH2)6CH=CH-CH=CH-CH=CH(CH2)4CH3, (CH2)6CH=CH-CH=CH-CH=CH(CH2)4CH3 및 (CH2)7CH=CH-CH=CH-CH=CH(CH2)3CH3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화학식 II;
    (viii)
    Figure 112017074270754-pat00030
    (화학식 Ⅲ)
    R은 H 또는 -C(O)R1이며, 여기서 R1은 선형 또는 분지형 C1-C27 알칸 또는 C2-C27 알켄이거나; 또는 R1은 -C(OH)-R3이며, 여기서 R3은 선형 또는 분지형 C1-C26 알칸 또는 C2-C26 알켄이거나; 또는 R1은 C6-C27 알칸 또는 알켄이며, 여기서 (a) C6-C27 알칸 또는 알켄은 C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리로 치환되거나, 또는 (b) C6-C27 알칸 또는 알켄은, C6-C27 알킬 또는 알케닐 쇄 내에, C5-C15 사이클로알칸, C5-C15 사이클로알켄, 이종원자 고리 또는 방향족 고리를 포함하거나; 또는 R1은 -(CH2)nR5이며, 여기서 n은 0∼5 범위의 정수이고, R5는 -C(O)OC2H5, 임의로 치환된 C5-C15 사이클로알칸, 임의로 치환된 방향족 고리 또는 아랄킬이고;
    R2는 (a) -CH2(CH2)xCH3,
    (b) -CH(OH)(CH2)xCH3,
    (c) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)2,
    (d) -CH=CH(CH2)xCH3,
    (e) -CH(OH)(CH2)xCH(CH3)CH2CH3
    중 하나이며, 여기서 X는 4∼17 범위의 정수인, 화학식 III;
    (ix) R1은 옥소; 하이드록시; 할로겐; 페닐; -OC(O)R6; -R6; -C(O)R6; 또는 N(R6)2로 치환되고, 각각의 R6은 독립적으로 할로겐; 하이드록시; -OC(O)R7; -OR7; -C(O)R7 또는 N(R7)2로 임의로 치환된 방향족 고리, C1-C6 알킬 또는 수소이고, 각각의 R7은 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬인, 화학식 III;
    (x) R1은
    Figure 112017074270754-pat00031

    Figure 112017074270754-pat00032

    Figure 112017074270754-pat00033

    Figure 112017074270754-pat00034

    Figure 112017074270754-pat00035

    Figure 112017074270754-pat00036

    Figure 112017074270754-pat00037

    Figure 112017074270754-pat00038

    Figure 112017074270754-pat00039

    Figure 112017074270754-pat00040

    Figure 112017074270754-pat00041
    및
    Figure 112017074270754-pat00042

    로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, ( )는 화학식 Ⅲ의 화합물에 대한 R1의 부착점을 나타내는 것인, 화학식 III;
    (xi) (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(KRN7000);
    (xii) (2S,3S)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3-옥타데칸디올; 및
    (xiii) (2S,3S,4R)-1-CH2-(α-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(α-C-GalCer).
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 복합체(MTBC: M. tuberculosis complex) 세포 및 비결핵성 마이코박테리아(NTM: nontuberculous mycobacterial) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형 박테리아.
  5. 제4항에 있어서, 상기 MTBC 세포는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 세포, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 세포, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 바실 칼멧-게랭(BCG: bacille Calmette-Guerin) 세포, 마이코박테리움 아프리카눔(Mycobacterium africanum) 세포, 마이코박테리움 카네티(Mycobacterium canetti) 세포, 마이코박테리움 카프라(Mycobacterium caprae) 세포 및 마이코박테리움 핀니페디(Mycobacterium pinnipedii) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형 박테리아.
  6. 제1항에 있어서, 박테리아 세포에서 유래한 항원에 대한 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 증강시키는 변형 박테리아.
  7. 제1항에 있어서, 상기 변형 박테리아는 재조합 박테리아 세포이고, 상기 재조합 박테리아 세포는 상기 박테리아 세포에 대해 이종(heterologous)인 면역원성 폴리펩티드인 항원에 대한 담체인 변형 박테리아.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변형 박테리아 및 약학적 담체를 포함하는 박테리아 감염성 질환의 치료를 위한 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 결핵, 한센병, 결핵 유사 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 및 파종성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 마이코박테리아 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 면역보강제를 더 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변형 박테리아를 포함하는, 결핵의 치료 또는 예방을 위한 조성물로서, 상기 마이코박테리아 세포는 MTBC 세포인 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 변형 박테리아를 포함하는, 동물에서 박테리아 세포에서 유래한 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변형 박테리아를 포함하는, 결핵의 치료 또는 예방을 위한 조성물로서, 상기 마이코박테리아 세포는 BCG 세포인 것인 조성물.
  14. (a) 박테리아 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 박테리아 세포에 대해 이종성(heterologous)이고 자연 살해 T(NKT) 세포를 자극하는 글리코실세라미드를, 글리코실세라미드가 상기 박테리아 세포의 세포벽에 통합되도록 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하며, 상기 박테리아 세포는 마이코박테리아(Mycobacterial) 세포, 리스테리아(Listeria) 세포, 살모넬라(Salmonella) 세포, 예르시니아(Yersinia) 세포, 프란시셀라(Francisella) 세포 및 레지오넬라(Legionella) 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인, 글리코실세라미드 및 박테리아 복합체의 제조 방법.
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