KR101928075B1

KR101928075B1 - 항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101928075B1
Application number: KR1020170092223A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2018-12-11
Also published as: KR20170119304A

Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 염증 세포의 증식을 억제함으로써 결과적으로 항염증 활성을 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having Activities for Anti-inflammation and Uses Thereof}

본 발명은 항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 및 이의 용도에 관한 것이다.

염증반응은 조직 또는 세포가 손상되거나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역세포가 관련되어 나타나는 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생하는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다.

정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알레르기성 염증질환 등이 나타나게 되며 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 세균 감염 및 종양 질환에 대한 숙주 면역 반응 중에 활성화된 대식세포 및 여러 다양한 세포에 의해 생성된다. 이 사이토카인은 염증 반응의 중요한 매개체로도 알려져 있는데, 류마티스성관절염(RA), 건선성 관절염, 크론병, 건선, 강직성척수염(AS)과 같은 염증성 질환에 중요한 역할을 담당하고 있는 염증성 사이토카인이다. 예를 들면, 류마티스성관절염에서 TNF-α는 활액 염증을 지속시키고 뼈와 연골을 지속적으로 파괴시킨다. 따라서, TNF-α의 특이적 생물 활성을 억제하는 것이 요구되므로, TNF-α가 매개되는 세포 반응을 막고 염증 전 사이토카인의 활성과 TNF-α에 의해 조절되는 과정을 조정하고자 하는 목적으로 TNF-α를 억제하는 다양한 생물학적 제제가 개발되고 있다.

현재 염증 치료제로는 부신피질 호르몬 성분을 이용한 덱사메타손, 코티손 등이 있다. 그러나 이들은 염증 치료제로서 작용을 하기는 하나, 독성이 강하며, 부작용으로서 부종 같은 증상을 일으키기도 한다. 또한, 염증 원인에 대하여 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다[Check W.A. and Kaliner M.A., Am. Rev. Respir. Dis., 141, p44∼51. 1990].

또한, 현존하는 항염증제인 부신피질 호르몬 성분을 이용한 스테로이드 약제로 부종과 같은 심한 부작용을 나타내므로 부작용이 없는 비스테로이드 성분의 약제의 개발이 시급한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1247350호 대한민국 등록특허 제10-1257228호

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 항염증 활성을 나타낸다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 항염증 활성을 나타낸다는 것을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

박테리아성 내독소인 LPS(Lipopolysaccharide)는 대식세포에서 iNOS, COX-2, TNF-α, 세포 내 ROS, 그리고 다양한 인터루킨들과 같은 염증인자의 생성을 촉진시킨다(Hinz, B., Brune, K. Cyclooxygenase-2--10 years later. J Pharmacol Exp Ther 300(2):367-375, 2002., 마우스 대식세포에서 혈갈(血竭)의 항산화 및 항염증 효과. 大韓本草學會誌 23(2):179-192, 2008.). 따라서 LPS에 의해서 생성되는 염증인자들을 억제하는 물질은 대식세포의 활성과 연관된 다양한 염증 질환들의 치료에 유용하게 쓰일 수 있다고 간주된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 염증관련 인자인 COX-2의 발현을 억제하며, ROS의 생성을 감소시키고, T 세포의 활성화를 억제함으로써 궁극적으로 염증 반응을 억제한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-2, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-15, IL-18, GM-CSF, IFN-α의 발현을 억제한다. 보다 바람직하게는 본 발명의 펩타이드는 TNF-α, IL-2, IFN-γ의 발현을 억제한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성을 자극함으로써 염증 반응 조절에 중요한 역할을 하는 효소인 COX-2의 발현을 억제한다. COX-2는 정상상태에서는 거의 발현되어 있지 않다가 염증인자나 사이토카인, 엔도톡신, 종양형성 유전자와 같은 미토겐 자극에 의해서 빠른 속도로 발현된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 염증 반응에서 중요한 인자인 ROS(reactive oxygen species)의 생성을 감소시킨다. 세포 내에 존재하는 미토콘드리아, XOD(peroxisome, xanthine oxidase), NADPH 산화효소 및 COX 등의 효소들은 지속적으로 ROS를 생성하고, RNS(reactive nitrogen species)는 염증반응 시 대식세포, 호중구 및 다른 면역 세포들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다(Delanty, N., Dichter, M.A. Oxidative injury in the nervous system. Acta Neurol Scand 98: 145-153, 1998., Brune, B., Zhou, J., Von Knethen, A. Nitric oxide, oxidative stress, and apoptosis. Kidney Int Suppl 84: 22-24, 2003.). 염증반응은 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 일련의 활성기전으로 대단히 복잡한 기전으로 조절된다. 중요한 것은 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고, 그 결과 영구적인 유전자의 변형이 야기되어 병태가 유발된다는 것이다(Kaplanski, G., et al., IL-6: a regulator of the transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation. Trends Immunol 24(1):25-29, 2003.). 이처럼 ROS와 RNS는 염증반응과 아주 깊은 관련이 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 T 세포의 활성화를 억제시킨다. 본 발명의 펩타이드는 LPS로 염증반응을 유도한 세포에서 T 세포 활성 발현 마커인 CD3 및 CD25의 발현을 억제한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 염증 세포의 증식을 억제시킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “인 비보”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하며 염증 세포의 증식을 억제하여 염증 반응을 억제함으로 염증성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

본 발명의 항염증용 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 염증질환은 아토피 피부염, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병 및 다발경화증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조될 경우, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 염증 세포의 증식을 억제함으로써 결과적으로 항염증 활성을 나타낸다.

(ⅲ) 본 발명의 펩타이드는 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 의한 TNF-α 및 IL-2의 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
(a) 서열목록 제1서열 펩타이드, (b) 서열목록 제2서열 펩타이드, (b) 서열목록 제3서열 펩타이드.
도 2는 본 발명의 펩타이드에 의한 COX2의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
(a) 서열목록 제1서열 펩타이드, (b) 서열목록 제2서열 펩타이드, (b) 서열목록 제3서열 펩타이드.
도 3은 본 발명의 펩타이드에 의한 TNF-α 및 INF-γ 분비 변화를 ELISA로 확인한 결과이다.
(a) 서열목록 제1서열 펩타이드, (b) 서열목록 제2서열 펩타이드, (b) 서열목록 제3서열 펩타이드.
도 4는 본 발명의 펩타이드에 의한 ROS 생성 감소를 측정한 결과이다.
(a) 서열목록 제1서열 펩타이드, (b) 서열목록 제2서열 펩타이드, (b) 서열목록 제3서열 펩타이드.
도 5는 비장세포에 본 발명의 펩타이드에 처리하고 의한 CD3+, CD25+ 세포를 FACS를 통해 분석한 결과이다.
(a) 서열목록 제1서열 펩타이드, (b) 서열목록 제2서열 펩타이드, (b) 서열목록 제3서열 펩타이드.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dechloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10㎖를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Asp(OtBu)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Met-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Thr-Met-Arg-Asp 펩타이드 1을 0.8 g 합성하였다(수율: 90.1%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 521.6 (이론값 : 521.5)를 얻을 수 있었다. 다른 서열 2 및 3 펩타이드도 위와 같은 방법으로 합성을 진행하였다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
번호	아미노산 서열	분석치	이론치
서열 1 (펩타이드-1)	Thr-Met-Arg-Asp	521.6	521.5
서열 2 (펩타이드-2)	Asp-Asn-Cys-Leu-Arg	619.7	619.6
서열 3 (펩타이드-3)	Gly-Val-Gln-His-Gln-Ala-Ser-Pro-Tyr	986.0	986.0

실시예 1: TNF-α & IL-2 RT-PCR

6-7주령 마우스를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 RBC (적혈구)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 사용하였다. 2회 동안 RBC를 제거하고 무혈청 RPMI1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI1640 배지를 첨가하였다. 세포 수를 측정하여 96웰 플레이트(1 x 10⁶ 세포/웰), 24웰 플레이트(1 x 10⁷ 세포/디쉬)에 시딩하였다. 이튿날, 각각의 펩타이드 샘플(0.2, 2, 20 μg/ml)과 자극제인 LPS를 처리하였다. 이때 타임 포인트를 맞추어 실험을 진행하였다.

Easy Blue(Intron)를 사용해 전체 RNA를 추출하였다. RNA로부터 단일가닥 DNA를 합성하기 위해서 RT 프리믹스(Intron)를 사용하여 3 ug RNA, 랜덤 헥사머 2 μg과 DEPC를 처리한 물을 가하여 총 20 μl가 되게 하고 65℃에서 5분, 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 95℃에서 5분간 가열하여 cDNA를 만들었다. PCR은 PCR 프리믹스(Intron)를 사용하여 3 μl cDNA, CGI 58 유전자에 특이적인 10 pmole의 프라이머를 PCR 프리믹스에 혼합하여 시행하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초, 55-56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 반응시켰다. 사이클 수 유전자들은 PCR 결과가 지수적으로 증폭할 수 있는 조건에서 분석하였다. PCR 산물의 5 μl을 얻어 1% 아가로스 겔에 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 확인하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
TNF-α 정방향	CGTCAGCCGATTRTGCTATCT
TNF-α 역방향	CGGACTCCGCAAAGTCTAAG
IL-2 정방향	CTCGCTTCCTGTGTCACATT
IL-2 역방향	ATCCTGGGGAGTTTCAGGTT

PCR 결과, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 처리 시 TNF-α, IL-2의 발현이 감소하는 경향이 나타났다(도 1a-c).

실시예 2: 웨스턴 블롯

실시예 1에서 수득한 비장세포를 이용하여 1×10⁷ 세포/웰의 세포 밀도로 24웰 플레이트에 시딩한다. 하룻밤 동안 배양한 후, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드를 농도별(0.2-20 μg/ml)로 처리하고 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양 후 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보한 후 단백질을 정량한다. 염증유도 인자인 COX2 에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯 결과, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 처리 시 COX2의 발현이 감소하였다(도 2a-c).

실시예 3: ELISA

3-1: ELISA(비장세포)

실시예 1에서 펩타이드 샘플과 자극제인 LPS를 처리한 비장세포를 48시간 후 배양 배지를 수거, 얻는 배지는 확인하고자 하는 사이토카인(TNF-α, INF-γ)의 ELISA 키트(R&D system)를 사용하여 실험을 실시하였다.

3-2: ELISA(Raw264.7 세포)

Raw264.7 세포를 1 x 10⁶ 세포/48웰로 시딩하고 하룻밤동안 배양하였다. 확인하고자 하는 시료를 세포에 0.2, 2, 20 μg/ml 전 처리하고 30분 뒤에 자극제인 LPS를 처리하였다. 계획한 타임 포인트에 맞춰 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 수거, 얻는 배지는 확인하고자 하는 사이토카인(TNF-α)의 ELISA 키트(R&D system)를 사용하여 실험을 실시하였다.

ELISA 결과, 서열목록 제1서열 및 제2서열의 펩타이드 처리 시 비장세포에서 TNF-α, INF-γ 분비가 감소하였고, RAW264.7에서 TNF-α 분비가 감소하는 경향이 나타났다(도 3a-b).

또한, 서열목록 제3서열의 펩타이드 처리 시 비장세포에서 TNF-α 분비 변화는 없었고, RAW264.7에서 TNF-α 분비가 감소하였다(도 3c).

실시예 4: 증식 어세이 및 FACS

4-1. 증식 어세이(비장세포)

실시예 1에 기재된 바와 같이 펩타이드 샘플과 자극제인 LPS를 처리하고 24시간 뒤에 Ez-cytox 키트를 이용하여 실험을 실시하였다.

4-2. FACS[세포 내 ROS 어세이(DCF-DA)]

Raw264.7 세포를 1 x 10⁶ 세포/6웰로 시딩하고 하룻밤동안 배양하였다. 확인 하고자 하는 시료를 세포에 1, 10, 50 μg/ml로 전처리하고 30분 뒤에 자극제인 LPS를 처리하였다. 계획한 타임 포인트에 맞춰 배양한 후 DCF-DH를 처리 30분 후 FACS를 이용하여 형광의 정도로 산화 활성을 측정하였다. FACs 결과, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 처리 시 ROS 생성이 감소하였다. 또한, 증식 어세이에서 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 처리 시 비장세포 생존율이 감소하였다(도 4a-c).

실시예 5: 활성화 T 세포 분석(FACS 시스템)

실시예 1에 기재된 바와 같이 펩타이드 샘플과 자극제인 LPS를 처리하고 24시간 후 항체(CD3, CD25) 활성화 T 세포 마커를 30분간 처리 후 PBS로 2회 세척하여 FACS 분석을 실시하였다.

FACs 결과, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 펩타이드 처리 시 CD3+, CD25+ 세포가 감소하였다(도 5a-c).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptides Having Activities for Anti-inflammation and Uses Thereof <130> PN160091 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Peptide 1 <400> 1 Thr Met Arg Asp 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Peptide 2 <400> 2 Asp Asn Cys Leu Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Peptide 3 <400> 3 Gly Val Gln His Gln Ala Ser Pro Tyr 1 5 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> TNF-alpha Forward Primer <400> 4 cgtcagccga ttrtgctatc t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> TNF-alpha Reverse Primer <400> 5 cggactccgc aaagtctaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> IL-2 Forward Primer <400> 6 ctcgcttcct gtgtcacatt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> IL-2 Reverse Primer <400> 7 atcctgggga gtttcaggtt 20

Claims

서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 2 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-2 및 INF-γ로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증성 사이토카인인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 ROS 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 염증 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 T 세포의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병 및 다발경화증 중 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.