KR101924071B1 - 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법 - Google Patents

미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에탄올 추출 후에 헥산을 이용한 세정 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물 내의 클로로필 a의 순도를 증진시키는 방법 및 클로로필 a의 순도가 증진된 미세조류 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 컬럼(column)을 이용한 순도 증진 방법에 비해 경제적인 방법이며, 본 발명의 제조방법으로 제조된 클로로필 a 함유 미세조류 추출물은 식품 또는 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법{Method for enhancing chlorophyll a purity in microalgae extract}
본 발명은 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법 및 클로로필 a의 순도가 증진된 미세조류 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
미세조류는 당질, 지질, 단백질, 색소, 비타민, 스테로이드 및 기타 의약성분 등의 유용성분과 수소, 탄화수소, 생화학 연료 등의 다양한 물질들을 생산한다. 또한, 광합성 효율이 높고 성장속도가 빠르며 지질 생산성이 높다. 미세조류는 광합성을 통해 생태계의 1차 생산자 역할을 함으로써, 해양 생물 양식에서 잠재적인 식품 소재로 이용될 수 있다. 또한, 대체에너지원, 식품, 건강보조식품, 수산 양식용 사료, 의약 원료물질, 생화학 물질 등 미세조류의 응용분야가 넓어지고 있다. 따라서, 미세조류의 분리 및 물질 탐색, 대량 생산 기술 등이 지속적으로 개발된다면 생리활성물질의 산업적 생산도 이루어질 수 있을 것이다.
해양 단세포 미세조류인 난노클로롭시스는 진안점조강(Eustigmatophyceae)의 일종으로 직경이 2-4 ㎛ 정도인 식물 플랑크톤이다. 난노클로롭시스 속 미세조류는 단세포 녹조류로 양식용 사료로 이용되며, 최적영양조건이 충족될 경우, 지질함량이 다른 미세조류에 비해 매우 높은 특성이 있다. 또한, 광합성 미세조류로서 배양이 용이하고 스테롤(sterol) 또는 EPA(eicosapentaenoic acid)의 지질 함량이 높아 고부가가치 기능성 식품으로서 이용가치가 높다.
난노클로롭시스 속 미세조류 중 하나인 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica)는 직경이 1-3 ㎛인 원형의 단세포 해양 미세 녹조류로서 클로렐라(chlorella)와 유사하지만, 클로로필의 조성에 차이가 있다. 클로렐라에는 광합성 작용을 하는 엽록소인 클로로필 a와 b가 3:1 비율로 함유되어 있으나, 난노크로롭시스 오세아니카에는 클로로필 a만 함유되어 있다. 클로로필 a는 세포재생, 항암, 미백, 주름개선 등에 효과가 있는 것으로 알려졌으나, 고순도로 분리 및 정제하는데 어려움이 있어 클로로필 a의 활용에 제약을 받고 있다.
현재까지 난노클로롭시스 속 미세조류에 대한 연구는 산업적 생산을 위한 대량 배양에 초점이 맞춰져 있었으며, 난노클로롭시스로부터 생리 활성 물질을 효과적으로 생산하는 가공 기술에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 난노클로롭시스로부터 새로운 생리 활성 물질을 추출하여 제품의 부가가치를 높일 수 있는 기술의 개발이 더욱 필요하다고 할 수 있다.
한편, 한국등록특허 제1323873호에는 '성장률이 우수한 난노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0062979호에는 'Nannochloropsis EP1 미세조류 배양용 배지 조성물 및 상기 미세조류의 용도'가 개시되어 있으나 본 발명의 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 미세조류 난노클로롭시스 오세아니카의 에탄올 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명자들은 난노클로롭시스 오세아니카 에탄올 추출물 내 유효물질인 클로로필 a의 순도를 증진시키기 위해, 헥산을 이용하여 세정하는 단계에서 헥산의 혼합비율 및 교반 시간 등의 조건을 확립하고, 최종적으로 90% 이상의 순도를 가진 클로로필 a 함유 추출물을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계; (3) 상기 (2) 단계의 제조된 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 첨가하고, 교반하여 혼합하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계; (5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 첨가하고, 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계; (6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및 (7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 혼합하고, 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물 내의 클로로필 a의 순도를 증진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 클로로필 a의 순도가 증진된 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 클로로필 a가 증진된 미세조류 추출물을 제공한다.
본 발명의 미세조류 추출물 내의 클로로필 a의 순도를 증진시키는 방법은 일반적으로 사용되는 컬럼(column)을 이용한 순도 증진 방법에 비해, 저렴한 비용으로 대량의 클로로필 a를 처리할 수 있어 산업적으로 경제적인 방법이다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 클로로필 a가 증진된 난노클로롭시스 오세아니카의 추출물은 식품, 건강기능식품, 의약품 등의 원료로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 미세조류 난노클로롭시스 오세아니카의 에탄올 추출물 내의 클로로필 a 함량을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a의 피크에 해당된다.
도 2는 미세조류 추출물에 헥산을 사용한 정제 및 세정 과정을 통해 수득된 헥산 분획층 내의 클로로필 a의 함량을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 제조된 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 첨가하고, 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 첨가하고, 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 혼합하고, 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물 내의 클로로필 a의 순도를 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법에 있어서, 상기 미세조류는 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 속 미세조류일 수 있고, 바람직하게는 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 난노클로롭시스 그라눌라타(N. granulata), 난노클로롭시스 림네티카(N. limnetica), 난노클로롭시스 오큘라타(N. oculata) 또는 난노클로롭시스 살리나(N. salina)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 난노클로롭시스 오세아니카일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법은 구체적으로는,
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 4~6배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:0.8~1:1.2 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.1~1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로는,
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 5배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:1 (v:v) 비율로 첨가하고, 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.5 (v:v) 비율로 첨가하고, 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.3 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 (5) 및 (6) 단계는 반복적으로 수행함으로써 추출물 내 클로로필 a의 순도를 증진시킬 수 있고, 반복 횟수는 바람직하게는 5~7회 반복 수행할 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 추출물 내의 불순물 제거 정도에 따라 반복 횟수를 결정할 수 있다.
본 발명의 상기 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법은 클로로필 a를 함유한 미세조류 에탄올 추출물을 헥산을 이용하여 세정하는 단계를 포함함으로써, 추출물 내 클로로필 a의 순도를 90% 이상 증진시킬 수 있다.
본 발명은 또한,
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 제조된 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 첨가하고, 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 첨가하고, 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 혼합하고, 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 혼합하고, 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류 추출물의 제조방법은 구체적으로는,
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 4~6배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:0.8~1:1.2 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.1~1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로는,
(1) 배양된 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 5배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:1 (v:v) 비율로 첨가하고, 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.5 (v:v) 비율로 첨가하고, 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.3 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 5분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 제조방법에 있어서, 상기 미세조류는 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된, 클로로필 a의 순도가 증진된 미세조류 추출물을 제공한다. 본 발명의 상기 미세조류 추출물은 클로로필 a의 순도가 90% 이상인 추출물로, 바람직하게는, 미세조류의 에탄올 추출물의 헥산 분획물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고순도의 클로로필 a가 함유된 미세조류 추출물의 제조
단계 1 : 미세조류의 에탄올 추출물 제조
배양된 난노클로롭시스 오세아니카를 3,700 rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하고 상등액을 버린 후, 바닥에 가라앉은 슬러지(sludge)를 회수하였다. 회수된 슬러지에 물을 슬러지 중량 대비 4배를 혼합하여 3,700 rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하고 상등액을 버린후, 다시 슬러지를 회수하여 미세조류 슬러지 내의 해수를 제거하였다. 상기 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 순도 99% 이상 에탄올을 슬러지 중량 대비 5배 첨가하여 12~24시간 동안 교반시킨 다음, 3,700 rpm의 조건으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수한 후 미세조류 에탄올 추출물을 수득하였다. 에탄올에 의한 추출 침전 과정을 총 2회 반복 실시하였다.
단계 2 : 헥산을 사용한 미세조류 추출물의 정제 및 세정
상기 단계 1에서 수득된 미세조류 에탄올 추출물 20ℓ에 헥산 20ℓ를 첨가하여 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 혼합하였다. 에탄올 추출물과 헥산의 혼합물에 물 20ℓ를 첨가하고 5분 동안 정치한 후, 분리된 층(layer) 중에서 상층(upper layer)의 헥산층만 분리하였다.
상기 수득된 헥산 분획층 20ℓ에 에탄올 10ℓ를 첨가하여 300 rpm의 조건으로 3분 동안 교반하여 혼합하였다. 헥산 분획층과 에탄올의 혼합물에 물 10ℓ를 첨가하여 5분 동안 정치한 후, 헥산층만 분리하는 과정을 6회 반복하였다. 6회 세정한 다음, 수득된 헥산 분획층 20ℓ에 물 10ℓ를 첨가하고 5분 동안 정치시킨 후, 하층의 물만 제거하여 헥산층만 분리하는 과정을 2회 반복함으로써, 최종적으로 클로로필 a의 순도를 증진시키기 위한 세정 단계를 완료하였다.
실시예 2. 미세조류 추출물 및 헥산 분획층 내의 클로로필 a 순도 측정
상기 단계 1에서 수득된 미세조류 에탄올 추출물과 단계 2에서 수득된 헥산 분획층을 취하여 HPLC(high pressure liquid chromatography)를 수행하여 추출물 또는 분획층 내의 클로로필 a의 순도를 분석하였다.
그 결과, 미세조류 에탄올 추출물의 경우, 보유 시간(retention time) 약 17.88분에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 42.11%의 클로로필 a가 함유되어 있음을 확인하였다(도 1). 또한, 헥산 분획층의 경우, 보유 시간 약 18.495분에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 90.199%의 클로로필 a가 함유되어 있음을 확인하였다(도 2).
상기의 결과를 통해, 본 발명의 헥산을 이용한 세정 방법이 추출물 내의 클로로필 a의 함량 및 순도를 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 방법은 컬럼을 이용한 클로로필 a의 정제 방법에 비해, 클로로필 a의 대량 생산을 위해서 보다 경제적이고 효율적인 방법으로, 클로로필 a의 활용성을 보다 증가시킬 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. (1) 배양된 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 속 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 4~6배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:0.8~1:1.2 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
    (4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
    (5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
    (6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.1~1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
    (7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물 내의 클로로필 a의 순도를 증진시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (5) 및 (6) 단계를 5~7회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 미세조류 추출물 내의 클로로필 a 순도를 증진시키는 방법.
  5. (1) 배양된 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 속 미세조류의 슬러지를 회수하고 해수를 제거하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계의 해수가 제거된 미세조류 슬러지에 에탄올을 슬러지 중량 대비 4~6배 혼합하여 미세조류 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계의 미세조류 에탄올 추출물에 헥산을 1:0.8~1:1.2 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 혼합하는 단계;
    (4) 상기 (3) 단계의 에탄올 추출물 및 헥산 혼합물에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계;
    (5) 상기 (4) 단계의 수득한 헥산 분획층에 에탄올을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 첨가하고, 280~320 rpm의 조건으로 1~5분 동안 교반하여 헥산과 에탄올을 혼합하는 단계;
    (6) 상기 (5) 단계의 헥산과 에탄올 혼합물에 물을 1:0.1~1:0.5 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 세정된 헥산 분획층을 수득하는 단계; 및
    (7) 상기 (6) 단계의 세정된 헥산 분획층에 물을 1:0.3~1:0.7 (v:v) 비율로 혼합하고, 3~7분 동안 정치하여 고순도의 클로로필 a가 함유된 헥산 분획층을 수득하는 단계를 포함하는, 클로로필 a의 순도가 증진된 미세조류 추출물의 제조방법.
  6. 제5항의 제조방법으로 제조된 클로로필 a 순도가 증진된 미세조류 추출물.
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