KR101919859B1

KR101919859B1 - 각시붕어와 흰줄납줄개의 교잡종 및 그 교잡 방법

Info

Publication number: KR101919859B1
Application number: KR1020180030837A
Authority: KR
Inventors: 박재민; 임후순
Original assignee: 경상북도 (수산자원연구소 토속어류산업화센터장)
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2018-11-19

Abstract

각시붕어와 흰줄납줄개가 자연 하천에서 혼서하는 것이 확인됨에 따라 자연 교잡종의 출현 가능성을 시사하고 있어 종간 잡종을 통해 부모개체와 교잡개체 간의 형태, 계수, 계측형질을 비롯한 인공채란, 난 발생 과정 및 자치어 형태발달 등을 조사하여 분류학적인 기초자료를 제공할 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명은 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 수컷과 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하거나, 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하고, 이들 간의 인공수정을 실시하여 수정란을 얻고, 상기 수정란을 부화하는 단계를 포함하는 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종 생산 방법을 제공한다.

Description

각시붕어와 흰줄납줄개의 교잡종 및 그 교잡 방법{Hybridized species of Rhodeus uyekii and Rhodeus ocellatus, and process for preparing same}

본 발명은 담수어류의 교잡종 및 그 교잡 방법에 관한 것이다.

담수어류의 교잡은 종종 자연에서 잡종개체가 출현하기도 하며, 종간 혹은 속간 인공 교잡을 통해서 생식적인 격리와 계통 유연관계를 논의하기도 한다(비특허문헌 1 참조). 특히 잉어과 어류들은 자연에서의 잡종개체가 빈번하게 발견된다고 알려져 있고(비특허문헌 2 참조), 어류에 있어서 종간 잡종은 진화학적 연구뿐만 아니라 산업적 측면에서도 매우 중요한 역할을 하며, 잡종강세를 통하여 상업적으로 유용한 형질을 발현시킬 수 있다(비특허문헌 3 참조).

잉어목(Cypriniformes) 잉어과(Cyprinidae) 납자루아과(Acheilognathinae) 어류는 몸에 비해 체고가 높은 소형 담수어류로 전 세계 약 40종이 보고되어 있고, 납자루아과 어류는 유럽과 지중해 지역에 출현하는 납줄개 Rhodeus sericeus, R. amarus, R. colchicus 등 3종을 제외한 나머지 종들이 주로 동남아시아, 중국, 한국 및 일본 등지에 분포한다고 보고하였으나(비특허문헌 4 참조), 우리나라에는 1939년 Uchida에 의해 납줄개가 서식하는 것으로 보고되어 유럽과 지중해 지역을 비롯한 우리나라에도 분포하기 때문에 수정되어야 할 것으로 보인다.

우리나라에 서식하는 납줄개속(Rhodeus) 어류는 각시붕어(R. uyekii)를 비롯하여 흰줄납줄개(R. ocellatus), 떡납줄갱이(R. notatus), 한강납줄개(R. psedosericeus), 납줄개 및 현재 멸종된 것으로 보고된 서호납줄갱이(R. hondae)를 포함한 6종이 서식하고 있다. 이외에 큰납지리속(Acanthorhodeus)의 큰납지리(A. macropterus)1종, 납자루속(Acheilognathus)의 가시납지리(A. chankaensis), 칼납자루(A. koreensis), 납자루(A. lanceolata intermedia), 큰줄납자루(A. majusculus), 납지리(A. rhombeus), 묵납자루(A. signifer), 임실납자루(A. somjinensis), 줄납자루(A. yamatsutae) 등 8종을 포함하여 총 15종의 납자루아과 어류가 서식하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5 내지 8 참조).

이들은 산란기 동안 암컷의 몸에서 긴 산란관이 나와 담수산 이매패류의 출수공을 통해서 새강 내 산란하며, 수정된 알은 난 내 발생 및 전기 자어기를 한 달 동안 보냄으로써 높은 생존율을 유지하도록 진화되어 왔다. 또한 산란시기 조개 주변에 세력권을 형성하는 수컷은 화려한 혼인색을 띠어 종간의 뚜렷한 차이를 나타내 분류학적 형질로 이용되기도 한다(비특허문헌 9 및 10 참조).

각시붕어는 우리나라 고유어종으로 서해와 남해를 흐르는 각 하천에 분포하고, 산란시기의 수컷은 주둥이 아랫부분과 뒷지느러미, 배지느러미, 꼬리지느러미의 위와 아래쪽에 노란색이 진해지고, 등지느러미 가장자리와 꼬리지느러미의 중앙부, 뒷지느러미의 가장자리에는 선홍색의 띠가 선명하게 나타나는 것이 특징이다(비특허문헌 11 참조).

흰줄납줄개는 동해안으로 흐르는 하천을 제외한 전국의 하천 및 호수, 일본 및 중국에 분포하고, 일본에 서식하는 본 종은 별도의 아종으로 분류되며, 북한 지역의 금강산 삼일포에도 서식하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 11 참조).

산란시기의 수컷은 각 지느러미를 비롯한 몸 전체에 화려한 다홍색 빛깔을 띠며, 입 주변에는 2차 성징인 추성이 생겨난다. 흰줄납줄개는 우리나라와 중국에 동일 아종인 R. ocellatus ocellatus가 분포하고, 일본에는 고유 아종인 R. ocellatus kurumeus와 우리나라 및 중국에 이식된 R. ocellatus ocellatus가 함께 서식하며, 같은 수역에 두 종이 서식하면서 잡종이 출현하기도 하여 현재 R. ocellatus kurumeus를 보호 종으로 지정하였다. 또한 2004~2005년 금강산 삼일포에서 일본산 고유 아종인 R. ocellatus kurumeus가 서식하는 것으로 확인 되었다(비특허문헌 11 참조).

잡종에 관한 국내연구로는 Cobitis taenia 아종(비특허문헌 12 참조), C. sinensis와 C. (Iksookimia) longicorpus(비특허문헌 13 참조), 가시고기(Pungitius sinensis)와 잔가시고기(P. kaibarae)(비특허문헌 14 참조), 돌고기(Puntungia herzi)와 감돌고기(Pseudopungtungia nigra)(비특허문헌 15 참조), 돌돔(Oplegnathus fasciatus)과 강담돔(O. punctatus)(비특허문헌 16 참조), 낙동강 황지천 상류에 서식하는 쉬리속(Coreoleuciscus) 어류 집단의 종 동정 및 잡종 판별을 위한 연구(비특허문헌 17 참조) 등 자연에서 발견된 잡종개체를 대상으로 연구가 진행된 반면에 잡종 3배체 어류 기름종개(C. hankugensis)와 왕종개(I. longicorpa)잡종군 간의 종간 교잡(비특허문헌 18 참조), 농어(Lateolabrax japonicus)와 점농어(L. maculatus)(비특허문헌 19 참조), 동자개(Pseudobagrus fulvidraco)와 대농갱이(Leiocassis ussuriensis)(비특허문헌 20 참조), 넙치(Paralichthys olivaceus)와 강도다리(Platichthys stellatus)(비특허문헌 21 참조), 바다송사리(Oryzias dancena)와 자바송사리(O. javanicus)(비특허문헌 22 참조), 붉바리(Epinephelus akaara)와 Brown marbled grouper E. fuscoguttatus(비특허문헌 23 참조) 등 인위적인 교잡 및 잡종유도로 생산된 개체를 대상으로 한 연구도 수행되었다.

납자루아과 어류를 이용한 교잡실험은 주로 인공교잡에 의한 잡종생산이 행해져 왔고, 특히 지역적으로 격리되어진 한국과 일본에 서식하는 종들의 교잡에 의한 잡종 생산 결과 보고도 많이 제시되고 있다(비특허문헌 24 내지 32 참조).

잡종으로 생산된 개체를 상업어종으로서 발전시키기 위한 연구는 인공교잡을 통해 각시붕어와 떡납줄갱이 간 정교배체, 상반교배체의 계측형질과 세포유전학적 분석(비특허문헌 33 참조)을 통해 외부 계측형질의 특성과 세부유전학적인 형질을 규명한 바 있다.

자연에서의 각시붕어 서식처는 여울이 느리게 흐르고 바닥에는 모래와 자갈이 깔린 수초지대에 서식하며, 흰줄납줄개는 물살이 없고 바닥은 사니질인 곳에 주로 서식하여 두 종의 서식처는 분리가 되었으나 최근 하천 정비사업, 보 건설로 인해 하상구조가 바뀌고, 수심이 깊어지는 등 서식지가 파괴되고 있는 실정이다. 그로 인해 산란숙주 역할을 하는 말조개(Unio douglasiae)의 개체 수 감소마저 초래하게 되어 납자루아과 어류의 자원이 급격하게 감소하고 있다(비특허문헌 10, 34 및 35 참조).

최근 납자루아과 어류의 자연 잡종출현이 빈번해지고 있는 가운데 서식처 파괴로 분리되었던 종들은 같은 장소에서 혼서하게 되었고, 산란시기가 중복되는 두 종이 개체 수가 감소한 말조개를 두고 종간의 번식을 위한 생존경쟁이 일어나면서 잡종 출현의 가능성을 시사하고 있다(비특허문헌 2 및 36 참조).

자연 잡종에 대한 연구로는 각시붕어 × 묵납자루(비특허문헌 37 참조), 한강납줄개 × 묵납자루(비특허문헌 35 참조), 묵납자루 × 납자루(비특허문헌 38 참조) 등이 수행되었고, 납자루아과 어류들은 과거부터 계통적 논란이 되어 온 분류군으로 잘 알려져 있다(비특허문헌 39 참조).

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본 발명은 각시붕어와 흰줄납줄개가 자연 하천에서 혼서하는 것이 확인됨에 따라 자연 교잡종의 출현 가능성을 시사하고 있어 종간 잡종을 통해 부모개체와 교잡개체 간의 형태, 계수, 계측형질을 비롯한 인공채란, 난 발생 과정 및 자치어 형태발달 등을 조사하여 분류학적인 기초자료를 제공하고자 한다.

또한, 관상어로서의 기본조건인 체형 및 체색을 부모개체와 교잡개체 간의 차이점을 통하여 생물학적인 관점에서 가질 수 있는 교잡개체의 산업적 가치를 확인하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 제1 양태로서 본 발명은, 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 수컷과 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하거나, 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하고, 이들 간의 인공수정을 실시하여 수정란을 얻고, 상기 수정란을 부화하는 단계를 포함하는 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종 생산 방법을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 제2 양태로서 본 발명은, 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 수컷과 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하거나, 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하여 이들 간의 인공수정으로 얻어진 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종의 수정란을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 제3 양태로서 본 발명은, 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 수컷과 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하거나, 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하여 이들 간의 인공수정으로 얻어진 수정란을 부화하여 얻어진 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종을 제공한다.

본 발명에 따르면, 자연 잡종개체의 출현 시 외부 및 내부형태 형질, 발생학적 특성, 유전자 형질 분석 등을 통해 부모개체와 교잡개체 간을 구분할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 정역교잡 실험을 설명하는 사진,
도 2는 본 발명의 실시예에서 정액 및 난을 채취하는 모습을 나타낸 사진,
도 3은 본 발명의 실시예에서 각시붕어의 산란수 분포를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 실시예에서 흰줄납줄개의 산란수 분포를 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 실시예에서 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 난 발생 과정을 단계별로 나타낸 사진,
도 6 및 도 7은 본 발명의 실시예에서 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 자치어 형태발달 과정을 단계별로 나타낸 사진,
도 8 내지 12는 본 발명의 실시예에서 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 자치어의 상대성장 변화를 나타낸 그래프,
도 13은 본 발명의 실시예에서 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 난 발생 과정을 단계별로 나타낸 사진,
도 14 내지 도 16은 본 발명의 실시예에서 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 자치어 형태발달 과정을 단계별로 나타낸 사진,
도 17 내지 21은 본 발명의 실시예에서 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 자치어의 상대성장 변화를 나타낸 그래프,
도 22는 본 발명의 실시예에서 교잡개체의 외부형질 분석 부위를 설명하는 모식도,
도 23은 본 발명의 실시예에서 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 교잡개체의 체형 및 체색을 설명하는 사진,
도 24는 본 발명의 실시예에서 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 교잡개체의 체형 및 체색을 설명하는 사진,
도 25는 본 발명의 실시예에서 교잡개체의 비늘을 관찰한 결과를 나타낸 사진,
도 26은 본 발명의 실시예에서 교잡개체의 척추골을 관찰한 결과를 나타낸 사진,
도 27은 본 발명의 실시예에서 교잡개체의 새파 수를 관찰한 결과를 나타낸 사진,
도 28은 본 발명의 실시예에서 유전자 계통수를 나타낸 도면,
도 29는 본 발명의 실시예에서 RAG-1 유전자형을 분석한 결과를 나타낸 그래프,
도 30은 본 발명의 실시예에서 부모개체와 교잡개체간 부화 소요시간을 각 단계별로 비교한 결과를 나타낸 그래프,
도 31은 본 발명의 실시예에서 교잡개체 자어의 형태학적 비교 결과를 나타낸 사진,
도 32는 본 발명의 실시예에서 교잡개체 성어의 형태학적 비교 결과를 나타낸 사진.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자는 각시붕어와 흰줄납줄개 부모개체, 교잡개체 간의 분류학적 유연관계를 밝히기 위해 2015년 5월부터 6월까지 경북 의성군의 낙동강 수계 위천에서 어미를 채집하여 교잡개체 생산을 통한 초기생활사, 계통분류 및 유전자 분석에 대한 연구를 수행하였다. 최근 납자루아과 어류의 자연 잡종 출현에 대한 보고가 빈번해지면서 같은 곳에 서식하는 종에서 나타날 수 있는 자연 잡종개체의 출현 시 정확한 분류가 필요할 것으로 사료되어, 분류학적 기초자료를 마련하고자 각시붕어와 흰줄납줄개 사이의 종간 교잡을 수행하였다.

이에, 본 발명은 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 수컷과 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하거나, 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하고, 이들 간의 인공수정을 실시하여 수정란을 얻고, 상기 수정란을 부화하는 단계를 포함하는 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종 생산 방법을 개시한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예 1: 초기 생활사 연구

재료 및 방법

(1) 인공채란

2015년 5~6월 경상북도 의성군 비안면에 위치한 낙동강 수계 위천(지방1급 하천)에서 반두(망목 3×3 mm)를 이용하여 각시붕어와 흰줄납줄개 어미를 채집 후 인공채란을 위해 유리 사각수조(35×30×35㎝) 2개에 각각 암, 수 10마리씩을 수용하였다. 정역교잡은 2개의 실험구로 나뉘어 실시하였고, 첫 번째 실험구는 각시붕어 수컷과 흰줄납줄개 암컷을 각각 5개체씩 총 10개체를 수용하였으며, 두 번째 실험구는 흰줄납줄개 수컷과 각시붕어 암컷을 각각 5개체씩 총 10개체를 수용 후 모래가 채워진 사각 용기에 말조개를 각각 4마리씩 넣었다(도 1 참조).

수조 내 사육수온은 채집시기인 5~6월과 동일한 20.5~22.5℃(평균 21.5±1.0℃)를 유지하였고, 사육 수는 1주일에 1회씩 50% 가량을 환수시켰으며, 수질정화는 스펀지여과기를 이용하여 순환여과식으로 사육하였다. 또한 성숙한 어미를 선별하기 위해 산란기 수컷의 2차 성징인 추성의 형성 유무를 확인하였고, 수컷의 정액은 Micro pipette을 이용하여 인공수정 전 미리 채취하였으며, 암컷은 산란관의 길이가 채란에 적합한 기준에 달하였을 때 복부압박법으로 인공채란을 실시하였다(도 2 참조). 난의 크기는 30개를 임의로 선택하여 만능투영기(Nikon JP V-12BM, Japan)를 이용, 장경과 단경을 0.01 mm까지 측정하였다.

(2) 난 발생 및 자치어 형태발달

난 발생 과정 관찰을 위해 성숙한 어미를 선별하여 습식법으로 수정하였고, 수정된 난을 대상으로 실체현미경(Nikon JP SMZ800, Japan)을 이용하여 난의 형태 및 크기를 측정하였으며, 수정율, 부화율, 기형율 등을 조사하였다.

수정란은 유리 재질의 Petri dish(φ 10cm)에 수용하였고, 사육수온 조절을 위해 실내 냉·난방 시스템을 이용하여 수온 20.5~22.5℃(평균 21.5±1.0℃)를 유지하였으며, 사육 수는 부화 직전까지 1일 1회 80% 정도 환수시켜 주었다.

자치어의 사육은 부화 직후부터 유영이 시작되기 전까지 Petri dish에서 지속적으로 사육하였고, 유영이 시작된 후기 자어기에서 치어기 까지는 유리 사각수조(35×30×35cm)에서 스펀지여과지를 이용하여 순환여과식으로 사육하였다.

자치어의 사육수온은 수정란 사육과 동일하게 유지시켜 주었고, 사육 수는 1주일에 1회 50% 정도를 환수시켜 주었다. 사육기간 중 자치어의 먹이는 난황 흡수 후부터 45일까지 알테미아(Artemia sp.)의 nauplius 유생을 1㎖당 2~3개체 정도 공급하였고, 45일 이후에는 냉동 장구벌레(Blood warm, Hikari China)와 입자크기 500㎛ 정도의 배합사료(Dry feed, Jeilfeed Korea)를 혼합 공급하였다.

자치어의 형태는 부화 직후부터 치어기로 이행하기까지 발육단계에 따라 발달과정을 관찰하였고, 계수형질인 등, 배, 뒷지느러미의 기조수를 계수하였다.

부화 직후부터 5일까지 1일 5마리씩, 부화 후 6일부터 치어기에 달하기까지 5일에 5마리씩 채취 후 마취제(MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA)를 이용하여 마취시킨 뒤 어체의 각 부위를 실체현미경과 만능투영기를 사용하여 0.01㎜까지 측정, 관찰하였다. 자치어의 형태발달 단계는 선행문헌(Okiyama, M., 1988. An atlas of the early stage fishes in Japan. Tokai. Univ. Press, Tokyo, 943pp.)에 따라 구분하였다.

실험 결과

(1) 인공채란

1) 산란수

산란 직전의 암컷을 복부압박법으로 인공채란 한 결과 각시붕어는 전장(Body length) 5.10~5.90cm(평균 5.55±0.57cm, n=10)일 때 1개체 당 채란된 난의 수는 13~22개(평균 17개)였고, 인공채란 후 암컷의 재 채란 가능 시기는 7~10일이 소요되었으며, 채란이 가능한 암컷의 산란관 길이(Ovipositor length)는 3.08~3.59cm(평균 3.34±3.61cm)였다. 체장에 대한 산란관 길이의 비는 60.4~60.8%(평균 60.6%)였다(하기 표 1 참조).

흰줄납줄개는 전장 6.46~6.58cm(평균 6.52±0.08cm, n=10)일 때 1개체 당 채란된 난의 수는 18~24개(평균 21개)였고, 인공채란 후 암컷의 재 채란 가능 시기는 6~10일이 소요되었으며, 채란이 가능한 암컷의 산란관 길이는 1.82~2.00cm(평균 1.91±0.13cm)였다. 체장에 대한 산란관 길이의 비는 28.2~30.4%(평균 29.3%)였다(표 2 참조).

2) 난의 형태 및 크기

각시붕어의 난 형태는 서양배 모양에 가까운 전구형으로 분리침성란 이었고, 유구는 없었으며, 난황의 색은 옅은 노란색과 불투명한 무색을 띠었다. 수정 후 난경은 장경(long eggs diameter)이 3.39~3.97mm(평균 3.68±0.41mm, n=30)였고, 단경(short eggs diameter)은 1.36~1.55mm(평균 1.45±0.13mm, n=30)였다. 난경의 빈도는 장경이 3.45~3.75mm, 단경은 1.42~1.50mm 사이에서 나타나 성숙난으로 판단되었다(도 3 참조).

흰줄납줄개의 난 형태는 서양배 모양에 가까운 전구형으로 분리침성란 이었고, 유구는 없었으며, 난황의 색은 옅은 노란색과 불투명한 무색을 띠었다. 수정 후 난경은 장경이 2.53~2.71mm(평균 2.62±0.12mm, n=30)였고, 단경은 1.47~1.60mm(평균 1.53±0.09mm, n=30)였다. 난경의 빈도는 장경이 2.59~2.64 mm, 단경은 1.49~1.56mm 사이에서 나타나 성숙난으로 판단되었다(도 4 참조).

(2) 난 발생 및 자치어 형태발달

1) 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)

ⅰ) 난 발생 과정

난 발생 과정은 도 5와 같이 15단계(A~O)로 구분하여 관찰하였고, 부화하기까지 소요되는 각 단계별 시간을 하기 표 3에 나타냈다. 수정 직후의 난은 물을 흡수하기 시작하였으며, 난막과 난황이 완전히 분리되지 않았다(도 5, A 참조).

수정 후 50분에는 난문부와 난황이 분리되기 시작하면서 난황과 난막 사이에 틈이 형성되기 시작하였다. 수정 후 1시간 40분에는 난문의 동물극 난황 상단부에 원형질이 분리되면서 난황의 1/4 정도를 차지하는 배반이 형성되었다(도 5, B 참조).

수정 후 2시간 30분에는 배반의 상단부 중앙이 갈라져 수직으로 이등분되었고, 2개의 할구가 형성되면서 2세포기에 달하였다(도 5, C 참조). 수정 후 3시간 10분에는 2개로 이등분되었던 할구가 이분되어 같은 크기의 4개 세포로 나누어져 4세포기에 달하였다(도 5, D 참조).

수정 후 4시간 10분에는 4개로 나누어졌던 할구가 8개로 나누어지면서 8세포기에 달하였다(도 5, E 참조). 수정 후 5시간 10분에는 같은 세포의 분열 방식으로 진행이 되어 16세포기에 달하였고(도 5, F 참조), 수정 후 6시간 10분에는 32세포기에 달하였으며(도 5, G 참조), 수정 후 7시간 10분에는 64세포기에 달하였다(도 5, H 참조). 수정 후 9시간 10분에는 세포의 수를 개수하기 어려울 정도로 세포의 분할이 이루어졌고, 할구의 크기가 작아지면서 상실기에 달하였다(도 5, I 참조). 수정 후 12시간 30분에는 할구의 표면이 난황과 거의 곡선을 이루면서 포배기에 달하였고(도 5, J 참조), 수정 후 18시간 10분에는 배환이 형성되면서 위쪽부터 아래 쪽으로 난황의 1/3 정도를 덮어 내려와 초기 낭배기에 달하였다(도 5, K 참조).

수정 후 27시간 30분에는 난황의 2/3 정도를 덮어 내려오면서 중기 낭배기에 달하였으며(도 5, L 참조), 수정 후 31시간 30분에는 배환이 식물극까지 완전히 덮어 내려와 함입이 되면서 난황의 바깥쪽에는 유백색의 배체가 형성되었고, 신경극과 척추의 원기가 발달되기 시작하였다(도 5, M 참조). 수정 후 36시간 30분에는 꼬리가 신장하면서 기저부분이 난황과 분리되었고, 머리 쪽에는 척추의 원기가 신장하였다. 수정 후 45시간 30분에는 머리의 앞쪽에 위치한 난황의 일부가 함입 되었고, 부화 직전에 이르게 되었다(도 5, N 참조).

수정 후 49시간 30분에는 배체의 머리 부분이 난문부의 반대쪽을 뚫고 나오면서 부화가 시작되었고, 배체의 움직임은 관찰되지 않았다(도 5, O 참조). 수정 후 53시간에는 전체 수정란의 50% 이상이 부화가 완료되었고, 54시간에는 모든 수정란의 부화가 완료되었다.

수정율은 61.5~100.0%(평균 80.7%)를 나타냈고, 수정란은 배체가 형성되는 시기에 폐사가 발생하는 것이 관찰되었으며, 부화가 완료되는 시간인 수정 후 54시간에는 부화율이 53.8~90.0%(평균 71.9%)로 나타났다. 부화자어의 기형발생은 부화 후 8일째부터 나타났고, 기형율은 11.1~22.2%(평균 16.6%)로 나타났다.

ⅱ) 자치어 형태발달

부화 직후의 자어는 전장 3.15~3.47mm(평균 3.31±0.23mm, n=5)로 난황의 앞부분에는 짧은 익상돌기 한 쌍이 발달되어 있었고, 머리는 앞으로 나와 있었으며, 기관이 뚜렷하게 형성되지 않았다. 꼬리는 짧고 아래쪽으로 말려 있는 상태였으며, 배체의 움직임은 관찰되지 않았다(도 6, A 참조).

부화 후 1일째 전기 자어는 전장 4.21~4.40mm(평균 4.31±0.13mm)로 난황 앞쪽에 형성된 한 쌍의 돌기는 신장하였고, 꼬리는 직선 형태를 갖추었다가 45° 위쪽으로 휘어지기 시작하였다. 배체는 꼬리부분만 움직이는 것이 관찰되었고, 척추를 따라 꼬리까지 막지느러미가 발달되기 시작하였다. 머리 부분은 발달되면서 앞쪽으로 신장하였고, 안포가 형성되었다(도 6, B 참조).

부화 후 2일째 전기 자어는 전장 5.28~5.54mm(평균 5.41±0.18mm)로 배 쪽에 1개의 돌기가 형성되었고, 막지느러미는 몸의 중반부에서 난황이 끝나는 지점까지 형성되어 있었다. 머리 부분에는 눈이 형성되었고, 뇌가 분화하기 시작하였으며, 한 쌍의 이석이 관찰되었다(도 6, C 참조).

부화 후 5일째 전기 자어는 전장 6.34~6.71mm(평균 6.53±0.26 mm)로 눈에는 흑색소포가 침착하기 시작하였고, 항문이 발달하면서 막으로 연결되었던 지느러미는 분리되었으며, 심장에서부터 몸의 아래쪽을 따라 혈액이 흐르기 시작하여 꼬리지느러미 기부와 막지느러미를 지나 다시 심장까지 흐르는 것이 관찰되었다(도 6, D 참조).

부화 후 8일째 중기 자어는 전장 7.35~7.41 mm (평균 7.38±0.04 mm)로 눈에는 렌즈가 분화하였고, 난황 위쪽에는 반점모양 8개, 나뭇가지 모양 5개의 흑색소포가 침착하였다. 이 시기에는 꼬리 끝의 미부봉상골이 45°로 휘어졌고, 꼬리지느러미가 분화하면서 3개의 줄기가 형성되었다(도 6, E 참조).

부화 후 12일째 중기 자어는 전장 7.45~8.07 mm (평균 7.76±0.44 mm)로 입이 열리기 시작하였고, 항문은 완전히 열리지 않았다. 머리 부분과 아가미 뚜껑부위에는 나뭇가지 모양의 흑색소포가 침착하였고, 몸의 중앙을 따라 꼬리지느러미 시작지점까지 반점모양의 흑색소포가 길게 이어져 침착하였다. 이 시기에는 각 부위별 지느러미가 발달하기 시작하였고, 줄기 수는 등지느러미 4개, 뒷지느러미 5개로 발달하였으며, 꼬리지느러미는 12개로 증가하였다(도 6, F 참조).

부화 후 17일째 후기 자어는 전장 8.42~8.60mm(평균 8.51±0.13mm)로 난황을 모두 흡수하였고, 소화기관이 발달하면서 항문이 완전히 열렸으며, 먹이를 섭취하기 시작하였다. 호흡기관인 부레가 발달하였고, 부상하였다가 가라앉기를 반복하였다. 각 부위별 지느러미 줄기 수는 등지느러미 10개, 뒷지느러미 11개, 꼬리지느러미 20개로 증가하였고, 꼬리지느러미의 끝은 두 갈레로 갈라졌으며, 배지느러미는 막으로 되어 있었다(도 7, A 참조).

부화 후 24일째 후기 자어는 전장 10.4~11.2mm(평균 10.8±0.56mm)로 수면에 정상적으로 유영하는 것이 관찰되었고, 반점모양의 흑색소포는 등, 뒷, 꼬리지느러미에 반점모양으로 침착하였고, 각 부위별 지느러미의 줄기 수는 등지느러미 13개, 뒷지느러미 12개로 증가하였다(도 7, B 참조).

부화 후 33일째 후기 자어는 전장 13.3~14.7mm(평균 14.0±0.98mm)로 머리 앞부분과 복부에 침착되었던 흑색소포는 사라졌고, 꼬리지느러미와 뒷지느러미에 침착되었던 것도 사라졌다. 각 부위별 지느러미 기조 수는 등지느러미 14개로 증가하였고, 막으로 되었던 배지느러미에는 4개가 형성되었다(도 7, C 참조).

부화 후 90일째 치어는 전장 22.8~24.2 mm (평균 23.5±0.98 mm)로 몸에 침착되었던 흑색소포는 등 쪽과 등지느러미에 반점모양으로 남아있었고, 체고는 다소 낮았으며, 몸 전체 비늘이 형성되어 있었다. 각 부위별 지느러미 기조 수는 등지느러미 ⅲ-11개, 뒷지느러미 ⅲ-9개, 배지느러미 ⅲ-4개로 모든 지느러미의 기조수가 정수에 달하였다(도 7, D 참조).

ⅲ) 상대성장

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 자치어의 사육기간 동안 전장크기 변화는 부화 직후 평균전장 3.31±0.23mm에서 후기 자어시기로 접어드는 부화 후 17일째 평균전장 8.51±0.13mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후 치어기로 이행하는 부화 후 90일째 평균전장 23.5±0.98mm까지 성장속도가 빨라졌다(도 8 참조).

전장에 대한 안장은 부화 후 1일째 평균전장 4.31±0.13mm부터 부화 후 8일째 평균전장 7.38±0.04mm까지 빠른 성장을 보였고, 이후 부화 후 12일째까지 완만한 성장을 보였으며, 다시 부화 후 12일째 평균전장 7.76±0.44mm부터 성장속도가 빨라졌다. 전장에 대한 두장은 부화 직후부터 치어기까지 완만한 성장을 보였고(도 9 참조), 전장에 대한 항문장은 부화 직후 평균전장 3.31±0.23 mm부터 부화 후 1일째 평균전장 4.31±0.13mm까지 빠른 성장을 보였고, 이후 완만한 성장을 보였으며, 부화 후 17일째 평균전장 8.51±0.13mm부터 부화 후 90일째 평균전장 23.5±0.98mm까지 빠른 성장을 보였다.

전장에 대한 체장은 부화 직후부터 부화 후 2일째 평균전장 5.41±0.18mm까지 빠른 성장을 보였고, 이후 완만한 성장을 보였으며, 부화 후 17일째 평균전장 8.51±0.13mm부터 성장속도가 빨라졌다(도 10 참조). 전장에 대한 체고는 부화 직후부터 부화 후 24일 평균전장 10.8±0.56mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후부터 치어기까지 빠른 성장을 보였다(도 11 참조).

두장에 대한 상악장은 부화 직후부터 부화 후 3일째 평균두장 0.78±0.07mm까지 크게 발달하지 않았으나, 난황의 흡수가 진행됨에 따라 성장하면서 상악장의 길이가 신장하였다. 부화 후 33일째 평균두장 2.93±0.07mm일 때 먹이 섭취활동이 활발해지면서 상악장의 길이가 점차 빠르게 신장하였다. 두장에 대한 안장은 전체적으로 성장속도가 완만하였고, 부화 후 24일째 평균두장 2.21±0.10mm일 때 눈의 크기가 빠르게 발달하였으며, 두장에 대한 비장은 부화 후 5일째 평균두장 1.01±0.09mm부터 성장속도가 빨라졌다(도 12 참조).

2) 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)

ⅰ) 난 발생 과정

난 발생 과정은 도 13과 같이 15단계(A~O)로 구분하여 관찰하였고, 부화하기까지 소요되는 각 단계별 시간을 하기 표 4에 나타냈다.

수정 직후의 수정란은 물을 흡수하면서 난막이 형성되기 시작하였고, 난황과 완전히 분리되지 않았으며(도 13, A 참조), 수정 후 50분이 경과하면서 난문부와 난황이 분리되기 시작하였고, 난황과 난막의 사이에는 틈이 생겼다. 수정 후 1시간 40분에는 난문 쪽의 동물극 난황 상단부에 원형질이 분리되면서 난황의 1/5 부분을 차지하는 배반이 형성되었다(도 13, B 참조). 수정 후 2시간에는 배반의 중앙 윗부분이 두 갈레로 갈라지고, 수직 이등분된 할구가 만들어지면서 2세포기에 달하였다(도 13, C 참조). 수정 후 2시간 20분에는 각 할구에서 수평 난할이 일어나 같은 크기로 이분되어 4세포기에 달하였다(도 13, D 참조). 수정 후 3시간 20분에는 수평 난할이 같은 방식으로 일어나 8세포기에 달하였고(도 13, E 참조), 수정 후 4시간 20분에는 16세포기에 달하였으며(도 13, F 참조), 수정 후 5시간 20분에는 32세포기에 달하였다(도 13, G 참조). 수정 후 6시간 20분에는 세포의 분열 수가 증가하면서 64세포기에 달하였고(도 13, H 참조), 수정 후 8시간 20분에는 세포의 분열 수를 개수 할 수 없을 정도로 분열되었으며, 상실기에 달하였다(도 13, I 참조). 수정 후 11시간 40분에는 할구의 크기가 점차 작아졌고, 표면이 곡선을 이루면서 포배기에 달하였다(도 13, J 참조). 수정 후 17시간에는 배반의 가장자리가 비후해지면서 배환을 형성하게 되고, 상단부에서부터 난황을 덮어 내려와 원구가 폐쇄되었으며, 초기 낭배기에 달하였다(도 13, K 참조).

수정 후 25시간에는 난황의 2/3를 덮어 내려오면서 중기 낭배기에 달하였고(도 13, L 참조), 수정 후 30시간 20분에는 배환이 식물극을 완전히 덮어 내려오면서 배체가 형성된다(도 13, M 참조). 수정 후 34시간 20분에는 머리 쪽에는 척추원기, 신경극 및 꼬리가 형성되었으며, 수정 후 44시간 20분에는 머리 쪽의 척추 원기와 꼬리 부분이 신장하였다(도 13, N 참조).

수정 후 48시간 20분에는 배체의 머리 부분이 난문부의 반대편을 뚫고나오면서 부화가 시작되었고(도 13, O 참조), 수정 후 50시간에는 전체 수정란의 50%가 부화하였으며, 수정 후 52시간에는 부화가 모두 완료되었다. 부화 직후의 자어는 움직임이 관찰되지 않았고, 꼬리는 난황의 아래쪽으로 말려 있었으며, 익상돌기는 가슴 쪽에 1쌍, 배 쪽에 1개 형성되어 있었다.

수정율은 66.6~100%(평균 83.3%)를 나타냈고, 배체가 형성되는 시기에 폐사가 발생하는 것이 관찰되었으며, 부화가 완료되는 시간인 수정 후 52시간에는 부화율이 69.2~82.3%(평균 75.7%)로 나타났다. 부화자어의 기형발생은 부화 후 5일째부터 나타났고, 기형율은 8.33~16.6%(평균 12.4%)로 나타났다.

ⅱ) 자치어 형태발달

부화 직후의 자어는 전장 4.36~4.55mm(평균 4.45±0.13 mm, n=5)로 난황의 앞쪽으로 1쌍의 익상돌기가 형성되어 있었고, 배 쪽에 1개의 돌기가 형성되어 있었다. 머리는 난황보다 앞쪽으로 돌출되어 발달하였고, 입과 항문은 형성되어 있지 않았다. 꼬리는 부화가 시작되면서 난황의 아래쪽으로 말려 있었으나 시간이 경과함에 따라 곧게 펴지면서 45°로 휘어졌다(도 14, A 참조).

부화 후 1일째 전기 자어는 전장 5.42~5.77mm(평균 5.60±0.25mm)로 난황 앞쪽에 형성된 1쌍의 익상돌기와 배 쪽의 돌기는 신장하였고, 머리는 발달하여 주둥이가 앞으로 돌출되기 시작하였고, 눈은 흔적 적으로 발달하였으며, 등을 따라 난황이 끝나는 지점까지 막으로 된 지느러미가 넓게 발달하였다. 이 시기의 자어는 꼬리 쪽 움직임이 관찰되었고, 유영능력은 없었다(도 14, B 참조).

부화 후 3일째 전기 자어는 전장 6.42~7.14mm(평균 6.78±0.51mm)로 난황 앞쪽에 형성된 1쌍의 익상돌기와 배 쪽의 돌기는 짧아졌고, 머리에는 뇌가 발달하였으며, 눈에는 흑색소포가 침착하였다(도 14, C 참조).

부화 후 5일째 전기 자어는 전장 6.74~7.46mm(평균 7.10±0.51mm)로 눈에 침착된 흑색소포는 진하게 착색되었고, 심장에서부터 꼬리 미부를 따라 막지느러미까지 혈액이 흐르는 것이 관찰되었다. 이 시기에는 소리와 진동에도 몸의 움직임이 반응하였고, 빠르게 움직였다가 정지하는 행동을 반복하였다(도 14, D 참조).

부화 후 8일째 중기 자어는 전장 7.29~7.86mm(평균 7.58±0.40mm)로 눈에는 눈동자가 발달하였고, 난황의 위쪽과 등 쪽에는 나뭇가지 모양의 흑색소포가 침착하였으며, 막으로 된 꼬리지느러미에도 침착하였다. 이 시기에는 항문이 발달하기 시작하였고, 꼬리의 끝은 미부봉상골이 45°로 휘어지면서 꼬리지느러미에 6개의 줄기가 발달하였다(도 15, A 참조).

부화 후 12일째 중기 자어는 전장 7.74~7.80mm(평균 7.77±0.04mm)로 나뭇가지 모양의 흑색소포는 두부의 상단부분과 난황 위쪽, 등, 미부 및 몸의 중앙을 비롯하여 꼬리지느러미 줄기까지 넓게 침착하였다. 등지느러미는 분화하기 시작하였고, 꼬리지느러미에 형성된 줄기 수는 20개로 증가하였다(도 15, B 참조).

부화 후 19일째 후기 자어는 전장 8.59~8.64mm(평균 8.61±0.04mm)로 두부 상단에 침착된 나뭇가지 모양의 흑색소포는 반점모양으로 변하였고, 아가미 뚜껑부분에는 나뭇가지 모양의 흑색소포가 침착되었다. 막으로 된 배지느러미를 제외한 각 부위별 지느러미는 분화하여 줄기가 형성되었고, 등지느러미 10개, 뒷지느러미에 11개가 형성되었다. 이 시기에는 입이 열리고, 먹이를 섭취하기 시작하였으며, 아가미 뚜껑의 개폐운동이 활발히 움직이는 것이 관찰되었다. 소화기관이 발달하면서 항문이 열렸고, 부레가 발달하여 수면 위에서 유영하는 것이 관찰되었다(도 15, C 참조).

부화 후 25일째 후기 자어는 전장 11.9~12.3mm(평균 12.1±0.28mm)로 난황의 윗부분과 아래 복부에는 나뭇가지 모양의 흑색소포가 침착하였고, 등, 뒷, 꼬리지느러미에는 반점모양의 흑색소포가 침착하였다. 각 부위별 지느러미 수는 등지느러미 12개, 뒷지느러미 13개로 증가하였고, 배지느러미는 막으로 되어 있었다도 15, D 참조).

부화 후 39일째 후기 자어는 전장 13.1~13.7mm(평균 13.4±0.42mm)로 복부 아래에 침착되었던 나뭇가지 모양의 흑색소포는 사라졌고, 각 부위별 지느러미 수는 뒷지느러미 14개로 증가하였으며, 막으로 되어있던 배지느러미에는 3개의 줄기가 형성되었다(도 15, E 참조).

부화 후 48일째 후기 자어는 전장 16.6~17.5mm(평균 17.0±0.63mm)로 꼬리 기저 부분과 등 쪽을 비롯하여 머리 부분의 아가미 위쪽에 반점모양의 흑색소포가 침착하였고, 아래턱에 있던 흑색소포는 사라졌으며, 배지느러미의 기조 수는 5개로 증가하였다(도 16, A 참조).

부화 후 70일째 치어는 전장 30.4~35.2mm(평균 32.8±3.39mm)로 몸 전체에 비늘이 형성되었고, 침착되었던 흑색소포는 대부분 사라졌으며, 몸 전체 지느러미 중 등지느러미에만 흑색반점이 짙게 착색되었다. 등지느러미 끝 부분에서부터 꼬리지느러미 시작 부분까지 파란색의 가로 줄이 선명하게 형성되었고, 체고는 다소 높았으며, 머리의 가운데 눈이 위치하였다. 각 부위별 지느러미 기조 수는 등지느러미 ⅲ-10개, 뒷지느러미 ⅲ-9개, 배지느러미 ⅲ-4개로 모든 지느러미의 기조 수가 정수에 달하였다(도 16, B 참조).

ⅲ) 상대성장

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 자치어의 사육기간 동안 전장크기 변화는 부화 직후 평균전장 4.45±0.13mm에서 후기 자어시기로 접어드는 부화 후 19일째 평균전장 8.61±0.04mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후부터 성장 속도가 빨라지면서 치어기에 접어드는 부화 후 48일째 평균전장 17.0±0.63mm부터 부화 후 70일째 평균전장 32.8±3.39mm까지 성장 속도가 빨라지면서 큰 변화를 나타냈다(도 17 참조).

전장에 대한 안장은 부화 직후부터 부화 후 48일째 평균전장 17.0±0.63mm까지 성장이 완만하였고, 이후부터 성장이 빨라졌으며, 전장에 대한 두장은 부화 직후부터 부화 후 19일째 평균전장 8.61±0.04mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후 부화 후 48일째 평균전장 17.0±0.63mm까지 빠른 성장을 보였으며, 부화 후 70일째 평균전장 32.8±3.39 mm까지 성장 속도가 빨라져 큰 변화를 보였다(도 18 참조).

전장에 대한 항문장은 부화 직후부터 부화 후 48일째 평균전장 17.0±0.63mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후부터 부화 후 70일째 평균전장 32.8±3.39mm까지 빠른 성장을 보였다. 전장에 대한 체장은 부화 직후부터 부화 후 25일째 평균전장 12.1±0.28mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후부터 부화 후 70일째 평균전장 32.8±3.39mm까지 빠른 성장을 보였다(도 19 참조).

전장에 대한 체고는 부화 직후부터 부화 후 25일째 평균전장 12.1±0.28mm까지 완만한 성장을 보였고, 이후부터 부화 후 48일째 평균전장 17.0±0.63mm까지 빠른 성장을 보였으며, 부화 후 70일째 평균전장 32.8±3.39 mm까지 빠른 성장을 보여 큰 차이를 나타냈다(도 20 참조).

두장에 대한 상악장은 부화 후 3일째 평균두장 0.65±0.07mm부터 부화 후 12일째 평균두장 1.43±0.05mm까지 빠른 성장을 보였고, 두장에 대한 안장은 치어기로 이행하는 시기까지 완만한 성장속도를 보였으며, 두장에 대한 비장은 부화 후 3일째 평균두장 0.65±0.07mm부터 부화 후 8일째 평균두장 1.22±0.07mm까지 빠른 성장을 보이다가 이후 완만한 성장을 보였다(도 21 참조).

실시예 2: 계통분류

재료 및 방법

(1) 외부형질

채집한 어미와 교잡개체는 실체현미경과 만능투영기를 이용하여 체형 및 체색등을 관찰하였다.

계측형질은 선행문헌(Abe, T. and O. Tabeta, 1984. Pufferfishes available in Japan, An illustrated guide to their identification. Central Law and regulation Publ., p. 85.)에 따라 19개의 부위를 선택하여 Vernier calipers로 계측 후 몸의 주요부분을 전장과 두장에 대한 백분비로 구하여 비교하였다. 또한, 각 종의 계측형질 AFL(Anal fin length, 뒷지느러미 길이), AL(Anus length, 항문장), BD(Body depth, 체고), CFL(Caudal fin length, 꼬리지느러미 길이), CPH(Caudal peduncle height, 꼬리자루 높이), CPL(Caudal peduncle length, 꼬리자루 길이), DFL(Dorsal fin length, 등지느러미 길이), ED(Eye diameter, 눈 지름), HL(Head length, 두장), IOW(Interorbital width, 양안간격), LAH(Longest anal fin height, 뒷지느러미 높이), LDH(Longest dorsal spine height, 등지느러미 높이), LOD(length of origin of dorsal fin, 등지느러미 앞까지의 거리), PFL(Pectoral fin length, 가슴지느러미 길이), BL(Body length, 체장), SNL(Snout length, 주둥이 길이), VFL(Ventral fin length, 배지느러미 길이), UJW (Upper jaw width, 턱 길이)는 TL (Total length, 전장)에 대한 백분율(%)로 분석하였으며, 눈 지름(ED), 양안간격(IOW), 주둥이 길이(SNL)는 두장(HL)에 대한 백분율(%)로 분석하였다(도 22 참조). 분석된 자료의 통계학적 분석은 SPSS 통계프로그램(ver. 17.0)을 사용하여 one way-ANOVA test를 통한 Duncan's multiple range test로 평균 간의 유의성을 검정하였다(P<0.05).

(2) 내부형질

내부형질은 척추골을 관찰하기 위하여 Super soft X-ray 투과영상기(VIX-60 type)를 이용하여 복추골과 미추골의 수를 조사하였고, 새파 수는 해부용 가위, 핀셋을 이용하여 첫 번째 새궁을 분리시킨 뒤 실체현미경을 이용하여 계수 및 관찰하였다.

실험 결과

(1) 외부형질

1) 체형 및 체색

ⅰ) 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 교잡개체의 형태는 체고가 다소 높지 않으며, 머리는 작고 눈이 큰 편이다. 몸은 옆으로 납작한 측편형이고, 꼬리자루로 갈수록 체고가 낮아진다. 꼬리지느러미는 두 갈레로 갈라져 있고, 양 끝은 둥글다. 등지느러미에는 검은색의 반점이 있고, 줄기 아래 부분에는 녹색을 띤다. 체색은 몸 전체가 푸른색을 띠고, 등 쪽은 짙은 갈색을 띠며, 배 쪽은 은백색의 광택을 띤다(도 23 참조).

ⅱ) 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 교잡개체의 형태는 체고가 다소 높고, 몸은 옆으로 납작한 측편형이며, 꼬리자루로 갈수록 체고가 낮아진다. 꼬리지느러미가 두 갈레로 갈라져 있고, 양 끝이 둥글다. 등지느러미에는 검은색 반점이 있고, 줄기 아래 부분에는 짙은 녹색을 띤다. 체색은 갈색을 띠고, 등 쪽으로 갈수록 짙어지며, 배 쪽에는 은백색의 광택을 띤다. 등지느러미가 끝나는 지점에서 꼬리지느러미 시작지점까지 몸 가운데 파란색의 가로줄이 나타나 있다(도 24 참조)

2) 계측형질

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)에서 전장에 대한 계측형질과 두장에 대한 계측형질을 비교한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

각시붕어와 흰줄납줄개 간에서 유사한 전장에 대한 계측형질은 BD, CFL, CPL, PFL, SNL이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었다(P<0.05). 각시붕어가 흰줄납줄개에 비해 유의적으로(P<0.05) 크게 나타난 전장에 대한 계측형질은 AL, BD, CFL, CPH, CPL, ED, HL, IOW, LOD, PFL, BL, SNL, VFL, UJW이었고, 두장에 대한 계측형질은 SNL, ED, IOW이었다(P<0.05). 흰줄납줄개가 각시붕어에 비해 유의적으로 크게(P<0.05) 나타난 전장에 대한 계측형질은 AFL, DFL, LAH, LDH이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었다(P<0.05). 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)가 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)보다 큰(P<0.05) 전장에 대한 계측형질은 BD, CFL, ED, HD, IOW, LAH, PFL, SNL, VFL, UJW이었고, 두장에 대한 계측형질은 SNL, ED, IOW이었다(P<0.05).

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)가 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 보다 큰(P<0.05) 전장에 대한 계측형질은 AL, AFL, CPH, CPL, DFL, LDH, LOD, BL이었다(P<0.05).

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)에서 각시붕어와 유사한 전장에 대한 계측형질은 DFL, LOD, SNL, UJW이었고, 두장에 대한 계측형질은 SNL, IOW이었으며(P<0.05), 흰줄납줄개와 유사한 전장에 대한 계측형질은 CPH, HL, IOW, LAH, BL, SNL이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었다(P<0.05).

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)가 각시붕어와 유사한 전장에 대한 계측형질은 DFL, SNL이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었다(P<0.05). 흰줄납줄개와 유사한 전장에 대한 계측형질은 AL, CPH, LAH, BL, SNL, VFL이었고, 두장에 대한 계측형질은 SNL, IOW이었다(P<0.05).

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)와 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)에서 공통적으로 각시붕어와 서로 유사한 전장에 대한 계측형질은 DFL, SNL이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었으며, 흰줄납줄개와 서로 유사한 전장에 대한 계측형질은 CPH, LAH, BL, SNL이었고, 두장에 대한 계측형질은 IOW이었다(P<0.05).

각시붕어, 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀), 흰줄납줄개 간의 형질 중 공통적으로 SNL은 유의차가 없었다(P>0.05).

3) 비늘

ⅰ) 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 비늘을 관찰한 결과 크기는 폭에 비해 길었고, 형태는 둥근 비늘로 끝부분에 소극이 없었으며, 안쪽의 끝부분에는 반점모양의 흑색소포가 12개 침착되어 있었다. 비늘표면에는 가운데부터 바깥 쪽 방향으로 나이테 모양의 주름이 형성되어 있었다(도 25, A 참조).

ⅱ) 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 비늘을 관찰한 결과 크기는 폭에 비해 길었고, 형태는 둥근 비늘로 끝부분에 소극이 없었으며, 안쪽의 끝부분에는 나뭇가지 모양의 흑색소포가 22~23개 침착되어 있었다. 비늘표면에는 가운데부터 바깥 쪽 방향으로 나이테 모양의 주름이 형성되어 있었다(도 25, B 참조).

(2) 내부형질

1) 척추골

ⅰ) 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 척추골은 복추골이 시작되는 곳에서 5개까지 융합되어 있었고, 신경극과 혈관극의 길이는 일정하였으며, 뒷지느러미가 끝나는 부분에서 꼬리 쪽으로 갈수록 길이가 짧아졌다. 척추골 수는 복추골 15개, 미추골 18개로 모두 33개였다(도 26, A 참조).

ⅱ) 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 척추골은 복추골이 시작되는 곳에서 5~6개까지 융합되어 있었고, 신경극과 혈관극의 길이는 일정하였으며, 뒷지느러미가 끝나는 부분에서 꼬리 쪽으로 갈수록 길이가 짧아졌다. 척추골 수는 복추골 16개, 미추골 17개로 모두 33개였다(도 26, B 참조).

2) 새파 수

ⅰ) 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)

각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 새파는 끝이 둥글고 길게 형성되어 있었고, 위쪽으로 갈수록 길이는 짧았으며, 새파 수는 7~10개였다(도 27, A 참조).

ⅱ) 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)

흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 새파 형태는 끝이 뾰족한 가시모양으로 2~3개씩 길게 형성되어 있었고, 위쪽으로 갈수록 길이는 짧았으며, 새파 수는 9~11개였다(도 27, B 참조).

실시예 3: 유전자 형질 분석

재료 및 방법

(1) DNA 추출

실험에 사용된 시료는 각시붕어, 흰줄납줄개의 어미 2종과 교잡개체 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 사이에서 생산된 2가지 형태를 사용하였고, DNA 추출은 비늘을 채취하였을 때 끝 부분의 미세한 근육조직을 분리하여 시료로 사용하였다. 실험어의 근육 조직으로부터 Genomic DNA를 추출하기 위해 DNeasy Blood & Tissue kit(QIAGEN Co., USA)를 이용하였으며, DNA kit 사용과정은 1)에서 10)까지 10단계로 구분하여 아래와 같이 설명하였다. 추출된 DNA는 나노 분광 광도계(Nanodrop)를 이용하여 농도 및 순도를 측정하였다.

1) 비늘과 피부 조직을 제거한 등 근육 조직을 적출하여 1.5ml tube에 넣는다.

2) ATL buffer 180㎕와 proteinase K 20㎕를 첨가하고 vortexing을 통해 섞은 후 조직이 완전히 용해될 때까지 56℃에서 보온한다.

3) 15초간 vortexing 후, AL buffer 200㎕를 첨가, 다시 vortexing하여 섞어준다.

4) 순수 에탄올 200㎕를 첨가하고 vortexing하여 섞어준다.

5) 위의 혼합 용액을 DNeasy Mini spin column으로 옮긴 뒤, 8,000rpm으로 1분간 원심분리를 실시한다.

6) 새로운 2ml collection tube로 교체 후, AW1 buffer 500㎕를 첨가하고 8,000rpm에서 1분간 원심분리한다.

7) 새로운 2ml collection tube로 교체한 뒤, AW2 buffer 500㎕를 첨가하고 14,000rpm에서 3분간 원심분리한다.

8) 2ml collection tube를 버리고, 새로운 1.5ml tube로 교체한다.

9) AE buffer 100㎕를 첨가하고 5분간 실온에 두고, 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 추출한다.

10) 필요에 따라 5)의 과정을 반복하여 2차로 DNA를 추출한다.

(2) mtDNA의 COI 유전자 및 RAG-1 유전자 단편 염기서열 결정을 위한 PCR

본 실험에서는 하나의 종 내에서 개체군 유전적 변이 패턴을 연구하는 데 주로 사용되는 mtDNA COI 유전자 및 핵유전자 마커인 RAG-1을 분석 마커로 사용하였다(하기 표 6 참조).

PCR 반응 혼합물은 AccuPower^® PCR PreMix kit(BIONEER Co., Korea) 또는 Solg^TM 2X Taq PCR Pre-Mix kit(SolGent Co., Korea)를 이용하였으며, AccuPower^®PCR PreMix kit의 경우는 전체 용량 20㎕에 맞추어 genomic DNA 1 ㎕, 10pmol의 프라이머 각 1㎕, 3차 증류수 17㎕을 첨가 후 혼합하였으며, Solg^TM 2X Taq PCR Pre-Mix kit의 경우에는 전체 용량 30㎕에 맞추어 15㎕의 2X Taq PCR Pre-Mix에 genomic DNA 1㎕, 10pmol의 프라이머 각 1㎕, 3차 증류수 12㎕을 첨가 후 혼합하였다(하기 표 7 참조).

혼합된 PCR 반응 용액은 Hanner 등(Hanner, R., S. Becker, N.V. Ivanova and D. Steinke, 2011. Fish-bol and seafood identification: Geographically dispersed case studies reveal systemic market substitution across Canada. Mitochondrial DNA, 22: 106-122.)의 방법에 의거하여 95℃에서 2분간 초기 변성 단계(initial denaturation) 후, 94℃ 변성 단계(denaturation) 30초, 52℃ 프라이머 결합 단계(annealing) 30초, 72℃ 신장 단계(extension) 1분을 35회 반복한 뒤, 72℃에서 추가 신장(final extension)을 10분간 진행하고 반응 종료 후 4℃가 유지되도록 하였다(하기 표 8 참조).

(3) PCR 반응 산물 확인

PCR 반응 산물을 확인하기 위해 전기영동을 수행하였고, 10X TBE buffer 100㎕ 및 agarose 1.0g을 혼합하여 전자레인지에서 녹인 뒤 EcoDye^TM DNA Staining solution(SolGent Co., Korea)을 10㎕ 첨가하여 1% agarose gel을 만들었으며, 시료의 양과 수에 맞추어 gel의 크기와 comb의 수를 조절하였다. Gel running tank에 gel을 넣고, gel이 완전히 잠기도록 10X TBE buffer를 채워 넣은 뒤, PCR 산물을 각 3㎕씩 gel의 구멍에 맞추어 넣은 다음 100V에서 30분간 전기영동 하였다. 전기영동이 완료되면 UV transilluminator 장치에 올려놓고, PCR 산물의 band를 확인하였다.

(4) 염기서열 결정

전기영동을 통해 확인된 PCR 산물은 ㈜바이오닉스에 의뢰하여 PCR 산물의 정제(Purification) 과정을 거쳐 ABI 3730xl DNA Analyzer를 통해 염기서열을 획득하였다. 획득된 염기서열은 BioEdit v.7.2.5 프로그램을 이용하여 확인 및 수정·보완하였으며, 개체별로 획득된 염기서열의 alignment를 수행하여 유전다양성 분석에 필요한 데이터 파일을 생성하였다.

실험 결과

(1) mtDNA CO1 유전자형

유전자 형질 분석은 교잡개체 생산을 위해 사육된 각시붕어 4개체, 흰줄납줄개 6개체를 사용하였다. 잡종세대는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)에서 유래된 5개체, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)에서 유래된 5개체를 무작위로 선택하여 분석을 실시하였다. 각시붕어와 흰줄납줄개를 모계로 유전하는 CO1 유전자 575bp를 분석한 결과 4개의 유전자형이 도출되었고, 각시붕어에서는 Hap3과 Hap4가 관찰되었으며, 흰줄납줄개에서는 Hap1과 Hap2가 관찰되었다.

흰줄납줄개의 기준 유전자형은 Hap1, 각시붕어의 기준 유전자형은 Hap3으로 잡았을 때 두 종간 최대 76개의 염기서열이 각 포지션에서 완전히 다른 것으로 관찰되었다. 종마다의 변이를 보면 흰줄납줄개는 136번에서 C→T, 364번에서 A→T로 염기 치환이 확인되었다. 각시붕어의 경우는 34번에서 G→A, 70번에서 A→G, 166번에서 T→G, 184번에서 C→C, 187번에서 T→C, 277번에서 G→A로 염기 치환이 확인되었다. 잡종세대 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)와 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 각 5개체에서도 각시붕어와 흰줄납줄개의 유전자형이 동일하게 도출되었다. 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 잡종세대인 Rhomix-27, Rhomix-28, Rhomix-30, Rhomix-31은 Rho-1과 Rho-2번, Rhomix-32는 Rho-4번이 흰줄납줄개 암컷에서 유래된 것을 알 수 있었다(하기 표 9 참조). mtDNA는 모계유전을 하는 유전자 영역으로 잡종세대의 부계 정보는 파악할 수 없었다.

mtDNA CO1 유전자형 결과와 NCBI에서 납자루아과 어류들의 유전정보를 다운받아 이를 바탕으로 N-J gene tree를 작성하였다(도 28 참조). 흰줄납줄개와 각시붕어를 제외한 나머지 종들은 outgroup을 이루었다. 이 연구에서 실험한 결과를 포함, Rhodeus속은 2개의 그룹(흰줄납줄개와 각시붕어, 떡납줄갱이와 납줄개)으로 분리되어 나타났으며, Acheilognathus속 역시 2개의 그룹(묵납자루와 임실납자루, 줄납자루와 납지리, 큰줄납자루, 큰납지리)을 형성하였다. 큰납지리는 Acheilognathus속 내에 위치하고 있어 향후 납자루아과 어류에 대한 계통분류의 정립이 필요할 것으로 판단되며, 본 발명에서 사용된 개체들의 유전자형과 NCBI에서 다운로드 한 HQ536500(흰줄납줄개)와 DQ155662(각시붕어) 염기서열은 각각의 종으로 그룹을 형성하여 실험에 사용된 개체들의 동정이 정확한 것으로 확인되었다. 각시붕어를 암컷으로 하여 생산한 교잡개체(Rhumix-25, 26, 33, 34, 35)는 모두 각시붕어의 성어 개체들과 그룹을 형성하였다. 흰줄납줄개를 암컷으로 하여 생산한 교잡개체(Rhomix-27, 28, 30, 31, 32)는 모두 흰줄납줄개의 성어 개체들과 그룹을 형성하였으며, N-J gene tree 결과를 통해 교잡개체들의 모계를 추정할 수 있었다.

(2) RAG-1 유전자형

각시붕어와 흰줄납줄개를 양친 유전하는 핵유전자인 RAG-1 유전자형을 분석하였다. 그 결과 각시붕어와 흰줄납줄개의 종간 유전자 염기서열 차이는 뚜렷하였다. 그러나 각 종별 개체들 간 염기서열 차이는 발견되지 않았다. 또한 암컷과 수컷의 유전적 차이도 도출되지 않았다. 따라서 각시붕어, 흰줄납줄개, 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 RAG-1유전자의 상관관계를 살펴본 결과 일부 영역에서 차이를 발견할 수 있었다(도 29 참조).

각시붕어와 흰줄납줄개 유전자형간 3개의 염기서열 변이구간이 명확하게 single peak로 확인되어 종간 차이를 나타내었다. 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 잡종개체에서는 RAG-1의 electropherogram을 분석한 결과 두 부모 종 각시붕어와 흰줄납줄개 개체들에서는 명확한 single peak가 나타났으나 부모종의 염기 치환이 관찰된 base position에서는 부모 종 양쪽 모두의 염기가 반응한 double peak가 잡종개체에서 확인되어 모계와 부계를 확인할 수 있었다.

종간 잡종 유도에 대한 연구는 우량형질의 두 종을 교배하여 단기간 내에 최소의 노력으로 산업성 있는 획득 형질, 즉 잡종강세를 얻기 위한 시도에서 비롯되었으며(비특허문헌 40 및 41 참조), 잡종의 산업적 가능성은 생존력, 성장력, 생식력, 성비 등에 의해 결정된다. 이들의 생존력은 배 발생, 부화, 난황 흡수 및 초기 먹이 붙임기인 발생 초기 단계에서 매우 다양하나 대체로 높은 사망률을 나타낸다(비특허문헌 42 및 43 참조). 이러한 초기 사망률을 낮추기 위해 잡종 3배체를 유도 생산하여 생존율 증가에 이용되고 있으며, 질병에 강한 품종을 생산하여 성장률 증가, 내병성 증가, 불임성 개체를 생산한 연구가 보고 되고 있다(비특허문헌 41, 44 및 45 참조).

현재까지 납자루아과에 대한 잡종연구는 주로 서식지역과 산란행위가 비슷한 어종 간에 발생된 자연잡종을 생물 통계적 연관관계 규명 등을 목적으로 다시 인공교잡 실험을 유도하고 있으며, 산업성 있는 형질 생산을 목적으로 한 인위적 유도에 대한 연구가 일부 수행되어 왔다(비특허문헌 46 참조). 납자루아과 어류는 크기가 작고, 체색이 다양하고 아름다워 산업적 가치가 더 높은 개체의 생산(높은 성장률과 뚜렷한 체색을 지닌 잡종의 생산 등)을 위해 연구되고 있다(비특허문헌 46 참조).

본 발명에서 사용된 각시붕어는 2015년 싱가포르에서 개최된 세계 아쿠아 펫 박람회(Aquarama)에서 관상어 경쟁 부문 3위에 입상하는 등 최근 우리나라를 대표하는 토속 관상어로서 그 가치를 주목받고 있으며, 흰줄납줄개는 체고가 높고, 몸 전체가 다홍색을 띠어 산란 시기가 되면 체색이 짙어지는 아름다운 색상을 가진 어종이다. 현재까지 각시붕어 및 흰줄납줄개 사이의 자연 잡종 출현은 보고되지 않았으나 두 종이 같은 서식지역에서 채집되는 것으로 나타나 잡종 출현 가능성에 대한 기초자료 확보가 필요하며, 또한 난 발생 및 자치어 형태발달 등 초기생활사 연구를 통해 교잡개체와 부모개체 간에서 나타나는 분류학적 형질차이를 규명할 수 있는 연구가 필요하다.

어류에서 초기생활사에 관한 연구는 종의 산란장소 선택 및 난 발생과 자치어 형태발달 등 종 특유의 생식전략을 분석하는 학문으로 종의 특징을 규명하고 유사종과의 분류학적 유연관계를 밝히는데 중요한 기초자료를 제공한다(비특허문헌 47 및 48 참조). 또한 난의 형태적, 생리적 특징과 배 발생 및 초기 성장 과정을 거치면서 종 고유 형질의 정보를 보여주기에 발생학적 특징에 관한 연구는 중요하다(비특허문헌 49 참조). 난 발생과 초기생활사 연구를 위해서는 성숙한 어미를 확보하거나 직접 사육을 해야 하는 등 친어의 확보, 산란유도 및 채란, 부화된 자치어의 초기 사육 어려움 등으로 지금까지 담수어류들의 초기생활사 연구가 활발하게 이루어지지 못하는 실정이다. 최근 하천의 개발 등 멸종위기종, 법적보호종을 중심으로 종의 보존과 복원의 중요성이 점차 인식되면서 많은 종들의 초기생활사 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 33, 50 내지 52 참조).

납자루아과 어류의 난 형태는 납줄개속(Rhodeus)의 전구형(bulb like type)과 납자루속(Acheilognathus)의 서양배형(pear type), 방추형(spindly type), 타원형(ovoid type)으로 잠정 구분할 수 있고, 그 크기와 미세 형태의 차이는 각 종마다 차이가 있어 분류와 분화 계통 형질로 사용된다(비특허문헌 53 참조).

각시붕어의 난 형태는 타원형에 가까운 전구형으로 난황색은 유백색이었다. 이와 같은 결과는 Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)의 보고와 일치하였고, 흰줄납줄개는 난황색이 담황색이었으며, 형태는 전구형으로 산란관에서 나올 때는 타원형이었으나 물을 흡수하면서 변하였다. Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)은 서양배 모양으로 분류하였고, 학자에 따라 분류 기준에 차이가 있으나 이 연구에서는 난 형태 분류 기준을 Kim 등(비특허문헌 53 참조)에 따랐다.

칼납자루(비특허문헌 53 참조)는 방추형이었고, 난황은 담황색을 띠었으며, 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조)는 타원형으로 난황은 담황색을 띠었다. 납자루(비특허문헌 57 참조)는 방추형이었고, 난황은 유백색을 띠었으며, 줄납자루(비특허문헌 58 참조)는 타원형이었고, 난황은 노란색을 띠었다. 묵납자루(비특허문헌 59 참조)는 서양배 모양이었고, 난황은 진한 황색을 띠었으며, 일본산 큰납지리(비특허문헌 60 참조)는 긴 타원형의 담황색을 띠었다. 한강납줄개(비특허문헌 61 참조)는 방추형의 서양배 모양이라고 보고하였으나 전구형에 가까웠으며, 난황은 담황색을 띠어 종마다 다양한 난 형태와 난황 색깔을 나타냈다.

각시붕어의 수정란 크기(장경×단경)는 평균 3.68×1.45mm였고, Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)이 보고한 경북 김해시 상동면에 위치한 낙동강 지류하천의 각시붕어는 수정란 크기 평균 3.35×1.65mm로 장경은 보다 컸고, 단경은 작아 차이를 보였다.

흰줄납줄개의 수정란 크기는 평균 2.62×1.53mm였고, Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)이 보고한 서식지는 Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)이 보고한 각시붕어 서식지와 동일하였으며, 평균 2.66×1.51mm였다. 안성천의 흰줄납줄개(비특허문헌 28 참조)는 평균 2.68×1.30mm로 장경은 안성천 개체가 가장 컸으나 단경은 가장 작아 차이를 보였다.

각시붕어와 흰줄납줄개의 수정란 크기는 장경이 각시붕어가 보다 컸고, 흰줄납줄개는 작았으며, 단경은 흰줄납줄개가 보다 컸고, 각시붕어가 작아 차이를 나타냈다.

수정란의 크기(장경×단경)를 같은 납자루아과 어류와 비교한 결과 칼납자루(비특허문헌 53 참조) 평균 4.35×1.76mm, 섬진강 개체(비특허문헌 62 참조) 평균 4.66×1.49mm, 납자루(비특허문헌 57 참조) 평균 4.58×1.49mm, 임실납자루(비특허문헌 63 참조) 평균 3.70×2.30mm로 각시붕어, 흰줄납줄개 보다 컸고, 칼납자루(비특허문헌 62 참조) 금강 개체 평균 3.19×1.34mm, 떡납줄갱이(비특허문헌 64 참조)는 안성천 개체 평균 3.58×1.17mm, 발안천 개체 평균 3.56×1.39mm로 각시붕어보다 작았으며, 김해시 상동면 개체와 흰줄납줄개 보다 컸다.

다른 납자루아과 어류의 경우 일본산 큰납지리(비특허문헌 60 참조) 평균 2.78×1.44mm, 한강납줄개(비특허문헌 61 참조) 평균 2.80×1.80mm, 일본산 칼납자루(비특허문헌 62 참조) 2.85×1.55mm로 각시붕어 보다 작았으나, 흰줄납줄개 보다는 컸으며, 납지리(비특허문헌 65 참조) 평균 2.58×1.77mm, 가시납지리(비특허문헌 66 참조) 2.09×1.26mm, 큰납지리(비특허문헌 67 참조) 평균 1.95×1.61mm, 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조) 평균 2.12×1.86mm, 줄납자루(비특허문헌 58 참조) 평균 1.19×1.57mm, 묵납자루(비특허문헌 59 참조) 평균 2.19×1.85mm, 남한강 개체(비특허문헌 68 참조) 평균 2.26×1.74mm, 임진강 개체 2.27×1.82mm로 각시붕어, 흰줄납줄개 보다 작았다(하기 표 10 및 11 참조).

Suzuki 및 Jeon(비특허문헌 29 참조)은 1976년 낙동강 본류로 합류되는 밀양강에서 채집한 각시붕어와 일본 Futatsu river에서 채집한 흰줄납줄개를 대상으로 인공교잡 실험을 실시하였다. 이 연구 결과와 비교해보았을 때 교잡개체의 부화 소요시간은 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)가 평균 수온 21.5℃ 일 때 53시간, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 동일한 수온에서 50시간, Suzuki 및 Jeon(비특허문헌 29 참조)은 수온 22.0℃일 때 흰줄납줄개(♀) × 각시붕어(♂) 39시간, 각시붕어(♀) × 흰줄납줄개(♂) 47시간이 소요되어 이 연구와 상반되는 결과를 나타냈다. 다른 교잡 개체에서는 떡납줄갱이(♀) × 각시붕어(♂) 및 각시붕어(♀) × 떡납줄갱이(♂) 평균 수온 22.0℃일 때 동일하게 46시간이 소요되어 교잡개체마다 수온에 따른 부화 시간이 다양하게 나타났다(비특허문헌 69 참조).

각시붕어는 평균수온 21.5℃ 일 때 48시간이 소요되었고, Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)은 수온 16.5~18.5℃ 일 때 48시간 30분이 소요되어 유사하였다. 흰줄납줄개는 평균 수온 21.5℃ 일 때 50시간이 소요되었고, Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)은 평균수온 21.2℃일 때 38시간, Suzuki 및 Jeon(비특허문헌 28 참조)은 평균수온 22.0℃ 일 때 39시간이 소요되어 수온은 유사하였으나 부화시간에서 다소 차이가 있었다. Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조), Suzuki 및 Jeon(비특허문헌 28 참조)은 부화가 시작되는 시간을 관찰 기준으로 한 것으로 보이며, 이 연구에서는 부화가 50% 이상 이루어졌을 때를 기준으로 하여 관찰자 시점에 따라 결과에 차이를 보이는 것으로 판단된다.

다른 납자루아과 어류의 부화 소요 시간은 칼납자루(비특허문헌 53 참조)는 수온 21.0℃ 일 때 49시간, 섬진강 및 금강 개체(비특허문헌 62 참조)는 수온 22.0℃일 때 45/47시간, 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조)는 평균수온 18.0℃ 일 때 43시간, 납자루(비특허문헌 57 참조)는 평균수온 22.0℃ 일 때 62시간, 줄납자루(비특허문헌 58 참조)는 평균수온 22.0℃ 일 때 39시간, 일본산 큰납지리(비특허문헌 60 참조)는 평균수온 20.0℃ 일 때 76시간, 묵납자루(비특허문헌 59 참조)는 평균수온 20.0℃ 일 때 49시간, 남한강 및 임진강(비특허문헌 68 참조) 개체는 평균수온 22.0℃ 일 때 53시간, 한강납줄개(비특허문헌 61 참조) 평균수온 17.0℃ 일 때 70시간, 떡납줄갱이(비특허문헌 64 참조)는 수온 22.0℃ 일 때 43시간이 소요되었다.

납자루아과 어류는 유사한 수온 임에도 종마다 다양한 부화 소요시간을 나타내었으며, 부화 수온은 자연 산란시기인 4~6월 수온과 유사한 20.0℃ 전후인 것으로 보아 산란시기에 따른 부화 적정수온이 생존율과 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다.

동일한 수온(평균 21.5℃)조건에서 각 단계별 소요시간을 부모개체와 교잡개체간 비교 결과 도 30과 같았다. 각시붕어는 비교개체 가운데 가장 빨리 부화 시간에 도달하였고, 흰줄납줄개는 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 보다 빠른 시간에 포배기까지 도달하였으나 부화시간이 동일하게 나타났다. 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 전체적으로 발생속도가 비교개체들 가운데 가장 느렸고 부화시간이 가장 많이 소요되는 것으로 나타나 차이를 보였다.

부화 직후 자어의 크기를 비교한 결과 교잡개체인 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 평균전장 3.31±0.23mm였고, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 평균전장 4.45±0.13mm로 보다 컸다. 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 각시붕어, 흰줄납줄개 보다 작았고, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 각시붕어 평균전장 4.98±0.04mm보다 작았으나 흰줄납줄개 평균전장 3.67±0.02 mm보다 컸다.

Suzuki 및 Jeon(비특허문헌 28 참조)은 흰줄납줄개(♀) × 각시붕어(♂) 평균전장 3.60mm, 각시붕어(♀) × 흰줄납줄개(♂) 평균전장 3.80mm로 보다 컸고 이 연구 결과와 비교해보면 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)가 가장 작았으며, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)가 비교 개체 중 가장 컸다.

다른 납자루아과 어류와 비교해보면 칼납자루(비특허문헌 62 참조) 섬진강 개체 평균전장 5.54mm, 금강 개체 평균전장 6.38mm, 일본 Sasagase river 개체 평균전장 4.95mm, 납자루(비특허문헌 57 참조) 전장 5.30~5.51 mm, 일본산 큰납지리(비특허문헌 60 참조)는 전장 5.60mm, 임실납자루(비특허문헌 63 참조) 평균전장 5.20mm, 떡납줄갱이(비특허문헌 64 참조)는 안성천 개체 평균전장 4.31mm, 발안천 개체 평균전장 4.03 mm, 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조)는 평균전장 4.23mm로 보다 작았으나 각시붕어, 흰줄납줄개 보다 컸다. 줄납자루(비특허문헌 58 참조) 전장 3.79~3.82mm, 남한강 묵납자루(비특허문헌 68 참조) 평균전장 3.65mm, 묵납자루(비특허문헌 59 참조) 전장 3.32~3.41mm, 가시납지리(Suzuki and Jeon,비특허문헌 66 참조) 평균전장 3.31mm, 한강납줄개(비특허문헌 61 참조) 평균전장 3.30mm, 임진강 묵납자루(비특허문헌 68 참조) 평균전장 3.25mm, 큰납지리(비특허문헌 67 참조) 평균전장 3.04mm로 각시붕어 보다 작았고, 흰줄납줄개 보다 컸다.

납자루아과 어류의 부화 자어는 익상돌기의 유무에 따라 납줄개속(난황에 익상돌기가 발달)과 납자루속(둥근 난황에 미세한 표피상 돌기가 발달)으로 구분되며, 각각의 종에 따라 독특한 형태를 가진다. 이러한 돌기는 난 발생 기간과 전기 자어시기를 조개 안에서 퇴출되지 않도록 생존해야 하는 생활사의 습성과 관련이 있는 것으로 보고 있다(비특허문헌 53 참조).

교잡개체인 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 부화 자어는 머리 양옆에 한 쌍의 익상돌기가 있었고, 바로 아래쪽에 1개의 돌기가 형성되어 있었다. 돌기의 소멸시기는 부화 후 15일째 난황의 흡수가 대부분 완료되었을 때 소멸되었다. 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 부화 자어는 머리의 양옆에 한 쌍의 익상돌기가 있었고, 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)보다 익상돌기가 길게 돌출되어 있었다. 아래쪽에는 1개의 돌기가 형성되어 있었고, 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)보다 돌기의 면적이 넓었으며, 반원 형태를 갖추고 있었다(도 31 참조). 돌기의 소멸 시기는 부화 후 8일째 난황의 흡수가 완료되기 전에 모두 소멸되었다. 각시붕어의 부화 자어는 머리 양 옆쪽에 익상돌기 한 쌍이 있었고, 아래쪽에는 1개의 돌기가 형성되어 있었다. 돌기 소멸 시기는 부화 후 11일째 난황 흡수가 완료되기 전 모두 소멸되었다. 흰줄납줄개는 머리 뒤쪽에 익상돌기 한 쌍이 있었고, 아래쪽에는 1개의 돌기가 형성되어 있었으며, 부화 후 13일째 난황 흡수가 완료되기 전 돌기가 모두 소멸되었다.

칼납자루(비특허문헌 53 참조)는 익상돌기가 없고, 표피상 돌기가 미세하게 있으며, 부화 후 8일째 난황이 모두 소모되는 시기에 돌기가 소멸된다. 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조)는 익상돌기가 없고, 난황표면에 미세한 돌기가 있다. 납자루(비특허문헌 57 참조)와 줄납자루(비특허문헌 58 참조)는 등 쪽에 표피상돌기가 형성되고, 부화 후 7일째 소멸된다. 묵납자루(비특허문헌 59 및 68 참조)는 체표면 전체에 표피상 돌기가 형성되고, 부화 후 20일에 완전히 소멸되는 것으로 알려져 있으며, 종마다 돌기의 형태와 위치가 다양하게 나타났다.

후기 자어로 이행하는 시기를 비교한 결과 교잡개체인 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 부화 후 17일째 평균전장 8.51±0.13mm, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 부화 후 19일째 평균전장 8.61±0.04mm로 이행 시기와 전장이 유사하였고, 각시붕어 보다 빨랐으며, 흰줄납줄개 보다 느렸다. 각시붕어는 부화 후 23일째 평균전장 8.97±0.08mm, Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)은 부화 후 22일째 평균전장 9.10mm, 흰줄납줄개는 부화 후 17일째 평균전장 8.12±0.01mm, Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)은 부화 후 30일 평균전장 8.50mm였다. 각시붕어는 이행 시기가 유사하였으나 전장의 차이가 있었고, 흰줄납줄개는 Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)의 관찰 시점이 본 연구 결과보다 늦어 시기와 전장에서 차이를 나타내었다. 큰줄납자루(비특허문헌 54 참조)는 부화 후 20일째 평균전장 10.12mm, 납자루(비특허문헌 57 참조) 부화 후 11일째 평균전장 9.70mm, 줄납자루(비특허문헌 58 참조) 부화 후 18일째 평균전장 7.39mm, 한강납줄개(비특허문헌 61 참조) 부화 후 15일째 평균전장 8.20mm, 묵납자루(비특허문헌 59 참조) 부화 후 12일째 평균전장 8.81mm, 일본산 큰납지리(비특허문헌 60 참조) 부화 후 15일째 평균전장 8.20mm로 전장은 종마다 다양한 차이를 보였고, 이행 시기는 각시붕어가 가장 늦었으며, 납자루가 비교 종 가운데 가장 빨랐다. 치어기로 이행하는 시기는 교잡개체인 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 부화 후 90일째 평균전장 23.5±0.98mm, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 부화 후 70일째 치어는 평균전장 32.8±3.39mm로 이행 시기가 보다 빨랐고, 전장 또한 보다 컸다(하기 표 12 참조). 각시붕어는 부화 후 56일째 평균전장 15.6±0.21mm, Kim 및 Han(비특허문헌 55 참조)은 부화 후 50일 평균 전장 14.5mm, 흰줄납줄개는 부화 후 58일째 평균전장 15.9±0.14mm, Kim 및 Park(비특허문헌 56 참조)은 부화 후 약 2개월 평균전장 14.4mm로 각시붕어는 시기와 전장이 다소 차이가 있었고, 흰줄납줄개는 시기가 유사하였으나 전장이 보다 컸다.

칼납자루는 부화 후 70일째 평균전장 20.4mm, 큰줄납자루 부화 후 50일째 평균전장 15.03mm, 한강납줄개 부화 후 40일째 평균전장 13.6mm로 전장은 종마다 다양한 차이를 보였고, 이행 시기는 교잡개체인 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)의 경우 가장 늦었으며, 한강납줄개는 비교 종 가운데 가장 빨랐다.

계수형질을 비교한 결과 지느러미 개수는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 등지느러미 ⅲ-11개, 뒷지느러미 ⅲ-9개, 배지느러미 ⅲ-4개로 각시붕어의 뒷지느러미, 흰줄납줄개의 등지느러미 개수가 유사하였고, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 등지느러미 ⅲ-10개, 뒷지느러미 ⅲ-9개, 배지느러미 ⅲ-4개로 각시붕어와 뒷지느러미 개수가 유사하게 나타났다(하기 표 13 참조).

척추골 수는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 복추골 15개, 미추골 18개 총 33개, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 복추골 16개, 미추골 17개 총 33개였고, 각시붕어는 복추골 17개 미추골 16개 총 33개, 흰줄납줄개는 복추골 16개, 미추골 17개 총 33개로 전체 척추골 수는 동일하였으나 교잡개체에서는 복추골과 미추골의 개수에서 차이를 나타냈으며, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)의 척추골 구조는 흰줄납줄개와 동일하게 나타났다. 새파 수는 각시붕어 6~8개로 총 14개, 흰줄납줄개 총 25개, 교잡개체는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 총 17개, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 총 20개로 차이를 나타냈다.

교잡개체의 유전자 분석을 위해 각시붕어 4개체와 흰줄납줄개 6개체의 성어, 잡종세대는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀), 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)를 각각 5개체씩 무작위로 선택하여 분석하였다.

각시붕어와 흰줄납줄개 모계를 유전하는 CO1 유전자 575bp를 분석한 결과 4개의 유전자형이 도출되었고, 두 종의 유전자형 간에는 최대 76개의 염기서열이 관찰되었으며, 교잡개체는 부모개체와 동일한 유전자형을 가지고 있다는 것이 확인되었다. 부모개체를 유전하는 핵 유전자인 RAG-1 유전자형을 분석한 결과 각시붕어와 흰줄납줄개의 종간 유전자 염기서열 차이가 뚜렷하게 나타났고, 부모종의 염기 치환이 관찰된 base position에서는 부모개체 양쪽 모두의 염기가 반응한 double peak가 잡종개체에서 확인되어 모계와 부계를 확인 할 수 있었다.

상기 결과를 종합해보면 각시붕어와 흰줄납줄개의 수정란은 뚜렷한 차이를 보였으나 같은 종임에도 불구하고 분포지역 및 수계별로 수정란, 부화자어 크기에서 차이를 보였다. 교잡개체는 부모 개체와 부화자어 형태가 상반되는 결과를 나타냈고, 크기에서 각각 차이를 나타내 형태적으로 명확히 구분할 수 있는 기초 자료를 마련하게 되었다. 부화 소요시간은 동일한 수온과 환경조건을 유지해주었고, 그 결과 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)와 흰줄납줄개의 부화시간이 동일하게 나타난 것을 확인할 수 있었다(하기 표 14 참조). 부화 직후부터 치어기까지 성장속도는 부모개체인 각시붕어의 경우 치어기로 이행하기까지 부화 후 56일이 소요되었고, 크기는 평균전장 15.6±0.21mm였으며, 흰줄납줄개는 부화 후 58일이 소요되었고, 크기는 평균전장 15.9±0.14mm로 나타났다. 교잡개체의 경우 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 사이에서 생산된 것이 부모개체 보다 성장속도에서 우세하게 나타났다. 이러한 현상은 육종학에서 잡종강세로 볼 수 있는데 주로 부모개체가 원연(서로 특성이 다른 것)일 때 동형접합성이 높은 양친 간에 크게 나타난다고 알려져 있다. 이 연구에서 생산된 교잡개체는 치어기에 달하였을 때 크기가 부모개체에 비해 우세하다는 점에서 1대 잡종의 강세를 나타내는 교배친의 상대적 능력인 조합능력을 가진 것으로 볼 수 있다. 향후 교잡개체의 산업적인 활용 가능성을 유추 해보았을 때 인위적인 선발과 반복적인 상호교배를 통해 우수한 체색과 형태를 지닌 우량개체를 생산하기 위해서는 유전자의 빈도를 높여가는 순환선발 생산에 대한 연구도 필요하다.

유도된 잡종이 친어 한쪽 종의 계측형질을 닮은 경우는 각시붕어와 떡납줄갱이(비특허문헌 32 참조)가 부계의 형질이 우세하다고 보고하였고, Yellowtail flounder, Pleuronectes ferrugineus (♀) × Winter flounder, P. americanus (♂) 사이의 잡종에서 모계 1가지, 부계 2가지의 형질을 닮은 것으로 나타났으며, 참돔(Pagrus major)(♀) × 감성돔(Acanthopagrus schlegelii)(♂) 사이의 잡종에서는 모계 2가지, 부계 7가지로 두 가지 연구 모두 부계의 형질을 많이 닮은 결과가 나타난 바 있다(비특허문헌 20 및 46 참조).

계측형질을 분석한 결과 각시붕어와 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 간의 유사한 전장에 대한 계측형질이 4가지, 두장에 대한 계측형질이 1가지였고, 흰줄납줄개와 유사한 전장에 대한 계측형질은 6가지로 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 흰줄납줄개와 가까웠다. 각시붕어와 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 전장에 대한 계측형질이 2가지였고, 흰줄납줄개와 유사한 전장에 대한 계측형질은 6가지, 두장에 대한 계측형질 1가지로 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 흰줄납줄개에 가까운 것으로 나타났다. 본 발명에서는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀) 경우 부계 5가지, 모계 6가지, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀) 경우 부계 7가지 모계 2가지로 모계의 형질이 더 우세한 것으로 나타났다.

형태적 차이점은 각시붕어의 등지느러미에서부터 꼬리지느러미 시작부분까지 이어진 파란색 줄무늬와 노란색을 띠는 뒷지느러미는 2종의 교잡개체에서 유사하였고, 꼬리지느러미 형태는 각시붕어, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)와 흰줄납줄개, 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)에서 유사하게 나타났다. 또한 흰줄납줄개의 짙은 색 등지느러미와 두부의 형태는 2종의 교잡개체에서 유사하였다(도 32 참조).

본 발명에서 조사된 분류형질은 발생학적 특징, 체형 및 체색, 계수 및 계측형질 등으로 부모개체와 유사한 형질을 종합한 결과 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)는 각시붕어 8가지, 흰줄납줄개 10가지로 나타났고, 흰줄납줄개(♂) × 각시붕어(♀)는 각시붕어 6가지, 흰줄납줄개 11가지로 교잡개체는 분류형질이 흰줄납줄개와 유사하였으며, 부모개체의 형질과 가장 유사한 교잡개체는 각시붕어(♂) × 흰줄납줄개(♀)인 것으로 나타났다(하기 표 14 참조).

최근 각시붕어 × 묵납자루(비특허문헌 37 참조), 한강납줄개 × 묵납자루(비특허문헌 35 참조), 묵납자루 × 납자루(비특허문헌 38 참조) 등 납자루아과 어류의 자연 잡종개체 출현이 증가하면서 계수형질인 새파, 척추골, 지느러미 줄기 수 등 형태적 분류, 유전 형질에 대한 기초자료 확보가 필요하여 향후 교잡에 대한 지속적인 연구가 이루어질 필요가 있다. 생산된 교잡개체는 부모개체에 비해 성장이 빠르고 체형 및 체색이 두 종의 특징을 골고루 가져 생물학적인 관점에서 보았을 때 부모개체보다 뛰어나다고 판단되어 관상어로서 산업적인 가치가 충분히 있을 것으로 보인다. 또한 새로운 관상어로 각광받기 위해서는 납자루아과 어류 특유의 아름다운 체색 발현을 유도하기 위한 빛, 수온, 먹이, 사육환경 등 적정조건을 규명하고, 재생산 여부 확인을 위한 연구가 이루어질 필요가 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims

추성이 형성된 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)의 수컷과 산란관의 길이가 3.08~3.59cm이고, 체장에 대한 산란관 길이의 비가 60.4~60.8%인 각시붕어(Rhodeus uyekii)의 암컷으로부터 각각 정액과 난을 채취하고, 이들 간의 인공수정을 실시하여 수정란을 얻고, 상기 수정란을 부화하는 단계를 포함하고, 상기 각시붕어(Rhodeus uyekii)와 흰줄납줄개(Rhodeus ocellatus)는 한국산 어종인 것을 특징으로 하는 각시붕어와 흰줄납줄개의 잡종 생산 방법.
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