KR101913627B1 - Variant Tomato Discrimination composition - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 변종 토마토를 판별할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 토마토 게놈 DNA 내 일정 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 포함함으로써 공시품종간 품종 구분, 공시품종과 변종 품종의 구분이 가능한 판별 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition capable of discriminating variant tomatoes, and more specifically, it relates to a composition for distinguishing varieties of tomatoes, including a set of primers capable of complementarily binding with a certain portion of tomato genomic DNA, The present invention relates to a distinguishable composition.
토마토(Solanum lycopersicum L.)는 약 1조원에 달하는 세계 종자시장 규모를 가진 고부가가치 글로벌 채소작물로, 국내에서도 소비가 증가하여 종자시장 규모가 2012년도에 186억으로 성장하였다. 국내 토마토 시장의 확대는 신품종 육성의 활성화를 이끌었는데 이와 더불어 지적재산권인 품종보호권의 중요성이 강조되고 있다. 토마토 신품종 심사는 잎, 꽃, 과실 등에서 발현되는 38개 형질에 대한 재배시험을 통해 기존 품종과 상호 비교하여 구별성을 판단하고 있다. 그런데, 이러한 형태적 특성조사는 시간과 비용이 많이 소요되고 경우에 따라 정확한 평가가 어렵다. 이러한 문제점을 보완할 수 있는 방법으로 DNA 마커로 평가하는 방법이 있다.Tomato ( Solanum lycopersicum L.) is a high value-added global vegetable crop with a global seed market amounting to about KRW 1 trillion, and its seed market has grown to 18.6 billion in 2012 due to increased consumption in Korea. The expansion of the domestic tomato market led to the activation of new varieties, and the importance of the right to protect varieties of intellectual property rights is emphasized. The screening of new varieties of tomatoes is carried out on 38 traits which are expressed in leaves, flowers, fruit, etc. However, this morphological characterization is time consuming and costly, and in some cases it is difficult to evaluate accurately. To overcome this problem, there is a method of evaluating with a DNA marker.
DNA 마커는 생물종의 유전체상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편으로, 식물 유전육종분야에서 유전자 지도 작성, 유용유전자 발굴 및 형질연관마커 개발, 유전적 다양성 분석, 순도검정 등에 활용되고 있다. DNA 마커에 의한 품종판별 방법은 형질특성검정에 근거한 방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 신속하고 정확도가 높다는 장점이 있다.DNA marker is a specific nucleotide sequence that can judge polymorphism on the genome of a species. It is used in genetic mapping, gene discovery and trait marker generation, genetic diversity analysis, and purity assay in the field of plant genetic breeding . The method of distinguishing the varieties by DNA markers is advantageous in that they are quick and accurate because they are not influenced by the cultivation environment and the growth stage of the crop compared to the method based on the trait characterization.
1992년에 처음으로 토마토의 유전자 지도가 보고된 이후, 다수의 마커가 개발되었으나, 개발된 마커는 광범위한 상업용 토마토에서 유전적 변이을 탐색하기에는 적절하지 못하다.Since the first genetic map of tomatoes was reported in 1992, a number of markers have been developed, but the developed markers are not suitable for exploring genetic variation in a wide range of commercial tomatoes.
이에, 광범위한 상업용 토마토 품종에서 유전적 변이를 높은 정확도로 간편하게 탐색할 수 있는 DNA의 마커의 개발이 절실히 필요하다.Thus, there is a strong need for the development of markers for DNA that can be easily searched for genetic variation with high accuracy in a wide range of commercial tomato varieties.
본 발명은 토마토 품종의 다형성을 확인할 수 있는 프라이머 세트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set which can confirm the polymorphism of tomato varieties.
본 발명은 신품종 심사에 활용될 수 있는 품종판별용 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.The object of the present invention is to provide a primer set, a composition and a kit for discriminating a variety which can be used for screening a new variety.
본 발명은 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 검출할 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set, a composition and a kit capable of detecting genetic mutations occurring in tomato varieties.
본 발명은 유전적으로 멀리 떨어진 대과종 품종과 소과종(방울형 및 대추형) 품종 간의 구별뿐 아니라, 유전적으로 가까운 방울형 품종과 대추형 품종을 구별할 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.The present invention provides a primer set, a composition and a kit which can distinguish not only genetically distant foliage varieties and small fern varieties (drop and jujube) varieties, but also genetically close varieties and jujube varieties The purpose.
본 발명은 유전적 변이가 발생한 토마토와 공시품종을 우수한 정확도로 구별할 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set, a composition and a kit which can distinguish genetically mutated tomatoes and cultivars with excellent accuracy.
본 발명은 시중에서 판매되는 대부분의 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 구별할 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set, a composition and a kit which can distinguish genetic mutations occurring in most commercially available tomato varieties.
본 발명은 육종가의 권리의 효율적 보호를 목적으로 토마토 품종간 구분을 위해 사용될 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set, a composition and a kit which can be used for sorting tomato varieties for the purpose of efficient protection of breeder's rights.
본 발명은 저렴하고 신속하게 토마토 품종 간 유전적 변이 발생을 판별할 수 있고, 토마토 공시품종을 구분할 수 있는 프라이머세트, 조성물 및 키트의 제공을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a primer set, a composition and a kit which can discriminate the occurrence of genetic mutation between tomato varieties inexpensively and promptly, and can distinguish tomato varieties.
1. 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트; 및 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트;를 포함하는 변종 토마토 판별용 조성물.1. A primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14; A primer set of SEQ ID NOS: 17 and 18; A primer set of SEQ ID NOS: 23 and 24; A primer set of SEQ ID NOS: 37 and 38; A primer set of SEQ ID NOS: 43 and 44; A primer set of SEQ ID NOS: 49 and 50; And a primer set of SEQ ID NOS: 67 and 68.
2. 위 1에 있어서, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 프라이머 세트; 및 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라미어 세트를 더 포함하는 변종 토마토 판별용 조성물.2. The primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16, A primer set of SEQ ID NOS: 51 and 52; A primer set of SEQ ID NOS: 53 and 54; A primer set of SEQ ID NOS: 57 and 58; And at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOs: 75 and 76.
3. 위 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트; 및 서열번호 81 및 82의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 더 포함하는 변종 토마토 판별용 조성물.3. The primer set according to any one of
4. 위 1에 있어서, 서열번호 1 내지 82의 프라이머를 포함하는 변종 토마토 판별용 조성물.4. The composition according to above 1, wherein the primers of SEQ ID NOS: 1 to 82 are used.
5. 위 1 내지 4 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 변종 토마토 판별용 키트.5. A kit for discriminating tomato varieties comprising any one of
6. 위 1 내지 4 중 어느 하나의 조성물로 토마토 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는 변종 토마토 판별 방법.6. A method for discriminating tomato varieties comprising amplifying tomato genomic DNA with any one of
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 검출할 수 있다.According to one embodiment of the invention, primer sets, compositions and kits are capable of detecting genetic variations occurring in tomato varieties.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 유전적으로 거리가 먼 대과종과 소과종 간의 구별뿐 아니라, 유전적으로 거리가 가까운 방울형 품종과 대추형 품종을 구별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, primer sets, compositions and kits are capable of discriminating between genetically distant foliage species and bovine species, as well as between genetically bell-like varieties and jujube varieties.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 유전적 변이가 발생한 토마토와 공시품종을 우수한 정확도로 구별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, primer sets, compositions and kits are capable of distinguishing between genetically mutated tomatoes and cultivars with excellent accuracy.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 시중에서 판매되는 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 구별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, primer sets, compositions and kits can distinguish genetic variations occurring in commercial tomato varieties sold on the market.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 육종가 권리의 효율적 보호를 목적으로 토마토 품종간 구분을 위해 사용될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, primer sets, compositions and kits can be used for the isolation of tomato varieties for the purpose of efficient protection of breeding rights.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프라이머세트, 조성물 및 키트는 저렴하고 신속하게 토마토 품종 간 유전적 변이 발생을 판별할 수 있고, 토마토 품종을 구분할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, primer sets, compositions and kits can inexpensively and quickly determine the occurrence of genetic mutations between tomato varieties, and can distinguish tomato varieties.
도 1은 61개의 F1 토마토 품종을 대상으로 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하여 확인된 대립유전자의 유무를 코드화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 62개의 F1 토마토 품종에 대한 본 발명에 따른 마커를 기반으로 수행한 PCA (Principal component analysis) 분석 결과이다. PCA 결과는 처음 두 주성분인 PC1과 PC2에 대해 각각 49.57%, 12.11%를 나타내는 점수를 플로팅하여 시각화한 것으로. 대과종 품종 (Fresh market)은 ▲, 대추형 품종 (Grape)은 ■, 방울형 품종 (Cherry)은 , 대목용 품종 (Rootstock)은 로 나타냈다.
도 3는 NTSYSpcv2.02에서 구현한 UPGMA (unweighted pair group mean algorithm)을 사용하여 62종의 F1 토마토 공시품종의 유전적 관계에 대한 dendrograms을 나타낸 것이다. UPGMA 분석은 본 발명에 따른 마커인 6 개의 SSR과 35 개의 InDel 마커를 포함한 41개의 마커를 사용하여 수행하였다. 도면의 오른쪽에 있는 숫자 (1 내지 62)는 표 1의 No 하위 목록에 기재되어 있는 숫자를 의미한다. 도면의 아래쪽의 눈금은 Jaccard의 유사도 계수를 나타낸다.
도 4는 10개의 염색체에 위치하는 12개의 InDel 마커를 사용하여 62개의 상업용 토마토 재배 품종에 대한 UPGMA dendrogram을 도시한 것이다.
도 5는 7개의 염색체에 위치하는 7개의 InDel 마커를 사용하여 62개의 상업용 토마토 재배 품종에 대한 UPGMA dendrogram을 도시한 것이다.FIG. 1 shows the results of encoding the presence or absence of alleles identified using the primer set according to the present invention in 61 F1 tomato cultivars.
FIG. 2 shows results of PCA (Principal Component Analysis) analysis based on the markers according to the present invention for 62 F1 tomato cultivars. The PCA results are visualized by plotting scores representing 49.57% and 12.11% for the first two components, PC1 and PC2, respectively. The fresh market is ▲, the jujube (Grape) is ■, the berry type (Cherry) is , Rootstock varieties (Rootstock) Respectively.
FIG. 3 shows dendrograms of genetic relationships of 62 species of F1 tomato varieties using UPGMA (unweighted pair group mean algorithm) implemented in NTSYSpcv2.02. UPGMA analysis was performed using 41 markers including 6 SSRs and 35 InDel markers, which are markers according to the present invention. The numbers (1 to 62) on the right side of the figure mean the numbers listed in the No sub-list of Table 1. [ The scale at the bottom of the figure shows the similarity coefficient of Jaccard.
Figure 4 shows a UPGMA dendrogram for 62 commercially available tomato cultivars using 12 InDel markers located on 10 chromosomes.
Figure 5 shows UPGMA dendrograms for 62 commercially available tomato cultivars using 7 InDel markers located on 7 chromosomes.
본 발명은 변종 토마토 판별용 조성물에 관한 것으로, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트; 및 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트를 포함함으로써, 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 검출할 수 있고, 유전적으로 거리가 먼 대과종과 소과종 간의 구별뿐 아니라, 유전적으로 거리가 가까운 방울형 품종과 대추형 품종을 구별할 수 있고, 유전적 변이가 발생한 토마토와 공시품종을 우수한 정확도로 구별할 수 있고, 시중에서 판매되는 대부분의 토마토 공시품종에서 발생한 유전적 변이를 구별할 수 있고, 육종가의 권리의 효율적 보호를 목적으로 토마토 품종간 구분을 위해 사용될 수 있고, 저렴하고 신속하게 토마토 품종 간 유전적 변이 발생을 판별할 수 있고, 토마토 품종을 구분할 수 있는, 변종 토마토 판별용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for discriminating variant tomatoes, comprising a primer set of SEQ ID NOS: 13 and 14; A primer set of SEQ ID NOS: 17 and 18; A primer set of SEQ ID NOS: 23 and 24; A primer set of SEQ ID NOS: 37 and 38; A primer set of SEQ ID NOS: 43 and 44; A primer set of SEQ ID NOS: 49 and 50; And SEQ ID NOS: 67 and 68, it is possible to detect the genetic mutation occurring in the tomato varieties and to distinguish genetically distant females from bovine species, as well as to distinguish genetically distant varieties Can identify the genetic variants of the jujube cultivars, distinguish genetically mutated tomatoes from published varieties with excellent accuracy, distinguish genetic variations in most commercially available tomato varieties sold, The present invention relates to a composition for discriminating tomato varieties which can be used for distinguishing tomato varieties for the purpose of efficient protection of rights, can discriminate occurrence of genetic mutation between tomato varieties inexpensively and quickly, and can distinguish tomato varieties.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
"프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥, 즉 주형 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 주형 가닥을 복제하기 위한 합성 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 주형 가닥의 복제를 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.A " primer " refers to a single strand oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be amplified, i.e., a template strand, and may serve as a synthetic start point for cloning template strands. The length and sequence of the primer should allow the template strand to begin replication. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 명세서에서 "서열번호 x 내지 y의 프라이머"는 "서열번호 x 내지 y의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프라이머"과 동일한 의미로 사용된다. 여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 20의 정수 중 어느 하나이다.In the present specification, "primer of SEQ ID NO: x to y" is used in the same sense as "primer consisting of polynucleotide of SEQ ID NO: x to y". Here, x and y are each independently an integer of 1 to 20.
"폴리뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)가 수개 이상 중합한 중합체를 의미하며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 폴리뉴클레오티드의 유사체 (예컨대, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산), 삽입 물질 등을 포함할 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는 "염기서열"과 동일한 의미를 갖는다.&Quot; Polynucleotide " means a polymer in which several or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides are polymerized in the form of a single strand or a double strand, and unless otherwise specified, an analog of a natural polynucleotide Phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids), intercalators, and the like. &Quot; Polynucleotide " has the same meaning as " base sequence ".
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 토마토 변종 판별 마커의 염기서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.The sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient if the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer. Therefore, the primer set provided in the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the nucleotide sequence of the tomato variant discrimination marker, and it is sufficient that the complementary set within the range capable of hybridizing to the primer function in this sequence is sufficient.
"상보적"이란 용어는 핵산과 관련하여 사용될 때, 그 염기들이 반대의 극성을 갖는 또 다른 핵산의 폴리뉴클레오티드의 염기들과 결합하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 한 방향의 극성을 갖는 핵산을 의미한다. 예를 들면, 5'에서 3'방향으로 서열 GCAT를 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서열 CGTA를 갖는 핵산과 상보적이다. 본 명세서에서, 상보적이라는 용어는 실질적으로 상보적인 핵산들을 포함하는 것으로 사용된다. 실질적으로 상보적이라는 것은 모든 뉴클레오티드가 또 다른 핵산의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지는 않지만 그럼에도 불구하고 두 핵산이 특정 조건하에서 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 갖는 것을 의미한다.The term " complementary " when used in reference to a nucleic acid means a nucleic acid having a polarity in one direction containing a polynucleotide sequence in which the bases bind to bases of a polynucleotide of another nucleic acid of opposite polarity . For example, a nucleic acid having a sequence GCAT in the 5 'to 3' direction is complementary to a nucleic acid having a sequence CGTA in the 3 'to 5' direction. As used herein, the term complementary is used to include substantially complementary nucleic acids. Substantially complementary means that not all nucleotides are paired with the nucleotides of another nucleic acid, but nevertheless both nucleic acids have a sequence capable of forming a stable hybrid under certain conditions.
본 발명은 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트; 및 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트;를 포함하는 변종 토마토 판별용 조성물을 제공한다.The present invention relates to a primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14; A primer set of SEQ ID NOS: 17 and 18; A primer set of SEQ ID NOS: 23 and 24; A primer set of SEQ ID NOS: 37 and 38; A primer set of SEQ ID NOS: 43 and 44; A primer set of SEQ ID NOS: 49 and 50; And a primer set of SEQ ID NOS: 67 and 68. The present invention also provides a composition for identifying a variant tomato.
변종 토마토는 본 발명에서 개시한 62개의 공시품종 토마토 내에서 자연적 또는 인위적으로 유전적 변이가 발생한 토마토를 의미한다.Variant tomatoes are tomatoes that have natural or artificially generated genetic mutations in the 62 disclosed tomato varieties of the present invention.
프라이머 세트는 본 발명에 따른 토마토의 Indel 마커 중 sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 또는 sli1920과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머로, 이들 마커의 증폭 여부를 판별함으로써 토마토의 변종 유무를 정확하게 판별할 수 있다.The primer set is a primer capable of complementarily binding to sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 or sli1920 among the Indel markers of the tomato according to the present invention. By determining whether these markers are amplified, Can be distinguished.
본 발명의 조성물을 사용 시 토마토의 변종 유무에 대한 판별이 저렴하고 신속하게 수행될 수 있고, 공시품종 토마토에서 발생하는 유전적 변이를 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 판별용 키트로 토마토의 품종간 구분이 가능하다.When the composition of the present invention is used, the discrimination of the presence or absence of the tomato variant can be carried out inexpensively and promptly, and the genetic variation occurring in the disclosed tomato variety can be discriminated. In addition, the discrimination kit of the present invention can distinguish between tomato varieties.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 대과종과 유전적으로 거리가 먼 소과종을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 유전적으로 거리가 가까운 방울형 품종과 대추형 품종도 구분할 수 있어 품종간 구분에 유용하다.According to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention not only distinguishes the species that are genetically distant from the major species, but also distinguishes the berry type and the jujube type genetically close to each other. useful.
본 발명의 조성물은 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트; 및 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트;만을 포함하더라도 토마토 변종 판별 또는 토마토의 품종간 구분을 우수한 정확도로 수행할 수 있다.The composition of the present invention comprises a primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14; A primer set of SEQ ID NOS: 17 and 18; A primer set of SEQ ID NOS: 23 and 24; A primer set of SEQ ID NOS: 37 and 38; A primer set of SEQ ID NOS: 43 and 44; A primer set of SEQ ID NOS: 49 and 50; And the primer set of SEQ ID NOS: 67 and 68, the discrimination of tomato varieties or the division of varieties of tomatoes can be performed with excellent accuracy.
그러나 상기 7개의 프라이머 세트만 사용하는 경우에는 예컨대, 장기간 많은 수의 토마토의 품종을 판별하는 임상 사용 시 예기치 못한 새로운 토마토 변종의 출현 또는 판별을 수행하는 사람 또는 기계의 실수 등 미리 예견할 수 없는 변수에 의해 만에 하나 잘못된 음성 반응이 나오는 경우가 생길 가능성을 완전히 배제할 수는 없다.However, in the case of using only the above-mentioned seven primer sets, for example, in the case of clinical use in which a large number of tomato varieties are discriminated over a long period of time, unexpected new tomato varieties appear, It is not possible to completely exclude the possibility that a false negative reaction may occur in only by
상기 잘못된 음성 반응이 나오는 가능성은 본 발명에 따른 추가의 프라이머 세트에 의한 중복 검사를 통해 보완할 수 있어, 품종간 구분 또는 공시품종과 다른 변종 토마토 여부에 대한 판별을 더욱 더 정확하게 수행할 수 있다.The possibility of the false negative reaction can be complemented by an additional primer set according to the present invention, so that it is possible to more accurately discriminate between the cultivars or whether or not the varieties are different from the known varieties.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 프라이머 세트; 및 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises a primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16; A primer set of SEQ ID NOS: 51 and 52; A primer set of SEQ ID NOS: 53 and 54; A primer set of SEQ ID NOS: 57 and 58; And a primer set of SEQ ID NOs: 75 and 76. The primer set of SEQ ID NOs: 75 and 76 may further comprise at least one primer set.
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트는 본 발명에 따른 변종 토마토를 판별할 수 있는 Indel 마커인 SL10126i, sli2792, sli1019, sli1285, sli3013 또는 sli1962와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머로 (표 3 참조), sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 및 sli1920의 증폭 여부의 확인과 더불어 추가적으로 이들 마커의 증폭 여부를 확인함으로써 변종 토마토 유무를 더욱 정확하게 판별할 수 있다.A primer set according to an embodiment of the present invention is a primer capable of complementarily binding with indel markers SL10126i, sli2792, sli1019, sli1285, sli3013 or sli1962 capable of discriminating a variant tomato according to the present invention (see Table 3) ), sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 and sli1920 in addition to confirming whether these markers are further amplified.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 판별용 키트는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트; 및 서열번호 81 및 82의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있으며, 이 경우 다른 프라이머 세트에 의한 판별 또는 구별에 문제가 생기더라도 이를 보완할 수 있어 높은 정확도로 변종 토마토를 판별하고, 토마토의 품종을 구별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the discriminating kit of the present invention comprises the primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; A primer set of SEQ ID NOS: 19 and 20; A primer set of SEQ ID NOS: 21 and 22; A primer set of SEQ ID NOS: 25 and 26; A primer set of SEQ ID NOs: 27 and 28; A primer set of SEQ ID NOs: 29 and 30; A primer set of SEQ ID NOS: 31 and 32; A primer set of SEQ ID NOS: 33 and 34; A primer set of SEQ ID NOS: 35 and 36; A primer set of SEQ ID NOS: 39 and 40; A primer set of SEQ ID NOS: 41 and 42; A primer set of SEQ ID NOs: 45 and 46; A primer set of SEQ ID NOS: 47 and 48; A primer set of SEQ ID NOS: 55 and 56; A primer set of SEQ ID NOS: 59 and 60; A primer set of SEQ ID NOs: 61 and 62; A primer set of SEQ ID NOS: 63 and 64; A primer set of SEQ ID NOs: 65 and 66; A primer set of SEQ ID NOS: 69 and 70; A primer set of SEQ ID NOS: 71 and 72; A primer set of SEQ ID NOS: 73 and 74; A primer set of SEQ ID NOS: 77 and 78; A primer set of SEQ ID NOS: 79 and 80; And a primer set of SEQ ID NOs: 81 and 82. In this case, even if there arises a problem in discrimination or discrimination by the other primer set, it can be supplemented, and a high accuracy To identify variant tomatoes, and to distinguish varieties of tomatoes.
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트는 본 발명에 따른 변종 토마토를 판별할 수 있는 SSR 또는 Indel 마커와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머로 (표 3 참조), 이들 마커에 대한 증폭 여부를 추가로 더 확인함으로써 변종 토마토 유무를 더욱 정확하게 판별할 수 있다.A primer set according to an embodiment of the present invention is a primer capable of complementarily binding SSR or Indel markers capable of discriminating a variant tomato according to the present invention (see Table 3) It is possible to more accurately determine the presence or absence of the variant tomato.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 변종 토마토 판별용 키트는 본 발명에 따른 변종 토마토를 판별할 수 있는 SSR 또는 Indel 마커와 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 1 내지 82의 프라이머를 포함할 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the kit for variant tomato discrimination of the present invention comprises a primer of SEQ ID NOS: 1 to 82 capable of complementarily binding with an SSR or Indel marker capable of discriminating a variant tomato according to the present invention .
본 발명의 조성물에 의한 유전자 마커의 증폭은, 본 발명의 조성물에 포함되는 2 이상의 프라이머 세트로 수행되며, 상기 증폭은 각각의 프라이머 세트에 의해 독립적으로 수행되거나 2 이상의 프라이머 세트로 동시에 또는 시간을 달리하여 수행될 수 있으며, 동시에 수행하는 경우 한 번의 증폭 반응에 2 이상의 프라이머 세트를 같이 사용하는 경우도 포함한다.Amplification of the genetic markers by the composition of the present invention is carried out with two or more sets of primers contained in the composition of the present invention and the amplification may be performed independently by each set of primers or simultaneously with two or more sets of primers, , And when two or more primer sets are used together in one amplification reaction when they are carried out at the same time.
본 발명의 조성물은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법에 사용되기 위한 것일 수 있다.The composition of the present invention can be used in a variety of fields such as polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Amplification (strand displacement amplification) or amplification through Q [beta] replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art.
본 발명의 조성물은 하기 키트에 추가로 포함되는 물질을 모두 포함할 수 있다.The composition of the present invention may include all of the substances further included in the following kit.
본 발명은 다른 양태로, 본 발명의 조성물을 포함하는 변종 토마토 판별용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for discriminating tomato varieties comprising the composition of the present invention.
본 발명의 키트는 전술한 본 발명의 조성물에 포함되는 물질을 모두 포함할 수 있다.The kit of the present invention may include all the substances included in the composition of the present invention described above.
또한, 본 발명의 판별용 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있고, 또한 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.In addition, the discriminating kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing the microarray. The microarray kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and may also include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 판별용 키트는 역전사효소, 중합효소, 반응완충액, 중합효소, dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), Mg2 +와 같은 조인자 및 버퍼 등이 더 포함될 수 있다. 반응완충액으로는 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2등의 성분을 포함하는 통상의 완충용액을 적절히 변형하여 사용할 수 있다. 역전사효소, 중합효소 및 버퍼는 각각 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있으며, 역전사효소 및 중합효소의 혼합물이 한 용기에 담겨 있고 버퍼가 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있고, 역전사효소, 중합효소 및 버퍼가 모두 혼합되어 한 용기에 담겨 있을 수도 있다.According to one embodiment of the present invention, the discriminating kit of the present invention further comprises a binding agent such as reverse transcriptase, a polymerase, a reaction buffer, a polymerase, dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), Mg 2 + . As the reaction buffer, a conventional buffer solution containing components such as Tris-HCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , MgCl 2 and the like can be suitably modified and used. The reverse transcriptase, the polymerase, and the buffer may be contained in separate containers. A mixture of the reverse transcriptase and the polymerase may be contained in one container, the buffer may be contained in a separate container, and the reverse transcriptase, They may all be mixed and contained in one container.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 판별용 키트는 일반적인 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응 등에 사용될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the discriminating kit of the present invention can be used for general polymerase chain reaction or real-time PCR.
중합효소연쇄반응의 결과물은 아가로즈 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 변종 토마토 판별, 공시품종을 구분할 수 있다.The result of the polymerase chain reaction can be separated by agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis, and DNA having a length corresponding to the DNA polymerized by the primer set used , And it is possible to distinguish the varieties of tomato varieties and the varieties of varieties.
본 발명의 판별용 키트가 실시간 중합효소연쇄반응에 사용되는 경우에는 본 발명에 따른 프라이머 세트와 더불어 프로브 (probe)를 추가적으로 사용할 수 있다. 프로브는 각각의 프라이머 세트의 사용에 적합하도록 제작하는 것이 바람직하다. 예컨대, 각각의 프로브는 해당 프로브와 함께 사용될 프라이머 세트에 의해 증폭되는 DNA 절편의 일 부분에 해당하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 각각의 프로브는 5'말단에는 형광물질이 결합되고 3'말단에는 소광체 (quencher)가 결합된 것일 수 있다.When the discriminating kit of the present invention is used in a real-time PCR, a probe may be additionally used in addition to the primer set according to the present invention. Preferably, the probes are designed to be suitable for use with each primer set. For example, each probe preferably comprises a sequence corresponding to a portion of the DNA fragment amplified by the primer set to be used with the probe. Each of the probes may have a fluorescent substance bound to the 5 'end and a quencher to the 3' end.
보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 각각의 프로브의 5'말단에는 적색, 녹색, 청색 등 특정 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3'말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다. 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소에 의해 소광체에 결합되어 있던 형광물질이 결합되어 있던 프로브가 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.According to a more specific embodiment, a fluorescent material that emits a specific wavelength such as red, green, and blue is bound to the 5'-end of each probe, and a black hole quencher (BHQ) is bonded to the 3'- have. In the state where the fluorescent substance and the quencher are bonded to the probe, the quencher absorbs the light emitted by the fluorescent substance, so that the fluorescent signal is not detected. On the other hand, fluorescence signals can be detected when a probe having a fluorescent substance bound to a quencher is separated by a DNA polymerase in DNA synthesis and elongation. During the course of the polymerase chain reaction, the fluorescence signal can be measured in real time, and the presence or absence of the virus can be determined based on the increased fluorescence signal. The use of such probes can be useful for real-time PCR reactions.
본 발명의 판별용 키트는 역전사반응과 중합효소연쇄반응을 각각 별도의 반응 혼합물 (mix)을 준비하여 별도로 수행하는 것일 수 있고, 또한 하나의 반응 혼합물을 준비하여 원스텝 역전사 중합효소연쇄반응 (one-step RT-PCR)을 수행하는 것일 수 있다.The identification kit of the present invention may be prepared by separately preparing a reaction mixture and a reverse reaction and a polymerase chain reaction separately. One reaction mixture may be prepared and subjected to one-step reverse transcription polymerase chain reaction (one- step RT-PCR).
본 발명의 판별용 키트는 인터널 컨트롤 (internal control)을 포함할 수 있다. 시료 내 본 발명에 따른 마커가 존재하지 않는 경우에는 유전자 증폭이 일어나지 않는데, 이러한 경우와 중합효소연쇄반응 자체에 문제가 있어서 유전자 증폭이 일어나지 않는 경우를 구분하기 위하여, 토마토 게놈 DNA에 존재하지 않는 외부 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트 및 해당 외부 유전자 DNA를 포함하는 인터널 컨트롤을 사용할 수 있다. 인터널 컨트롤의 증폭을 통해 중합효소연쇄반응 과정의 유효성을 확인할 수 있다.The discriminating kit of the present invention may include an internal control. In the case where the marker according to the present invention is not present in the sample, gene amplification does not occur. In order to distinguish the case where the gene amplification does not occur due to a problem in this case and the polymerase chain reaction itself, A primer set that specifically amplifies the gene and an internal control containing the foreign gene DNA can be used. The amplification of the internal control can be used to confirm the effectiveness of the polymerase chain reaction.
본 발명의 판별용 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 판별용 키트는 용기 (예컨대, 일회용 PCR 튜브 등)에 담겨 있는 동결건조된 (lyophilized) 프라이머를 포함할 수 있다. 두 개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우에는, 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 PCR 튜브에 담겨 있을 수도 있고, 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 PCR 튜브에 담겨 있을 수도 있다. 예컨대, 여러 개의 프라이머 세트를 포함하는 판별용 키트의 경우, 어느 하나의 프라이머 세트가 동결건조분말 형태로 담겨 있는 일회용 PCR 튜브와, 상기 프라이머 세트와 다른 프라이머 세트가 동결건조분말 형태로 각각 담겨 있는 일회용 PCR 튜브가 판별용 키트에 포함될 수 있다. 또한, 여러 개의 프라이머 세트가 동결건조분말 형태로 혼합되어 담겨 있는 일회용 PCR 튜브가 판별용 키트에 포함될 수 있다.The identification kit of the present invention is not limited to a particular form, but may be embodied in various forms. According to one embodiment, the discriminating kit may comprise a lyophilized primer contained in a container (e.g., a disposable PCR tube, etc.). In the case of containing two or more primer sets, a plurality of primer sets may be mixed and contained in a PCR tube, and each primer set may be individually contained in each PCR tube. For example, in the case of a discriminating kit including a plurality of primer sets, a disposable PCR tube in which one primer set is contained in the form of a lyophilized powder, and a disposable PCR tube in which a primer set different from the primer set is contained in a lyophilized powder form PCR tubes may be included in the discrimination kit. Also, a disposable PCR tube in which several primer sets are mixed and contained in the form of a lyophilized powder may be included in the discriminating kit.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 판별용 키트에는 역전사효소, 중합효소 및 버퍼 등이 포함될 수 있다. 역전사효소, 중합효소 및 버퍼는 각각 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있으며, 역전사효소 및 중합효소의 혼합물이 한 용기에 담겨 있고 버퍼가 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있고, 역전사효소, 중합효소 및 버퍼가 모두 혼합되어 한 용기에 담겨 있을 수도 있다.Also, according to one embodiment of the present invention, the discriminating kit may include a reverse transcriptase, a polymerase, a buffer, and the like. The reverse transcriptase, the polymerase, and the buffer may be contained in separate containers. A mixture of the reverse transcriptase and the polymerase may be contained in one container, the buffer may be contained in a separate container, and the reverse transcriptase, They may all be mixed and contained in one container.
다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 판별용 키트에는 위의 프라이머, 역전사효소, 중합효소 및 버퍼를 포함하는 반응 혼합물이 액체의 형태로 용기 (예컨대, 일회용 PCR 튜브)에 담겨 있을 수 있다. 이를 냉동 보관 하였다가 필요시 해동하여 사용할 수 있다. 이러한 판별용 키트의 경우, 판별 시 검체를 추가하는 것 외에는 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 판별 편의성 및 신속성이 증대될 수 있다.According to another embodiment, a reaction kit comprising the above primers, reverse transcriptase, a polymerase and a buffer may be contained in a container (for example, a disposable PCR tube) in the form of a liquid in the discriminating kit of the present invention. It can be stored frozen and thawed if necessary. In the case of such a discriminating kit, since a separate mixing process is not required except for adding a sample at the time of discrimination, the convenience of discrimination and quickness can be increased.
본 발명은 다른 양태로, 토마토에서 추출된 게놈 DNA와 상보적으로 결합하는 본 발명에 따른 프라이머 세트 중 적어도 하나로 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 변종 토마토 판별 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method of identifying a variant tomato, comprising amplifying a target sequence into at least one of a primer set according to the present invention that binds complementarily to genomic DNA extracted from tomato.
토마토 게놈 DNA는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수득할 수 있으며, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트로 수득할 수 있다.Tomato genomic DNA can be obtained by a method commonly used in the art such as phenol / chloroform extraction method and SDS extraction method, and can be obtained by a commercially available DNA extraction kit.
또한, 토마토 게놈 DNA를 얻는 방법은 토마토의 RNA 유전체로부터 역전사효소의 작용을 통한 역전사 반응을 별도로 수행하여 cDNA를 수득하는 것일 수 있다. 토마토 cDNA를 얻기 위한 RNA의 추출은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 추출된 RNA는 영하 70 ℃에서 보관될 수 있다.In addition, the method for obtaining the tomato genome DNA may be to separately obtain a cDNA by carrying out reverse transcription reaction through the action of reverse transcriptase from the RNA genome of tomato. Extraction of RNA for obtaining tomato cDNA can be performed using various methods known to those skilled in the art. The extracted RNA can be stored at minus 70 ° C.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 토마토에서 추출된 게놈 DNA는 토마토의 잎, 줄기, 뿌리, 씨앗 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나에서 유래된 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, genomic DNA extracted from tomatoes may be derived from at least one selected from the group consisting of leaves, stem, root, seed and fruit of tomato.
본 발명의 방법은 상기 증폭에 의한 산물을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method of the present invention may further comprise detecting the product by said amplification. The detection of the amplification product can be performed by DNA chip, gel electrophoresis, radioactive measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
증폭 산물은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예컨대, 증폭 산물은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 증폭 산물을 형광 현미경으로 검출할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 사용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.The amplification product may be labeled with a detectable labeling substance. For example, the amplification product may be a fluorescent, phosphorescent, or radioactive substance, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance may be Cy-5 or Cy-3. When PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer upon amplification, the amplified product can be detected by fluorescence microscope. When the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, the amplification product may be synthesized and radioactivity may be incorporated and the amplification product may be labeled as radioactive.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 변종 토마토를 판별할 수 있는 6개 SSR 마커 (TG7-18, TG9-11, TOM196, TOM144, TG12-5, TG12-13)와 35개 InDel 마커 (sli2887, SL10126i, sli2792, LEOH174, SL10279i, sli2495, sli2569, sli2645, SL10480i, SL10689i, sli2215, sli2238, sli2311, SL10888, sli555, sli583, SL10151i, SL10373i, sli608, sli1019, sli1285, sli1275, sli3013, sli1847, sli1864, sli1817, sli1820, sli1920, sli3018, sli1809, SL10737i, sli1962, sli2009, sli2112 및 LEOH301)의 전부 또는 일부의 증폭 여부를 확인함으로써 변종 토마토 유무를 판별할 수 있고, 공시품종의 품종을 구분할 수 있다.The method of the present invention comprises six SSR markers (TG7-18, TG9-11, TOM196, TOM144, TG12-5, TG12-13) and 35 InDel markers (sli2887, SL10126i , sli2792, LEOH174, SL10279i, sli2495, sli2569, sli2645, SL10480i, SL10689i, sli2215, sli2238, sli2311, SL10888, sli555, sli583, SL10151i, SL10373i, sli608, sli1019, sli1285, sli1275, sli3013, sli1847, sli1864, , sli1920, sli3018, sli1809, SL10737i, sli1962, sli2009, sli2112, and LEOH301) can be identified by the amplification of all or a part thereof, and the varieties of the disclosed varieties can be identified.
이하, 본 발명을 하기 실시예로 보다 자세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님은 당연하다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. The following examples are of course not intended to limit the scope of the invention.
실시예Example
1. 공시 품종1. Published varieties
국내에서 품종보호출원 및 유통되고 있는 토마토 품종의 DNA profiling을 위해 Nongwoo Bio, Kore-gon, Monsanto Korea 및 Syngenta Korea 등 총 16개 종자회사에서 62개의 F1 품종의 종자를 수집하였다 (표 1).Sixteen seeds of F1 varieties were collected from 16 seed companies including Nongwoo Bio, Korea-gon, Monsanto Korea, and Syngenta Korea for DNA profiling of tomato varieties filed and distributed in Korea (Table 1).
2. 유전자형 분석2. Genotype analysis
공시품종의 DNA는 유묘기의 어린잎을 채취하여 CTAB 방법을 이용하여 분리하였고, 농도를 ㎕당 20 ng로 맞추어 PCR 분석에 사용하였다. 유전자형 분석은 기존에 토마토에서 보고된 SSR 및 InDel 마커들을 대상으로 PIC (Polymorphism information content) 값, 염색체상의 위치 및 대립유전자 크기를 고려하여 선발하였고 수행하였다. 형태적으로 큰 차이를 보여주는 '미니찰' 등 8개의 품종을 이용하여 이러한 마커들의 품종간 다형성 여부를 조사하였다 (표 1). PCR 반응은 40 ng DNA, 0.1 μM SSR primer, 0.2 mM dNTP, 1 unit의 Taq polymerase, 2 ㎕의 10x buffer (20 mM Tric-HCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl, Stabilizer, 50% glycerol, pH 7.5) (GenesLabs, Korea)에 멸균된 증류수를 첨가하여 총 반응액을 20㎕로 맞추었다. PCR 반응은 Veriti Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 pre-denaturation은 94℃에서 5분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 55℃에서 30초, extension은 72℃에서 45초, final-extension은 72℃에서 10분간 수행하였다. 총 cycle 수는 40회이다. 분자마커의 PCR 증폭 산물을 2-3% agarose gel에서 전기영동 하여 각 품종별 대립유전자의 차이를 분석하였다. 8개 품종에서 다형성을 보여주는 InDel 마커들은 나머지 54개 품종의 유전자형을 조사하는데 사용되었다.The DNA of the cultivars was isolated using the CTAB method and the concentration was adjusted to 20 ng / μl for PCR analysis. Genotype analysis was performed by considering the polymorphism information content (PIC), chromosomal location, and allele size of SSR and InDel markers reported in tomato. The polymorphism of these markers was investigated using eight varieties, including 'Minichal', which shows a large difference in morphology (Table 1). The PCR reaction consisted of 40 ng DNA, 0.1 μM SSR primer, 0.2 mM dNTP, 1 unit of Taq polymerase, 2 μl of 10x buffer (20 mM Tric-HCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl, glycerol, pH 7.5) (GenesLabs, Korea) was added sterilized distilled water to adjust the total reaction volume to 20 μl. PCR was carried out using Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 45 seconds, -extension was carried out at 72 캜 for 10 minutes. The total number of cycles is 40. The PCR amplification products of the molecular markers were electrophoresed on 2-3% agarose gels and the differences of each alleles were analyzed. InDel markers showing polymorphism in 8 varieties were used to investigate the genotypes of the remaining 54 varieties.
품종 간 유연관계분석은 NTSYSpc v2.2 (Exter software, USA) 프로그램을 이용하여 실시하였다. 품종 간의 유전적 거리는 Jaccrad coefficient 계산법에 따라 계산되었고 비가중산술법 (UPGMA, Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Average)을 이용하여 따라 dendrogram을 작성하였다.The relationship between cultivars was analyzed using NTSYSpc v2.2 (Exter software, USA) program. The genetic distances between the cultivars were calculated according to the Jaccrad coefficient method and the dendrograms were prepared using UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Average).
3. 신규 품종판별용 마커 개발3. Development of markers for discrimination of new varieties
토마토 품종판별을 위한 신규 마커를 개발하기 위해 SGN 데이터베이스(DB)에서 검색된 2,687개의 토마토 SSR 마커 중에서 PIC값과 대립유전자의 수를 바탕으로 242개를 선발하였다. 또한 2,272개의 토마토 InDels 중 PIC값, 염색체상의 위치 및 대립유전자 크기를 고려하여 76개를 선발하였다. 공시품종 중 형태적으로 다양한 8개 품종 (표 2)을 선발하였다.To develop a new marker for the identification of tomato varieties, 242 tomato SSR markers were selected based on the PIC value and the number of alleles from 2,687 tomato SSR markers retrieved from the SGN database (DB). 76 of the 2,272 tomato InDels were selected considering the PIC value, chromosomal location and allele size. Eight varieties of varieties (Table 2) were selected from the varieties.
그리고 이들 8개의 품종에 대한 다형성 여부를 조사하여 대립유전자 구분이 용이한 6개 SSR 마커 (TG7-18, TG9-11, TOM196, TOM144, TG12-5, TG12-13)와 35개 InDel 마커 (sli2887, SL10126i, sli2792, LEOH174, SL10279i, sli2495, sli2569, sli2645, SL10480i, SL10689i, sli2215, sli2238, sli2311, SL10888, sli555, sli583, SL10151i, SL10373i, sli608, sli1019, sli1285, sli1275, sli3013, sli1847, sli1864, sli1817, sli1820, sli1920, sli3018, sli1809, SL10737i, sli1962, sli2009, sli2112 및 LEOH301)를 선발하였다.Six SSR markers (TG7-18, TG9-11, TOM196, TOM144, TG12-5, TG12-13) and 35 InDel markers (sli2887, , SL10126i, sli2792, LEOH174, SL10279i, sli2495, sli2569, sli2645, SL10480i, SL10689i, sli2215, sli2238, sli2311, SL10888, sli555, sli583, SL10151i, SL10373i, sli608, sli1019, sli1285, sli1275, sli3013, sli1847, sli1864, sli1817 , sli1820, sli1920, sli3018, sli1809, SL10737i, sli1962, sli2009, sli2112 and LEOH301) were selected.
하기 표 3은 62개의 F1 토마토 품종 분석을 위한 41개 마커 (6개의 SSR 마커 및 35개의 InDel 마커)의 PIC 값과 이들을 탐지하는 프라이머 서열을 나타낸 것이다.Table 3 below shows the PIC values of 41 markers (6 SSR markers and 35 InDel markers) for the analysis of 62 F1 tomato varieties and the primer sequences to detect them.
62개의 토마토 품종에서, 41 개의 마커의 PIC 값은 0.243에서 0.375로, 평균 0.350였다. 6 개의 SSR 마커의 PIC 값은 0.301 (TG12-13)에서 0.374 (TOM196)의 범위를 가지며, 평균 0.355였다. 상기 SSR 마커는 염색체 (Chromosome, chr) 7 (TG7-18), 9 (TG9-11), 11 (TOM196 및 TOM144) 및 12 (TG12-5 및 TG12-13)에 분포한 것으로 나타났다. 35개의 InDel 마커의 PIC 값은 0.243 (sli1817)에서 0.375 (SL10279i, sli2311, sli583, sli1285 및 sli3013)로, 평균 0.349로 나타났으며, 상기 InDel 마커는 12개의 염색체 중 염색체 8 및 10을 제외한 나머지 10개의 염색체에 분포되어 있는 것으로 나타났다.In 62 tomato varieties, the PIC values of 41 markers ranged from 0.243 to 0.375, with an average of 0.350. The PIC values of the six SSR markers ranged from 0.301 (TG12-13) to 0.374 (TOM196), with an average of 0.355. The SSR markers were distributed on chromosomes (Chr) 7 (TG7-18), 9 (TG9-11), 11 (TOM196 and TOM144) and 12 (TG12-5 and TG12-13). The PIC values of 35 InDel markers ranged from 0.243 (sli1817) to 0.375 (SL10279i, sli2311, sli583, sli1285 and sli3013), and the average of the InDel markers was 0.349, Were distributed on chromosomes.
종류Marker
Kinds
(Mbp)Physical map position
(Mbp)
(5′→ 3′)Primer sequence
(5 '- >3')
F: GTTTCCCCAAATTAAAGCAAAAA
서열번호 2
R: CAAACAACATGAGAAGCAGCASEQ ID NO: 1
F: GTTTCCCCAAATTAAAGCAAAAA
SEQ ID NO: 2
R: CAAACAACATGAGAAGCAGCA
F: GGACCAAGCGAAGTTGGATA
서열번호 4
R: CGAGTGTTTCGCTTCTCCTCSEQ ID NO: 3
F: GGACCAAGCGAAGTTGGATA
SEQ ID NO: 4
R: CGAGTGTTTCGCTTCTCCTC
F: CCTCCAAATCCCAAAACTCT
서열번호 6
R: TGTTTCATCCACTATCACGASEQ ID NO: 5
F: CCTCCAAATCCCAAAACTCT
SEQ ID NO: 6
R: TGTTTCATCCACTATCACGA
F: CTGTTTACTTCAAGAAGGCTG
서열번호 8
R: ACTTTAACTTTATTATTGCGACGSEQ ID NO: 7
F: CTGTTTACTTCAAGAAGGCTG
SEQ ID NO: 8
R: ACTTTAACTTTATTATTGCGACG
F: GAAACAACAAGTGCTGCATGG
서열번호 10
R: CTTTTCCATTTATCCCGTAAAASEQ ID NO: 9
F: GAAACAACAAGTGCTGCATGG
SEQ ID NO: 10
R: CTTTTCCATTTATCCCGTAAAA
F: GAAAGAGGTAAAATCGCGGGT
서열번호 12
R: CCTTTACGATTTCGCCTACGSEQ ID NO: 11
F: GAAAGAGGTAAAATCGCGGGT
SEQ ID NO: 12
R: CCTTTACGATTTCGCCTACG
F: AAGTGGCATGGGGACAGTAG
서열번호 14
R: ATTCTCTGAAGACCCAGCCASEQ ID NO: 13
F: AAGTGGCATGGGGACAGTAG
SEQ ID NO: 14
R: ATTCTCTGAAGACCCAGCCA
F: ATGACTGAGCATCTGCGTTC
서열번호 16
R: GCCGCCACTTATTGTAGGATSEQ ID NO: 15
F: ATGACTGAGCATCTGCGTTC
SEQ ID NO: 16
R: GCCGCCACTTATTGTAGGAT
F: TGGTCTGAGGGTCAACTAATGA
서열번호 18
R: GGTTGAGCCGAAATTTTCAASEQ ID NO: 17
F: TGGTCTGAGGGTCAACTAATGA
SEQ ID NO: 18
R:
F: CGAGTCCGAGGAAGACTGAT
서열번호 20
R: TCAAGACAGACACGGATTGCSEQ ID NO: 19
F: CGAGTCCGAGGAAGACTGAT
SEQ ID NO: 20
R:
F: TGATGCCGCAATTACTTTTAG
서열번호 22
R: GAAAGCCAAACCAGGATTTTCSEQ ID NO: 21
F: TGATGCCGCAATTACTTTTAG
SEQ ID NO: 22
R: GAAAGCCAAACCAGGATTTTC
F: ACTTGCTAGACCAAGGGGGT
서열번호 24
R: TCTCCATGCAAGTTGGTCTGSEQ ID NO: 23
F: ACTTGCTAGACCAAGGGGGT
SEQ ID NO: 24
R: TCTCCATGCAAGTTGGTCTG
F: CACTGAACTCGCATTCTTTTCA
서열번호 26
R: ATTGGCAGTTTCTTCATGCCSEQ ID NO: 25
F: CACTGAACTCGCATTCTTTTCA
SEQ ID NO: 26
R:
F: GGGTCTCTTTGGTTTTAAGACTTC
서열번호 28
R: CAAATAGATGAAAGGGGCCASEQ ID NO: 27
F: GGGTCTCTTTGGTTTTAAGACTTC
SEQ ID NO: 28
R:
F: TCGCATCAATTGCAACACAC
서열번호 30
R: AAACGCAAGGTGATCAGTCCSEQ ID NO: 29
F: TCGCATCAATTGCAACACAC
SEQ ID NO: 30
R:
F: AGCCCAATACCCTCTCACAC
서열번호 32
R: ACCAAACCTCGGTGTTCTTCSEQ ID NO: 31
F: AGCCCAATACCCTCTCACAC
SEQ ID NO: 32
R: ACCAAACCTCGGTGTTCTTC
F: ACACCTTTCGAAATCGGTTG
서열번호 34
R: GGGGATATACATTGGAGCACASEQ ID NO: 33
F: ACACCTTTCGAAATCGGTTG
SEQ ID NO: 34
R: GGGGATATACATTGGAGCACA
F: CGTTGTACAGAATCACTCATCACA
서열번호 36
R: GGGATGAATTCCGACCAAATSEQ ID NO: 35
F: CGTTGTACAGAATCACTCATCACA
SEQ ID NO: 36
R: GGGATGAATTCCGACCAAAT
F: AACACCAGATGAACCGAAGC
서열번호 38
R: GCCATAAAAGTCAAATGCCGSEQ ID NO: 37
F: AACACCAGATGAACCGAAGC
SEQ ID NO: 38
R: GCCATAAAAGTCAAATGCCG
F: AAGCCTCCTTTACCAATCAGC
서열번호 40
R: GCCATGAAAGTGAACTGAAGCSEQ ID NO: 39
F: AAGCCTCCTTTACCAATCAGC
SEQ ID NO: 40
R: GCCATGAAAGTGAACTGAAGC
F: TAGGTCAACCTACGCCTGCT
서열번호 42
R: AGGACCCTTCCATTTTAGCCSEQ ID NO: 41
F: TAGGTCAACCTACGCCTGCT
SEQ ID NO: 42
R: AGGACCCTTCCATTTTAGCC
F: TTCTGCAACGTGTCTTCCTG
서열번호 44
R: GGAAACATTCACTCAGCCAAASEQ ID NO: 43
F: TTCTGCAACGTGTCTTCCTG
SEQ ID NO: 44
R: GGAAACATTCACTCAGCCAAA
F: GCTACAGGCAGACAGCATAGAC
서열번호 46
R: CTGCATTCCCTTGTGTTTTSEQ ID NO: 45
F: GCTACAGGCAGACAGCATAGAC
SEQ ID NO: 46
R: CTGCATTCCCTTGTGTTTT
F: CCGGAAAGCATTGTTGTAGC
서열번호 48
R: ACAGTTGAAATTGCCTGAGCSEQ ID NO: 47
F: CCGGAAAGCATTGTTGTAGC
SEQ ID NO: 48
R: ACAGTTGAAATTGCCTGAGC
F: TGGGTCACATTCTCCAACAA
서열번호 50
R: ATGCAGATTGAGTTGCGTGASEQ ID NO: 49
F: TGGGTCACATTCTCCAACAA
SEQ ID NO: 50
R: ATGCAGATTGAGTTGCGTGA
F: GTATCGCGTAATTTGCCGTT
서열번호 52
R: TCTGAAAGCAACCATTTCCCSEQ ID NO: 51
F: GTATCGCGTAATTTGCCGTT
SEQ ID NO: 52
R: TCTGAAAGCAACCATTTCCC
F: CGTTGGTTGAGGAAATGGTT
서열번호 54
R: GCAGCTGAATAACATGCACAGSEQ ID NO: 53
F: CGTTGGTTGAGGAAATGGTT
SEQ ID NO: 54
R: GCAGCTGAATAACATGCACAG
F: ACATTCAAGGTGCATTTCGT
서열번호 56
R: GCGCCATTGCCAAGATATTASEQ ID NO: 55
F: ACATTCAAGGTGCATTTCGT
SEQ ID NO: 56
R: GCGCCATTGCCAAGATATTA
F: TCAAACGAAGATAGGAGTAAGAT
서열번호 58
R: TGGAACATTGAAGAACAGGTSEQ ID NO: 57
F: TCAAACGAAGATAGGAGTAAGAT
SEQ ID NO: 58
R: TGGAACATTGAAGAACAGGT
F: GGGCTTGGTTCTCTTGATGA
서열번호 60
R: GATGGCACATTTCCTTGGATSEQ ID NO: 59
F: GGGCTTGGTTCTCTTGATGA
SEQ ID NO: 60
R: GATGGCACATTTCCTTGGAT
F: AGGAAGTGTTGAAAGCCCCT
서열번호 62
R: CAGATGCAACACACACACTCASEQ ID NO: 61
F: AGGAAGTGTTGAAAGCCCCT
SEQ ID NO: 62
R: CAGATGCAACACACACACTCA
F: CCATTCGTTGACCTTCCAAC
서열번호 64
R: TGGGCGAGTTAATGGGTCTASEQ ID NO: 63
F: CCATTCGTTGACCTTCCAAC
SEQ ID NO: 64
R: TGGGCGAGTTAATGGGTCTA
F: CAACCGTCCTCTCGAACATT
서열번호 66
R: TGCAACCCTTGACTTGAGAASEQ ID NO: 65
F: CAACCGTCCTCTCGAACATT
SEQ ID NO: 66
R: TGCAACCCTTGACTTGAGAA
F: AAGAAGGTCCTTGAGGAGGG
서열번호 68
R: CCTAGTGGCCTTCTGCTTGASEQ ID NO: 67
F: AAGAAGGTCCTTGAGGAGGG
SEQ ID NO: 68
R: CCTAGTGGCCTTCTGCTTGA
F: CTGCAAAATTTCAACCAACCA
서열번호 70
R: TCCGAGTAGAGGGCAATGATAAGTSEQ ID NO: 69
F: CTGCAAAATTTCAACCAACCA
SEQ ID NO: 70
R: TCCGAGTAGAGGGCAATGATAAGT
F: CGGCAAAAGCATCAATATCC
서열번호 72
R: TGAAGCATATAGCCCTTCCGSEQ ID NO: 71
F: CGGCAAAAGCATCAATATCC
SEQ ID NO: 72
R: TGAAGCATATAGCCCTTCCG
F: CCACTCCTGGGACTCAAATC
서열번호 74
R: TGGACCCACAGGTAATGAGGSEQ ID NO: 73
F: CCACTCCTGGGACTCAAATC
SEQ ID NO: 74
R: TGGACCCACAGGTAATGAGG
F: GAAGCAGATGATGTTTTGGCT
서열번호 76
R: AGCCTTCTGCGCTTTATTCASEQ ID NO: 75
F: GAAGCAGATGATGTTTTGGCT
SEQ ID NO: 76
R: AGCCTTCTGCGCTTTATTCA
F: TCTTTAGCGCCTCAATCGTT
서열번호 78
R: GAATGGGTTGCAAGGGTAGASEQ ID NO: 77
F: TCTTTAGCGCCTCAATCGTT
SEQ ID NO: 78
R: GAATGGGTTGCAAGGGTAGA
F: GAAGAACAAGGCAACCTCCA
서열번호 80
R: ACCTACGCTTCAAGCACGTTSEQ ID NO: 79
F: GAAGAACAAGGCAACCTCCA
SEQ ID NO: 80
R:
F: TGCTGTTTTGTTTGGCTCAC
서열번호 82
R: TGTTCATATCTTTGATGGCATGTSEQ ID NO: 81
F: TGCTGTTTTGTTTGGCTCAC
SEQ ID NO: 82
R: TGTTCATATCTTTGATGGCATGT
62개의 토마토 품종에서, 41개의 마커의 PIC 값은 0.243에서 0.375로, 평균 0.350였다. 6개의 SSR 마커의 PIC 값은 0.301 (TG12-13)에서 0.374 (TOM196)의 범위를 가지며, 평균 0.355였다. 상기 SSR 마커는 염색체 (Chromosome, chr) 7 (TG7-18), 9 (TG9-11), 11 (TOM196 및 TOM144) 및 12 (TG12-5 및 TG12-13)에 분포한 것으로 나타났다. 35개의 InDel 마커의 PIC 값은 0.243 (sli1817)에서 0.375 (SL10279i, sli2311, sli583, sli1285 및 sli3013)로, 평균 0.349로 나타났으며, 상기 InDel 마커는 12개의 염색체 중 염색체 8 및 10을 제외한 나머지 10개의 염색체에 분포되어 있는 것으로 나타났다.In 62 tomato varieties, the PIC values of 41 markers ranged from 0.243 to 0.375, with an average of 0.350. The PIC values of the six SSR markers ranged from 0.301 (TG12-13) to 0.374 (TOM196), with an average of 0.355. The SSR markers were distributed on chromosomes (Chr) 7 (TG7-18), 9 (TG9-11), 11 (TOM196 and TOM144) and 12 (TG12-5 and TG12-13). The PIC values of 35 InDel markers ranged from 0.243 (sli1817) to 0.375 (SL10279i, sli2311, sli583, sli1285 and sli3013), and the average of the InDel markers was 0.349, Were distributed on chromosomes.
4. 품종간 유연관계 분석4. Analysis of the relationship between cultivars
본 발명에 따른 프라이머 세트와 상보적으로 결합하는 마커를 이용하여 PCA 분석을 통해 토마토 공시품종의 유전자형 분석을 수행하였다. PCA 분석에서 사용되는 Principal component (PC)는 데이터의 변화가 최대가 되는 지표로, 이를 식별함으로써 데이터의 차원을 감소시킬 수 있다. 본 연구에서 사용된 PC1 및 PC2는 각각 전체 데이터 변화의 49.57%, 12.11%를 설명하는 지표에 해당한다. PCA 분석에 사용된 2개의 PC가 전체 데이터 변화의 70% 미만을 설명하는 지표에 해당하므로, 하기 PCA 분석 데이터는 유효한 데이터일 수 있다.Genotyping of tomato varieties was carried out by PCA analysis using a marker complementary to the primer set according to the present invention. The Principal component (PC) used in the PCA analysis is an index that maximizes the change of the data, and it can reduce the dimension of the data by identifying it. PC1 and PC2 used in this study are the indicators that account for 49.57% and 12.11% of total data change, respectively. Since the two PCs used in the PCA analysis correspond to indicators that account for less than 70% of the total data change, the following PCA analysis data may be valid data.
위 PC1 및 PC2에 의해 62종의 토마토 품종을 대목용 품종을 제외하고 시장분류에 따라 대과종 품종, 대추형 품종, 방울형 품종 등 3개의 클러스터로 분리되었다(도 2). PC1에 의해 대추형 및 방울형 품종과 대과종 품종(클러스터 I)가 분리되었고, PC2에 의해 방울형 품종 (클러스터 III)과 대추형 품종(클러스터 II)이 분리되었다. 그러나, PCA 분석에서 한 종의 대추형 품종 "TY Tiny"는 다른 대추형 품종에 비해 대과종 품종 클러스터에 가까웠다 (도 2). 유사하게 두 방울형 품종의 "Blackrich"와 "TY Miracle"은 다른 방울형 품종과 비교하여 대과종 품종과 대추형 품종에 더 가까운 유전적 관계를 보였다 (도 2).According to the above PC1 and PC2, 62 kinds of tomato varieties were separated into three clusters according to the market classification, except for the rootstock varieties, such as major species, jujube type, and drop type varieties (Fig. 2). PC1 showed that the jujube - type and the drop - type varieties were separated from the major species varieties (cluster I). PC2 was able to separate the drop - type varieties (cluster III) and jujube varieties (cluster II). However, in the PCA analysis, one type of jujube varieties, "TY Tiny", was similar to other major varieties (Fig. 2). Similarly, the two-drop varieties "Blackrich" and "TY Miracle" showed a closer genetic relationship to the major and the juvenile varieties than the other drop varieties (FIG. 2).
UPGMA dendrogram에서는, Jaccarb 계수 0.29에서 클러스터 I과 클러스터 II로 분리되었다 (도 3). 더 나아가, 클러스터 I (총 35개 품종)은 Jaccarb 계수 0.43 내지 0.47에서 I-1 (대과종 품종 29개, 방울형 품종 1개), I-2 (대과종 품종 1개, 대목용 품종 2개) 및 I-3 (대과종 품종 1개, 대추형 품종 1개)로 분리되었다. 방울형 품종 "Black-rich"는 29개의 대과종 품종과 같이 I-1에 클러스터링 되었으며, 대추형 품종 "TY Tiny"는 대과종 품종 "Cheonggang"과 함께 I-3에 클러스터링 되었다. 클러스터 II-1는 17개의 대추형 품종과 3개의 방울형 품종 ("TY Miracle", "Yoyo" 및 "Olleh TY")으로 구성된 반면, 클러스터 II-2는 8개의 방울형 품종으로 구성되었다. 즉, 본 발명에 따른 마커의 증폭여부를 확인함으로써 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다.In the UPGMA dendrogram, the Jaccarb coefficient was split from 0.29 into cluster I and cluster II (Fig. 3). In cluster I (35 varieties), the Jaccarb coefficients ranged from 0.43 to 0.47 at I-1 (29 species of major species, 1 species of drop type), I-2 (1 species of major species, 2 species of main species ) And I-3 (one major species, one jujube type). Black-rich varieties were clustered in I-1 like 29 major varieties and jujube varieties "TY Tiny" were clustered in I-3 along with major varieties "Cheonggang". Cluster II-1 consisted of 17 jujube varieties and three drop varieties ("TY Miracle", "Yoyo" and "Olleh TY") while cluster II-2 consisted of eight drop varieties. That is, it is possible to distinguish between the cultivars by confirming whether the marker according to the present invention is amplified.
또한, 클러스터링 외에도, 62 F1 토마토 공시품종을 본원 발명에 따른 프라이머 세트와 상보적으로 결합하는 마커로 분화시켰다.In addition to clustering, the 62 F1 tomato-exposed varieties were differentiated into markers that complementarily complement the primer set according to the present invention.
그 결과, "Dotaerang Dia"와 "Super Dotaerang" 토마토 품종은 동일한 육종 프로그램에서 개발되어 유전적으로 유사성이 높아 구분하지 못하였으나, 나머지 품종 (전체 62개의 품종 중 61개의 품종)은 모두 구분이 가능한 것으로 확인되었다 (도 3).As a result, "Dotaerang Dia" and "Super Dotaerang" tomato varieties were developed in the same breeding program and could not be distinguished because they were genetically similar. However, the remaining varieties (61 of 62 varieties) (Fig. 3).
추가로, 하기 그룹의 마커를 사용하여 UPGMA dendrogram을 통해 토마토 공시품종의 품종간 구분이 가능한지 여부를 판단하였다 (도 4 및 5):In addition, the UPGMA dendrogram was used to determine whether the tomato varieties could be distinguished by using the markers of the following groups (FIGS. 4 and 5):
그룹 1: sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 및 sli1920Group 1: sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 and sli1920
그룹 2: sli2887, SL10126i, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608, sli1019, sli1285, sli3013, sli1920 및 sli1962Group 2: sli2887, SL10126i, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608, sli1019, sli1285, sli3013, sli1920, and sli1962
62개의 토마토 공시품종에 대하여 각 그룹의 마커를 사용하여 품종간 구분이 가능한지 여부에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 도 4 내지 5에 나타내었다.Experiments were conducted on 62 tomato varieties using the markers of each group to determine whether the cultivars could be distinguished from each other, which is shown in FIGS. 4 to 5.
그 결과, 그룹 1의 마커의 증폭 여부를 통해 품종간 구분을 수행한 경우, 62개의 토마토 공시품종 중 51개의 공시품종에 대하여 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다.As a result, it was found that among 51 varieties of 62 informative varieties, it was possible to classify the varieties of varieties by the amplification of markers of
그룹 2의 마커의 증폭 여부를 통해 품종간 구분을 수행한 경우, 62개의 토마토 공시품종 중 61개의 공시품종에 대하여 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다.In case of discrimination between the breeds by the amplification of the markers of
종합하면, 그룹 1의 마커만을 사용하더라도 전체 토마토 공시품종 중 약 84%의 품종에 대하여 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났으며, 그룹 2의 마커를 사용할 경우 대부분의 토마토 공시품종에 대한 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다.As a result, it was found that about 84% of the total tomato varieties could be distinguished even if only the marker of
본 발명에 따른 마커로 구분된 품종이 유전적으로 서로 다른 품종인지 확인하기 위하여, 이들 간의 유전적 차이의 크기를 쌍방향 Fst 및 Nei의 표준유전적 거리 (D)로 추정하였다 (표 4).In order to confirm that the genotypes classified by the marker according to the present invention are genetically different from each other, the magnitude of the genetic difference between them was estimated as the standard genetic distance D of bidirectional F st and Nei (Table 4).
θ의 쌍방향 예측은 대각선 위에 나타냈고, D의 쌍방향 예측은 대각선 아래에 나타냈다. Fst의 쌍방향 예측을 위해, P값은 Bonferroni 보정을 사용하여 10,000 순열로 계산하였다. (*p <0.005)The bidirectional prediction of θ appeared on the diagonal line, and the bidirectional prediction of D appeared below the diagonal line. For the bidirectional prediction of F st, P values were calculated using the Bonferroni correction to 10,000 permutations. ( * p < 0.005)
표 4에 나타난 바와 같이, 대추형 품종 (Fst = 0.530, p <0.005, D = 0.711)과 방울형 품종 (Fst = 0.443, p <0.005, D = 0.517)과 비교할 때 상당히 다른 하위 집단을 나타냈으며, 대추형 품종과 방울형 품종간에 유의성 있는 유전적 차이를 발견했다 (Fst = 0.257, p <0.005; D = 0.221).As shown in Table 4, when compared to the jujube cultivars (F st = 0.530, p <0.005, D = 0.711) and the drop varieties (F st = 0.443, p <0.005, D = 0.517) (F st = 0.257, p <0.005; D = 0.221), indicating a significant genetic difference between the jujube-type and drop-type varieties.
또한, 대추형 및 방울형 품종 사이의 쌍방향 Fst 및 D의 추정은 대과종 품종과 대추형 및 방울형 품종 사이의 차이보다 크지 않았다.In addition, the estimates of the bi - directional F st and D between jujube - type and drop - type varieties were not larger than those between major species, juvenile - type and drop - type varieties.
더욱이, 각각의 하위 집단 (대과종 품종, 대추형 품종 및 방울형 품종)내 유전적 다양성의 수준을 allelic richness (A) 및 예상되는 이형접합체 (He)를 사용하여 측정하였고, 측정 결과는 하기 표 5에 나타냈다.Furthermore, the level of genetic diversity in each subgroup (major species, jujube type and bell-shaped varieties) was measured using allelic richness (A) and anticipated heterozygotes (He) 5.
b 표본의 크기에 맞게 수정된 예상되는 이형접합체 a Allelic richness
b An expected heterozygous conjugate modified to the size of the sample
가장 높은 수준의 유전적 다양성은 방울형 품종에서 발견되었다 (A = 1.795, He = 0.401). 대추형 품종은 중간 정도의 유전적 다양성을 보였고 (A = 1.636, He = 0.333), 대과종 품종에서 가장 낮은 유전적 다양성 추정치가 나타났다 (A = 1.597, He = 0.306).The highest genetic diversity was found in drop varieties (A = 1.795, He = 0.401). The jujube varieties showed moderate genetic diversity (A = 1.636, He = 0.333), with the lowest genetic diversity estimates in the major species (A = 1.597, He = 0.306).
5. 결론5. Conclusion
본 발명에 따른 마커들의 유전자형 데이터를 토대로 62개 공시품종간 유전적 거리를 계산하고 품종간 유사도를 분석한 결과, 표 3의 41개 마커가 61개 품종을 구별하는 것을 확인하였으며 (도 3), 41개의 마커를 모두 사용하지 않고 그룹 1의 마커만을 사용하더라도 전체 토마토 공시품종 84% 이상의 품종에 대해 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다. 또한, 그룹 1보다 5개 많은 마커에 대한 증폭 여부를 판단함으로써 대부분의 토마토 공시품종에서 품종간 구분이 가능한 것으로 나타났다.Based on the genotype data of the markers according to the present invention, the genetic distances between 62 different cultivars were calculated and the similarities between the cultivars were analyzed. As a result, it was confirmed that 41 markers of Table 3 distinguish 61 cultivars (FIG. 3) Even if only the markers of
즉, 본 발명의 41개의 마커 중 7개의 마커 (sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 및 sli1920)의 증폭여부를 확인함으로써 대부분의 F1 토마토 공시품종에서 유전적 변이 검출 또는 품종간 구분을 할 수 있으며, 7개보다 많은 12개의 마커 (sli2887, SL10126i, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608, sli1019, sli1285, sli3013, sli1920 및 sli19620)의 증폭 여부를 판단함으로써 품종간 구분을 하는 경우 그 정확도는 더 높아지는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 41개의 마커 전부의 증폭 여부를 판단함으로써 품종간 구분 및 유전적 변이를 탐지하는 경우의 정확도가 가장 높은 것으로 나타났다.In other words, genetic mutation detection or breeding can be identified in most F1 tomato varieties by confirming amplification of seven markers (sli2887, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608 and sli1920) among the 41 markers of the present invention And the accuracy of the discrimination between cultivars by judging whether or not amplification of more than 12 markers (sli2887, SL10126i, sli2792, sli2495, sli2311, sli583, sli608, sli1019, sli1285, sli3013, sli1920 and sli19620) Respectively. In addition, the accuracy of detection of genetic variation and genetic variation among the 41 markers of the present invention was found to be the highest.
그리고, 본 발명에 따른 프라이머 세트로 본 발명에 따른 마커의 증폭 여부를 확인함으로써, 유전적으로 멀리 떨어진 대과종 품종과 방울형 및 대추형 품종 간의 구별뿐 아니라, 유전적으로 가까운 방울형 품종과 대추형 품종을 구별할 수 있어, 유전적 변이가 발생한 토마토와 공시품종을 우수한 정확도로 구별할 수 있다는 것을 확인하였다.By confirming whether the marker according to the present invention is amplified with the primer set according to the present invention, not only the distinction between genetically distant larvae, droplet and jujube varieties, but also genetically close bell-shaped varieties and jujube varieties , And it was confirmed that the tomatoes with the genetic variation and the varieties with the genetic variation can be distinguished with excellent accuracy.
따라서, 본 발명에 따른 마커와 상보적으로 결합할 수 있는 본 발명의 프라이머 세트 (또는 프라이머)는 시중에서 판매되는 토마토 공시품종 대부분에 대하여 품종간 구분 나아가 유전적 변이 판별을 통해 변종 토마토의 판별이 가능하다.Thus, the marker < RTI ID = 0.0 & The primer set (or primer) of the present invention, which can be complementarily combined, can discriminate among most species of tomato varieties sold on the market by discriminating between varieties, further discriminating genetic mutations.
또한, 본 발명의 프라이머 세트 (또는 프라이머)는 육종가의 권리를 보호하기 위해 상업용 F1 토마토의 교배를 통한 유전적 변이로 인한 품종 간 구분을 위해 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 마커들의 PIC 값과 상기 마커가 증폭됨으로써 발생되는 밴드 패턴을 통해 토마토의 품종간 구분 또는 공시품종과 다른 변종 토마토인지 여부에 대한 판단이 가능하여 저렴하고 신속하게 토마토 품종 구분 및 변종 토마토를 판별할 수 있다.The primer set (or primer) of the present invention can be used for sorting breeds due to genetic variation through crossing of commercial F1 tomatoes in order to protect the rights of the breeding stock, and the PIC value of the markers according to the present invention, Through the band pattern generated by the amplification of the marker, it is possible to judge whether the tomato is a varietal or a variant of the different varieties from the disclosed varieties, so that it is possible to discriminate the tomato varieties and the variant tomatoes promptly and inexpensively.
<110> INDUSTRY-ACADEMIA COOPERATION GROUP OF SEJONG UNIV <120> Variant Tomato Discrimination composition <130> 17P02048 <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 1 gtttccccaa attaaagcaa aaa 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 2 caaacaacat gagaagcagc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 3 ggaccaagcg aagttggata 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 4 cgagtgtttc gcttctcctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 5 cctccaaatc ccaaaactct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 6 tgtttcatcc actatcacga 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 7 ctgtttactt caagaaggct g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 8 actttaactt tattattgcg acg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 9 gaaacaacaa gtgctgcatg g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 10 cttttccatt tatcccgtaa aa 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 11 gaaagaggta aaatcgcggg t 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 12 cctttacgat ttcgcctacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 13 aagtggcatg gggacagtag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 14 attctctgaa gacccagcca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 atgactgagc atctgcgttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 gccgccactt attgtaggat 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 tggtctgagg gtcaactaat ga 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 ggttgagccg aaattttcaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 cgagtccgag gaagactgat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 tcaagacaga cacggattgc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 tgatgccgca attactttta g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 gaaagccaaa ccaggatttt c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 acttgctaga ccaagggggt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 tctccatgca agttggtctg 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 cactgaactc gcattctttt ca 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 attggcagtt tcttcatgcc 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 gggtctcttt ggttttaaga cttc 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 caaatagatg aaaggggcca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 29 tcgcatcaat tgcaacacac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 aaacgcaagg tgatcagtcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 agcccaatac cctctcacac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 accaaacctc ggtgttcttc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 acacctttcg aaatcggttg 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 34 ggggatatac attggagcac a 21 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 35 cgttgtacag aatcactcat caca 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 36 gggatgaatt ccgaccaaat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 37 aacaccagat gaaccgaagc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 38 gccataaaag tcaaatgccg 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 39 aagcctcctt taccaatcag c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 40 gccatgaaag tgaactgaag c 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 41 taggtcaacc tacgcctgct 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 42 aggacccttc cattttagcc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 43 ttctgcaacg tgtcttcctg 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 44 ggaaacattc actcagccaa a 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 45 gctacaggca gacagcatag ac 22 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 46 ctgcattccc ttgtgtttt 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 47 ccggaaagca ttgttgtagc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 48 acagttgaaa ttgcctgagc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 49 tgggtcacat tctccaacaa 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 50 atgcagattg agttgcgtga 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 51 gtatcgcgta atttgccgtt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 52 tctgaaagca accatttccc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 53 cgttggttga ggaaatggtt 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 54 gcagctgaat aacatgcaca g 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 55 acattcaagg tgcatttcgt 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 56 gcgccattgc caagatatta 20 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 57 tcaaacgaag ataggagtaa gat 23 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 58 tggaacattg aagaacaggt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 59 gggcttggtt ctcttgatga 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 60 gatggcacat ttccttggat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 61 aggaagtgtt gaaagcccct 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 62 cagatgcaac acacacactc a 21 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 63 ccattcgttg accttccaac 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 64 tgggcgagtt aatgggtcta 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 65 caaccgtcct ctcgaacatt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 66 tgcaaccctt gacttgagaa 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 67 aagaaggtcc ttgaggaggg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 68 cctagtggcc ttctgcttga 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 69 ctgcaaaatt tcaaccaacc a 21 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 70 tccgagtaga gggcaatgat aagt 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 71 cggcaaaagc atcaatatcc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 72 tgaagcatat agcccttccg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 73 ccactcctgg gactcaaatc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 74 tggacccaca ggtaatgagg 20 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 75 gaagcagatg atgttttggc t 21 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 76 agccttctgc gctttattca 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 77 tctttagcgc ctcaatcgtt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 78 gaatgggttg caagggtaga 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 79 gaagaacaag gcaacctcca 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 80 acctacgctt caagcacgtt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 81 tgctgttttg tttggctcac 20 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 82 tgttcatatc tttgatggca tgt 23 <110> INDUSTRY-ACADEMIA COOPERATION GROUP OF SEJONG UNIV <120> Variant Tomato Discrimination composition <130> 17P02048 <160> 82 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 1 gtttccccaa attaaagcaa aaa 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 2 caaacaacat gagaagcagc a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 3 ggaccaagcg aagttggata 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 4 cgagtgtttc gcttctcctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 5 cctccaaatc ccaaaactct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 6 tgtttcatcc actatcacga 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 7 ctgtttactt caagaaggct g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 8 actttaactt tattattgcg acg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 9 gaaacaacaa gtgctgcatg g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 10 cttttccatt tatcccgtaa aa 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 11 gaaagaggta aaatcgcggg t 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 12 cctttacgat ttcgcctacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 13 aagtggcatg gggacagtag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 14 attctctgaa gacccagcca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 atgactgagc atctgcgttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 gccgccactt attgtaggat 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 tggtctgagg gtcaactaat ga 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 ggttgagccg aaattttcaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 cgagtccgag gaagactgat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 tcaagacaga cacggattgc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 tgatgccgca attactttta g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 gaaagccaaa ccaggatttt c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 acttgctaga ccaagggggt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 tctccatgca agttggtctg 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 cactgaactc gcattctttt ca 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 attggcagtt tcttcatgcc 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 gggtctcttt ggttttaaga cttc 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 caaatagatg aaaggggcca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 29 tcgcatcaat tgcaacacac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 aaacgcaagg tgatcagtcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 agcccaatac cctctcacac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 accaaacctc ggtgttcttc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 acacctttcg aaatcggttg 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 34 ggggatatac attggagcac a 21 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 35 cgttgtacag aatcactcat caca 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 36 gggatgaatt ccgaccaaat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 37 aacaccagat gaaccgaagc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 38 gccataaaag tcaaatgccg 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 39 aagcctcctt taccaatcag c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 40 gccatgaaag tgaactgaag c 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 41 taggtcaacc tacgcctgct 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 42 aggacccttc cattttagcc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 43 ttctgcaacg tgtcttcctg 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 44 ggaaacattc actcagccaa a 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 45 gctacaggca gacagcatag ac 22 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 46 ctgcattccc ttgtgtttt 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 47 ccggaaagca ttgttgtagc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 48 acagttgaaa ttgcctgagc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 49 tgggtcacat tctccaacaa 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 50 atgcagattg agttgcgtga 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 51 gtatcgcgta atttgccgtt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 52 tctgaaagca accatttccc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 53 cgttggttga ggaaatggtt 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 54 gcagctgaat aacatgcaca g 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 55 acattcaagg tgcatttcgt 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 56 gcgccattgc caagatatta 20 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 57 tcaaacgaag ataggagtaa gat 23 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 58 tggaacattg aagaacaggt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 59 gggcttggtt ctcttgatga 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 60 gatggcacat ttccttggat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 61 aggaagtgtt gaaagcccct 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 62 cagatgcaac acacacactc a 21 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 63 ccattcgttg accttccaac 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 64 tgggcgagtt aatgggtcta 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 65 caaccgtcct ctcgaacatt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 66 tgcaaccctt gacttgagaa 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 67 aagaaggtcc ttgaggaggg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 68 cctagtggcc ttctgcttga 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 69 ctgcaaaatt tcaaccaacc a 21 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 70 tccgagtaga gggcaatgat aagt 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 71 cggcaaaagc atcaatatcc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 72 tgaagcatat agcccttccg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 73 ccactcctgg gactcaaatc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 74 tggacccaca ggtaatgagg 20 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 75 gaagcagatg atgttttggc t 21 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 76 agccttctgc gctttattca 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 77 tctttagcgc ctcaatcgtt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 78 gaatgggttg caagggtaga 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 79 gaagaacaag gcaacctcca 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 80 acctacgctt caagcacgtt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 81 tgctgttttg tttggctcac 20 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 82 tgttcatatc tttgatggca tgt 23
Claims (6)
A primer set of SEQ ID NOS: 13 and 14; A primer set of SEQ ID NOS: 17 and 18; A primer set of SEQ ID NOS: 23 and 24; A primer set of SEQ ID NOS: 37 and 38; A primer set of SEQ ID NOS: 43 and 44; A primer set of SEQ ID NOS: 49 and 50; And a primer set of SEQ ID NOS: 67 and 68.
The method according to claim 1, wherein the primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16; A primer set of SEQ ID NOS: 51 and 52; A primer set of SEQ ID NOS: 53 and 54; A primer set of SEQ ID NOS: 57 and 58; And at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOs: 75 and 76.
The method according to claim 1, wherein the primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; A primer set of SEQ ID NOS: 19 and 20; A primer set of SEQ ID NOS: 21 and 22; A primer set of SEQ ID NOS: 25 and 26; A primer set of SEQ ID NOs: 27 and 28; A primer set of SEQ ID NOs: 29 and 30; A primer set of SEQ ID NOS: 31 and 32; A primer set of SEQ ID NOS: 33 and 34; A primer set of SEQ ID NOS: 35 and 36; A primer set of SEQ ID NOS: 39 and 40; A primer set of SEQ ID NOS: 41 and 42; A primer set of SEQ ID NOs: 45 and 46; A primer set of SEQ ID NOS: 47 and 48; A primer set of SEQ ID NOS: 55 and 56; A primer set of SEQ ID NOS: 59 and 60; A primer set of SEQ ID NOs: 61 and 62; A primer set of SEQ ID NOS: 63 and 64; A primer set of SEQ ID NOs: 65 and 66; A primer set of SEQ ID NOS: 69 and 70; A primer set of SEQ ID NOS: 71 and 72; A primer set of SEQ ID NOS: 73 and 74; A primer set of SEQ ID NOS: 77 and 78; A primer set of SEQ ID NOS: 79 and 80; And at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOS: 81 and 82.
The composition according to claim 1, comprising the primers of SEQ ID NOS: 1-82.
A kit for discriminating tomato varieties comprising the composition according to any one of claims 1 to 4.
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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DNA Research, (2014), Vol. 21, No. 4, pp429-438. |
Plant physiol, (2016.09), Vol. 172, No.1, pp38-61. |
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Legal Events
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---|---|---|---|
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GRNT | Written decision to grant |