KR101913414B1

KR101913414B1 - Composition for producing aglycone protopanaxadiol comprising two kinds of enzymes and method for producing aglycone protopanaxadiol using the same

Info

Publication number: KR101913414B1
Application number: KR1020170079731A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 최지현
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 주식회사 밥스누
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2018-10-30

Abstract

The present invention relates to a composition for producing aglycone protopanaxadiol comprising Dictyoglomus turgidum derived β-glycosidase and Caldicellulosiruptor bescii derived β-glycosidase, and a method for producing aglycone protopanaxadiol using the same.

Description

Technical Field [0001] The present invention relates to a composition for preparing an ugly cone protopanaxadiol containing two kinds of enzymes and a method for producing the same,

본 발명은 2종 효소를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물 및 이를 이용한 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preparing uglycon protopanaxadiol containing two kinds of enzymes and a method for producing the uglycon protopanaxadiol using the same.

현재까지 어글리콘 프로토파낙사다이올은 면역 증강, 염증 완화, 암세포 혈관형성 억제, 암세포 전이 억제, 피로 억제, 불안 완화, UV에 의한 피부손상 회복, 피부노화 저해 및 주름 억제 등 여러 가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있으나, 종래 효소를 이용하면 어글리콘 프로토파낙사다이올을 제조하면 생산성 및 수율이 낮아 산업화에 한계가 있어 왔는바, 안정적이고 효율적인 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법에 대한 필요성이 커지고 있는 실정이다. Up to now, the euglycone protopanaxadiol has been shown to exert various excellent effects such as immunity enhancement, inflammation relief, inhibition of cancer cell angiogenesis, inhibition of cancer cell metastasis, suppression of fatigue, anxiolysis, restoration of skin damage by UV, skin aging inhibition and wrinkle suppression However, it has been known that the production of uglycon protopanaxadiol using conventional enzymes has a low productivity and yield, and therefore industrialization has been limited. Thus, there is a need for a stable and efficient method for producing protoplanaxidiol It is a fact that it is getting bigger.

종래 효소 중에서, 어글리콘 프로토파낙사다이올의 제조시 생산성 및 수율이 높다고 알려져 있는 효소로는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제가 있는데(한국등록특허 제10-1210453호), 어글리콘 프로토파낙사다이올을 제조하기 위해서는 높은 농도의 효소가 요구되는 한계가 있었다.Of the conventional enzymes, enzymes known to have high productivity and yield in the production of uglycon protopanaxadiol include Pyrococcus furiosus- derived? -glycosidase (Korean Patent No. 10-1210453), there was a limit in that a high concentration of enzyme was required to produce an uglycon protopanaxadiol.

최근 들어, 낮은 농도의 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제를 이용하여 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사다이올을 제조한 보고가 있지만, 아라비노스(arabinose)을 분해하지 못해 진세노사이드 compound Y 및 진세노사이드 compound Mc 등이 축적되는 한계가 있다.In recent years, low concentrations of Dictyoglomus < RTI ID = 0.0 > trisidium- derived β-glycosidase has been reported to produce ginsenoside uglycon protopanaxadiol. However, it has been reported that the senenoside compound Y and the ginsenoside compound Mc which fail to degrade arabinose There is a limit to accumulate.

본 발명은 어글리콘 프로토파낙사다이올의 생산량을 증대시키면서 수율을 높이기 위한, 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다. The invention Ugly cone protocol wave incident die while increasing the production volume of all for increasing the yield, Dick thio claw mousse tool gidyum (Dictyoglomus turgidum- derived? -glycosidase and Caldicellulosilupter and a composition for producing uglycon protopanaxadiol including a β-glycosidase derived from a bacillus subtilis .

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제; 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii; Cb) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물을 제공한다. The present invention relates to a Dictyoglomus turgidum ( Dt ) -derived? -Glycosidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And [beta] -glycosidase derived from Caldicellulosiruptor bescii ( Cb ) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a composition for producing an uglycon protopanaxadiol .

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 100:1(w/v:w/v) 내지 200:1(w/v:w/v)일 수 있다.The Dt- derived? -Glycosidase and Cb The composition ratio of the resulting? -Glycosidase may be 100: 1 (w / v: w / v) to 200: 1 (w / v: w / v).

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 8.01 mg/ml 내지 12.05 mg/ml일 수 있다.The total concentration of Dt- derived? -Glycosidase and Cb- derived? -Glycosidase may be 8.01 mg / ml to 12.05 mg / ml.

상기 조성물은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.Wherein the composition comprises at least one protoplast selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K Or for treating a substrate comprising a diol based saponin.

상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml일 수 있다.The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate may be 1.0 mg / ml to 5.0 mg / ml.

본 발명의 일 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of Dictyoglomus a gene encoding turgidum- derived? -glycosidase; And a gene coding for? -Glycosidase derived from Caldicellulosiruptor bescii comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. The present invention also provides a composition for producing an aggredone protopanaxadiol .

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법을 제공한다. In another embodiment of the present invention, there is provided a process for preparing an uglycon protopanaxadiol comprising the step of treating the composition with a substrate.

상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함할 수 있다.Wherein the substrate is one or more protoplasts selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K Diol-based saponins.

상기 처리는 pH 4.5~7.0 및 70~100℃ 조건에서, 1시간 이상 수행되는 것일 수 있다. The treatment may be carried out at pH 4.5 to 7.0 and 70 to 100 ° C for 1 hour or more.

본 발명에 따르면, 2종 효소로서 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글리코시다아제를 최적 조성비로 이용함으로써, 70℃ 이상의 고온 반응을 통해 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시키면서, 동시에, 어글리콘 프로토파낙사다이올을 단시간에 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있는 바, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 어글리콘 프로토파낙사아디올은 UV에 의한 피부손상 회복 효능을 가지는바, 화장품 원료로 유용하게 활용될 수 있다. According to the invention, by using the claws Dick thio mousse tool gidyum (Dictyoglomus turgidum) derived from β- glycosidase syrup emitter and a dehydratase kaldi cellulose shi (Caldicellulosiruptor bescii) derived from β- glycosidase to the optimum composition ratio as the two kinds of enzyme, 70 It is possible to produce the uglycon protopanaxadiol in a short time with high productivity and high yield, and at the same time, it is useful in various industrial fields such as medicines, foods, and cosmetics It is expected that it can be used. In particular, the uglycon protopanaxadiol has the effect of restoring skin damage by UV, and thus can be usefully used as a cosmetic raw material.

도 1은 실시예 2의 (1)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 인삼 추출물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프(○: 진세노사이드 Rb2, ▲: 진세노사이드 Rc, △: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, □: 진세노사이드 compound K, ■: 진세노사이드 APPD)이다.
도 2는 실시예 2의 (2)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프(●: 진세노사이드 Rb1, ○: 진세노사이드 Rb2, ▲: 진세노사이드 Rc, △: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, □: 진세노사이드 compound K, ■: 진세노사이드 APPD)이다.
도 3는 실시예 2의 (3)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프(●: 진세노사이드 Rb1, ○: 진세노사이드 Rb2, ▲: 진세노사이드 Rc, △: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, □: 진세노사이드 compound K, ■: 진세노사이드 APPD)이다.
도 4는 실시예 2의 (4)에서 준비한 농도별 추가 효소액 및 최적 농도가 결정된 Dt 유래 β-글리코시다아제의 효소 혼합액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 추가 효소액 내 Cb 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프(△: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, ■: 진세노사이드 APPD)이다.
도 5는 실시예 2의 (5)에서 준비한 혼합 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프(●: 진세노사이드 Rb1, ○: 진세노사이드 Rb2, ▲: 진세노사이드 Rc, △: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, □: 진세노사이드 compound K, ■: 진세노사이드 APPD)이다.
도 6은 비교예 1에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프(●: 진세노사이드 Rb1, ○: 진세노사이드 Rb2, ▲: 진세노사이드 Rc, △: 진세노사이드 Rd, ▼: 진세노사이드 compound Y, ▽: 진세노사이드 compound Mc, □: 진세노사이드 compound K, ■: 진세노사이드 APPD)이다.FIG. 1 is a graph showing the results of confirming the optimal concentration of protopanaxyl diol-based saponin in ginseng extract as a result of treating the enzyme solution prepared in (1) of Example 2 with ginseng extract (O: ginsenoside Rb2, Syn: compound G, ginsenoside Rc, G: ginsenoside Rd, g: ginsenoside compound Y, g: ginsenoside compound Mc, ginsenoside compound K, ginsenoside APPD).
FIG. 2 is a graph showing the results of confirming the optimum concentration of? -Glycosidase derived from Dt in the enzyme solution as a result of treating the enzyme solution prepared in (2) of Example 2 with the ginseng extract (?: Ginsenoside Rb1, Ginsenoside Rb, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc, ginsenoside compound K, ginsenoside APPD) .
FIG. 3 is a graph showing the results obtained by confirming the optimal time for treating the enzyme solution to the substrate as a result of treating the enzyme solution prepared in (3) of Example 2 with the ginseng extract. (●: ginsenoside Rb1, ○: ginsenoside Rb2, : Ginsenoside Rc, G: Ginsenoside Rd, G: Ginsenoside compound Y, G: Ginsenoside compound Mc, Ginsenoside compound K, Ginsenoside APPD).
Figure 4 is a second embodiment of the (4) enzyme solution and the Dt added determined the optimal concentration prepared concentrations derived from β- glycosidase a result of the enzyme treatment to a mixture of azetidine ginseng extract, add enzyme solution within Cb origin of β- glycosidase (△: ginsenoside Rd, ▼: ginsenoside compound Y, ▽: ginsenoside compound Mc, ■: ginsenoside APPD) showing the result of confirming the optimum concentration.
FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the optimum time for treating the mixed enzyme solution to the substrate as a result of treating the mixed enzyme solution prepared in (5) of Example 2 with the ginseng extract (●: ginsenoside Rb1, ○: ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc, ginsenoside compound K, ginsenoside APPD).
6 is a graph showing the results of confirming the optimum time for treating the enzyme solution to the substrate as a result of treating the enzyme solution prepared in Comparative Example 1 with the ginseng extract (●: ginsenoside Rb1, ○: ginsenoside Rb2, ▲: Side Rc,?: Ginsenoside Rd,?: Ginsenoside compound Y, g: ginsenoside compound Mc, ginsenoside compound K, ginsenoside APPD).

본 발명자들은 어글리콘 프로토파낙사다이올의 신규 제조방법에 대한 지속적인 연구를 수행한 결과, 고온성 미생물인 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum; Dt) 유래 β-글리코시다아제 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii ; Cb) 유래 β-글리코시다아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 효소액을 각각 생산한 다음, 효소들을 최적 조성비로 함유하는 혼합 효소액을 기질에 처리함으로써 어글리콘 프로토파낙사다이올을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have conducted continuous research on a new method for preparing uglycon protopanaxadiol. As a result, they have found that a high temperature microorganism, Dictyoglomus turgidum ( Dt ) -derived beta -glycosidase and Caldicellulose syrup A recombinant expression vector and a transformed microorganism are produced by cloning a Caldicellulosiluptor bescii ( Cb ) -derived? -Glycosidase , and an enzyme solution is produced using the transformed microorganism. Then, a mixed enzyme solution containing the enzymes in an optimal composition ratio Of the present invention can be produced with high productivity and high yield by treating the substrate with the uglycon protopanaxadiol. The present invention has been completed based on this finding.

본원 명세서 내 “어글리콘 프로토파낙사다이올(Aglycone protopanaxatriol; APPD)”또는 “진세노사이드 APPD”라 함은 하기 화학식 1로 표시된다:The term " Aglycone protopanaxatriol (APPD) " or " ginsenoside APPD "

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 어글리콘 프로토파낙사다이올은 인삼 사포닌의 장내 세균 대사산물로서, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌에서 글루코오스 또는 아라비노스 부분이 가수분해되어 생성될 수 있다. The uglycon protopanaxadiol is an intestinal bacterial metabolite of ginseng saponin and is a metabolite of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and And the ginsenoside compound K. In the present invention, at least one protopanaxadiol saponin selected from the group consisting of ginsenoside compound K and glucose or arabinose is hydrolyzed.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제; 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시( Caldicellulosiruptor bescii; Cb) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물을 제공한다. The present invention relates to a Dictyoglomus turgidum ( Dt ) -derived? -Glycosidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And a kaldi cellulose consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 syrups emitter shi (Caldicellulosiruptor bescii; Cb) provides Ugly cone protocol wave incident diol-producing composition comprising an origin β- glycosidase.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 3로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 이때, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 활성 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.0이고, 최적 활성 온도는 70℃ 이상, 바람직하게 75℃ 내지 85℃이다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 프로토파낙사다이올계 사포닌, 특히, 진세노사이드 compound K에서 글루코오스 부분을 효과적으로 가수분해시켜 어글리콘 프로토파낙사다이올을 높은 생산성으로 제조하기 위한 역할을 한다. The Dt- derived? -Glycosidase is not only composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 but also a functional equivalent thereof, that is, mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence to achieve the object of the present invention , And the Dt- derived? -Glycosidase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. At this time, the Dt The optimum activity pH of the derived? -Glycosidase is 4.5 to 7.0, preferably 5.0 to 6.0, and the optimum activation temperature is 70 ° C or higher, preferably 75 ° C to 85 ° C. The Dt Derived β-glycosidase serves to efficiently hydrolyze the glucose moiety in protopanaxadiol-based saponins, in particular the ginsenoside compound K, to produce the uglycon protopanaxadiol in high productivity.

또한, 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 이때, 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제의 최적 활성 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.0이고, 최적 활성 온도는 70℃ 이상, 바람직하게 75℃ 내지 85℃이다. 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제는 프로토파낙사다이올계 사포닌, 특히, 진세노사이드 compound Y 및 진세노사이드 compound Mc에서 아라비노스 부분을 진세노사이드 compound K로 효과적으로 가수분해시키는바, 최종적으로 어글리콘 프로토파낙사다이올을 높은 수율로 제조하기 위한 역할을 한다.The Cb- derived? -Glycosidase is not only composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 but also a functional equivalent thereof, that is, a mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence, , And the Cb- derived? -Glycosidase may be a product expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. At this time, the optimal active pH of the Cb- derived? -Glycosidase is 4.5 to 7.0, preferably 5.0 to 6.0, and the optimum activation temperature is 70 ° C or higher, preferably 75 ° C to 85 ° C. The Cb- derived? -Glycosidase effectively hydrolyzes the arabinose moiety to the ginsenoside compound K in the protopanaxadiol saponins, particularly the ginsenoside compound Y and the ginsenoside compound Mc, It plays a role in producing protopanaxadiol in high yield.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Dt 유래 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 Dt 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Cb 유래 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 Cb 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The Dt- derived? -Glycosidase is produced by culturing a microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, Dt derived β- glycosidase is preferably used to give a dehydratase, a more preferable to specifically obtain a Dt derived β- glycosidase separated by adding kinase and purified using, and the like. The Cb- derived? -Glycosidase may be obtained by culturing a microorganism transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, Over-expressed Cb Derived β-glycosidase is preferably obtained and used. More preferably, the Cb- derived β-glycosidase thus obtained is further separated and purified and used, but is not limited thereto.

상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-24a(+) 또는 pET-24a 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.As the recombinant vector, any vector may be used as long as it is a plasmid vector used in the art for genetic recombination. Specifically, it is preferable to use pET-24a (+) or pET-24a plasmid, but not limited thereto .

그밖에, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자(또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자)와 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자(또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자)를 모두 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 수득하여 사용할 수도 있다. 이때, 재조합 벡터로서, 구체적으로 pACYC duet 플라스미드를 사용할 수 있다.In addition, a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or a gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) and a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (or a gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: ) And culturing the microorganism transformed with the recombinant vector containing both of the Dt- derived? -Glycosidase and Cb- derived? -Glycosidase in the microorganism. At this time, pACYC duet plasmid can be specifically used as a recombinant vector.

상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.As the above-mentioned transformed microorganism, any microorganism may be used as long as it is a microorganism used in the art as a system for over-expressing a desired protein by transformation with a recombinant vector. Specifically, it is more preferable to use Escherichia coli BL21 (DE3) strain But is not limited thereto.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하는 과정은 ⅰ) 상기 미생물의 배양액 내 세포를 파쇄하는 단계; ⅱ) 상기 세포 파쇄물을 1차 원심분리하여 1차 상등액을 얻는 단계; ⅲ) 상기 1차 상등액을 고온 열처리한 후 2차 원심분리하여 2차 상등액을 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차 상등액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 파쇄는 프렌치 프레서 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 15,000 lb/in² 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅲ) 단계에서 고온 열처리는 70℃ 및 10분 내외로 수행될 수 있으며, ⅳ) 단계에서 여과는 0.45 ㎛ 내외의 여과지를 사용하여 수행될 수 있다.The further step of separating and purifying the Dt- derived? -Glycosidase and the Cb- derived? -Glycosidase comprises the steps of: i) disrupting the cells in the culture medium of the microorganism; Ii) subjecting the cell lysate to primary centrifugation to obtain a first supernatant; Iii) subjecting the first supernatant to high temperature heat treatment and second centrifuging to obtain a second supernatant; And iv) filtering the secondary supernatant. Specifically, in step (i), the crushing may be performed in a range of about 15,000 lb / in ² using a device known in the art such as a French press, and the high temperature heat treatment in step iii) is performed at about 70 ° C. for about 10 minutes And in step iv), filtration can be performed using a filter paper having a pore size of about 0.45 μm.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 100:1(w/v:w/v) 내지 200:1(w/v:w/v)인 것이 바람직하고, 150:1(w/v:w/v) 내지 170:1(w/v:w/v)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제는 이러한 최적 조성비를 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사다이올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다. 이때, Dt 유래 β-글리코시다아제의 함량이 너무 낮은 경우에는, 진세노사이드 compound K에서 글루코오스 부분을 효과적으로 가수분해시키지 못하여 어글리콘 프로토파낙사다이올을 높은 생산성으로 제조하지 못하는 문제점이 있고, Cb 유래 β-글리코시다아제의 함량이 너무 낮은 경우에는, 진세노사이드 compound Y 및 진세노사이드 compound Mc에서 아라비노스 부분을 진세노사이드 compound K로 효과적으로 가수분해시키지 못하는바, 최종적으로 어글리콘 프로토파낙사다이올의 수율을 저하시키는 문제점이 있다.The composition ratio of the Dt- derived? -Glycosidase and the Cb- derived? -Glycosidase is preferably 100: 1 (w / v: w / v) to 200: 1 (w / v: w / v) : 1 (w / v: w / v) to 170: 1 (w / v: w / v). The Dt- derived? -Glycosidase and Cb The resulting 棺 -glycosidase can produce the uglycon protopanaxadiol at a high productivity and a high yield by maintaining the optimal composition ratio. At this time, when the content of beta -glycosidase derived from Dt is too low, it is not possible to efficiently hydrolyse the glucose moiety in the ginsenoside compound K, resulting in a problem that the aglycon protopanaxadiol can not be produced with high productivity, and Cb If the content of derived? -Glycosidase is too low, the ginsenoside compound Y and the ginsenoside compound Mc do not effectively hydrolyze the arabinose moiety to the ginsenoside compound K, and ultimately, There is a problem that the yield of the diol is lowered.

또한, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 8.01 mg/ml 내지 12.05 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제의 농도는 8.00 mg/ml 내지 12.00 mg/ml인 것이 바람직하고, Cb 유래 β-글리코시다아제의 농도는 0.01 mg/ml 내지 0.05 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제는 이러한 총 농도를 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사다이올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다. The total concentration of Dt- derived? -Glycosidase and Cb- derived? -Glycosidase is preferably 8.01 mg / ml to 12.05 mg / ml, but is not limited thereto. Specifically, the concentration of the D- β-glycosidase is preferably 8.00 mg / ml to 12.00 mg / ml, and the concentration of Cb- derived β-glycosidase is preferably 0.01 mg / ml to 0.05 mg / ml But is not limited thereto. The Dt By maintaining this total concentration, derived 棺 -glycosidase and Cb- derived 棺 -glycosidase, uglycon protopanaxadiol can be produced with high productivity and high yield.

이때, 총 농도라 함은 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제의 농도(w/v)와 Cb 유래 β-글리코시다아제의 농도(w/v)를 합한 값이다. In this case, the total concentration means the concentration of Dt (W / v) of the derived? -Glycosidase and the concentration (w / v) of the Cb- derived? -Glycosidase.

또한, 상기 조성물은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다. 구체적으로 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물일 수 있다. 구체적으로, 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼의 열매, 뿌리, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명에서는 삼 추출물로, 프로토파낙사다이올계 사포닌을 다량 함유하는 인삼 추출물을 사용하였다.The composition may also comprise one or more prototypes selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K For example, to treat substrates comprising paraxaxidiol saponins. Specifically, the substrate is selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K It may be a ternary extract containing panaxadius saponins. Specifically, the ternary extract may be a solvent extract of one or more fruits, roots, stems or leaves selected from the group consisting of ginseng, red ginseng, ginseng, white ginseng, pseudo ginseng and ginseng. At this time, the solvent extraction may be performed with water, C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol. In the present invention, ginseng extract containing a large amount of protopanaxadiol saponin was used as a ternary extract.

상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml일 수 있다. 구체적으로, 프로토파낙사다이올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물을 기질로 사용한 경우, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 농도 는 2.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml 인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도를 상기 범위 내로 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사다이올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate may be 1.0 mg / ml to 5.0 mg / ml. Specifically, when a triple extract containing protopanaxadiol saponin is used as a substrate, the optimum concentration of protopanaxadiol saponin in the substrate is preferably 2.0 mg / ml to 5.0 mg / ml, but is not limited thereto . By maintaining the concentration of protopanaxyl diol-based saponin in the above range within the above range, the uglycon protopanaxadiol can be produced with high productivity and high yield.

또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii ; Cb) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조용 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a DNA sequence encoding a Dictyoglomus < RTI ID = 0.0 > turgidum ; Dt ) -derived? -Glycosidase; And a gene coding for? -Glycosidase derived from Caldicellulosiruptor bescii ( Cb ) comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4. The present invention also provides a composition for producing an uglycon protopanaxadiol .

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.The Dt The gene coding for the derived? -Glycosidase is not only composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 but also a functional equivalent thereof, that is, a mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence, Lt; RTI ID = 0.0 > mutant < / RTI >

또한, 상기 Cb 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.Further, the Cb The gene coding for the resulting? -Glycosidase is not only composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 but also a functional equivalent thereof, that is, mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence, Lt; RTI ID = 0.0 > mutant < / RTI >

또한, 본 발명은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법을 제공한다. The present invention also provides a method for preparing an uglycon protopanaxadiol comprising the step of treating the composition with a substrate.

본 발명에 따른 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함한다.The method for preparing an uglycon protopanaxadiol according to the present invention comprises the step of treating the composition with a substrate.

상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글리코시다아제를 포함하거나, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Cb 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로, 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.The composition comprises Dt- derived? -Glycosidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and Cb- derived? -Glycosidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, A gene coding for? -Glycosidase derived from Dt, and a gene coding for? -Glycosidase derived from Cb consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. The specific contents are as described above.

또한, 본 발명에 따른 어글리콘 프로토파낙사다이올 제조방법에서 사용되는 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 및 진세노사이드 compound K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물을 기질로 사용할 수도 있다. In addition, the substrate used in the method for preparing an uglycon protopanaxadiol according to the present invention is selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, compound Mc, and a ginsenoside compound K. The present invention is not limited thereto. Specifically, one or more protoplast dies selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K A ternary extract containing an oily saponin may be used as a substrate.

구체적으로, 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼의 열매, 뿌리, 줄기 또는 잎을 을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명에서는 삼 추출물로, 프로포타낙사다이올계 사포닌을 다량 함유하는 인삼 추출물을 사용하였다. Specifically, the ternary extract may be obtained by solvent extraction of any one or more of the fruits, roots, stems or leaves selected from the group consisting of ginseng, red ginseng, ginseng, white ginseng, pseudo ginseng and ginseng. At this time, the solvent extraction may be performed with water, C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol. In the present invention, ginseng extract containing a large amount of propotanaxadiol saponin was used as a ternary extract.

상기 처리는 pH 4.5~7.0 및 70~100℃ 조건에서, 1시간 이상 수행될 수 있다. 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 5.0~6.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 75~100℃인 것이 바람직하고, 80℃인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조건을 유지함으로써, 사용되는 효소들을 모두 최적으로 활성화시킬 수 있어, 최종적으로 어글리콘 프로토파낙사다이올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.The treatment can be carried out at pH 4.5 to 7.0 and 70 to 100 ° C for 1 hour or more. The pH condition for the treatment is preferably pH 5.0 to 6.0, but is not limited thereto. A citrate / phosphate buffer solution may be used as a reaction solvent to maintain such pH conditions. The temperature condition for the treatment is preferably 75 to 100 ° C, more preferably 80 ° C, but is not limited thereto. By maintaining these conditions, all of the enzymes used can be optimally activated, and ultimately, the uglycon protopanaxadiol can be produced with high productivity and high yield.

또한, 상기 처리는 1시간 내지 3시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 처리를 위한 반응시간 내에서, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌은 어글리콘 프로토파낙사다이올로 모두 전환될 수 있다. 이때, 상기 처리를 위한 반응시간이 상기 범위 미만인 경우에는 어글리콘 프로토파낙사다이올의 생산성이 너무 낮은 문제점이 있고, 상기 처리를 위한 반응시간이 상기 범위를 초과하더라도 어글리콘 프로포파낙사다이올의 생산성은 크게 증가하지 아니하므로 공정 효율이 저하되는 문제점이 있다. In addition, the treatment is preferably performed for 1 to 3 hours, but is not limited thereto. Within the reaction time for the treatment, the protopanaxadiol saponins in the substrate can be converted to the uglycon protopanaxadiol. At this time, when the reaction time for the treatment is less than the above range, the productivity of the uglycon protopanaxadiol is too low, and even if the reaction time for the treatment exceeds the above range, The productivity is not greatly increased and the process efficiency is deteriorated.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 2종 효소로서 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 β-글리코시다아제를 최적 조성비로 이용함으로써, 70℃ 이상의 고온 반응을 통해 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시키면서, 동시에, 어글리콘 프로토파낙사다이올을 단시간에 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있는 바, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 어글리콘 프로토파낙사아디올은 UV에 의한 피부손상 회복 효능을 가지는바, 화장품 원료로 유용하게 활용될 수 있다.As described above, according to the present invention, as two kinds of enzyme Dick thio claw mousse tool gidyum (Dictyoglomus turgidum) derived from β- glycosidase and kaldi cellulite in syrup emitter shi (Caldicellulosiruptor bescii) the optimum ratio derived from β- glycosidase It is possible to produce the uglycon protopanaxadiol at a high yield and in a high yield in a short time while eliminating various contaminants from the reaction medium through the reaction at a high temperature of 70 ° C or higher, It is expected to be useful in various industrial fields. In particular, the uglycon protopanaxadiol has the effect of restoring skin damage by UV, and thus can be usefully used as a cosmetic raw material.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1: One: 딕티오클로무스Dictiochromus 툴기듐ToolGuide (( DictyoglomusDictyoglomus turgidumturgidum ; ; DtDt ) 유래 β-글리코시다아제 및 ) -Derived? -Glycosidase and 칼디셀룰로시럽터Kaldi cellulite syrup 베시Betsy (( CaldicellulosiruptorCaldicellulosiruptor besciibescii ; ; CbCb ) 유래 β-글리코시다아제의 발현) -Induced expression of? -Glycosidase

(1) 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작(1) Production of Recombinant Expression Vector and Transformed Microorganism

본 발명에서는 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 제조하기 위하여, 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii)의 유전자로부터 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.In the present invention, Dt Derived? -Glycosidase and Cb In order to prepare the resulting? -Glycosidase, Dictyoglomus turgidum and Caldicellulosiruptor lt ; RTI ID = 0.0 > Dt < / RTI & Derived β-glycosidase and Cb- derived β-glycosidase were isolated and a recombinant expression vector for overexpressing the gene was prepared.

구체적으로, Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자(Genebank 번호: YP002352162, 서열번호 3) 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자(Genebank 번호: ACM59590.1, 서열번호 4)를 증폭하기 위한 적절한 프라이머를 제작하였다. 그리고, 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 및 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii)를 각각 배양하여 이로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 각각의 유전체 DNA로부터 적절한 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 재조합 발현 벡터는 pET-24a(+) 및 pET-24a를 사용하였으며, 제한효소 없이 ligation하여 제작한 재조합 발현 벡터를 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-24a/β-글리코시다아제로 명명하였다.Specifically, the gene (Genebank number: YP002352162, SEQ ID NO: 3) encoding Dt- derived β-glycosidase and the gene (Genebank number: ACM59590.1, SEQ ID NO: 4) encoding Cb- derived β-glycosidase were amplified A suitable primer was prepared. And Dictyoglomus < RTI ID = 0.0 > turgidum and Caldicellulosiruptor the bescii) were each cultured by extracting genomic DNA from it. PCR was carried out using appropriate primers from each of the extracted genomic DNAs to obtain a gene coding for? -Glycosidase derived from Dt and Cb And the gene encoding the derived? -Glycosidase was amplified. The recombinant expression vector was constructed by pET-24a (+) and pET-24a. The recombinant expression vector prepared by ligation without restriction enzyme was transformed with pET-24a (+) /? - glycosidase and pET-24a / Aze.

그런 다음, pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-24a/β-글리코시다아제를 대장균 BL21(DE3) ER2566에 형질전환하고, 형질전환된 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a/β-글리코시다아제 균주로 명명하였다. 형질전환된 재조합 대장균은 진세노사이드 APPD의 제조를 위한 배양을 실시하기 전에는 20% 글리세린 용액을 첨가하여 -70 ℃에 냉동 보관하였다.Then, pET-24a (+) /? - glycosidase and pET-24a /? - glycosidase were transformed into E. coli BL21 (DE3) ER2566, and the transformed recombinant E. coli was transformed into E. coli BL21 (DE3) ER2566 pET-24a (+) /? - glycosidase strain and E. coli BL21 (DE3) ER2566 pET-24a / [beta] -glycosidase. The transformed recombinant E. coli was stored frozen at -70 DEG C by adding 20% glycerin solution before culturing for the production of ginsenoside APPD.

(2) (2) DtDt 유래 β-글리코시다아제 및 Derived? -Glycosidase and CbCb 유래 β-글리코시다아제의 발현 및 정제 Expression and Purification of Derived? -Glycosidase

효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관된 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a/베타-글리코시다아제 균주를 각각 LB 배지 50 ㎖가 들어있는 250 ㎖의 플라스크에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 진탕 배양하였다. 그 다음 배양액을 다시 LB 배지 500 ㎖가 들어있는 2ℓ의 삼각 플라스크에 첨가하여 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하였고, 이때, 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 조정하였다. 여기에 0.1 mM IPTG(isopropyl-beta-thiogalactoside)를 첨가하여 단백질이 과발현된 효소들의 제조를 유도하였으며 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하였다.For the protein expression of the enzymes, E. coli BL21 (DE3) ER2566 pET-24a (+) / beta-glycosidase cryopreserved E. coli and E. coli The BL21 (DE3) ER2566 pET-24a / beta-glycosidase strain was inoculated into a 250 ml flask containing 50 ml of LB medium, and incubated in a shaking incubator at 37 DEG C until the absorbance at 600 nm reached 2.0. Respectively. Then, the culture was added again to a 2 liter Erlenmeyer flask containing 500 ml of LB medium and incubated until the absorbance at 600 nm reached 0.8. The stirring speed was 200 rpm and the incubation temperature was adjusted to 37 ° C. To this end, 0.1 mM IPTG (isopropyl-beta-thiogalactoside) was added to induce the production of the over-expressed proteins. The stirring speed was 150 rpm and the incubation temperature was adjusted to 16 ° C.

이후 이러한 효소들을 정제하기 위하여, 형질전환된 균주들의 배양액을 4,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in²에서 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 70℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 진세노사이드 APPD의 제조에 사용될 수 있는 효소액으로 준비하였다.In order to purify these enzymes, the culture of the transformed strains was centrifuged at 4,000 x g for 30 minutes at 4 DEG C, and the cell solution was disrupted at 15,000 lb / in ² in French fries. Cell lysates were again centrifuged at 13,000 x g for 20 minutes at 4 ° C, heat-treated at 70 ° C for 10 minutes, and centrifuged again at 13,000 x g for 20 minutes at 13,000 x g . The resulting supernatant was filtered with 0.45 쨉 m filter paper to prepare an enzyme solution which can be used to prepare ginsenoside APPD.

이때, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제의 특정 활성을 평가하였다. 비교대상이 되는 효소들로 Pyrococcus furiosus 유래 β-글리코시다아제(Mi-Hyun Yoo et al. Appl Microbiol Biotechnol 89: 1019-1028, 2011), Caldicellulosiruptor saccharolyticus 유래 β-갈락토시다아제(Kyung-Chul Shin et al. J Biotechnol 167: 33-40, 2013), Sulfolobus acidocaldarius 유래 β-글리코시다아제(Kyeong-Hwan Noh et al. Biol Pharm Bull 11: 1830-1835, 2009)를 사용하였다. 먼저, 진세노사이드 compound Y 또는 진세노사이드 compound K 1.0 mg/ml에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, 각 효소액을 80℃에서 2시간 동안 열처리한 다음, 각 효소들의 특정 활성을 평가하였고, 그 결과는 하기 표 1과 같다. At this time, specific activities of Dt- derived? -Glycosidase and Cb- derived? -Glycosidase were evaluated. The enzymes to be compared include Pyrococcus furiosus- derived? -glycosidase (Mi-Hyun Yoo et al., Appl Microbiol Biotechnol 89: 1019-1028, 2011), Caldicellulosiruptor saccharolyticus Derived β-galactosidase (Kyung-Chul Shin et al. J Biotechnol 167: 33-40, 2013), Sulfolobus acidocaldarius- derived? -glycosidase (Kyeong-Hwan Noh et al. Biol Pharm Bull 11: 1830-1835, 2009) was used. First, 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5) and each enzyme solution were heat-treated at 80 ° C. for 2 hours to 1.0 mg / ml of ginsenoside compound Y or ginsenoside compound K , And the specific activity of each enzyme was evaluated. The results are shown in Table 1 below.

미생물microbe 효소enzyme 특정 활성(nmol/min/mg)Specific activity (nmol / min / mg) 기질 (생산물)Substrate (product) 진세노사이드 compound Y
(진세노사이드 compound K)Ginsenoside compound Y
(Ginsenoside compound K) 진세노사이드 compound K
(진세노사이드 APPD)Ginsenoside compound K
(Gene Senide APPD) DictyoglomusDictyoglomus turgidumturgidum β-글리코시다아제 β -glycosidase 00 16.7 ± 0.316.7 ± 0.3 CaldicellulosiruptorCaldicellulosiruptor bescii bescii β- 글리코시다아제 β -glycosidase 37900 ± 11037900 ± 110 00 PyrococcusPyrococcus furiosusfuriosus β- 글리코시다아제 β -glycosidase 1750 ± 201750 ± 20 2.2 ± 0.12.2 ± 0.1 CaldicellulosiruptorCaldicellulosiruptor saccharolyticus saccharolyticus β- 갈락토시다아제 β -galactosidase 3510 ± 303510 ± 30 00 SulfolobusSulfolobus acidocaldarius acidocaldarius β- 글리코시다아제 β -glycosidase 1.0 ± 0.11.0 ± 0.1 00 SulfolobusSulfolobus solfataricussolfataricus β- 글리코시다아제 β -glycosidase 2200 ± 302200 ± 30 00

표 1에 나타난 바와 같이, Dt 유래 β-글리코시다아제는 다른 효소 대비 진세노사이드 compound K를 진세노사이드 APPD로 전환하는 능력이 크게 뛰어나므로, 진세노사이드 compound K의 글루코오스의 분해능이 매우 우수한 것으로 확인된다. 한편, Cb 유래 β-글리코시다아제는 다른 효소 대비 진세노사이드 compound Y를 진세노사이드 compound K로 전환하는 능력이 크게 뛰어나므로, 진세노사이드 compound Y의 아라비노스의 분해능이 매우 우수한 것으로 확인된다. 따라서, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Cb 유래 β-글리코시다아제를 조합하여, 진세노사이드 compound Y 및 진세노사이드 compound K를 모두 포함하는 기질에 처리하는 경우, 진세노사이드 APPD 제조에 현저한 상승 효과를 나타낼 수 있다. As shown in Table 1, β-glycosidase derived from Dt has a remarkable ability to convert ginsenoside compound K to ginsenoside APPD with respect to other enzymes, and thus has excellent resolution of glucose of ginsenoside compound K Is confirmed. On the other hand, Cb- derived? -Glycosidase has a great ability to convert ginsenoside compound Y to ginsenoside compound K in comparison with other enzymes, and thus it is confirmed that the resolution of arabinose of ginsenoside compound Y is very excellent. Therefore, Dt- derived? -Glycosidase and Cb Glucosidase is combined with a substrate containing both a ginsenoside compound Y and a ginsenoside compound K, a remarkable synergistic effect can be exhibited in the production of ginsenoside APPD.

실시예Example 2: 2: DtDt 유래 β-글리코시다아제 및 Derived? -Glycosidase and CbCb 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 혼합 Mixture containing derived? -Glycosidase 효소액을The enzyme solution 이용한 진세노사이드 Used ginsenoside APPDAPPD 제조 Produce

(1) 기질 내 (1) in the matrix 프로토파낙사다이올계The proto 사포닌의 최적 농도 확인 Determination of optimum concentration of saponin

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 농도를 확인하기 위해, 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 2.0 mg/ml을 포함하는 효소액을 80℃에서 4시간 동안 열처리하였다. 이때, 인삼 추출물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도(0.0~5.0 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.In the present invention, in order to determine the optimum concentration of protopanaxadiol-based saponins in the ginsenoside APPD, 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5) and Dt And an enzyme solution containing 2.0 mg / ml of derived? -Glycosidase was heat-treated at 80 ° C for 4 hours. At this time, various concentrations of protopanaxadiol saponin (0.0-5.0 mg / ml) were prepared in ginseng extract.

도 1은 실시예 2의 (1)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 인삼 추출물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.FIG. 1 is a graph showing the results of examining the optimal concentration of protopanaxyl diol-based saponin in ginseng extract as a result of treating the enzyme solution prepared in (1) of Example 2 with ginseng extract.

도 1에 나타난 바와 같이, 프로토파낙사다이올계 사포닌 함유 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 농도는 2.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml, 바람직하게 2.5 mg/ml 내지 4.0 mg/ml인 것으로 확인된다. 다만, 실시예 2의 (1)에서 준비한 효소액을 이용하면, 진세노사이드 APPD를 100% 전환시키지 못하는 것으로 확인된다. As shown in Fig. 1, when the protopanaxadiol saponin-containing ginseng extract is used as a substrate, the optimum concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate is 2.0 mg / ml to 5.0 mg / ml, preferably 2.5 mg / ml To 4.0 mg / ml. However, when the enzyme solution prepared in (1) of Example 2 was used, it was confirmed that the ginsenoside APPD was not 100% converted.

(2)(2) DtDt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도 확인 Determination of optimum concentration of derived? -Glycosidase

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인하기 위해, 프로토파낙사다이올계 사포닌 3.0 mg/ml 함유 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, Dt 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 효소액을 80℃에서 4시간 동안 열처리하였다. 이때, Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도(0.0~12.0 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.In the present invention, in the preparation of ginsenoside APPD, Dt In order to confirm the optimum concentration of the resulting β-glycosidase, 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5) was added to the purified ginseng root extract containing protopanaxadiol saponin 3.0 mg / ml, , Dt The enzyme solution containing the resulting? -Glycosidase was heat-treated at 80 ° C for 4 hours. At this time, Dt The optimum concentration (0.0 to 12.0 mg / ml) of the resulting? -Glycosidase was prepared in various ways.

도 2는 실시예 2의 (2)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. Figure 2 is a result of processing the enzyme solution prepared in (2) Example 2 a ginseng extract, enzyme solution within Dt And the result of confirming the optimum concentration of the derived? -Glycosidase.

도 2에 나타난 바와 같이, 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도는 8.0 mg/ml 내지 12.0 mg/ml인 것으로 확인된다. 다만, 실시예 2의 (2)에서 준비한 효소액을 이용하면, 진세노사이드 APPD를 100% 전환시키지 못하는 것으로 확인된다. As shown in FIG. 2, when the ginseng extract was used as a substrate, it was confirmed that the optimum concentration of β-glycosidase derived from Dt in the enzyme solution was 8.0 mg / ml to 12.0 mg / ml. However, when the enzyme solution prepared in (2) of Example 2 was used, it was confirmed that the ginsenoside APPD was not 100% converted.

(3) (3) DtDt 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 Derived β-glycosidase 효소액을The enzyme solution 기질에 처리하는 최적 시간 확인 Determine optimal time to treat substrate

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, Dt 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인하기 위해, 프로토파낙사다이올계 사포닌 3.0 mg/ml 함유 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 8.0 mg/ml를 포함하는 효소액을 80℃에서 4시간 동안 열처리하였다. In the present invention, in the preparation of ginsenoside APPD, In order to confirm the optimum time for treating the substrate with the enzyme solution containing Dt- derived? -Glycosidase, a purified ginseng root extract containing 3.0 mg / ml protopanaxadiol saponin was added to 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5) and 8.0 mg / ml of Dt- derived? -glycosidase was heated at 80 ° C for 4 hours.

도 3는 실시예 2의 (3)에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.FIG. 3 is a graph showing the results of determining the optimum time for treating the enzyme solution to the substrate as a result of treating the enzyme solution prepared in (3) of Example 2 with the ginseng extract.

도 3에 나타난 바와 같이, 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간은 1.5 시간 이상, 바람직하게 2 시간 이상인 것으로 확인된다. 다만, 실시예 2의 (3)에서 준비한 효소액을 이용하면, 진세노사이드 APPD를 100% 전환시키지 못하는 것으로 확인된다. 이때, 진세노사이드 compound Y, 가 다량 잔류하고, 진세노사이드 compound Mc 등도 역시 소량 잔류하는 것으로 확인된다. As shown in FIG. 3, when the ginseng extract was used as a substrate, it was confirmed that the optimum time for treating the enzyme solution to the substrate was 1.5 hours or more, preferably 2 hours or more. However, when the enzyme solution prepared in (3) of Example 2 was used, it was confirmed that the ginsenoside APPD could not be 100% converted. At this time, a large amount of ginsenoside compound Y remains, and a small amount of ginsenoside compound Mc also remains.

(4) (4) CbCb 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도 확인 Determination of optimum concentration of derived? -Glycosidase

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인하기 위해, 프로토파낙사다이올계 사포닌 3.0 mg/ml 함유 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, 다양한 농도의 Dt 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 효소액을 80℃에서 2시간 동안 열처리하였다. Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도는 8 mg/ml로 확인되었다. 그다음, 반응시 잔류 프로토파낙사다이올계 사포닌을 진세노사이드 APPD로 전환시키기 위한 Cb 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인하기 위하여, 위와 동일한 인삼 추출물 및 완충 용액 조건에서 Dt 유래 β-글리코시다아제와 Cb 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 효소액을 80℃에서 열처리하였다.In the present invention, in order to confirm the optimal concentration of β-glycosidase derived from Dt in the preparation of ginsenoside APPD, purified ginseng root extract containing protopanaxadiol saponin 3.0 mg / ml was added with 50 mM citrate / A citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5) and various concentrations of Dt- derived? -Glycosidase was heat-treated at 80 ° C for 2 hours. The optimum concentration of D- derived β-glycosidase was found to be 8 mg / ml. Then, Cb to convert the remaining protopanaxyl diol saponins to ginsenoside APPD during the reaction In order to confirm the optimum concentration of the derived? -Glycosidase, an enzyme solution containing D- derived? -Glycosidase and Cb- derived? -Glycosidase was heat-treated at 80 ° C under the same ginseng extract and buffer conditions as above.

도 4는 실시예 2의 (4)에서 준비한 농도별 추가 효소액과 최적 농도의 Dt 유래 β-글리코시다아제의 혼합액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 추가 효소액 내 Cb 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. Fig. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of the additional enzyme solution prepared in (4) of Example 2 and the Dt Glucosidase obtained in Example 1 was treated with the ginseng extract to determine the optimum concentration of Cb- derived? -Glycosidase in the additional enzyme solution.

도 4에 나타난 바와 같이, 두 효소 혼합액에 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 추가 효소액 내 Cb 유래 β-글리코시다아제의 최적 농도는 0.01 mg/ml 내지 0.05 mg/ml인 것으로 확인된다. 즉, 실시예 2의 (4)에서 준비한 추가 효소액을 이용하면, 잔류 프로토파낙사다이올계 사포닌(진세노사이드 compound Y, 진세노사이드 compound Mc 등)에 존재하는 아라비노스를 분해할 수 있어, 진세노사이드 APPD를 100% 전환시킬 수 있는 것으로 확인된다.As shown in FIG. 4, when ginseng extract was used as a substrate in the mixture of two enzymes, Cb The optimum concentration of the derived? -Glycosidase is confirmed to be 0.01 mg / ml to 0.05 mg / ml. That is, when the additional enzyme solution prepared in (4) of Example 2 is used, it is possible to decompose arabinose present in the remaining protopanaxadiol saponins (ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc, etc.) It is confirmed that senoside APPD can be converted to 100%.

(5) (5) DtDt 유래 β-글리코시다아제 및 Derived? -Glycosidase and CbCb 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 혼합 Mixture containing derived? -Glycosidase 효소액을The enzyme solution 기질에 처리하는 최적 시간 확인 Determine optimal time to treat substrate

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인하기 위해, 프로토파낙사다이올계 사포닌 3.0 mg/ml 함유 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 8.0 mg/ml 및 Cb 유래 β-글리코시다아제 0.05 mg/ml를 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 3시간 동안 열처리하였다. In the present invention, in order to determine the optimum time for treating the mixed enzyme solution to the substrate in the preparation of ginsenoside APPD, purified ginseng root extract containing 3.0 mg / ml protopanaxadiol saponin was added with 50 mM citrate / phosphate (citrate / phosphate) buffer (pH 5.5), 8.0 mg / ml of Dt- derived? -glycosidase and Cb And a mixed enzyme solution containing 0.05 mg / ml of derived? -Glycosidase was heat-treated at 80 ° C for 3 hours.

도 5는 실시예 2의 (5)에서 준비한 혼합 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.FIG. 5 is a graph showing the results of determining the optimal time for treating the mixed enzyme solution to the substrate as a result of treating the mixed enzyme solution prepared in (5) of Example 2 with the ginseng extract.

도 5에 나타난 바와 같이, 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간은 1시간 이상, 바람직하게 1.5 시간 이상인 것으로 확인된다. 이때, 진세노사이드 APPD의 생산량은 최대이고, 진세노사이드 APPD의 수율은 100%에 도달하는 것으로 확인된다. As shown in FIG. 5, when the ginseng extract was used as a substrate, it was confirmed that the optimum time for treating the mixed enzyme solution to the substrate was 1 hour or more, preferably 1.5 hours or more. At this time, the yield of ginsenoside APPD was found to be the maximum, and the yield of ginsenoside APPD reached 100%.

비교예Comparative Example 1: One: 파이로코커스Pyrococcus 퓨리오서스Puri Orthosis (( PyrococcusPyrococcus furiosusfuriosus ) 유래 β-) Derived β- 글리코시다아제 를Glycosidase 포함하는 Included 효소액을The enzyme solution 이용한 진세노사이드 Used ginsenoside APPDAPPD 제조 Produce

본 발명에서는 진세노사이드 APPD를 제조함에 있어, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인하기 위해, 프로토파낙사다이올계 사포닌 3.0 mg/ml 함유 정제된 인삼 뿌리 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 5.5)과, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제 8.05 mg/ml를 포함하는 효소액을 80℃에서 36시간 동안 열처리하였다. In the present invention, in order to determine the optimal time for treating the enzyme solution containing β-glycosidase derived from Pyrococcus furiosus in the preparation of ginsenoside APPD, protopanaxadiol saponin To the purified ginseng root extract containing 3.0 mg / ml was added 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 5.5), Pyrococcus furiosus The enzyme solution containing 8.05 mg / ml of furiosus- derived? -glycosidase was heat-treated at 80 ° C for 36 hours.

도 6은 비교예 1에서 준비한 효소액을 인삼 추출물에 처리한 결과, 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.FIG. 6 is a graph showing the results of determining the optimum time for treating the enzyme solution to the substrate as a result of treating the enzyme solution prepared in Comparative Example 1 with the ginseng extract. FIG.

도 6에 나타난 바와 같이, 인삼 추출물을 기질로 이용한 경우, 비교예 1에서 준비한 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간은 적어도 20 시간 이상인 것으로 확인된다. 뿐만 아니라, 진세노사이드 compound K에서 진세노사이드 APPD로의 분해능력이 낮은 것을 확인하였다.As shown in FIG. 6, when the ginseng extract was used as a substrate, it was confirmed that the optimum time for treating the enzyme solution prepared in Comparative Example 1 to the substrate was at least 20 hours or more. In addition, it was confirmed that the ability to decompose ginsenoside compound K to ginsenoside APPD was low.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXADIOL COMPRISING TWO KINDS OF ENZYMES AND METHOD FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXADIOL USING THE SAME <130> 1062061 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 749 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 1 Met Ser Val Asp Ile Lys Lys Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Asp Phe Trp His Thr Lys Pro Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Ile Arg Met Ser Asp Gly Pro His Gly 35 40 45 Leu Arg Lys Glu Glu Thr Met Phe Ser Lys Thr Val Pro Ala Thr Cys 50 55 60 Phe Pro Thr Ala Val Thr Ile Ala Ala Ser Trp Asp Lys Ser Leu Ala 65 70 75 80 Glu Lys Met Gly Lys Ala Ile Gly Glu Glu Cys Gln Ala Glu Asn Val 85 90 95 Gln Ile Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg Ser Pro Leu Cys 100 105 110 Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ala Gly Glu 115 120 125 Leu Ala Ala His Phe Ile Lys Gly Val Gln Ser Glu Gly Val Gly Thr 130 135 140 Ser Leu Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu His Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 Val Asn Ala Ile Ile Asp Glu Arg Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Glu Arg Ala Val Lys Glu Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys 180 185 190 Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Thr Tyr Ala Ser Glu Asn Glu Phe Leu 195 200 205 Leu Thr Lys Val Leu Lys Glu Glu Trp Gly Phe Glu Gly Phe Val Val 210 215 220 Ser Asp Trp Gly Ala Val Asn Asp Arg Val Met Gly Leu Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Asp Leu Gln Met Pro Tyr Asp Gly Gly Tyr Gly Asp Lys Lys Ile 245 250 255 Ile Glu Ala Val Lys Ser Gly Lys Ile Pro Glu Glu Val Leu Asp Arg 260 265 270 Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ile Val Phe Lys Ala Ile Glu Asn Lys 275 280 285 Lys Glu Asn Ala Thr Tyr Asp Lys Glu Thr His His Lys Ile Ala Arg 290 295 300 Glu Ile Ala Arg Glu Cys Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Asp Ile 305 310 315 320 Leu Pro Leu Lys Lys Glu Gly Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Phe Ala 325 330 335 Lys Asn Pro Gln Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala His Val Asn Pro Thr 340 345 350 Met Val Asp Asp Ala Val Glu Glu Ile Arg Lys Met Val Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Glu Ile Leu Tyr Ala Asp Gly Tyr His Ile Glu Lys Asp Glu Val 370 375 380 Asp Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Lys Glu Val Ala Lys Val Ala Asp 385 390 395 400 Val Val Val Ile Phe Ala Gly Leu Pro Glu Arg Tyr Glu Ser Glu Gly 405 410 415 Phe Asp Arg Pro His Met Lys Met Pro Glu Ser His Asn Arg Leu Ile 420 425 430 Glu Glu Ile Ser Lys Val Asn Glu Asn Leu Val Val Val Leu Ser Asn 435 440 445 Gly Ala Pro Ile Glu Met Pro Trp Leu Glu Lys Pro Lys Ala Ile Leu 450 455 460 Glu Thr Tyr Arg Gly Gly Gln Ala Trp Gly Gly Ala Val Ala Asp Val 465 470 475 480 Leu Phe Gly Val Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Pro Glu Thr Phe Pro 485 490 495 Lys Lys Leu Ser Asp Asn Pro Ser Tyr Leu Phe Phe Pro Gly Glu Asp 500 505 510 Asp Arg Val Glu Tyr Arg Glu Gly Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr 515 520 525 Asp Lys Lys Glu Met Glu Val Leu Phe Pro Phe Gly Tyr Gly Leu Ser 530 535 540 Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Ser Asp Leu Lys Leu Asp Lys Lys Glu Met 545 550 555 560 Arg Asp Asp Glu Val Leu Lys Val Ser Val Lys Val Lys Asn Thr Gly 565 570 575 Lys Val Lys Gly Lys Glu Val Val Gln Leu Tyr Val Arg Asp Val Glu 580 585 590 Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Glu Lys Glu Leu Lys Gly Phe Glu Lys Val 595 600 605 Glu Leu Glu Pro Gly Glu Glu Lys Glu Val Val Phe Tyr Leu Asp Lys 610 615 620 Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Asn Ile Asp Ile Lys Asp Trp Tyr Val Glu 625 630 635 640 Asp Gly Asp Phe Glu Ile Leu Ile Gly Lys Ser Ser Arg Asp Ile Val 645 650 655 Leu Arg Asp Lys Val Phe Val Lys Ser Thr Thr Lys Ile Lys Arg Thr 660 665 670 Tyr His Ile Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ile Met Arg Asp Pro Ile Ala 675 680 685 Trp Glu Lys Phe Lys Asp Ile Leu Gln Gln Phe Ala Ser Ala Phe Pro 690 695 700 Ala Phe Ser Ser Glu Glu Ala Ile Met Asn Phe Ala Glu Met Met Lys 705 710 715 720 Tyr Met Pro Leu Arg Ser Leu Ile His Phe Gly Gln Gly Lys Ile Thr 725 730 735 Pro Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Arg Glu Leu Asn Ser 740 745 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 2 Met Ser Leu Pro Lys Gly Phe Leu Trp Gly Ala Ala Thr Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asn Glu Asp Gly Lys Gly Glu Ser Ile Trp 20 25 30 Asp Arg Phe Thr His Gln Lys Gly Asn Ile Leu Tyr Gly His Asn Gly 35 40 45 Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Phe Glu Glu Asp Val Ser Leu 50 55 60 Met Lys Glu Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ala 65 70 75 80 Arg Ile Phe Pro Asp Gly Phe Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly Leu Glu 85 90 95 Phe Tyr Asp Arg Leu Ile Asn Lys Leu Val Glu Asn Gly Ile Glu Pro 100 105 110 Val Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Lys Leu Gln Asp Ile 115 120 125 Gly Gly Trp Ala Asn Pro Glu Ile Val Asn Tyr Tyr Phe Glu Tyr Ala 130 135 140 Met Leu Ile Val Asn Arg Tyr Lys Asp Lys Val Lys Lys Trp Ile Thr 145 150 155 160 Phe Asn Glu Pro Tyr Cys Ile Ala Phe Leu Gly His Phe Tyr Gly Val 165 170 175 His Ala Pro Gly Ile Lys Asp Phe Lys Val Ala Met Asp Val Val His 180 185 190 Asn Ile Met Leu Ser His Phe Lys Val Val Lys Ala Val Lys Glu Asn 195 200 205 Asn Ile Asp Val Glu Val Gly Ile Thr Leu Asn Leu Thr Pro Val Tyr 210 215 220 Phe Gln Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Lys Val Ser Glu Ile Glu Arg Glu 225 230 235 240 Met Val Asn Leu Ser Ser Gln Leu Asp Asn Glu Leu Phe Leu Asp Pro 245 250 255 Val Leu Lys Gly Ser Tyr Pro Gln Lys Leu Phe Asp Tyr Leu Val Gln 260 265 270 Lys Asp Leu Leu Glu Thr Gln Lys Val Leu Ser Met Gln Gln Glu Val 275 280 285 Lys Glu Asn Phe Val Phe Pro Asp Phe Leu Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr 290 295 300 Arg Ala Val Arg Leu Tyr Asp Glu Asn Ser Asn Trp Ile Phe Pro Ile 305 310 315 320 Arg Trp Glu His Pro Ala Gly Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val 325 330 335 Phe Pro Gln Gly Leu Tyr Asp Leu Leu Ile Trp Ile Lys Glu Ser Tyr 340 345 350 Pro Gln Ile Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Asn Asp 355 360 365 Lys Val Glu Asp Gly Arg Val His Asp Gln Lys Arg Val Glu Tyr Leu 370 375 380 Lys Gln His Phe Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ile Glu Asn Gly Val Asp 385 390 395 400 Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Leu Asp Asn Leu Glu Trp Ala 405 410 415 Met Gly Tyr Thr Lys Arg Phe Gly Val Ile Tyr Val Asp Tyr Glu Thr 420 425 430 Gln Lys Arg Ile Lys Lys Asp Ser Phe Tyr Phe Tyr Gln Gln Tyr Ile 435 440 445 Lys Glu Asn Ser 450 <210> 3 <211> 2247 <212> DNA <213> Dictyoglomus turgidum <400> 3 atgagtgtgg atataaaaaa gctcatatct caaatgaccc ttgaggaaaa ggcaagcctt 60 tgttctgggc ttgacttttg gcatacaaaa cccattgaaa gacttggaat accatctata 120 agaatgtcgg atggtcctca tggacttaga aaagaagaaa ccatgtttag taagactgtt 180 cctgctacat gcttccctac tgctgtaact attgcagcat cctgggataa atcccttgct 240 gagaagatgg gaaaggctat tggcgaagaa tgccaggctg aaaatgtaca aatactcctt 300 ggacctggag ttaacataaa aagatctccc ctttgtggaa gaaactttga atactactct 360 gaagatccac tccttgcagg agaacttgca gcccatttta ttaagggagt acaaagtgag 420 ggagtaggaa cttctcttaa acattttgca gcaaacaacc aagaacatag aaggcttact 480 gtaaatgcca tcattgacga gagaaccttg agagagattt atctttctgc ctttgagagg 540 gcagtaaaag aggcaaaacc atggaccgtt atgtgctcat acaatagagt aaatgggact 600 tatgcatcag agaatgaatt tcttctcaca aaggtattga aagaagaatg gggatttgaa 660 ggatttgtag tatccgattg gggagcagta aatgataggg taatgggact ttctgcagga 720 cttgatcttc aaatgcctta tgatggtgga tatggagaca aaaagatcat tgaggcagta 780 aaaagtggaa aaattcctga ggaggttctt gatagggctg tagaaagaat tcttaggatt 840 gtattcaagg caatagaaaa caaaaaagaa aatgccacct atgacaagga aactcatcat 900 aaaattgcaa gagagattgc aagggaatgt tttgtgcttc tcaaaaatga aggggacatt 960 cttccactga aaaaagaagg aaagattgca ttaataggag cctttgctaa gaaccctcaa 1020 atacaaggag gaggaagtgc ccatgtaaat ccaaccatgg tagatgatgc agtagaagag 1080 ataagaaaga tggtagaagg aaaggcagag attctttatg ccgatggata tcatatagaa 1140 aaggatgagg tagatgaaag acttatagag gaggcaaaag aggttgcaaa ggtagcggat 1200 gtggtggtaa tttttgcagg acttcccgaa agatacgaat cggaaggctt tgacaggcct 1260 cacatgaaga tgcctgaaag ccacaatagg ctaatagaag aaatctcaaa ggtaaatgaa 1320 aatcttgtgg tggtacttag caatggagca cctatagaga tgccatggtt agagaagcca 1380 aaggcaatcc ttgagaccta cagaggagga caagcctggg gaggagcagt tgcagatgtt 1440 ctttttggag tagtaagtcc ttctggaaag cttccagaga cctttccaaa gaagctaagt 1500 gataatccgt cttacttatt cttcccaggg gaggatgacc gagtagagta cagggaaggg 1560 atatttgtag gatataggta ttatgataag aaggagatgg aagtattgtt tccctttgga 1620 tatggtcttt cctatactac ctttgagtat tcagacttaa agcttgacaa gaaagagatg 1680 agagatgatg aagtacttaa ggtaagtgtg aaggtaaaga atacggggaa ggtaaaaggt 1740 aaagaagtag tgcagttata tgtgagggat gtggaaagta gctatataag gcctgagaag 1800 gagctaaagg gatttgagaa ggtagagctt gagccaggag aagaaaagga agtagtgttt 1860 tatcttgata agagggcttt tgccttctat aacatagaca taaaggattg gtatgtggag 1920 gatggagatt ttgagatatt aattgggaag tcatcaaggg atattgtgct aagggataaa 1980 gtatttgtta agtctaccac aaagataaag agaacttacc atattaattc tactattggg 2040 gatattatga gggaccctat agcatgggag aagtttaagg atatactaca gcagtttgca 2100 agtgcctttc ctgccttttc atcggaagaa gcaatcatga actttgcaga gatgatgaaa 2160 tacatgcctc ttcgaagcct tattcacttt ggtcaaggaa aaatcacacc agaaatagta 2220 gaaaacctac tgagagaact taatagc 2247 <210> 4 <211> 1359 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 4 atgagtttac caaaaggatt tctgtggggt gctgcaactg catcatatca gattgagggt 60 gcttggaatg aagatggaaa aggtgaatct atatgggaca ggtttacaca tcaaaaagga 120 aatattttat atggtcataa tggcgacgtt gcctgtgacc actatcatag gttcgaagaa 180 gatgtctctc ttatgaaaga acttggacta aaagcctaca ggttttctat tgcatgggcg 240 agaatttttc cagatggttt cggtactgtg aatcaaaaag gtcttgagtt ttatgataga 300 ctcatcaaca agcttgttga aaacggtatt gaaccggttg tcaccattta tcactgggat 360 cttcctcaaa agctacaaga cattggcggt tgggcaaacc cagaaattgt aaattattat 420 tttgaatatg caatgcttat cgtaaaccgt tataaagaca aagtaaaaaa atggataaca 480 tttaatgaac cttattgtat tgcctttttg ggacactttt atggagttca tgcaccagga 540 ataaaagact ttaaagttgc aatggatgtt gtgcacaaca ttatgctttc tcattttaag 600 gttgtaaaag ctgtaaagga aaacaatatt gatgttgagg taggaattac actaaattta 660 actccagttt actttcaaac agagcgtctt ggatataagg taagcgaaat tgaaagagaa 720 atggtaaacc tcagcagcca gcttgacaat gaacttttcc ttgatccagt actcaaagga 780 agctatccac aaaagctgtt tgattacctt gttcaaaaag atttgttgga aactcaaaaa 840 gtattgagta tgcagcagga agtaaaagaa aatttcgttt ttcctgattt tcttggtatc 900 aactactata cacgtgctgt caggctttac gatgaaaatt ctaactggat atttccaata 960 agatgggaac atcctgcagg agagtacacc gagatgggct gggaagtgtt cccacaagga 1020 ctttatgatc ttttgatttg gattaaagaa agttacccac aaattccaat ttatataaca 1080 gaaaacggtg ctgcttataa cgacaaggta gaagatggaa gagttcatga ccaaaagaga 1140 gtggagtatt taaaacagca ctttgaagca gcaagaaagg caattgaaaa tggagtggat 1200 ttgcgaggtt attttgtgtg gtctttgttg gacaatcttg aatgggcaat gggttataca 1260 aaaaggtttg gagttatata tgtggactat gaaacccaaa aaaggattaa aaaagacagc 1320 ttctattttt atcagcagta tataaaggaa aactcataa 1359 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXADIOL COMPRISING TWO KINDS OF ENZYMES AND METHOD FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXADIOL USING THE SAME <130> 1062061 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 749 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 1 Met Ser Val Asp Ile Lys Lys Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Asp Phe Trp His Thr Lys Pro Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Ile Arg Met Ser Asp Gly Pro His Gly 35 40 45 Leu Arg Lys Glu Glu Thr Met Phe Ser Lys Thr Val Ala Thr Cys 50 55 60 Phe Pro Thr Ala Val Thr Ile Ala Ala Ser Trp Asp Lys Ser Leu Ala 65 70 75 80 Glu Lys Met Gly Lys Ala Ile Gly Glu Glu Cys Gln Ala Glu Asn Val 85 90 95 Gln Ile Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg Ser Pro Leu Cys 100 105 110 Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ala Gly Glu 115 120 125 Leu Ala Ala His Phe Ile Lys Gly Val Gln Ser Glu Gly Val Gly Thr 130 135 140 Ser Leu Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu His Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 Val Asn Ale Ile Ile Asp Glu Arg Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Glu Arg Ala Val Lys Glu Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys 180 185 190 Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Thr Tyr Ala Ser Glu Asn Glu Phe Leu 195 200 205 Leu Thr Lys Val Leu Lys Glu Glu Trp Gly Phe Glu Gly Phe Val Val 210 215 220 Ser Asp Trp Gly Ala Val Asn Asp Arg Val Met Gly Leu Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Asp Leu Gln Met Pro Tyr Asp Gly Gly Tyr Gly Asp Lys 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aatactcctt 300 ggacctggag ttaacataaa aagatctccc ctttgtggaa gaaactttga atactactct 360 gaagatccac tccttgcagg agaacttgca gcccatttta ttaagggagt acaaagtgag 420 ggagtaggaa cttctcttaa acattttgca gcaaacaacc aagaacatag aaggcttact 480 gtaaatgcca tcattgacga gagaaccttg agagagattt atctttctgc ctttgagagg 540 gcagtaaaag aggcaaaacc atggaccgtt atgtgctcat acaatagagt aaatgggact 600 tatgcatcag agaatgaatt tcttctcaca aaggtattga aagaagaatg gggatttgaa 660 ggatttgtag tatccgattg gggagcagta aatgataggg taatgggact ttctgcagga 720 cttgatcttc aaatgcctta tgatggtgga tatggagaca aaaagatcat tgaggcagta 780 aaaagtggaa aaattcctga ggaggttctt gatagggctg tagaaagaat tcttaggatt 840 gtattcaagg caatagaaaa caaaaaagaa aatgccacct atgacaagga aactcatcat 900 aaaattgcaa gagagattgc aagggaatgt tttgtgcttc tcaaaaatga aggggacatt 960 cttccactga aaaaagaagg aaagattgca ttaataggag cctttgctaa gaaccctcaa 1020 atacaaggag gaggaagtgc ccatgtaaat ccaaccatgg tagatgatgc agtagaagag 1080 ataagaaaga tggtagaagg aaaggcagag attctttatg ccgatggata tcatatagaa 1140 aaggatgagg tagatgaaag acttatagag gaggcaaaag aggttgcaaa ggtagcggat 1200 gtggtggtaa tttttgcagg acttcccgaa agatacgaat cggaaggctt tgacaggcct 1260 cacatgaaga tgcctgaaag ccacaatagg ctaatagaag aaatctcaaa ggtaaatgaa 1320 aatcttgtgg tggtacttag caatggagca cctatagaga tgccatggtt agagaagcca 1380 aaggcaatcc ttgagaccta cagaggagga caagcctggg gaggagcagt tgcagatgtt 1440 ctttttggag tagtaagtcc ttctggaaag cttccagaga cctttccaaa gaagctaagt 1500 gataatccgt cttacttatt cttcccaggg gaggatgacc gagtagagta cagggaaggg 1560 atatttgtag gatataggta ttatgataag aaggagatgg aagtattgtt tccctttgga 1620 tatggtcttt cctatactac ctttgagtat tcagacttaa agcttgacaa gaaagagatg 1680 agagatgatg aagtacttaa ggtaagtgtg aaggtaaaga atacggggaa ggtaaaaggt 1740 aaagaagtag tgcagttata tgtgagggat gtggaaagta gctatataag gcctgagaag 1800 gagctaaagg gatttgagaa ggtagagctt gagccaggag aagaaaagga agtagtgttt 1860 tatcttgata agagggcttt tgccttctat aacatagaca taaaggattg gtatgtggag 1920 gatggagatt ttgagatatt aattgggaag tcatcaaggg atattgtgct aagggataaa 1980 gtatttgtta agtctaccac aaagataaag agaacttacc atattaattc tactattggg 2040 gatattatga gggaccctat agcatgggag aagtttaagg atatactaca gcagtttgca 2100 agtgcctttc ctgccttttc atcggaagaa gcaatcatga actttgcaga gatgatgaaa 2160 tacatgcctc ttcgaagcct tattcacttt ggtcaaggaa aaatcacacc agaaatagta 2220 gaaaacctac tgagagaact taatagc 2247 <210> 4 <211> 1359 <212> DNA <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 4 atgagtttac caaaaggatt tctgtggggt gctgcaactg catcatatca gattgagggt 60 gcttggaatg aagatggaaa aggtgaatct atatgggaca ggtttacaca tcaaaaagga 120 aatattttat atggtcataa tggcgacgtt gcctgtgacc actatcatag gttcgaagaa 180 gatgtctctc ttatgaaaga acttggacta aaagcctaca ggttttctat tgcatgggcg 240 agaatttttc cagatggttt cggtactgtg aatcaaaaag gtcttgagtt ttatgataga 300 ctcatcaaca agcttgttga aaacggtatt gaaccggttg tcaccattta tcactgggat 360 cttcctcaaa agctacaaga cattggcggt tgggcaaacc cagaaattgt aaattattat 420 tttgaatatg caatgcttat cgtaaaccgt tataaagaca aagtaaaaaa atggataaca 480 tttaatgaac cttattgtat tgcctttttg ggacactttt atggagttca tgcaccagga 540 ataaaagact ttaaagttgc aatggatgtt gtgcacaaca ttatgctttc tcattttaag 600 gttgtaaaag ctgtaaagga aaacaatatt gatgttgagg taggaattac actaaattta 660 actccagttt actttcaaac agagcgtctt ggatataagg taagcgaaat tgaaagagaa 720 atggtaaacc tcagcagcca gcttgacaat gaacttttcc ttgatccagt actcaaagga 780 agctatccac aaaagctgtt tgattacctt gttcaaaaag atttgttgga aactcaaaaa 840 gtattgagta tgcagcagga agtaaaagaa aatttcgttt ttcctgattt tcttggtatc 900 cactus agatgggaac atcctgcagg agagtacacc gagatgggct gggaagtgtt cccacaagga 1020 ctttatgatc ttttgatttg gattaaagaa agttacccac aaattccaat ttatataaca 1080 gaaaacggtg ctgcttataa cgacaaggta gaagatggaa gagttcatga ccaaaagaga 1140 gtggagtatt taaaacagca ctttgaagca gcaagaaagg caattgaaaa tggagtggat 1200 ttgcgaggtt attttgtgtg gtctttgttg gacaatcttg aatgggcaat gggttataca 1260 aaaaggtttg gagttatata tgtggactat gaaacccaaa aaaggattaa aaaagacagc 1320 ttctattttt atcagcagta tataaaggaa aactcataa 1359

Claims

? -Glycosidase derived from Dictyoglomus turgidum (Dt ) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; And
A composition for preparing an uglycon protopanaxadiol comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which comprises? -Glycosidase derived from Caldicellulosiruptor bescii (Cb )
The concentrations of the Dt- derived? -Glycosidase and the Cb- derived? -Glycosidase are 8.00 to 12.00 mg / ml and 0.01 to 0.05 mg / ml, respectively,
Wherein the composition is treated to a substrate containing protopanaxadiol saponin at a concentration of 2.0-5.0 mg / ml to degrade both glucose and arabinose present in the protopanaxadiol saponin. Composition for the manufacture of cone protopanaxadiol.

The method according to claim 1,
The Dt- derived? -Glycosidase and Cb (W / v: w / v) to 200: 1 (w / v: w / v)
Compositions for the manufacture of uglycon protopanaxadiol.

delete

The method according to claim 1,
Wherein the protopanaxadiol-based saponin is selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K More than one
Compositions for the manufacture of uglycon protopanaxadiol.

delete

A gene encoding Dictyoglomus turgidum (Dt ) -derived? -Glycosidase consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3; And
A composition for preparing an uglycon protopanaxadiol comprising a gene encoding a β-glycosidase derived from Caldicellulosiruptor bescii (Cb ) comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4,
The concentrations of the Dt- derived? -Glycosidase and the Cb- derived? -Glycosidase are 8.00 to 12.00 mg / ml and 0.01 to 0.05 mg / ml, respectively,
Wherein the composition is treated to a substrate containing protopanaxadiol saponin at a concentration of 2.0-5.0 mg / ml to degrade both glucose and arabinose present in the protopanaxadiol saponin. Composition for the manufacture of cone protopanaxadiol.

Treating the composition according to claim 1 or 6 with a substrate comprising protopanaxadiol-based saponin at a concentration of from 2.0 to 5.0 mg / ml
Manufacturing method of uglycon protopanaxadiol.

8. The method of claim 7,
Wherein the protopanaxadiol-based saponin is selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd, ginsenoside compound Y, ginsenoside compound Mc and ginsenoside compound K More than one
Manufacturing method of uglycon protopanaxadiol.

delete

8. The method of claim 7,
The treatment is carried out at pH 4.5 to 7.0 and 70 to 100 ° C for 1 hour or more
Manufacturing method of uglycon protopanaxadiol.