KR101433660B1

KR101433660B1 - Production of ginsenoside Rg3, Rh1 and Rg2 using novel ginsenoside glycosidase

Info

Publication number: KR101433660B1
Application number: KR1020120074221A
Authority: KR
Inventors: 임완택; 김진광; 최창호; 류청매; 김선창
Original assignee: 한국과학기술원; 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2014-08-26
Also published as: KR20140006683A

Abstract

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 전환시켜서 가용성 마이너 사포닌을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 또는 PPT 타입의 사포닌의 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다. The present invention relates to a novel ginsenoside glycosidase protein, a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the protein, or a PPD type or PPT type using the culture of the transformant The present invention relates to a method for producing soluble minor saponins by converting saponins of Flavobacterium johnsoniae . More particularly, the present invention relates to a novel ginsenoside glycosidase protein derived from Flavobacterium johnsoniae , Or a composition for the conversion of saponin of PPD or PPT type into soluble saponin in a form of easy absorption, a novel ginsenoside glycosidase protein, A vector comprising the nucleic acid, and a transformant into which the vector is introduced.

Description

Production of ginsenosides Rg3, Rh1 and Rg2 using novel ginsenoside glycosidase using novel ginsenoside glycosidase [

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 전환시켜서 가용성 마이너 사포닌을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 또는 PPT 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel ginsenoside glycosidase protein, a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the protein, or a PPD type or PPT type using the culture of the transformant The present invention relates to a method for producing soluble minor saponins by converting saponins of Flavobacterium johnsoniae . More particularly, the present invention relates to a novel ginsenoside glycosidase protein derived from Flavobacterium johnsoniae , Or a composition for converting the saponin of the PPD or PPT type into soluble saponin in a form that is easily absorbable in the body, a novel ginsenoside glycosidase protein, A nucleic acid to be encoded, a vector containing the nucleic acid, and a transformant into which the vector is introduced The.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다. Saponin means a substance in which a non-sugar moiety is composed of a plurality of ring compounds in a glycoside widely present in the plant system. Since triterpene saponin, which is a saponin component contained in ginseng or red ginseng as a major physiologically active ingredient, has a chemical structure different from that of saponin found in other plants, in order to distinguish saponin from other plant saponins, ginseng ) Glycoside is called ginsenoside.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), Rg3(S), 화합물 Y(Compound Y), 화합물Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2 및 화합물 K(Compound K, C-K)가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.The ginsenosides are classified as protopanaxadiol-type (PPD type) ginsenoside, protopanaxatriol-type (PPT type) ginsenoside, and oleanolin acid type based on the structure of aglycone (Oleanolic acid type) and ginsenosides. These three groups are again composed of sugar moieties (aglycones) attached by glycosidic bonds at the 3-carbon, 6-carbon and 20-carbon positions of the ring of the compound structure Location and number. The basic skeleton of the oleanolic acid-based ginsenosides is 5-ring, which is the only ginsenoside Ro, and the aglycon is oleanolic acid. At present, more than 40 ginsenosides have been isolated, most of which are PPD-type ginsenosides. Rx, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2, Gypenoside XVII, Compound O, Compound Mc1, Compound Y, Compound Mc, Rg3, Rh2 and Compound K (Compound K, CK). The ginsenosides of the PPT type include Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1, and the like.

또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 1,000 달톤 부근의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮다. 따라서 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해서 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 마이너 진세노사이드로 전환시키는 과정이 필요하다. 즉, 메이저 진세노사이드는 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다. 메이저 진세노사이드에는 Rg1, Re, Rb1, Rb2 및 Rc 등이 포함되며, 미량으로 존재하는 생체 내 가용성인 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)에는 Rg3(S), Rg3, Rg2(S), Rh1(S), Rh2, Rh2(S), 지페노사이드(gypenoside, Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, C-K, O, Mc, Mc1(compound K, C-K, 0, Mc, Mc1)등이 포함된다.
In addition, it occupies more than 90% of the ginsenosides in the ginseng, which is major ginsenoside, but it has a very low absorption rate in vivo due to its large size near 1,000 daltons. Therefore, in order to increase the efficacy of ginsenoside, it is necessary to convert major ginsenosides into minor ginsenosides that are relatively well absorbed and have better efficacy. That is, major ginsenosides require a conversion process to deglycosylate glucose, arabinose, rhamnose, xylose, and the like, which constitute the sugar in order to effectively exhibit physiological activity in vivo . Major gensenosides include Rg1, Re, Rb1, Rb2, and Rc, and minor amounts of Rg3 (S), Rg3, Rg2 (S) Rh 1 (S), Rh 2, Rh 2 (S), gypenoside (Gyp) XVII, ziphenoside LXXV and compounds K, CK, O, Mc, Mc1 .

인삼에 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 Rg3는 항암활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 진세노사이드 Rg3는 폐 전이(lung metastasis)를 억제하며, 상기와 같은 전이 억제는 종양에 의해 유도되는 혈관신생(angiogensis)의 억제뿐만 아니라, 암세포의 침윤 및 부착(adhesion)을 억제하는 것과 관련되어 있다. 또한, 진세노사이드 Rg3는 염증 등에 관여하는 전사인자인 NF-kB 및 AP-1 전사인자를 하향조절(down-regulation)하여, 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 기작 외에도 Rg3는 세포내 칼슘 수준을 감소키는 것으로 알려져 있으며, 대장암에서는 세포예정사(apoptosis)를 유발하며, 전립선암에서는 암세포의 증식을 억제하며(Kim et al., 2004), 난소암에서는 단독 또는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 병용사용하였을 때 암세포의 증식 및 혈관신생을 억제하는 것을 보인바 있다(Xu et al., 2007). 진세노사이드 Rg3는 상기와 같은 항암 효과 뿐만 아니라, AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호전달 경로 및 PPAR-γ 억제를 통하여 항 비만 효과를 가지고 있음이 알려진바 있다(Hwang et al., 2009). 이러한 이유로 Rg3는 암 및 비만 등을 포함하는 다양한 질병에서 약학적 활성 성분으로서 많은 주목을 받아 오고 있다.Ginsenoside Rg3, a minor ginsenoside present in ginseng in a minor amount, is known to have anticancer activity. The ginsenoside Rg3 inhibits lung metastasis and the inhibition of such metastasis is associated with inhibition of tumor-induced angiogensis as well as suppression of invasion and adhesion of cancer cells . In addition, ginsenoside Rg3 is known to exhibit anticancer effects by down-regulating NF-kB and AP-1 transcription factors involved in inflammation and the like. In addition to the above mechanisms, Rg3 is known to decrease intracellular calcium levels, and it induces apoptosis in colon cancer, inhibits the proliferation of cancer cells in prostate cancer (Kim et al., 2004) In ovarian cancer, it has been shown to inhibit proliferation and angiogenesis of cancer cells when used alone or in combination with cyclophosphamide (Xu et al., 2007). It has been known that ginsenoside Rg3 has an anti-obesity effect through the AMPK (AMP-activated protein kinase) signaling pathway and PPAR-γ inhibition as well as the anticancer effects described above (Hwang et al., 2009). For this reason, Rg3 has received much attention as a pharmaceutically active ingredient in various diseases including cancer and obesity.

다만, 상기 Rg3는 고려인삼(Panax ginseng C.A. Mayer)에 존재하고 있으나, 그 양이 매우 적어, 대량생산을 할 수 있는 방법이 요구되어 왔다. Rg3를 인삼으로부터 얻는 방법에는 산열 복합처리가 있으며 이의 대표적인 예가 바로 한국의 홍삼화 방법이다. 또 다른 방법은 균주나 효소를 이용하여 선택적으로 Rg3(S)를 얻는 방법이다. 홍삼화는 인삼의 보존과 효과 증진을 이루기 위해 특히 한국에서 수백 년 전부터 발달된 방법으로, 홍삼화 과정은 85 내지 100℃에서 18시간 동안 열처리를 한다. 이 과정을 통하여 인삼에 존재하는 메이저 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1)의 20번 탄소의 탈글리코실화(deglycosylation)를 야기시켜서 진세노사이드의 활성이 증진시킬 수 있다. 이러한 홍삼화 과정은 Rg3와 같은 마이너 진세노사이드의 함량을 증가시킬 수 있지만, 선택적인 streoisomer 타입의 Rg3를 생산할 수 없는 단점을 지닌다. 즉, Rg3(S) 폼만이 아니라 항상 Rg3(R)이 동시에 생기게 된다. 또한, PPD type의 메이저 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rb3, Rd를 약산성 조건에서 열처리를 하면 쉽게 20번 탄소의 탈글리코실화(deglycosylation)를 야기시켜 Rg3을 만들 수 있지만, 이는 20번 탄소의 탈수화 형태(dehydration form)의 Rk1, Rg5이라는 부산물을 생성하므로, Rg3의 함량은 낮게 되는 단점을 지닌다. However, although Rg3 is present in Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Mayer), the amount thereof is very small, and a method for mass production has been required. Rg3 is obtained from ginseng, and there is a combination treatment of acid and heat. A representative example of this is Korean red ginseng. Another method is to obtain Rg3 (S) selectively using a strain or an enzyme. Red ginseng is developed in Korea for several hundred years to achieve the preservation and enhancement of ginseng. The red ginseng process is heat treated at 85 ~ 100 ℃ for 18 hours. Through this process, deglycosylation of the 20th carbon of the major ginsenosides (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1) present in ginseng can be induced and the activity of ginsenosides can be enhanced . This red ginseng process can increase the content of minor ginsenosides such as Rg3, but it has a disadvantage that it can not produce selective streoisomeric Rg3. That is, not only the Rg3 (S) form, but also Rg3 (R) always occurs at the same time. Further, when the major ginsenosides Rb1, Rb2, Rb3, and Rd of the PPD type are heat-treated under slightly acidic conditions, deglycosylation of the 20th carbon is easily caused to cause Rg3, Rg1 and Rg5 of the dehydration form, and thus the content of Rg3 is low.

진세노사이드 Rh1은 항 알러지 및 항 염증 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 진세노사이드 Rh1은 기억력 증진 효과 및 암에서 항 전이활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 에스트로겐 수용체를 활성화시키므로, 이러한 점에서 진세노사이드 Rh1은 암을 비롯한 여러 질병 등에서 신규한 치료 물질로 여겨지고 있다(Lee et al., 2003; Park et al., 2004; Wang et al., 2009; Yoon et al., 2012).Ginsenoside Rh1 is known to have anti-allergic and anti-inflammatory activity. In addition, since ginsenoside Rh1 not only has a memory enhancing effect and an antitumor activity in cancer but also activates estrogen receptor, ginsenoside Rh1 is considered to be a novel therapeutic substance in various diseases including cancer ( Park et al., 2004; Wang et al., 2009; Yoon et al., 2012).

진세노사이드 Rg2는 AMPK(AMP-activated protein kinase)에 의한 GSK-3-β(Glycogen synthase kinase-3-β)의 인산화를 통하여 간에서 글루코스 생산을 억제시키므로, 제2형 당뇨병에 대한 치료 효과를 가지고 있는 것으로 여겨진다(Yuan et al., Chem Biol Interact. 2012 5;195(1):35-42). 아울러, 상기 진세노사이드 Rh1과 Rg2는 밴드 3 단백질의 SH기의 산화를 억제함으로써 적혈구의 유동학적 기능(rheological function)을 보호하는 것으로 알려져 있다(Yoon et al., 2012). 이러한 점에서 상기 진세노사이드 Rh1 및 Rg2는 암, 염증성 신경 질환 및 당뇨병과 같은 여러 질병에서 치료 효능을 제공할 것이라 주목받고 있다.
Ginsenoside Rg2 inhibits glucose production in the liver through phosphorylation of GSK-3-β (Glycogen synthase kinase-3-β) by AMP-activated protein kinase (AMPK) (Yuan et al., Chem. Biol. Interact. 2012 5; 195 (1): 35-42). In addition, the ginsenosides Rh1 and Rg2 are known to protect the rheological function of erythrocytes by inhibiting the oxidation of the SH group of the band 3 protein (Yoon et al., 2012). In this respect, it has been noted that the ginsenosides Rh1 and Rg2 will provide therapeutic efficacy in various diseases such as cancer, inflammatory neurological diseases and diabetes.

미량으로 존재하는 상기와 같은 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법, 효소적 방법 및 배당체 합성을 이용한 방법 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있었다. Methods for producing such minor ginsenosides, which are present in trace amounts, have been proposed, such as chemical decomposition methods, enzymatic methods, and synthesis methods using glycosides. However, the above-mentioned methods 1) 2) the desired components are lost during the production process, 3) the use of a catalyst unsuitable for edible purposes, or 4) the yield is low and there is still a limit to mass production.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)가 있으며, 이와 같은 효소를 이용한 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었다. 그러나 이들 역시 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.Among enzymatic methods, enzymes which can be used include β-glucosidase, α-L-arabinopyranosidase, α-L-arabinofuranosin L-arabinofuranosidase and? -L-rhamnosidase. There have been many studies on the biotransformation of major ginsenosides using such enzymes. However, these are also ineffective as a mass production method, and there is a problem that a large cost is incurred.

뿐만 아니라, β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 아스로박터 클로로페노리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인된 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다. 즉, 상기 효소들은 그 유래 등에 따라 기질 및 최종 산물에 차이가 있다. L-arabinofuranosidase,? -L-arabinofuranosidase,? -Glucosidase,? -L-arabinopyranosidase, Although belonging to? -L-rhamnosidase, all of them do not have the activity to convert major jinenoside into minor jinenoside. For example, beta-glucosidase, which is known to be derived from Arthrobacter chlorophenolicus A6, has been found to lack the biosynthesizing activity of ginsenosides. In addition, existing known enzymes, such as beta-glycosidase A, an enzyme known to have the ability to convert to Rb1, have little activity even when biosynthesizing activity of ginsenosides is present. That is, the enzymes differ in the substrate and the end product depending on the origin and the like.

또한, 한국등록특허 제10-0329259호는 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입 또는 PPT 타입 진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 Rh2 또는 Rh1를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rg3(S)를 진세노사이드 Rh2로 전환시킨다. 또한, 베타-람노시다제를 이용하여 진세노사이드 Rg2로부터 Rh1을 제조할 수도 있다. 그러나 상기 특허의 실시예 3에 기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야하는 단점이 있다. 따라서, 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실될 수 있다는 단점이 있다.
Korean Patent No. 10-0329259 also discloses a method for producing ginsenoside Rh2 or Rh1 by digesting the saponin pulling group of PPD type or PPT type ginsenoside with saponin alpha-glucosidase. Said saponin alpha-glucosidase of the present invention converts ginsenoside Rg3 (S) to ginsenoside Rh2. Rh1 can also be prepared from ginsenoside Rg2 using beta-lambsocidase. However, as described in Example 3 of the above patent, the saponin alpha-glucosidase has disadvantages in that germ bacteria is added to a culture medium containing a pulse and ginseng powder, and cultured to remove the cells. Therefore, it shows a low yield, which is not effective as a mass production method, has a high production cost, and can disadvantageously lose desired components during the production process.

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 플라보박테리엄 존소니에 KACC 11414^T 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드에서 마이너 진세노사이드로의 생전환 활성을 가지는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득하고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 진세노사이드 글리코시다제가 메이저 진세노사이드인 Rb1을 진세노사이드 Rd를 거쳐 진세노사이드 Rg3(S)로, 진세노사이드 Rg1을 진세노사이드 Rh1(S)으로, 진세노사이드 Re를 진세노사이드 Rg2(S)로 전환할 수 있음을 확인하여, 마이너 진세노사이드인 Rg3, Rh1 및 Rg2를 대량생산할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop a method for easily obtaining a minor form of rare ginsenoside present in a trace amount in a plant such as ginseng in a high yield at a high yield. As a result, To obtain a ginsenoside glycosidase gene having a biotransformation activity from a major form of ginsenoside to a minor ginsenoside from a KACC 11414 ^T strain and to obtain a ginsenoside glycosidase gene encoded by the gene The major ginsenoside Rb1 is converted to ginsenoside Rg3 (S) via ginsenoside Rd, ginsenoside Rg1 to ginsenoside Rh1 (S), ginsenoside Re to ginsenoside Rg2 (S) The present inventors completed the present invention by developing a method capable of mass production of the minor ginsenosides Rg3, Rh1 and Rg2.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입 또는 PPT(protopanaxatriol) 타입의 사포닌을 전환시켜서 가용성인 마이너 사포닌을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a novel ginsenoside glycosidase protein, a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the protein, or a PPD (protopanaxadiol) type or PPT (protopanaxatriol) type saponin to convert the saponin into a soluble saponin.

본 발명의 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD(protopanaxadiol) 타입 또는 PPT(protopanaxatriol) 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 마이너 사포닌으로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a novel ginsenoside glycosidase protein, a transformant into which a vector containing a nucleic acid encoding the protein is introduced, or a culture of the transformant as an active ingredient A saponin of PPD (protopanaxadiol) type or PPT (protopanaxatriol) type, which is easy to be absorbed into the body.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a novel ginsenoside glycosidase protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a nucleic acid encoding the protein, a vector comprising the nucleic acid, and a transformant into which the vector is introduced.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입 또는 PPT(protopanaxatriol) 타입의 사포닌을 전환시켜서 가용성인 마이너 사포닌을 제조하는 방법을 제공한다.
In one aspect of the present invention, the present invention provides a novel ginsenoside glycosidase protein, a vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the protein, (PPD) type or PPT (protopanaxatriol) type saponin using a culture of a spermatogonial sieve to produce soluble minor saponins.

본 발명에서 용어, "PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌"은 담마란(dammarane)계 사포닌으로, 비 당부분(aglycone)에 붙어있는 수산기(-OH)의 숫자가 2개인 진세노사이드를 의미하며, 이의 예로 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Ra3, Rg3, Rh2, Rs1, C-O, C-Y, C-Mc1, C-Mc, F2, C-K, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 지페노사이드 LXXV(Gypenoside LXXV) 또는 Rs2가 있다. 본 발명의 목적상 PPD 타입의 사포닌은 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 Rg3로 전환될 수 있는 사포닌을 모두 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 대표적으로 Rb1, Rd 또는 Rc가 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 진세노사이드 Rg3(S)로 전환될 수 있음을 확인하였다. 상기 PPD 타입의 사포닌은 바람직하게는 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 Rc이나, 이에 제한되지 않는다.
The term "saponin of PPD (protopanaxadiol)" in the present invention means a saponin of dammarane type and means a ginsenoside having two hydroxyl groups (-OH) attached to an aglycone, Examples thereof include Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Ra3, Rg3, Rh2, Rs1, CO, CY, C-Mc1, C-Mc, F2, CK, Gypenoside XVII, Gypenoside LXXV) or Rs2. For the purposes of the present invention, the saponin of the PPD type includes all saponins which can be converted into ginsenoside Rg3 by the action of the ginsenoside glycosidase. In the examples of the present invention, it has been confirmed that Rb1, Rd or Rc can be converted into ginsenoside Rg3 (S) by the activity of the ginsenoside glycosidase of the present invention. Said PPD type saponins are preferably, but not limited to, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rd or ginsenoside Rc.

본 발명에서 용어, "PPT(protopanaxatriol) 타입의 사포닌"은 담마란계 사포닌으로, 비 당부분에 붙어있는 수산기가 3개인 진세노사이드를 의미하며, 이의 예로 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rf, 진세노사이드 F1, 진세노사이드 Rg2, PPT(protopanaxatriol) 또는 진세노사이드 Rh1이 있다. 본 발명의 목적상 상기 PPT 타입의 사포닌은 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 Rg2 또는 Rh1으로 전환될 수 있는 사포닌을 모두 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 대표적으로 Re 및 Rg1이 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 각각 Rg2(S) 및 Rh1(S)으로 전환될 수 있음을 확인하였다. 상기 PPT 타입의 사포닌은 바람직하게는 Re 또는 Rg1이나, 이에 제한되지 않는다. The term "saponin of PPT (protopanaxatriol) type" in the present invention means saponin of fumaranese type and refers to ginsenoside having three hydroxyl groups attached to the non-sugar moiety. Examples thereof include ginsenoside Re, ginsenoside Rg1, Ginsenoside Rf, ginsenoside F1, ginsenoside Rg2, PPT (protopanaxatriol) or ginsenoside Rh1. For the purpose of the present invention, the PPT type saponin includes all saponins which can be converted into ginsenoside Rg2 or Rh1 by the action of the ginsenoside glycosidase. In the examples of the present invention, it has been confirmed that Re and Rg1 can be converted into Rg2 (S) and Rh1 (S) respectively by the activity of the ginsenoside glycosidase of the present invention. Said saponin of PPT type is preferably Re or Rg1 but is not limited thereto.

상기 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌은 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드들을 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 화기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 PPD 타입 또는 PPT타입의 사포닌의 구조를 도 1에 나타내었다.Said PPD type or PPT type saponin may be separated and purified saponin, or ginsenosides contained in powder or extract of ginseng or red ginseng may be used. That is, the method of the present invention may be carried out by using powder or extract of ginseng or red ginseng containing saponin as a direct starting material. As the ginseng to be used in the present invention, various known ginsengs can be used, and ginseng such as ginseng (Panax ginseng), P. quiquefolius, P. notoginseng, P. japonicus, trifolium, P. pseudoginseng, and P. vietnamensis. The structure of the PPD type or PPT type saponin is shown in Fig.

본 발명에서 용어, "가용성인 마이너 사포닌"은 체내 흡수가 어려운 메이저(major) 형태의 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌의 20번째 탄소에 있는 글루코스가 순차적으로 가수분해되어 생성된, 상대적으로 체내 흡수가 용이한 마이너(minor) 형태의 사포닌을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메이저 형태의 PPD 타입 사포닌은 Rb1, Rc 또는 Rd을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 메이저 형태의 PPT 타입 사포닌은 Re, Rg1 또는 Rf을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 가용성 사포닌은 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rh2, 진세노사이드 F1, C-O, C-Mc1 또는 PPT를 포함하며, 바람직하게는 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rg2 또는 진세노사이드 Rh1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "soluble minor saponin" refers to a saponin of the major type PPD type or saponin of the PPT type, which is difficult to be absorbed by the body, is relatively hydrolyzed, Easy refers to saponin in a minor form, but is not limited thereto. The major type of PPD type saponin includes, but is not limited to, Rb1, Rc or Rd. In addition, the major type PPT type saponin includes, but is not limited to, Re, Rg1 or Rf. Further, the soluble saponin includes ginsenoside Rd, ginsenoside Rg3, ginsenoside Rg2, ginsenoside Rh1, ginsenoside Rh2, ginsenoside F1, CO, C-Mc1 or PPT, But are not limited to, ginsenoside Rd, ginsenoside Rg3, ginsenoside Rg2 or ginsenoside Rh1.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rg3"는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 두 개의 글루코스(Glc→Glc)가 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rb1, Rd 및 Rc 등에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 진세노사이드 Rg3는 Rg3(S) 및 Rg3(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rg3(S)이나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "ginsenoside Rg3" means a minor ginsenoside in which two glucose (Glc → Glc) are bonded to carbon number 3 in the basic carbon skeleton of saponin of PPD type. Rb1 , Rd and Rc, etc., which are easily absorbed into the body. The ginsenoside Rg3 includes both Rg3 (S) and Rg3 (R), preferably Rg3 (S), but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rg2"는 PPT 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 6번 탄소에 람노피라노실기가 연결된 글루코스(Glc(2→1)Rha)가 존재하는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Re에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 의미한다. 상기 진세노사이드 Rg2는 Rg2(S) 및 Rg2(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rg2(S)이나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the term "ginsenoside Rg2" refers to the minor carbon of the form in which glucose (Glc (2 → 1) Rha) exists in the basic carbon skeleton of saponin of the PPT type and the rhamnopyranosyl group is linked to the 6th carbon Means senoside, and means ginsenoside in which saccharide is removed as compared with Re to facilitate absorption into the body. The ginsenoside Rg2 includes both Rg2 (S) and Rg2 (R), preferably Rg2 (S), but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rh1"은 PPT 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 6번 탄소에 글루코스가 존재하는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rg1에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 의미한다. 상기 진세노사이드 Rh1은 Rh1(S) 및 Rh1(R)을 모두 포함하며, 바람직하게는 Rh1(S)이나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "ginsenoside Rh1" refers to a minor ginsenoside in the form of a glucose at the 6th carbon in the basic carbon skeleton of PPT type saponin. &Lt; / RTI > refers to an easy form of ginsenoside. The ginsenoside Rh1 includes both Rh1 (S) and Rh1 (R), preferably Rh1 (S), but is not limited thereto.

상기 진세노사이드 Rg3는 항암, 항산화 효과를 가지므로, 암과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이며, Rg2 및 Rh1는 항 알러지, 항 염증 활성을 지녀 염증성 질환 등에 사용될 수 있는 유용성을 지닌다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 진세노사이드 Rg3, Rg2 및 Rh1은 인삼에 미량으로 존재하므로 대량생산할 필요가 있으며, 이때 진세노사이드 Rg3, Rg2 및 Rh1, 특히 Rg3(S), Rg2(S) 및 Rh1(S)로 전환시킬 수 있는 적절한 효소를 규명해야한다. 다만, 같은 글리코시다제에 속하는 효소라 하더라도 그 효소 활성이 글루코시다제, 셀룰라제와 같이 다양한 효소 활성을 나타낼 수 있으므로, 진세노사이드 Rg3, Rg2 및 Rh1으로 전환시키는 활성을 지닌 적절한 효소를 규명해야할 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 이와 같은 활성을 갖는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 동정하여 그 기능을 확인하였다. Since ginsenoside Rg3 has anticancer and antioxidative effects, it can be used for the treatment of diseases such as cancer. Rg2 and Rh1 have antiallergic and anti-inflammatory activity and are useful for inflammatory diseases and the like . Despite this usefulness, ginsenosides Rg3, Rg2 and Rh1 are present in trace amounts in ginseng and therefore need to be produced in large quantities. The ginsenosides Rg3, Rg2 and Rh1, in particular Rg3 (S), Rg2 (S) and Rh1 (S). However, even the enzymes belonging to the same glycosidase may exhibit various enzyme activities such as glucosidase and cellulase, so that it is necessary to identify suitable enzymes having activity to convert ginsenosides Rg3, Rg2 and Rh1 There is a need. Accordingly, the present inventors isolated and identified a novel ginsenoside glycosidase having such activity, and confirmed its function.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 글리코시다제(Ginesenoside glycosidase)"는 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미한다. 진세노사이드 글리코시다제의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 본 발명의 목적상 PPD 타입의 인삼 사포닌을 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 Rg3로, PPT 타입의 사포닌을 전환시켜서 Rh1 또는 Rg2로의 전환활성을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 의미할 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 상기 진세노사이드 글리코시다제를 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.In the present invention, the term "Ginesenoside glycosidase" refers to a degrading enzyme that hydrolyzes the glucosidic linkage of the polysaccharide above the disaccharide. The degree and function of the activity of ginsenoside glycosidase varies by enzyme type. For the purpose of the present invention, if the PPD type ginseng saponin is converted into ginsenoside Rd or ginsenoside Rg3 and the PPT type saponin is converted to Rh1 or Rg2, the kind thereof is not particularly limited, May refer to a ginsenoside glycosidase protein defined by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The ginsenoside glycosidase preferably has an amino acid sequence having not less than 70%, preferably not less than 80%, more preferably not less than 90%, more preferably not less than 90% , Preferably at least 95%, and most preferably at least 98%, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Also, as the sequence having such similarity, a protein variant having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted or added is also an amino acid sequence having the same or corresponding biological activity as that of the ginsenoside glycosidase, It is self-evident that it is included in the range.

상기 유사성이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.The similarity is intended to indicate a similar degree to the amino acid sequence of a wild-type protein or a nucleic acid sequence encoding the wild-type protein, and includes a sequence having the same sequence as the amino acid sequence or the nucleic acid sequence of the present invention, . Comparison of these similarities can be performed using a visual program or a comparison program that is easy to purchase.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414^T에서 유래한 효소로서, 이는 본원발명에서 Bgl BX10과 혼용될 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성을 가져, 두 개의 글루코스 또는 글루코스가 치환된 분자를 연결하는 β1→2, β1→4, β1→6 결합을 분해할 수 있어, 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rg2로 전환시킬 수 있다. 다만, 베타-글루코시다제 활성을 가지는 효소라고 하여도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환할 수 있는 활성을 가지고 있는 것은 아니며, 진세노사이드의 특정 탄소에 위치한 어떠한 당기를 자르는 활성을 지니는지 여부는 규명되어야 한다. 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 메이저 진세노사이드의 20번 탄소 당기를 선택적으로 잘라 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rg2로 전환시키는 용도는 알려진바 없다. 또한, 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 타입 및 PPT 타입의 진세노사이드를 모두 기질로 하여 생전환시킬 수 있는 활성을 가지므로 Rg3, Rh1 또는 Rg2와 같은 마이너 진세노사이드의 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제는 Rb1 또는 Rd를 Rg3(S)로 선택적으로 전환시키며, Re를 Rg2(S)로, Rg1을 Rh1(S)로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌다.The ginsenoside glycosidase is an enzyme derived from Flavobacterium johnsoniae KACC 11414 ^T , which can be used in combination with Bgl BX10 in the present invention. The ginsenoside glycosidase has beta-glucosidase activity and is capable of decomposing β1 → 2, β1 → 4, β1 → 6 linking two glucose or glucose-substituted molecules , And major gensenosides can be converted to minor ginsenoside ginsenoside Rg3, Rh1 or Rg2. However, even an enzyme having a beta-glucosidase activity does not have an activity to convert major ginsenosides to minor ginsenosides, Whether or not it is genie should be clarified. There is no known use of the ginsenoside glycosidase of the present invention to convert the 20 carbon-carbon moiety of the major ginsenoside selectively to the ginsenosides Rg3, Rh1 or Rg2, which are selectively cut-and-mined. In addition, since the ginsenoside glycosidase of the present invention has an activity of biosynthesizing both PPD type and PPT type ginsenosides as substrates, it is possible to produce minor ginsenosides such as Rg3, Rh1 or Rg2 Can be usefully used. In addition, the ginsenoside glycosidase of the present invention selectively activates Rb1 or Rd to Rg3 (S) and has an activity to convert Re to Rg2 (S) and Rg1 to Rh1 (S).

상기 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소의 바깥쪽 및 안쪽 글루코스에 대한 선택적 가수분해능을 가진다. 따라서 본 발명의 상기 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 진세노사이드 Rg3를 제조하는 방법은 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 선택적 가수분해하여 진세노사이드 Rg3를 제조하는 방법이라면 제한없이 포함될 수 있다. 대표적으로 본 발명의 일 실시예에서는 진세노사이드 Rb1을 진세노사이드 Rd로 전환, 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 Rg3(S)로 전환하여 진세노사이드 Rg3(S)를 제조하는 것을 확인하여 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 진세노사이드 Rg3(S)를 제조할 수 있음을 확인하였다. The ginsenoside glycosidase has the selective hydrolysis ability to the outside of the 20 carbon of the PPD type saponin and the inner glucose. Therefore, the method of producing ginsenoside Rg3 using the ginsenoside glycosidase of the present invention is not limited to the method of producing ginsenoside Rg3 by selectively hydrolyzing glucose located at the 20th carbon of the PPD type saponin . For example, in one embodiment of the present invention, it has been confirmed that ginsenoside Rb1 is converted to ginsenoside Rd and ginsenoside Rd is converted to ginsenoside Rg3 (S) to produce ginsenoside Rg3 (S) It was confirmed that the inventive ginsenoside Rg3 (S) can be produced by selective hydrolysis of the 20th carbon of glucose of PPD type saponin with the ginsenoside Glycosidase.

구체적으로, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb1의 경우, 진세노사이드 Rb1의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 두 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety) 중 바깥쪽 글루코스(outer glucose)를 먼저 가수분해하여, 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있으며, 진세노사이드 Rd의 20번 탄소의 한 개의 글루코스 모이어티 글루코스를 가수분해하여, 진세노사이드 Rg3, 특히 Rg3(S)로 전환시킬 수 있다. Specifically, the ginsenoside glycosidase has a selective hydrolysis ability to the 20-carbon of ginsenoside Rb1 in the case of ginsenoside Rb1, so that the out of the two glucose moieties located at the 20-carbon The outer glucose can first be hydrolyzed to convert to ginsenoside Rd and one glucose moiety of the 20 carbon of ginsenoside Rd is hydrolyzed to give ginsenoside Rg3, ). &Lt; / RTI >

또한, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 PPT 타입의 사포닌의 20번 탄소에 위치한 글루코스에 대한 선택적 가수분해능을 가진다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 진세노사이드 Re의 경우, 진세노사이드 Re의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여 진세노사이드 Rg2, 특히 Rg2(S)로 전환시킬 수 있다. 더불어 진세노사이드 Rg1의 경우, Rg1의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 한 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety)를 가수분해하여 진세노사이드 Rh1, 특히 Rh1(S)로 전환시킬 수 있다. In addition, the ginsenoside glycosidase has selective hydrolysis ability to glucose located at 20 carbon of the PPT type saponin. In the case of ginsenoside Re, the ginsenoside glycosidase has a selective hydrolysis ability to the 20th carbon of ginsenoside Re, hydrolyzing one glucose moiety located at the 20th carbon, Side Rg2, especially Rg2 (S). In addition, in the case of ginsenoside Rg1, the hydrolysis of one glucose moiety located at the 20th carbon atom has selective hydrolysis of Rg1 to the 20th carbon to convert it into ginsenoside Rh1, particularly Rh1 (S) .

따라서 본 발명의 진세노사이드 Rg3를 제조하는 방법은 바람직하게는 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd로의 전환 과정, 진세노사이드 Rd로부터 Rg3로의 전환 과정을 포함하며, 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법은 바람직하게는 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg2로의 전환 과정을 포함하며, 진세노사이드 Rh1를 제조하는 방법은 진세노사이드 Rg1으로부터 진세노사이드 Rh1으로의 전환과정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 진세노사이드 글리코시다제의 전환 활성을 도 4에 나타내었다.
Therefore, the process for preparing ginsenoside Rg3 of the present invention preferably comprises a process for converting ginsenoside Rb1 to ginsenoside Rd, a process for converting ginsenoside Rd to Rg3, and a method for producing ginsenoside Rg2 Preferably comprises the conversion of ginsenoside Re to ginsenoside Rg2, and the method of preparing ginsenoside Rh1 includes, but is not limited to, the conversion of ginsenoside Rg1 to ginsenoside Rh1 . The conversion activity of such ginsenoside glycosidase is shown in Fig.

본 발명의 진세노사이드 Rg3를 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물과 PPD 타입의 사포닌을 반응시키는 단계에, α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The method for producing ginsenoside Rg3 of the present invention is a method for producing the ginsenoside Rg3, which comprises transforming a vector containing the ginsenoside glycosidase protein, a nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant with a PPD type The step of reacting saponin may include the steps of reacting a transformant into which a vector containing an alpha -L-arabinofuranosidase protein or a nucleic acid encoding the protein is introduced, Lt; RTI ID = 0.0 > culture. &Lt; / RTI >

본 발명에서 용어, "α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질"은 α-1,6 아라비노퓨라노실(arabinofuranosyl) 잔기에 대한 선택적 가수분해능을 지니는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기에 대한 선택적 가수분해능을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질을 의미할 수 있다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소에 존재하는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기에 대해 선택적 가수분해능을 지니나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the term "α-L-arabinofuranosidase protein" refers to an enzyme having selective hydrolysis ability to α-1,6 arabinofuranosyl residues do. For the purpose of the present invention, the kind of the enzyme having the selective hydrolysis ability to the? -1,6 arabinofuranosyl residue is not particularly limited, but preferably? -L- Arabinofuranosidase < / RTI > protein. The α-L-arabinofuranosidase preferably has an ability to selectively hydrolyze α-1,6 arabinofuranosyl residues present at the 20-carbon of the PPD-type saponin, but is not limited thereto.

상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 진세노사이드 Rc의 20번 탄소에 존재하는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 가수분해하여 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있으므로, 상기 (a) α-L-아라비노퓨라노시다제를 이용하여 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시키는 단계; 및 (b) 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 상기 전환된 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 Rg3로 전환시키는 단계를 수행하여 진세노사이드 Rg3를 제조할 수 있다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제를 서열번호 3으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 α-L-아라비노퓨라노시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 α-L-아라비노퓨라노시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. The α-L-arabinofuranosidase can hydrolyze the α-1,6 arabinofuranosyl residue present at the 20-carbon of the ginsenoside Rc to convert it into ginsenoside Rd, a) converting ginsenoside Rc to ginsenoside Rd using? -L-arabinofuranosidase; And (b) converting the converted ginsenoside Rd to ginsenoside Rg3 using ginsenoside glycosidase to produce ginsenoside Rg3. The α-L-arabinofuranosidase is preferably an α-L-arabinofuranosidase having an amino acid sequence which is not less than 70%, preferably not less than 80%, more preferably not more than 80% L-arabinofuranosidase as an amino acid sequence exhibiting at least 90% homology, more preferably at least 95% homology, and most preferably at least 98% homology. Further, as the sequence having such similarity, if it is an amino acid sequence having substantially the same or a corresponding biological activity as that of? -L-arabinofuranosidase, a protein variant having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, Are also included within the scope of the present invention.

상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 바람직하게는 서열번호 4로 기재된 핵산 서열로 정의되는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 의미할 수 있으나, α-L-아라비노퓨라노시다제 활성을 갖는 서열인 한 이에 제한되지 않는다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 서열번호 4로 기재한 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 핵산 서열로서 실질적으로 α-L-아라비노퓨라노시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 핵산을 포함한다. The α-L-arabinofuranosidase may preferably mean an α-L-arabinofuranosidase as defined by the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but α-L-arabinofuranosidase Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI > The α-L-arabinofuranosidase has not only the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 but also the sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95 , More preferably at least 98%, and most preferably at least 98%, of nucleic acid sequences capable of encoding proteins having substantially the activity of alpha -L-arabinofuranosidase.

진세노사이드 Rg3를 제조하는 방법에 있어, 상기 진세노사이드 글리코시다제 및 α-L-아라비노퓨라노시다제는 순차적으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 사용하여 진세노사이드 Rc와 먼저 반응시킨 후, 진세노사이드 글리코시다제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법의 예로, α-L-아라비노퓨라노시다제는 35 내지 37℃ 온도에서 최적의 효소활성을 지니므로, 35 내지 37℃ 온도에서 Rc와 먼저 반응시킨 후, 이를 37 내지 55℃ 온도에서 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제와 반응시켜, 진세노사이드 Rg3, 특히 Rg3(S)를 제조할 수 있다.
In the method for producing ginsenoside Rg3, the ginsenoside glycosidase and? -L-arabinofuranosidase can be used sequentially. Preferably, alpha -L-arabinofuranosidase is used to first react with ginsenoside Rc and then ginsenoside glycosidase may be used, but is not limited thereto. As an example of this method, α-L-arabinofuranosidase has optimal enzyme activity at a temperature of 35 to 37 ° C., so it is first reacted with Rc at a temperature of 35 to 37 ° C., Can be reacted with the ginsenoside glycosidase of the present invention to prepare ginsenoside Rg3, particularly Rg3 (S).

본 발명의 가용성인 마이너 사포닌을 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양물과 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 추가로 포함하여 진세노사이드 Rg3를 제조할 수 있다.The method for producing the soluble minor saponin of the present invention is characterized in that a vector containing the nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase protein is introduced into a transformant or a culture of the transformant and a PPD type or PPT type saponin Lt; / RTI > Further, the method of the present invention may further comprise the step of using a vector-introduced transformant containing the α-L-arabinofuranosidase protein, a nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant, Can be produced.

본 발명에서, 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. In the present invention, the term "vector" refers to a nucleic acid construct comprising an essential control element operatively linked to the expression of a nucleic acid insert, which is an expression vector capable of expressing the desired protein in a suitable host cell.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. In the present invention, the term "transformation" refers to a phenomenon in which DNA is introduced as a host and DNA can be cloned as a factor of chromosome or by integration of chromosome integration, thereby introducing an external DNA into cells to cause an artificial genetic change it means.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.Any transformation method of the present invention can be used, and can be easily carried out according to a conventional method in the art.

상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rg3로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌인 진세노사이드 Rb1로부터 진세노사이드 Rd로의 전환활성, 진세노사이드 Rd로부터 진세노사이드 Rg3로의 전환활성을 지닌 형질전환체를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 형질전환체는 PPT 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rg2 또는 Rh1로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPT 타입의 사포닌인 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg2로의 전환활성 또는 진세노사이드 Rg1로부터 Rh1으로의 전환활성을 지니나, 이에 제한되지 않는다.The vector-introduced transformant containing the nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase protein of the present invention transformed by the above method has an activity of converting PPD type saponin to convert to ginsenoside Rg3 Means a transformant having a conversion activity from ginsenoside Rb1, which is a saponin of PPD type, to ginsenoside Rd, and ginsenoside Rd to ginsenoside Rg3, but is not limited thereto . In addition, the transformant has an activity of converting PPT type saponin into ginsenoside Rg2 or Rh1, and preferably has a conversion activity from ginsenoside Re, which is a PPT type saponin, to ginsenoside Rg2 Or from ginsenoside Rg1 to Rh1, but is not limited thereto.

상기 α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 선택적으로 가수분해할 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 진세노사이드 Rc의 20번 탄소에 위치한 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 가수분해하여 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있는 활성을 지니나, 이에 제한되지 않는다.The transformant into which the recombinant vector containing the nucleic acid encoding the? -L-arabinofuranosidase has been introduced has an activity of selectively hydrolyzing the? -1,6 arabinofuranosyl residue , Preferably an activity capable of hydrolyzing an α-1,6 arabinofuranosyl residue located at the 20th carbon of ginsenoside Rc to convert it to ginsenoside Rd, but is not limited thereto.

본 발명에서 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli )과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.
In the present invention, the host is not particularly limited as long as it is capable of expressing the nucleic acid of the present invention. Specific examples of hosts that can be used in the present invention include Escherichia (Escherichia) bacteria belonging to the genus such as Escherichia coli (E. coli); Bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis ; Bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida ; Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , and the like; Animal cells and insect cells.

또한, 상기 형질전환체를 배양하여 수득한 배양물을 이용하여 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 전환시켜 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rh1 및 진세노사이드 Rg2를 제조할 수 있다.Furthermore, the cultured product obtained by culturing the transformant can be used to convert PPD type or PPT type saponin to produce ginsenoside Rg3, ginsenoside Rh1 and ginsenoside Rg2.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rg3로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌인 진세노사이드 Rb1로부터 진세노사이드 Rd로의 전환활성, 진세노사이드 Rd로부터 진세노사이드 Rg3로의 전환활성을 지닌 형질전환체의 배양물을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배양물은 PPT 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rg2 또는 Rh1으로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPT 타입의 사포닌인 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg2로의 전환활성 또는 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 Rh1으로의 전환활성을 지니나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "culture product" can mean a product obtained by culturing the transformant according to a known microorganism culture method. The culture of the transformant into which the expression vector containing the nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase is introduced has an activity of converting the PPD type saponin into ginsenoside Rg3, Means a culture of a transformant having a conversion activity from ginsenoside Rb1, which is a PPD type saponin, to ginsenoside Rd, and a conversion activity from ginsenoside Rd to ginsenoside Rg3, but the present invention is not limited thereto. In addition, the culture has an activity to convert PPT-type saponin into ginsenoside Rg2 or Rh1, and preferably has a conversion activity from ginsenoside Re, which is a PPT type saponin, to ginsenoside Rg2 or And has a conversion activity from ginsenoside Rg1 to ginsenoside Rh1, but is not limited thereto.

또한, α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 배양물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. In addition, a culture of a transformant into which an expression vector containing a nucleic acid encoding? -L-arabinofuranosidase has been introduced may be cultured in a culture having an activity capable of converting ginsenoside Rc into ginsenoside Rd But is not limited thereto.

본 발명의 실시예에서는 플라보박테리엄 존소니에 KACC 11414^T 로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 정제하였고, 이를 Bgl BX10로 명명하였다(실시예 1). 상기 Bgl BX10를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2445bp 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 814개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.In the example of the present invention, a ginsenoside glycosidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was isolated and purified from KACC 11414 ^{T in} Flavobacterium Johnson, which was named Bgl BX10 (Example 1) . The polynucleotide encoding Bgl BX10 comprises a polynucleotide of 2445 bp in length and encodes a polypeptide consisting of 814 amino acids.

또한, Bgl BX10는 베타-글루코시다제의 효소 활성을 지녀, PPD 타입의 진세노사이드인 Rb1의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 순차적으로 분해하여 진세노사이드 Rd를 거쳐 진세노사이드 Rg3로 전환시키는 활성을 지님을 확인하였고, 또한, PPT 타입의 진세노사이드인 Re의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 분해하여 진세노사이드 Rg2로 전환시키는 활성을 지니며, PPT 타입의 진세노사이드인 Rg1의 20번 탄소에 위치한 글루코스를 분해하여 진세노사이드 Rh1으로 전환시키는 활성을 지님을 확인하여, 본 발명의 진세노사이드 글루코시다제가 인삼 사포닌의 20번 탄소에 위치한 글루코스에 대하여 선택적 가수분해능이 있는 것을 확인하였다(도 3). 아울러, 상기 진세노사이드 글리코시다제 외에 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 추가로 사용하는 경우, 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd를 거쳐 진세노사이드 Rg3로 전환시킬 수 있음을 확인하였다(도 6).
In addition, Bgl BX10 has an enzyme activity of beta-glucosidase, and has activity to convert glucose located at the 20th carbon of Rb1, which is a ginsenoside of PPD type, sequentially to ginsenoside Rd through ginsenoside Rd In addition, it has an activity of decomposing glucose located at the 20th carbon of Re, which is a ginsenoside of PPT type, to convert it into ginsenoside Rg2, and has the activity of converting the 20th carbon of Rg1 which is the PPT type ginsenoside , It was confirmed that the ginsenoside glucosidase of the present invention had selective hydrolysis ability to glucose located at the 20th carbon of ginseng saponin 3). In addition, when α-L-arabinofuranosidase is additionally used in addition to the ginsenoside glycosidase, the ginsenoside Rc is converted to ginsenoside Rg3 via ginsenoside Rd (Fig. 6).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD(protopanaxadiol) 타입 또는 PPT(protopanaxatriol) 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 마이너 사포닌으로의 전환용 조성물을 제공한다.In another embodiment, the present invention relates to a method for producing a recombinant vector comprising the above ginsenoside glycosidase protein, a vector containing a nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant, A saponin of PPD (protopanaxadiol) type or PPT (protopanaxatriol) type, which is easy to be absorbed into the body.

상기 PPD 타입의 사포닌, PPT 타입의 사포닌, 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 마이너 사포닌, 형질전환체 또는 이의 배양물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 진세노사이드 Rg3로의 전환용 조성물은 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. The PPD type saponin, the PPT type saponin, the ginsenoside glycosidase protein, the minor saponin, the transformant or the culture thereof are as described above. Further, the composition for converting ginsenoside Rg3 may be a transformant into which a vector containing an α-L-arabinofuranosidase protein or a nucleic acid encoding the protein is introduced, or a culture of the transformant As shown in FIG.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 인삼 사포닌의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 지니므로 마이너 진세노사이드인 Rg3, Rg2 또는 Rh1을 생산하는 데 있어 유용하게 사용될 수 있다.
Since the ginsenoside glycosidase protein has selective hydrolysis ability to the 20th carbon of ginseng saponin, it can be useful for producing Rg3, Rg2 or Rh1 which is a minor ginsenoside.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for producing a protein comprising a ginsenoside glycosidase protein defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a nucleic acid encoding the protein, a vector comprising the nucleic acid, Thereby providing a transformant.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. The ginsenoside glycosidase protein, the nucleic acid encoding the protein, the vector containing the nucleic acid, and the transformant into which the vector is introduced are as described above.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노사이드 글루코시다제를 코딩하는 핵산은 진세노사이드 글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 유사성은 상기에서 설명한 바와 같다.The nucleic acid encoding the ginsenoside glycosidase protein may preferably be a nucleic acid represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. The nucleic acid encoding the ginsenoside glucosidase is not limited to the nucleic acid encoding the protein having the activity of ginsenoside glucosidase, but preferably the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, And more preferably 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI > protein having activity. The similarity is as described above.

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입 또는 PPT 타입의 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성인 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있으며, 이 단백질은 활성 및 안정성이 유지될 수 있는 한 다양한 온도 및 pH 조건에서 사용될 수 있으며, ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, DTT 및 머캅토에탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속 및 화학 제재를 함께 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The ginsenoside glycosidase protein of the present invention can convert ginsenosides of PPD type or PPT type into minor soluble ginsenosides which are readily soluble in the body, And may be used at various temperatures and pHs as long as it is at least one selected from the group consisting of ZnCl ₂ , MnCl ₂ , CaCl ₂ , CoCl ₂ , MgCl ₂ , EDTA, NaCl, KCl, CuCl ₂ , SDS, DTT, and mercaptoethanol Metals and chemical agents may be used together, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 진세노사이드 글리코시다제의 효소 특성을 분석하여 30℃이하에서 효소의 안정성이 탁월하였으며, 35-45℃에서 효소의 활성이 높았고, pH 6.0에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월한 것을 확인하였다(도 5a 및 5b).
According to one embodiment of the present invention, the enzymatic properties of the ginsenoside glycosidase were analyzed, and it was found that the stability of the enzyme was excellent at 30 ° C or less, the activity of the enzyme was high at 35-45 ° C, And excellent activity (Figs. 5A and 5B).

본 발명의 신규한 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드 Rg3, Rg2 또는 Rh1으로 전환시키는 우수한 활성을 나타내어, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드 Rg3, Rg2 또는 Rh1의 대량생산 및 제조에 이용될 수 있다.
The novel ginsenoside glycosidase of the present invention exhibits excellent activity of converting PPD type or PPT type saponin into ginsenoside Rg3, Rg2 or Rh1, which is an easily absorbable form, and its pharmacological effect has been proved, And can be used for the mass production and production of the minor form of ginsenosides Rg3, Rg2 or Rh1, which has been produced only in trace quantities and has been limited in use.

도 1은, PPD(protopanaxadiol) 타입과 PPT(protopanaxatriol) 타입의 진세노사이드의 종류를 나타낸 것이다.
도 2는, Bgl BX10 정제를 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
M, 단백질 분자량 마커; 레인 1, Bgl BX10의 발현이 유도된 재조합 BL21(DE3) 세포의 조추출물의 수용성 부분; 레인 2, GST-결합 아가로스 레진에 의해 정제된 GST-Bgl BX10; lane 3, 트롬빈을 처리한 후 정제된 재조합 Bgl BX10
도 3은, Bgl BX10 단백질의 생전환 활성을 나타내는 TLC(Thin-layer chromatography) 사진이다.
S, 진세노사이드 표준물질 마커; lane 1, 진세노사이드 Rb1의 진세노사이드 Rg3(S)로의 전환; lane 2, 진세노사이드 Rb2의 비전환; lane 3, 진세노사이드 Rc의 비전환; lane 4, 진세노사이드 Rd의 진세노사이드 Rg3(S)로의 전환; 5, 진세노사이드 Re의 진세노사이드 Rg2(S)로의 전환; 6, 진세노사이드 Rg1의 진세노사이드 Rh1(S)로의 전환.
도 4는, Bgl BX10 단백질의 생전환 반응경로를 나타내는 모식도이다.
도 5a는, E. coli로부터 정제된 Bgl BX10의 pH에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이고, 도 5b는, 온도에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은, PPD 타입 진세노사이드 혼합물(PPD type ginsenoside mixture)를 기질로 이용하여 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 선 이용하여 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시킨 후, Bgl BX10 단백질을 이용하여 진세노사이드 Rb1 및 Rd를 진세노사이드 Rg3(S)로 모두 전환시킨 HPLC(High performance liquid chromatography) 분석결과를 나타낸 것이다. Fig. 1 shows the types of ginsenosides of PPD (protopanaxadiol) type and PPT (protopanaxatriol) type.
Figure 2 shows the results of SDS-PAGE analysis for Bgl BX10 purification.
M, protein molecular weight marker; Lane 1, soluble portion of crude extract of recombinant BL21 (DE3) cells induced expression of Bgl BX10; Lane 2, GST-Bgl BX10 purified by GST-conjugated agarose resin; lane 3, purified recombinant Bgl BX10 after treatment with thrombin
3 is a TLC (Thin-layer chromatography) photograph showing the biotransformation activity of Bgl BX10 protein.
S, ginsenoside standard material marker; lane 1, conversion of ginsenoside Rb1 to ginsenoside Rg3 (S); lane 2, non-conversion of ginsenoside Rb2; lane 3, non-conversion of ginsenoside Rc; lane 4, conversion of ginsenoside Rd to ginsenoside Rg3 (S); 5, conversion of ginsenoside Re to ginsenoside Rg2 (S); 6, conversion of ginsenoside Rg1 to ginsenoside Rh1 (S).
FIG. 4 is a schematic diagram showing a biotransformation reaction pathway of the Bgl BX10 protein. FIG.
Figure 5a is a graph showing the pH-dependent stability and activity of purified Bgl BX10 from E. coli , and Figure 5b is a graph depicting stability and activity with temperature.
FIG. 6 is a graph showing the results obtained by using α-L-arabinofuranosidase as a substrate using a PPD type ginsenoside mixture as a substrate to convert ginsenoside Rc into ginsenoside Rd, and then converted to ginsenoside Rg3 (S) by using Bgl BX10 protein. The high performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed that Rb1 and Rd were converted into ginsenoside Rg3 (S).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: One: 신규한New 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)의Of ginsenoside glycosidase 제조 Produce

실시예 1-1: 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작Example 1-1 Production of Recombinant Expression Vector and Transformed Microorganism Containing Novel Ginsenoside Glycosidase

본 발명에서는 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 제조하기 위하여, 먼저 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414^T 균주로부터 신규한 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)를 스크리닝하였으며, 이를 Bgl BX10로 명명하였다. In the present invention, in order to prepare a novel ginsenoside glycosidase capable of converting major ginsenoside into minor ginsenoside, first, Flavobacterium johnsoniae) ^T KACC 11414 were screened to a ginsenoside glycosidase (ginsenoside glycosidase) from the new strain and named it as a Bgl BX10.

구체적으로, 플라보박테리엄 존소니에(KACC 11414^T) 균주를 선발하고, 이의 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머(서열번호 5)와 역방향 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. Specifically, Flavobacterium Johnsonia (KACC 11414 ^T ) strain was selected and its genomic DNA was extracted. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using the genomic DNA as a template using a forward primer (SEQ ID NO: 5) and a reverse primer (SEQ ID NO: 6). The primer sequences are shown in Table 1 below.

프라이머primer 서열(5'→3')The sequence (5 '- > 3') 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머Forward primer CGGGATCCgctttagtgatttcgaatttatcatggCGGGATCCgctttagtgatttcgaatttatcatgg 서열번호 5SEQ ID NO: 5 역방향 프라이머Reverse primer CCCCTCGAGttattgttttaactctttaaatggagtCCCCTCGAGttattgttttaactctttaaatggagt 서열번호 6SEQ ID NO: 6

상기 반응으로 증폭된 단편을, 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 EzCloning Kit(Enzynomics)를 이용하여 삽입하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터 GST-Bgl BX10 진세노사이드 글리코시다제를 제작하였다. 상기 재조합 발현 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)시켰다.
The amplified fragment was inserted into a plasmid vector pGEX4T-1 (GE Healthcare, USA) into which glutathione S-transferase was inserted using an EzCloning Kit (Enzynomics) to obtain the recombinant expression vector GST-Bgl BX10 Ginsenoside glycosidase was prepared. The recombinant expression vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) by a conventional transformation method.

실시예Example 1-2: 1-2: 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)의Of ginsenoside glycosidase 발현 Expression

실시예 1-1의 진세노사이드 글리코시다제를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지 100㎖이 들어있는 삼각플라스크에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 200rpm으로 종균 배양을 실시하였다. 가용성 단백질의 발현여부를 여러 온도(18, 22, 25, 30, 37℃)에 따라 확인하기 위하여 여기에 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 최종 0.1mM 농도가 되도록 첨가하여 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 대량 발현을 유도하였다. 균주가 정체기(staionary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리한 다음, 수용성인 진세노사이드 글리코시다제를 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 상등액으로부터 획득하였다. 분리정제된 진세노사이드 글리코시다제를 SDS-PAGE로 분석하였다. 이때, 상기 진세노사이드 글리코시다제 Bgl BX10의 아미노산 개수는 814개이며, 상기 Bgl BX10의 아미노산 서열을 서열번호 1로 표시하였다. GST fusion 단백질은 약 110 kDa의 분자량을 나타내었다(도 2).
In order to mass-produce the ginsenoside glycosidase of Example 1-1, the transformed strain was inoculated into an Erlenmeyer flask containing 100 ml of LB medium supplemented with Ampicillin, and the absorbance at 600 nm was 0.6 The seed culture was carried out at 200 rpm in a shaking incubator at 37 ° C. IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside) was added to the final concentration of 0.1 mM to identify the expression of soluble protein according to various temperatures (18, 22, 25, 30, Resulting in the induction of a large amount of senoside glycosidase. When the strain was in the staionary phase, the culture of the strain was centrifuged at 6,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, suspended in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) Was disrupted with a sonicator. The cell lysate was centrifuged again at 13,000 x g for 15 minutes at 4 < 0 > C and then the water-soluble ginsenoside glycosidase was obtained from the supernatant which can be used for ginsenoside production. The separated purified ginsenoside glycosidase was analyzed by SDS-PAGE. At this time, the amino acid number of the ginsenoside glycosidase Bgl BX10 was 814, and the amino acid sequence of the Bgl BX10 was represented by SEQ ID NO: 1. The GST fusion protein showed a molecular weight of about 110 kDa (Figure 2).

실시예Example 2: 2: 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제Glycosidase Bgl BX10의 Of Bgl BX10 진세노사이드Gin Senocide 특이적 전환 능력 평가 및 분석 Evaluation and analysis of specific conversion ability

PPD 타입 또는 PPT 타입의 진세노사이드 3번 탄소(C-3), 6번 탄소(C-6) 및 20번 탄소(C-20) 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 효소의 특이성 및 선택성을 분석하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rg1을 기질로 사용하였다. 효소 0.2U, 50mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v) (pH 7.0), 및 기질을 포함하는 각 반응 혼합물을 37℃에서 배양하였다. 샘플을 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH₃OH에 용해시켜 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. The specificity and selectivity of the enzyme for glucose hydrolysis attached to the sites of the PPD type or PPT type ginsenoside 3 (C-3), 6 (C-6) and 20 (C-20) For analysis, ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re and Rg1 were used as substrates. Each reaction mixture containing 0.2 U of enzyme, 50 mM sodium phosphate buffer 0.1% (w / v) (pH 7.0), and substrate was incubated at 37 占 폚. Samples were collected at appropriate intervals, and the reaction was terminated by adding an aqueous-saturated butanol equivalent volume. The n-butanol fraction was dried and evaporated, and the residue was dissolved in CH ₃ OH and analyzed by thin layer chromatography (TLC). The results are shown in FIG.

그 결과, 진세노사이드 Rb1의 경우 진세노사이드 Rg3(S)로 전환되었고(레인 1), 진세노사이드 Rb2의 경우 진세노사이드 전환이 되지 않았으며(레인 2), 진세노사이드 Rc의 경우도 전환이 되지 않았으며(레인 3), Rd는 Rg3(S)로 전환된 결과를 보였다(레인 4). 또한 진세노사이드 Re는 진세노사이드 Rg2(S)로 전환을 보였으며(레인 5), 진세노사이드 Rg1은 진세노사이드 Rh1(S)으로 전환을 보였다(레인 6). As a result, in the case of ginsenoside Rb1, it was converted into ginsenoside Rg3 (S) (lane 1), in the case of ginsenoside Rb2, ginsenoside was not converted (lane 2), and in case of ginsenoside Rc (Lane 3), and Rd was converted to Rg3 (S) (lane 4). Also, ginsenoside Re showed conversion to ginsenoside Rg2 (S) (lane 5) and ginsenoside Rg1 showed conversion to ginsenoside Rh1 (S) (lane 6).

이와 같은 결과는, 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 Bgl BX10이 PPD 타입 또는 PPT 타입의 사포닌을 가용성 마이너 사포닌인 Rg3, Rg2 또는 Rh1으로 효율적으로 전환시킬 수 있는 활성을 지님을 보여주는 것이다.
These results show that the ginsenoside glycosidase Bgl BX10 of the present invention has an activity to efficiently convert PPD type or PPT type saponins into soluble minor saponins Rg3, Rg2 or Rh1.

실시예Example 3: 3: 신규한New 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제(Bgl BX10)를Glycosidase (Bgl BX10) 이용한 미량 Trace amount used 진세노사이드Gin Senocide 대량 생산 massive production

실시예Example 3-1: 3-1: 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제(Bgl BX10)를Glycosidase (Bgl BX10) 포함하는 Included 효소액Enzyme solution 획득 Obtain

10g 단위 미량 진세노사이드들을 생산하기 위한 효소액을 대량으로 얻기 위해서는 10L 단위의 발효기(fermentor)에 형질전환된 E. coli 세포를 키워야하므로, 하기와 같은 과정을 수행하였다. 본 배양에 앞서, 전날 500ml 플라스크에 앰피실린이 함유된 LB 배지에 GST-Bgl BX10이 함유되어 있는 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 세포를 접종하여 다음날 10L 발효기에서 6L 볼륨의 LB(Luria-Bertani media)에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 3이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 500rpm으로 배양을 실시하였다. 수용성 재조합 단백질인 Bgl BX10의 발현 유도하기 위해서 발효기의 온도를 30℃로 낮추고, E. coli 세포의 추가 성장을 원활히 하기 위하여 글루코스 용액(600g/ℓ)을 200-500㎖를 넣어주었다. 여기에 1M 인산나트륨 버퍼 300-500㎖를 넣어주어서 안정적인 pH 조건을 꾀하였다. 여기에 최종 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 농도가 0.1mM이 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제 Bgl BX10의 대량 발현을 유도하였다. 20 내지 36시간 동안 이를 배양하여 균주가 정체기(stationary phase)에 들었을 때 상기 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여, E. coli 세포를 200g 얻을 수 있었다(30g/ℓ 전후). 이에 100mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 다음, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 수용성으로 발현된 상기 Bgl BX10이 들어있어 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 효소액을 대량으로 획득하였다.
In order to obtain a large amount of enzyme solution for producing 10 g unit microcrystals of ginsenosides, transformed E. coli cells were cultured in a 10 L fermentor. Therefore, the following procedure was performed. Prior to the present culture, 500 ml flask on the previous day was inoculated with transformed E. coli containing GST-Bgl BX10 in LB medium containing ampicillin BL21 (DE3) cells were inoculated on the following day and cultured at 500 rpm in a shaking incubator at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm reached 3 by inoculating LB (Luria-Bertani media) of 6 L volume in the 10 L fermenter the following day. To induce the expression of the water-soluble recombinant protein Bgl BX10, the temperature of the fermenter was lowered to 30 ° C, and E. coli 200-500 ml of glucose solution (600 g / l) was added to facilitate further growth of cells. 300-500 ml of 1 M sodium phosphate buffer was added thereto to obtain stable pH conditions. The final concentration of IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside) was added to 0.1 mM to induce the mass expression of ginsenoside glycosidase Bgl BX10. When the strain was put into a stationary phase for 20 to 36 hours, the culture of the strain was centrifuged at 6,000 x g for 15 minutes at 4 DEG C to obtain 200 g of E. coli cells (about 30 g / l ). After adding 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) to the suspension, the cell solution was disrupted with a sonicator. The cell lysate was further centrifuged at 13,000 x g for 15 minutes at 4 ° C to obtain a large amount of an enzyme solution containing water-soluble Bgl BX10, which can be used for producing ginsenoside.

실시예 3-2: 진세노사이드 Rg3(S) 대량 생산Example 3-2: Mass production of ginsenoside Rg3 (S)

상기 실시예 3-1에서 대량으로 얻어진 효소액 1ℓ에 최대 농도 10%인 PPD type 진세노사이드 혼합물(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 1L를 37℃의 온도에서 150rpm으로 교반시키면서 반응시켰다. Bgl BX10만 단독으로 사용시에는 진세노사이드 Rb1과 Rd는 모두 Rg3(S)로 전환이 가능하나, 진세노사이드 Rc가 전환되지 않으면 최고 높은 순도의 Rg3(S)를 얻기에는 어려우므로 이를 극복하기 위하여 본 발명자 소유의 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 복합적으로 넣고 반응시켰을 때는 Rc 또한 Rd를 거쳐 Rg3(S)로 전환된다는 것을 확인하였다(도 6). 반응을 중단시키고 전환된 Rg3(S)을 회수하기 위하여 주정을 70%가 되도록 첨가하여 재조합 효소는 불활성시켜 다운시키고, 진세노사이드 Rg3(S)는 용해시켰다. 용해된 진세노사이드는 다시 알콜 농도를 낮추어 HP20 다공성 수지로 흡착 후, 물로 세척 후, 80% 에탄올을 이용하여 탈착시킨 후, 감압식 회전 증발기로 날려서 순도 높은 진세노사이드 Rg3(S)를 획득할 수 있었다. 최종적으로 PPD 혼합물 100g을 반응시켜서 52.1g의 진세노사이드 Rg3(S)을 얻을 수 있었다.
1 L of a PPD type ginsenoside mixture (Rb1, Rb2, Rc, Rd) having a maximum concentration of 10% was reacted with 1 L of a large amount of the enzyme solution obtained in Example 3-1 while stirring at 150 rpm at a temperature of 37 캜. When Bgl BX10 alone is used alone, both ginsenosides Rb1 and Rd can be converted to Rg3 (S), but it is difficult to obtain the highest purity Rg3 (S) unless the ginsenoside Rc is converted. When α-L-arabinofuranosidase belonging to the present inventor was mixed and reacted, it was confirmed that Rc was also converted to Rg3 (S) via Rd (FIG. 6). To stop the reaction and recover the converted Rg3 (S), the solvent was added to 70% to inactivate the recombinase, and the ginsenoside Rg3 (S) was dissolved. The dissolved ginsenosides were again adsorbed with HP20 porous resin, then washed with water, desorbed using 80% ethanol, and then discharged with a rotary evaporator to obtain high purity ginsenoside Rg3 (S) there was. Finally, 100 g of the PPD mixture was reacted to obtain 52.1 g of ginsenoside Rg3 (S).

실시예Example 4: 4: 진세노사이드Gin Senocide 글리코시다제Glycosidase (Bgl BX10) 효소 특성 분석(Bgl BX10) enzyme characterization

2.0mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 포함하는 pH 7.0, 50mM 인산 나트륨 버퍼 90㎕에 대해 특이 활성을 측정하였고, 반응 개시 전 10㎕ 희석 정제 효소와 37℃에서 20분 동안 반응시켜 배양하였다. 1M Na₂CO₃ 0.1㎖로 5분 동안 처리하여 반응을 종료시키고, 405nm에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 분비를 즉각적으로 측정하였다. 활성 유닛(one unit of activity)을 분당 p-니트로페놀 1μmol의 분비량으로 정의하였다. 특이 활성은 단백질 밀리그램(milligram)당 유닛으로 발현되었다. Bio-Rad 단백질 분석 염색 시약 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 분석은 적어도 세 번 이상 수행하였다.
Specific activity was measured against 90 占 퐇 of 50 mM sodium phosphate buffer at pH 7.0 containing 2.0 mM pNPGlc (p-nitrophenyl-? -D-glucopyranoside; Sigma), and 10 희 diluted purified enzyme was added thereto at 37 캜 for 20 minutes Lt; / RTI > 1M Na ₂ CO ₃ The reaction was terminated by treatment with 0.1 ml for 5 minutes and the secretion of p-nitrophenol was immediately measured at 405 nm. One unit of activity was defined as the amount of 1 μmol of p-nitrophenol per minute. Specific activity was expressed in units per milligram of protein. Bio-Rad Protein Analysis Protein concentrations were measured using a staining reagent protocol. All analyzes were performed at least three times.

실시예 4-1: pH 변화에 따른 효과 측정Example 4-1: Measurement of effect according to pH change

pH가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 기질은 2.0mM pNPGlc(p-nitrophenyl-D-glucopyranoside; Sigma)을 사용하였고, 하기와 같은 버퍼(50mM)를 사용하여 pH를 조절하였다.
The effect of pH on enzyme activity was measured. The substrate was 2.0 mM pNPGlc (p-nitrophenyl-D-glucopyranoside; Sigma), and the pH was adjusted using a buffer (50 mM) as described below.

pH 2 내지 10의 범위: KCl-HCl(pH 2), 글라이신-HCl(pH 3), 아세트산 나트륨(pH 4 및 5), 인산 나트륨(pH 6 및 7), Tris-HCl(pH 8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH 10)
HCl (pH 8 and 9), sodium chloride (pH 4 and 5), sodium phosphate (pH 6 and 7), Tris-HCl (pH 8 and 9) And glycine-sodium hydroxide (pH 10)

또한, pH가 효소 안정성에 미치는 효과를 측정하였다. 4℃의 온도에서 24시간 동안 상기 언급된 버퍼 각각에서 효소를 배양한 후, 50mM 칼륨(potassium) 버퍼 내에서 pHPGlc을 분석함으로써 pH 변동에 따른 효소 안정성을 측정하였다. 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하여 최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 그 결과를 도 5a에 나타내었다.The effect of pH on enzyme stability was also measured. Enzymes were incubated in each of the above-mentioned buffers at a temperature of 4 캜 for 24 hours, and enzyme stability with respect to pH variation was determined by analyzing pHPGlc in a 50 mM potassium buffer. The residue activity was analyzed by standard analytical methods and the activity probabilities obtained at optimum pH are shown in FIG. 5A.

그 결과, 진세노사이드 글리코시다제(Bgl BX10)는 pH 6.0에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월함을 보여주었다(도 5a).
As a result, ginsenoside glycosidase (Bgl BX10) showed excellent stability and activity of the enzyme at pH 6.0 (FIG. 5A).

실시예 4-2: 온도 변화에 따른 효과 측정Example 4-2: Measurement of effect according to temperature change

온도가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 4-90℃로 온도를 조절하였으며, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma) 2.0mM을 사용하여 5분 동안 최적 pH에서 50mM 인산 칼륨 버퍼 내 온도 의존적 활성을 분석하였다.The effect of temperature on enzyme activity was measured. The temperature was adjusted to 4-90 ° C. and the temperature dependent activity in 50 mM potassium phosphate buffer was analyzed at optimal pH for 5 minutes using pNPGlc (p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma) 2.0 mM.

또한, 동일 온도 범위 내에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 이는 10분간 얼음으로 샘플을 냉각한 후, 표준 분석 방법에 의해 측정된 잔존 활성을 확인함으로써 수행한 후, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.In addition, a temperature stability analysis was performed by incubating enzyme equivalents in 50 mM potassium phosphate buffer for 30 minutes in the same temperature range. This was done by cooling the sample with ice for 10 minutes and then confirming the residual activity as measured by standard analytical methods and the results are shown in Figure 5b.

그 결과, Bgl BX10의 활성은 45℃에서 최고치를 보인 반면, 열 안정성 실험 결과 30℃ 이하의 온도에서는 안정한 것으로 나타났다. 다만, 37℃에서는 30분경과 후 90% 가량의 활성을 상실하였다(도 5b).
As a result, the activity of Bgl BX10 showed the maximum at 45 ° C, while the stability of Bgl BX 10 was found to be stable at temperatures below 30 ° C. However, at 37 ° C, activity of about 30 minutes and 90% was lost (FIG. 5b).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 PPD 타입의 사포닌을 가용성 사포닌인 진세노사이드 Rg3로, PPT 타입의 사포닌을 가용성 사포닌인 진세노사이드 Rg2 또는 Rh1으로 효율적으로 전환시킬 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
These results show that the ginsenoside glycosidase of the present invention can efficiently convert the PPD type saponin into the soluble saponin Ginsenoside Rg3 and the PPT type saponin into the soluble saponin Ginsenoside Rg2 or Rh1 It is supported.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Intelligent Synthetic Biology Center <120> Production of ginsenoside Rg3, Rh1 and Rg2 using novel ginsenoside glycosidase <130> PA120547KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 814 <212> PRT <213> Flavobacterium johnsoniae <400> 1 Met Lys Lys Thr Ile Ile Lys Thr Ala Arg Val Ser Leu Leu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Val Ile Ser Asn Leu Ser Trp Asn Ser Val Ser Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Asn Pro Pro Phe Leu Thr Val Lys Gly Phe Thr Phe Arg Asp Leu Asn 35 40 45 Lys Asn Gly Lys Leu Asp Ile Tyr Glu Asp Thr Arg Leu Ser Ile His 50 55 60 Glu Arg Ala Val Asp Leu Val Lys Lys Met Thr Glu Glu Glu Lys Ala 65 70 75 80 Asn Phe Leu Met Gly Thr Gly Met Pro Gly Phe Asp Gly Ile Lys Pro 85 90 95 Val Val Gly Ala Ile Glu Gly Arg Val Pro Gly Ala Ala Gly Gly Thr 100 105 110 Tyr Glu Ile Lys Arg Leu Gly Ile Pro Ala Ile Ile Val Ala Asp Gly 115 120 125 Pro Ala Gly Leu Arg Ile Lys Pro Ile Arg Glu Asn Asp Lys Asn Thr 130 135 140 Tyr Tyr Cys Thr Ala Phe Pro Val Gly Thr Ala Leu Ala Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asn Glu Ser Leu Ile Glu Lys Val Gly Lys Ala Met Gly Asn Glu Val 165 170 175 Lys Glu Tyr Gly Val Asp Val Leu Leu Ala Pro Ala Leu Asn Ile His 180 185 190 Arg Asn Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro 195 200 205 Leu Val Ser Gly Lys Ile Ala Ser Ala Met Val Lys Gly Ile Gln Leu 210 215 220 Asn Gly Val Gly Thr Ser Ile Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu 225 230 235 240 Thr Asn Arg Leu Ser Ile Asn Glu His Ile Ser Glu Arg Ala Met Arg 245 250 255 Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Phe Glu Ile Thr Val Lys Glu Ser Asn Pro 260 265 270 Trp Thr Val Met Ser Ser Tyr Asn Leu Ile Asn Gly Thr Tyr Thr Ser 275 280 285 Ala Arg Lys Asp Leu Leu Thr Asp Ile Leu Arg Asn Glu Trp Gly Phe 290 295 300 Lys Gly Ile Val Met Thr Asp Trp Phe Gly Gly Phe Ala Gly Ala Gln 305 310 315 320 Ser Ile Met Ala Gly Ser Ser Asn Val Thr Glu Gln Leu Ser Ala Gly 325 330 335 Asn Asp Leu Leu Met Pro Gly Ile Glu Ala Gln Lys Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Glu Asn Ile Asn Asn Lys Lys Leu Ser 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ttgcttcggc gatggtaaaa 660 gggattcagt taaatggagt aggaacttca attaaacatt ttgcagctaa taatcaggaa 720 accaaccgcc tttcaatcaa tgaacacatc agcgaaagag ctatgcgtga aatttattta 780 aaaggttttg agattactgt aaaagaatca aatccatgga cggttatgtc ttcgtataat 840 ttgattaacg gaacctatac ttcggcaaga aaagaccttc taacagatat tcttcgtaat 900 gaatgggggt ttaaagggat cgttatgaca gactggtttg gaggttttgc cggagcacaa 960 tctattatgg caggttcaag caatgttaca gaacagctga gtgccggaaa cgatttatta 1020 atgccgggaa tcgaagcaca aaagaaagct attattgaaa acatcaataa taagaaatta 1080 tctaaagaag ttgtagacaa aaatgtagaa agaattctgg aattggtttt aagatcgcca 1140 attatggaaa actacaaata ctcaaacaaa cccaatttaa aagaaaacgc acaaattacc 1200 agacaggcag catctgaagg aatgattttg ctgaaaaatg ataaaaatgt gcttccgttt 1260 acgaacaaaa aaggaaaagc agccgttttt ggagttacat catatgattt tatttcggga 1320 ggaaccggaa gcggcgacgt aaacgaagct tatacaattt ctttattgga tggtttaaaa 1380 aatgcaggtt actcaattga tgaagaatta aaaacaactt acacaccatt tgttgcaaag 1440 gtaaaagagg cagaaatgga aagccgtaaa aaagaaggtt ttctggcttt accaaaaaga 1500 cttcctgaat taaaattgga aaaacaagaa attgcaaaac acgccgcatc atcagaattg 1560 gcaattataa ctattggtag aaattctgga gaaggaggcg accgcaaggt tgataacgat 1620 tttaatcttg ctcaggatga ggtagaatta atcaataatg tttctgaagc ttttcattca 1680 aaaggaaaaa aagtagttgt aattttaaat ataggcggtg ttatagaaac tgcaagctgg 1740 aaagataaag ctgatgccat tttactttca tggcagccag ggcaggaagg aggaaattca 1800 gtagctgatg ttttttcagg aaaagtaaat ccgtctggaa aattaactat gacttttcca 1860 atgaaatatg aagacacacc atcggcaaaa aactggttag gaactcctgc agacaatccg 1920 gcaaatgtaa cgtacgaaga aggtgtatat gttggatatc gttattacaa tacctttaat 1980 gtaaaaccat cttatgaatt tggttttgga aattcatata caacattcaa ttattctgat 2040 gtaaaattaa gttcaccagt ttttaataat gcaatgacag tttcagttac agttaaaaat 2100 accggaaaaa ctgctgggaa agaagtagtg caagtatact tgtctgcacc ttcaaaatct 2160 atcgataaac ccaaagaaga attaaaagct tttgcaaaaa caaaggaatt aaaaccaggc 2220 gaaagtgaaa ctttacaact ggtattgtca ccaaaagatc tggcttcttt tttagaaaat 2280 aaaaatgcat ggattgcaga agcaggaact tataaagttt tggttggtgc ttcatcttta 2340 gacattaaaa aaacggcaga atttacagta tcaaatgaaa ttgtagtcga aaaagtaaaa 2400 aaagcttttg aactcgacac tccatttaaa gagttaaaac aataa 2445 <210> 3 <211> 508 <212> PRT <213> Leuconostoc sp. <400> 3 Met Lys Val Lys Ile Glu Lys Arg Gln Asn Glu Thr Lys Ile Asn Pro 1 5 10 15 Arg Leu His Gly Gln Phe Ile Glu Phe Leu Gly Asn Ala Ile Asn Asp 20 25 30 Gly Ile Trp Val Gly Lys Glu Ser Lys Ile Pro Asn Ile Asn Gly Met 35 40 45 Arg Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Lys Glu Ile Glu Pro Pro Ile Ile 50 55 60 Arg Trp Pro Gly Gly Val Phe Ala Asp His Tyr Asn Trp Arg Asp Gly 65 70 75 80 Val Gly Glu Lys Arg Glu Lys Val Phe Asn Glu Gly Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Ser Val Glu Thr Asn Glu Phe Gly Thr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Ala 100 105 110 Ser Leu Ile His Ser Glu Pro Trp Ile Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly 115 120 125 Ser Ala Arg Glu Met Thr Glu Trp Met Glu Tyr Ile Asn Arg Lys Gln 130 135 140 Ser Thr Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ser Gly His Glu Lys Pro 145 150 155 160 Tyr Asp Val Asn Tyr Trp Gly Ile Gly Asn Glu Val 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gaaggattcg gaacatatag cgttgaaacc 300 aatgagtttg gtacggatga gtttctagaa tttgcgtcac tgattcattc tgagccatgg 360 atcaatgtta atttattaac tggttcagct cgggaaatga ctgagtggat ggaatatatt 420 aatcgtaagc agtcgacgta tttatcaaaa aagagaaaag attctggtca tgaaaaaccc 480 tatgatgtaa attattgggg aatcgggaat gaagtttggg gtggtggagg catgatgacc 540 cccgagcaat atgttgctga ttaccgaaag tacgcaacgg cggcaccaac atttgcattg 600 aatcagtttt cagaggattc gcgctacttc attttgagtg gtgccgatgc taataaacca 660 aaagaacgcc gttattggac taaaagtgta atgaaggaat tagcaagggc tcgtccacca 720 aaagttgatg gttatgattt gcattggtat aactggtacc tgggtaatga gttttccgcc 780 tcagcaacag attttaatgc caacgactgg tatcaagtaa ttaaaggtgc gacagaatta 840 gaagatatcc ttaaagaaca atacgatttg attcaagatg gtttggatca actgccagaa 900 cctgaaggag agtttgatca aaaactagag aaaatggatc tgattttagg tgagtggggc 960 aattggtatg ggagagcttt ttttgaagag aaggcactgt atcaacaaaa tacaatgcgc 1020 gatgcgataa caactgcaat cgttttagat attcttcatt ctaatgctga taaagttaaa 1080 atggctagta tggctcagac aattaatgtg ttaaatgcat taatattaac taacggtgaa 1140 caatttgtgc taacaccagt atatgatatt ttcaagatgt acaaagtgca tagaaataat 1200 gatgttctag atgtgacaat aacagatgag aatagtgatc acgttaagtt ttttgcatca 1260 ataaatgaca aaacaattta cttaaatgtg attaattttg atttgactga aaccatcagt 1320 gttgacattg atttaccagg gttggtactt cagtatcaaa aggaggagtt agcggccaat 1380 gatatgcatg aaaccaatac gttcgaggat cctaatcaac tacgtgcagc gattgttgaa 1440 cagcgtaata atgtttctgc gaatgagtta tttgatatta gcataaagcc aatgtcagtt 1500 tctgtattca aaattgtatt aggttag 1527 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cgggatccgc tttagtgatt tcgaatttat catgg 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 cccctcgagt tattgtttta actctttaaa tggagt 36 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Intelligent Synthetic Biology Center <120> Production of ginsenoside Rg3, Rh1 and Rg2 using novel ginsenoside glycosidase <130> PA120547KR <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 814 <212> 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atgaaaaaaa caattataaa aacagcacga gtatcacttt tgactgcttt agtgatttcg 60 aatttatcat ggaacagtgt ttctgatgat gaaaataatc cgccttttct aacagtaaaa 120 ggatttactt ttagagattt aaataaaaat ggaaaactgg atatttatga agataccaga 180 ctttcgattc acgaacgtgc tgtcgatttg gtcaaaaaaa tgactgagga agaaaaagct 240 aattttttaa tgggaacggg aatgccgggt tttgacggaa taaaaccggt agtaggagca 300 attgaaggac gtgttccagg ggctgcagga ggaacttacg aaattaaacg tttaggaatt 360 ccggccatta ttgtggctga cggacctgcg ggacttagaa taaaacctat tcgtgagaat 420 gataaaaata cgtattactg taccgctttt cctgttggaa ctgctttagc ttcaacatgg 480 aacgaatcat tgattgaaaa agtaggcaaa gcaatgggaa atgaagtaaa agaatatgga 540 gttgatgtat tgctggcgcc ggctttaaac attcacagaa atcctttgtg cggcagaaat 600 tttgagtatt attctgaaga tccgctggtt tctggcaaaa ttgcttcggc gatggtaaaa 660 gggattcagt taaatggagt aggaacttca attaaacatt ttgcagctaa taatcaggaa 720 accaaccgcc tttcaatcaa tgaacacatc agcgaaagag ctatgcgtga aatttattta 780 aaaggttttg agattactgt aaaagaatca aatccatgga cggttatgtc ttcgtataat 840 ttgattaacg gaacctatac ttcggcaaga aaagaccttc taacagatat tcttcgtaat 900 gaatgggggt ttaaagggat cgttatgaca gactggtttg gaggttttgc cggagcacaa 960 tctattatgg caggttcaag caatgttaca gaacagctga gtgccggaaa cgatttatta 1020 atgccgggaa tcgaagcaca aaagaaagct attattgaaa acatcaataa taagaaatta 1080 tctaaagaag ttgtagacaa aaatgtagaa agaattctgg aattggtttt aagatcgcca 1140 attatggaaa actacaaata ctcaaacaaa cccaatttaa aagaaaacgc acaaattacc 1200 agacaggcag catctgaagg aatgattttg ctgaaaaatg ataaaaatgt gcttccgttt 1260 acgaacaaaa aaggaaaagc agccgttttt ggagttacat catatgattt tatttcggga 1320 ggaaccggaa gcggcgacgt aaacgaagct tatacaattt ctttattgga tggtttaaaa 1380 aatgcaggtt actcaattga tgaagaatta aaaacaactt acacaccatt tgttgcaaag 1440 gtaaaagagg cagaaatgga aagccgtaaa aaagaaggtt ttctggcttt accaaaaaga 1500 cttcctgaat taaaattgga aaaacaagaa attgcaaaac acgccgcatc atcagaattg 1560 gcaattataa ctattggtag aaattctgga gaaggaggcg accgcaaggt tgataacgat 1620 tttaatcttg ctcaggatga ggtagaatta atcaataatg tttctgaagc ttttcattca 1680 aaaggaaaaa aagtagttgt aattttaaat ataggcggtg ttatagaaac tgcaagctgg 1740 aaagataaag ctgatgccat tttactttca tggcagccag ggcaggaagg aggaaattca 1800 gtagctgatg ttttttcagg aaaagtaaat ccgtctggaa aattaactat gacttttcca 1860 atgaaatatg aagacacacc atcggcaaaa aactggttag gaactcctgc agacaatccg 1920 gcaaatgtaa cgtacgaaga aggtgtatat gttggatatc gttattacaa tacctttaat 1980 gtaaaaccat cttatgaatt tggttttgga aattcatata caacattcaa ttattctgat 2040 gtaaaattaa gttcaccagt ttttaataat gcaatgacag tttcagttac agttaaaaat 2100 accggaaaaa ctgctgggaa agaagtagtg caagtatact tgtctgcacc ttcaaaatct 2160 atcgataaac ccaaagaaga attaaaagct tttgcaaaaa caaaggaatt aaaaccaggc 2220 gaaagtgaaa ctttacaact ggtattgtca ccaaaagatc tggcttcttt tttagaaaat 2280 aaaaatgcat ggattgcaga agcaggaact tataaagttt tggttggtgc ttcatcttta 2340 gacattaaaa aaacggcaga atttacagta tcaaatgaaa ttgtagtcga aaaagtaaaa 2400 aaagcttttg aactcgacac tccatttaaa gagttaaaac aataa 2445 <210> 3 <211> 508 <212> PRT <213> Leuconostoc sp. <400> 3 Met Lys Val Lys Ile Glu Lys Arg Gln Asn Glu Thr Lys Ile Asn Pro 1 5 10 15 Arg Leu His Gly Gln Phe Ile Glu Phe Leu Gly Asn Ala Ile Asn Asp 20 25 30 Gly Ile Trp Val Gly Lys Glu Ser Lys Ile Pro Asn Ile Asn Gly Met 35 40 45 Arg Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Lys Glu Ile Glu Pro Pro Ile Ile 50 55 60 Arg Trp Pro Gly Gly Val Phe Ala Asp His Tyr Asn Trp Arg Asp Gly 65 70 75 80 Val Gly Glu Lys Arg Glu Lys Val Phe Asn Glu Gly Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Ser Val Glu Thr Asn Glu Phe Gly Thr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Ala 100 105 110 Ser Leu Ile His Ser Glu Pro Trp Ile Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly 115 120 125 Ser Ala Arg Glu Met Thr Glu Trp Met Glu Tyr Ile Asn Arg Lys Gln 130 135 140 Ser Thr Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ser Gly His Glu Lys Pro 145 150 155 160 Tyr Asp Val Asn Tyr Trp Gly Ile Gly Asn Glu Val Trp Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Met Met Thr Pro Glu Gln Tyr Val Ala Asp Tyr Arg Lys Tyr Ala 180 185 190 Thr Ala Ala Pro Thr Phe Ala Leu Asn Gln Phe Ser Glu Asp Ser Arg 195 200 205 Tyr Phe Ile Leu Ser Gly Ala Asp Ala Asn Lys Pro Lys Glu Arg Arg 210 215 220 Tyr Trp Thr Lys Ser Val Met Lys Glu Leu Ala Arg Ala Arg Pro Pro 225 230 235 240 Lys Val Asp Gly Tyr Asp Leu His Trp Tyr Asn Trp Tyr Leu Gly Asn 245 250 255 Glu Phe Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Asn Ala Asn Asp Trp Tyr Gln 260 265 270 Val Ile Lys Gly Ala Thr Glu Leu Glu Asp Ile Leu Lys Glu Gln Tyr 275 280 285 Asp Leu Ile Gln Asp Gly Leu Asp Gln Leu Pro Glu Pro Glu Gly Glu 290 295 300 Phe Asp Gln Lys Leu Glu Lys Met Asp Leu Ile Leu Gly Glu Trp Gly 305 310 315 320 Asn Trp Tyr Gly Arg Ala Phe Phe Glu Glu Lys Ala Leu Tyr Gln Gln 325 330 335 Asn Thr Met Arg Asp Ile Thr Thr Ala Ile Val Leu Asp Ile Leu 340 345 350 His Ser Asn Ala Asp Lys Val Lys Met Ala Ser Met Ala Gln Thr Ile 355 360 365 Asn Val Leu Asn Ala Leu Ile Leu Thr Asn Gly Glu Gln Phe Val Leu 370 375 380 Thr Pro Val Tyr Asp Ile Phe Lys Met Tyr Lys Val His Arg Asn Asn 385 390 395 400 Asp Val Leu Asp Val Thr Ile Thr Asp Glu Asn Ser Asp His Val Lys 405 410 415 Phe Phe Ala Ser Ile Asn Asp Lys Thr Ile Tyr Leu Asn Val Ile Asn 420 425 430 Phe Asp Leu Thr Glu Thr Ile Ser Val Asp Ile Asp Leu Pro Gly Leu 435 440 445 Val Leu Gln Tyr Gln Lys Glu Glu Leu Ala Ala Asn Met Glu Glu 450 455 460 Thr Asn Thr Phe Glu Asp Pro Asn Gln Leu Arg Ala Ile Val Glu 465 470 475 480 Gln Arg Asn Asn Val Ser Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ile Ser Ile Lys 485 490 495 Pro Met Ser Val Ser Val Phe Lys Ile Val Leu Gly 500 505 <210> 4 <211> 1527 <212> DNA <213> Leuconostoc sp. <400> 4 atgaaagtta aaatagaaaa acgtcaaaat gagactaaaa tcaatccacg tttacatggt 60 caatttatag aatttcttgg taatgcgata aatgatggta tatgggtcgg aaaagaaagt 120 aaaatcccaa acattaatgg gatgcggtta gatgtcatta acgccttgaa agaaattgaa 180 cctccaatta taaggtggcc aggtggtgta tttgcggatc attacaattg gcgagacgga 240 gttggggaaa aaagggaaaa ggtatttaac gaaggattcg gaacatatag cgttgaaacc 300 aatgagtttg gtacggatga gtttctagaa tttgcgtcac tgattcattc tgagccatgg 360 atcaatgtta atttattaac tggttcagct cgggaaatga ctgagtggat ggaatatatt 420 aatcgtaagc agtcgacgta tttatcaaaa aagagaaaag attctggtca tgaaaaaccc 480 tatgatgtaa attattgggg aatcgggaat gaagtttggg gtggtggagg catgatgacc 540 cccgagcaat atgttgctga ttaccgaaag tacgcaacgg cggcaccaac atttgcattg 600 aatcagtttt cagaggattc gcgctacttc attttgagtg gtgccgatgc taataaacca 660 aaagaacgcc gttattggac taaaagtgta atgaaggaat tagcaagggc tcgtccacca 720 aaagttgatg gttatgattt gcattggtat aactggtacc tgggtaatga gttttccgcc 780 tcagcaacag attttaatgc caacgactgg tatcaagtaa ttaaaggtgc gacagaatta 840 gaagatatcc ttaaagaaca atacgatttg attcaagatg gtttggatca actgccagaa 900 cctgaaggag agtttgatca aaaactagag aaaatggatc tgattttagg tgagtggggc 960 aattggtatg ggagagcttt ttttgaagag aaggcactgt atcaacaaaa tacaatgcgc 1020 gatgcgataa caactgcaat cgttttagat attcttcatt ctaatgctga taaagttaaa 1080 atggctagta tggctcagac aattaatgtg ttaaatgcat taatattaac taacggtgaa 1140 caatttgtgc taacaccagt atatgatatt ttcaagatgt acaaagtgca tagaaataat 1200 gatgttctag atgtgacaat aacagatgag aatagtgatc acgttaagtt ttttgcatca 1260 ataaatgaca aaacaattta cttaaatgtg attaattttg atttgactga aaccatcagt 1320 gttgacattg atttaccagg gttggtactt cagtatcaaa aggaggagtt agcggccaat 1380 gatatgcatg aaaccaatac gttcgaggat cctaatcaac tacgtgcagc gattgttgaa 1440 cagcgtaata atgtttctgc gaatgagtta tttgatatta gcataaagcc aatgtcagtt 1500 tctgtattca aaattgtatt aggttag 1527 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cgggatccgc tttagtgatt tcgaatttat catgg 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 cccctcgagt tattgtttta actctttaaa tggagt 36

Claims

A gene encoding a ginsenoside glycosidase protein defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a vector containing a nucleic acid encoding the protein, or a culture of the transformant And converting the sugar located at the 20 carbon of the saponin selected from the group consisting of ginsenosides Rb1, Rd, Re and Rg1 to a deglycosylated form by hydrolysis.

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The process according to claim 1, wherein the preparation of the soluble minor saponin comprises the conversion of ginsenoside Rb1 to ginsenoside Rd, the conversion of ginsenoside Rd to ginsenoside Rg3, the conversion of ginsenoside Re to ginsenoside Rg2 A conversion process and a conversion process from ginsenoside Rg1 to ginsenoside Rh1.

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A ginsenoside glycosidase protein defined by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a transformant into which a vector containing a nucleic acid encoding the protein is introduced, or a culture of the transformant, (Protopanaxadiol) type or PPT (protopanaxatriol) type of saponin selected from the group consisting of ginsenosides Rb1, Rd, Re and Rg1 as a soluble minor saponin in a sugar deglycosylated form located at 20 carbon &Lt; / RTI >

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