KR101913210B1 - 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법 - Google Patents

동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법 Download PDF

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송규영
양석균
이호수
예병덕
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울산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 1,324명의 궤양성 대장염 환자(972명의 나쁜 예후 케이스 및 352명의 좋은 예후 케이스)에 대한 3개의 독립적인 발굴 코호트(cohorts) 유래 HLA fine-mapping data와, 587명의 궤양성 대장염 환자(463명의 나쁜 예후 케이스 및 124명의 좋은 예후 케이스)의 재현 data를 이용하여, 케이스 내 분석을 수행하였으며, 궤양성 대장염의 예후와 관련되어 있는 rs9268877 SNP의 변이를 확인하였다. 이에, 본 발명은 궤양성 대장염의 예후 진단에 있어, 치료 전략을 수립하고 환자 맞춤 치료를 진행하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법{Composition of single nucleotide polymorphism markers for predicting prognosis of ulcerative colitis in Asians and method for predicting prognosis of ulcerative colitis using the same}
본 발명은 동양인의 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC) 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법에 관한 것이다.
최근 유전자형 분석 기술의 발달로 인해, 궤양성 대장염 관련 유전적 감수성 유전자좌(loci)가 많이 밝혀졌다. 유전적 마커들은 궤양성 대장염의 치료 반응 및 임상 경과에 있어 훌륭한 예측자인데, 이들은 시간이 지나도 안정적이고, 주관적 해석이 포함될 여지가 적다. 하지만, 이러한 기대에도 불구하고, 현재 알려진 대부분의 궤양성 대장염 감수성 유전자좌는 궤양성 대장염의 임상 경과와 연관성이 없거나 거의 일치하지 않는다. 이 중, 이전의 서양 연구에 따르면, 백인에게서 가장 강력한 궤양성 대장염 감수성 HLA allele인 HLA DRB1*0103 allele가 대장염(pancolitis) 및 결장절제술(colectomy) 필요성에 연관되어 있다고 보고하였다. 동양인에 있어서, HLA-DRB1*1502 allele는 궤양성 대장염의 감수성과 연관되어 있으나, 이의 난치성(intractability)과의 연관성에 대해서는 일치하지 않는 결과를 나타냈다. 이와 같은 결과는 HLA 부위가 더 연구할 가치가 있다는 것을 나타낸다. 하지만, 궤양성 대장염의 예후를 예측하는 유전적 변이를 찾기 위한 HLA의 포괄적 fine-mapping이 동양인에서는 수행되지 않아 추가적인 연구가 필요한 실정이다.
Nat Genet. 2008; 40(11):1319-23
본 발명의 목적은 rs9268877 단일염기다형성 마커를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 rs9268877 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 rs9268877 단일염기다형성 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측 키트를 제공하는데 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 궤양성 대장염 예후를 예측하는 단계를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측 키트를 제공한다.
본 발명은 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 궤양성 대장염 예후 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 1,324명의 궤양성 대장염 환자(972명의 나쁜 예후 케이스 및 352명의 좋은 예후 케이스)에 대한 3개의 독립적인 발굴 코호트(cohorts) 유래 HLA fine-mapping data와, 587명의 궤양성 대장염 환자(463명의 나쁜 예후 케이스 및 124명의 좋은 예후 케이스)의 재현 data를 이용하여, 케이스 내 분석을 수행하였으며, 궤양성 대장염의 예후와 관련되어 있는 rs9268877 SNP의 변이를 확인하였다. 이에, 본 발명은 궤양성 대장염의 예후 진단에 있어, 치료 전략을 수립하고 환자 맞춤 치료를 진행하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 실험 디자인을 나타내는 모식도이다. 총 1,936명의 궤양성 대장염 환자(476명의 좋은 예후 환자 및 1,460명의 나쁜 예후 환자)가 포함되었다.
도 2는 궤양성 대장염의 나쁜 예후 및 좋은 예후 분류에 대한 모식도이다. 나쁜 예후의 궤양성 대장염은 단계적 접근법을 기반으로 하는 궤양성 대장염 치료 단계에 따라 4개의 서브그룹으로 분류된다.
도 3은 한국인 궤양성 대장염의 임상적 심각성에 대한 케이스 내 HLA 연관 분석 결과를 나타낸다. 가로 점선은 P = 1.0×10-4인 변이를 나타낸다. (a) 카테고리 3의 나쁜 예후(항-TNF 제제 또는 결정절제술을 받은 환자) vs 좋은 예후 분석에서 rs9268877이 가장 유의성 있는 연관성을 나타냈다. (b) rs9268877의 조건화.
도 4는 궤양성 대장염을 가진 1,911명 환자(3개의 발굴 집단 및 재현 집단)에서의 rs9268877에 대한 장기간 임상적 결과 분석을 나타낸다. 한국인 궤양성 대장염 환자에서의 결장절제술 및 약물 사용에 대한 누적 확률을 나타낸다. (a) 결장결제술, (b) 항-TNF 제제 사용, (c) 티오퓨린 사용, (d) 코르티코스테로이드 사용.
도 5는 심각성 서브그룹에 대한 가중 유전 위험 점수의 상자-수염 플롯(Box-and-whisker plots)을 나타낸다. 각 박스는 평균 및 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 가중치는 859명의 환자(611명의 나쁜 예후 케이스, 248명의 좋은 예후 케이스)에서 29개의 궤양성 대장염 감수성 SNPs에 대한 본 발명자들의 이전 연구에서 도출된 β 계수를 기반으로 하였다. (a) 발굴 1 (Immunochip v1.0), (b) 발굴 2 (Immunochip v2.0), and (c) discovery 3 (GWAS).
이에, 본 발명자들은 궤양성 대장염의 예후에 영향을 미치는 유전적 예측 마커를 확인하기 위해서, 한국인 개체에서 좋은 예후의 궤양성 대장염과 나쁜 예후의 궤양성 대장염을 비교하는 케이스 내 연구(within-cases study)를 수행하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A/G일 수 있다.
상세하게는, 상기 궤양성 대장염 예후는 면역억제제 투여 또는 결장절제술이 필요한 나쁜 예후일 수 있으며, 보다 상세하게는, 상기 면역억제제는 코르티코스테로이드, 티오퓨린 및 항-TNF 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 동양인은 한국인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 rs9268877로 표시하여 기재할 수 있다. 상기 rs9268877는 Chromosome 6 상의 HLA-DRA 및 HLA-DRB 사이에 존재하며, 대립유전자형은 A/G이다. 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, A 또는 G일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.
본 발명의 "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 궤양성 대장염 예후를 예측하는 단계를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 궤양성 대장염 예후를 예측하는 단계는 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 AA 동형접합체인 경우, 궤양성 대장염 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.
상세하게는, 상기 동양인은 한국인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계에서, DNA는 대상의 혈액, 피부세포, 점막 세포 및 모발 등 모든 세포로부터 분리될 수 있다. 해당 세포로부터 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 DNA 추출용 키트를 사용할 수 있다.
상기 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCRSSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염 예후 예측 키트를 제공한다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 궤양성 대장염 예후는 면역억제제 투여 또는 결장절제술이 필요한 나쁜 예후일 수 있으며, 보다 상세하게는, 상기 면역억제제는 코르티코스테로이드, 티오퓨린 및 항-TNF 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 동양인은 한국인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험 대상
본 발명자들은 1,324명의 궤양성 대장염 환자(972명의 나쁜 예후 케이스 및 352명의 좋은 예후 케이스)에 대한 3개의 독립적인 발굴 코호트(cohorts) 유래 HLA fine-mapping data와, 587명의 궤양성 대장염 환자(463명의 나쁜 예후 케이스 및 124명의 좋은 예후 케이스)의 재현 data를 이용하여, 케이스 내 분석을 수행하였다(도 1). 좋은 예후의 궤양성 대장염은 5년 이상의 유병 기간 동안 면역억제제[코르티코스테로이드(corticosteroids), 티오퓨린(thiopurines) 또는 항-TNF 제제(anti-TNF agents)] 뿐만 아니라 결장절제술(colectomy)도 필요 없는, 경도 내지 중등도 활성 질환으로 정의된다. 나쁜 예후의 궤양성 대장염은 면역억제제[코르티코스테로이드, 티오퓨린 또는 항-TNF 제제] 및/또는 결장절제술이 필요한 활성 질환으로 정의된다. 나쁜 예후의 궤양성 대장염은 단계적 접근법을 기반으로 하는 궤양성 대장염 치료 단계에 따라 4개의 서브그룹으로 분류된다(도 2). 카테고리 1은 코르티코스테로이드, 티오퓨린, 항-TNF 제제 또는 결장절제술로 치료받는 환자를 포함한다. 카테고리 2는 티오퓨린, 항-TNF 제제 또는 결장절제술로 치료받는 환자를 포함한다. 카테고리 3은 항-TNF 제제 또는 결장절제술로 치료받는 환자를 포함한다. 카테고리 4는 오직 결장절제술을 받는 환자를 포함한다. 발굴 코호트의 1,522명의 환자 중, 중등도 또는 불확실한 예후를 가진 198명의 환자(13.0%)는 제외하였다. 재현 코호트는 좋은 예후를 가진 124명의 환자 및 나쁜 예후를 가진 488명의 환자로 이루어졌다.
모든 환자는 한국계였고, 아산병원 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease; IBD) 클리닉(대한민국, 서울)으로부터 모집하였다. 궤양성 대장염의 진단은 기존의 임상적 판단, 방사선 검사, 내시경 검사 및 병리조직학적 검사 기준에 기초하였다. 본 발명에 참가한 환자들의 인구 통계적 및 임상적 특성은 1997년 이후로 장기적으로 관라되는 아산 IBD 레지스트리로부터 받았다. 몬트리얼 분류법(Montreal classification)에 따른 질병 범위의 변화, 새로운 약물의 투약 및 수술 과정에 대한 정보를 포함하는, 추적 기간 동안의 임상 정보 변화는 클리닉을 방문할 때마다 또는 적어도 매년, IBD 전문가에 의해 업데이트되었다. 본 발명에 참가한 환자들의 인구 통계적 및 임상적 특성은 표 1에 나타냈다.
Figure 112017047871920-pat00001
2. 한국에서의 궤양성 대장염 치료 전략
궤양성 대장염에 대한 본 발명자들의 치료 전략은 단계적 접근법을 기반으로 한다. 국소 및/또는 경구 투여하는 5-아미노살리실레이트(5-aminosalicylates)는 경도(mild) 내지 중등도(moderate) 궤양성 대장염을 완화시키기 위한 1차 치료방법이다. 전신 코르티코스테로이드 치료는 중등도(moderate) 내지 중증(severe) 궤양성 대장염을 가진 환자 및 5-아미노살리실레이트에 반응하지 않는 환자에게 사용하였고, 상기 치료는 2-3 개월에 걸쳐 점차 줄여 중단시켰다. 상기 치료에 실패한 경우, 티오퓨린 및 항-TNF 제제를 스테로이드-의존성 또는 스테로이드-불응성 환자에게 사용하였다. 한국에서, 1차 생물학적 치료는 보험 급여가 거의 적용되지 않고, 항-TNF 제제 적용 범위에 대해 자격 조건을 갖추기 전, 환자들이 보험 급여를 적용받기 위해서는 엄격한 기준을 만족해야만 한다. 정부의 보험 급여를 적용받기 위해서는, 통상적인 코르티코스테로이드 및/또는 티오퓨린 치료에 대한 부적절한 반응 및 증등도 내지 중증 질환 활성이 환자에게 필수적으로 요구된다.
3. 유전형 분석 및 품질 관리
발굴 코호트 1의 샘플은 670명의 궤양성 대장염 환자(189명의 좋은 예후 및 481명의 나쁜 예후)로 구성되었고, 선행 Immunochip 연구의 일부분으로서 유전형 분석하였다. 발굴 코호트 2의 샘플은 464명의 궤양성 대장염 환자(104명의 좋은 예후 및 360명의 나쁜 예후)로 구성되었고, Immunochip v2.0 array을 사용하여 유전형 분석하였다. 발굴 코호트 3의 샘플은 190명의 궤양성 대장염 환자(59명의 좋은 예후 및 131명의 나쁜 예후)로 구성되었고, 선행 GWAS의 일부분으로서 유전형 분석하였다.
품질 관리 기준에 통과하지 못한 샘플 및 SNPs는 제외하였다. 재현 코호트의 유전형 분석은 TaqMan genotyping technology (7900HT Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 753명의 궤양성 대장염 케이스 및 497명의 대조군으로 이루어진 발굴 코호트 2의 유전형 분석은 Immunochip v2.0(the Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles)을 사용하여 수행하였다. X, Y 및 미토콘드리아 염색체 상의 모든 SNPs는 제외하였다. 유전자형 분석 성공률(call rate)이 98% 미만, 대조군에서 Hardy-Weinberg equilibrium으로부터의 유의성 편차가 P < 1.0×10-5 또는 소수 형질 빈도(minor allele frequency; MAF) < 0.01인 SNPs는 제외하였다. 96% 이하의 유전형 분석율은 나타나지 않았다. 최종적으로, 추후 분석을 위해 166,843 SNPs가 남았다. 유전적 관련성을 높이기 위해서(PI_HAT > 0.25, IBS > 0.8), 8개의 샘플(3개의 궤양성 대장염 케이스 및 5개의 대조군)을 제거하였다. 다음으로, 본 발명자들은 PLINK 1.07 software and R을 사용하여 개체군 이상치(outliers) 및 층화(stratification)를 검출하기 위해서, 주성분 분석(principal-component analysis; PCA)을 수행하였다. PCA에 따라, 3개의 샘플(2개의 궤양성 대장염 케이스 및 1개의 대조군)을 확인하고 제거하였다. SNP 및 샘플 품질 관리 분석 후, 본 발명자들은 발굴 코호트 2(평균 유전자형 분석 성공률 99.99%)에서 748명의 케이스 및 491명의 대조군 내 166,843 SNPs가 포함된, 최종적인 Immunochip v2.0 data를 사용하였다.
4. 통계 분석
(1) HLA 결측치 추정(Imputation)
염색체 6의 29M-34M 유래 유전형 분석 데이터를 품질 관리 이후의 데이터세트로부터 추출하였고, SNPs, 전형적인 HLA alleles 및 아미노산의 결측치를 추정하는데 사용하였다. 결측치 추정을 위한 참조 패널은 한국인에서의 HLA 결측치 추정을 정확하게 하기 위해서 한국계 413명의 개체로 이루어졌고, HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQB1 및 DPB1으로 정의되는 10,159개의 이중 마커들(binary markers)을 포함하고 있다. 본 발명자들은 3개의 다른 유전형 분석 플랫폼(Immunochip v1.0, Immunochip v2.0 및 GWAS chip)에 따른 3개의 코호트에 대해서, 10,159개의 이중 마커들로 환자 케이스 및 대조군의 결측치를 추정하였다. 결측치 추정 후, 본 발명자들은 마커들의 INFO 점수(결측치 추정의 정확도를 간접적으로 측정)를 측정하였고, INFO 점수가 0.8 이상인 마커들에 대해서만 분석하였다. 최종 세트에는 총 4,117 SNPs, 4-digit 해상도에서 95 HLA alleles, 2-digit 해상도에서 63 HLA alleles 및 2,500 단일-아미노산 변이가 포함되었다.
(2) 연관 시험을 위한 통계적 접근
본 발명자들은 결측치 추정에 있어 불확실성을 고려한 확률적 유전자형 용량(probabilistic genotypic dosages)을 이용하여 이중 마커들에 대한 연관성을 분석하였다. 본 발명자들은 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 사용하였다. HLA allele data의 결측치가 추정되면, 본 발명자들은 단일쌍 상호 조건부 로지스틱 회귀분석(single pairwise reciprocal conditional logistic regression)을 통해 연관 마커를 확인하였고, 더 많은 연관성을 전방-검색하였다. 본 발명자들은 게놈-와이드 유의성 임계치로 P <5×10- 8를 정의하여 사용하였다.
(3) 2단계 접근법
본 발명자들은 유전형 및 2중 표현형(비교를 위한 임상 경과의 반대편 환자들) 간 케이스 내 로지스틱 회귀분석을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 연관성이 나쁜 예후 케이스에 대한 기준에 따라 의존적인지 확인하였다. 나쁜 예후 케이스는 치료 효능 상승에 따라 4가지 단계로 분류되었다(도 2). 상기 접근법은 효과적인 민감도 분석을 가능하게 하였는데, 이는 최소 나쁜 예후 서브그룹에서 최대 나쁜 예후 서브그룹에 이르기까지 오즈비(odds ratio; OR)가 점차적으로 증가되었기 때문이다. 둘째로, 서브-표현형 중 예후 관련 변이들의 궤양성 대장염 감수성에 있어서의 차이를 설명하기 위해서, 본 발명자들은 로지스틱 회귀분석을 이용하여 케이스-대조군 분석을 수행하였는데, 이는 영향이 없는 건강한 대조군과 비교하여 각 서브타입의 감수성 위험을 측정하기 위함이다(N = 5,416; 1,185 for Immunochip v1.0, 492 for Immunochip v2.0, and 3,739 for GWAS chip).
(4) 메타 분석을 이용한 상호 분석
3개의 독립적인 발굴 코호트 및 재현 코호트의 결과를 조합하기 위해서, 본 발명자들은 3개의 발굴 코호트 및 재현 코호트를 통한 상호 분석(Meta combined) 뿐만 아니라 3개의 발굴 코호트를 통한 발굴 분석(Meta discovery)에 있어서, 고정-효과-메타-분석 모델(역분산 가중 평균산출법)을 사용하여 데이터를 조합하였다.
(5) 임상적 이질성(clinical heterogeneity)에 대한 조절
결장절제술에 있어서, 전대장 침범(Extensive colitis)은 잘 알려진 위험 인자이다. 따라서, 질병 정도를 설명하기 위해서, 본 발명자들은 발굴 분석에 있어 변수로서 진단시 질병 정도에 대한 이중 모델(광범위 vs. 비-광범위 질병[좌측 대장염 또는 직장염])을 포함시켰다. 질병 정도에 대한 데이터는 발굴 분석에 있어서 1,324명의 환자 중 1,170명에 대해 얻을 수 있었다(332명의 좋은 예후 케이스 및 838명의 나쁜 예후 케이스). 질병 정도에 대한 데이터가 없는 샘플들은 제외하였다. 상기 결과들이 추적 기간 동안 궤양성 대장염의 심각성 차이에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, 회귀 분석에 있어 변수로서 유병기간도 포함시켰다.
(6) 유전적 이질성(genetic heterogeneity)에 대한 조절
심각성 표현형 간의 연관성을 확인하기 위해서, 한국인에서 알려진 감수성 유전자좌로부터 유전 위험 점수를 계산하였다. 상기 점수는 이전 연구에서 보고한 궤양성 대장염과 연관된 29 SNPs로부터 계산하였다. 가중된 감수성 allele 수는 관련 β 계수(coefficients)와 위험 alleles의 수를 합하여 계산하였다. 발굴 집단에 있어서, 발굴 1(Immunochip v1.0)에서 24 SNPs, 발굴 2(Immunochip v2.0)에서 27 SNPs 및 발굴 3(GWAS chip)에서 29 SNPs를 얻어냈다. 통계적 유의성은 3개의 발굴 집단에 대해 Prizm (GraphPad. San Diego, CA)에서 제공된 one-way ANOVA test를 이용하여 별도로 측정하였다. 또한, 로지스틱 회귀 분석에서 변수로서 유전 위험 점수를 각 발굴 집단에 대해 별도로 분석하였다.
(7) 유전형에 따른 임상 결과
본 발명자들은 확인된 변이가 임상 결과 및 예후에도 영향을 미칠 수 있는지 평가하였는데, 여기에는 1,911명의 궤양성 대장염 환자에 있어서 결장절제술 및 약물 사용(항-TNF 제제, 티오퓨린 및 코르티코스테로이드)에 대한 누적 확률이 포함된다. 누적 확률은 log-rank test에 따라 측정된 차이로 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석하였다. 직접 연관성과 간접 연관성을 구별하기 위해서, 본 발명자들은 다른 표현형(발병 나이, 성별, 궤양성 대장염 진단시 흡연 상태 및 궤양성 대장염 진단시 질병 정도)에 대한 모든 회귀 분석 모델도 조절하였다. P 수치가 0.05 이하이면 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 통계적 측정은 통계 소프트웨어 패키지 Prizm (GraphPad. San Diego, CA) 및 SPSS 21.0 for Windows (IBM SPSS, Ver. 21.0; IBM Co., Armonk, NY)를 사용하여 수행하였다.
5. 후보 유전자 및 기능적 영향
연관 부위에서의 관심 유전자는 Ensembl, UCSC Genome Bioinformatics, and GeneCards를 사용하여 확인하였다. 상위 연관된 변이들의 기능적 영향을 예측하기 위해서, 본 발명자들은 ENCODE project data, HaploReg(v4) 및 RegulomeDB를 사용하였다. 본 발명자들은 관심 유전체 부위 내 발현 양적 형질 유전자좌(expression quantitative trait locus; eQTL)를 조사하기 위해서 GTEx를 사용하였다.
6. URLs
HLA Korean reference panel, https://sites.google.com/site/scbaehanyang/hla_panel.
< 실시예 >
높은 확률을 가진 예후-연관 변이를 찾기 위해서는, 정확한 표현형 및 표현형 결과를 활용하기 위한 적절한 전략이 중요하다. 궤양성 대장염의 예후에 대한 유전적 예측 확인에 있어, 기존의 연구들은 환자들을 결장절제술을 시행한 환자와 그렇지 않은 환자, 단지 2개의 그룹으로 분류함으로써 한계가 있었다. 이러한 분류는 결정절제술을 시행하지 않은 환자들 사이에서 예후 이질성(prognostic heterogeneity)을 초래할 수 있는데, 이는 확고한 결론을 내리는데 방해가 될 수 있다. 이를 우회하기 위해서, 본 발명자들은 '극단의 표현형(extremes of phenotype)' 접근법을 적용하였다. 예후 스펙트럼의 반대편 극단에 있는 총 1,936명의 궤양성 대장염 환자, 즉 좋은 예후 궤양성 대장염을 가진 476명의 환자(5년 이상의 추적 기간 동안 면역억제제 및 결정절제술이 필요없는 경도 내지 중등도 활성 질환으로 정의) 및 나쁜 예후 궤양성 대장염을 가진 1,460명의 환자(면역억제제 및/또는 결장절제술이 필요한 모든 활성 질환으로 정의)가 본 발명에 포함되었다(도 1). 나쁜 예후 궤양성 대장염은 단계적 접근법에 기반한 궤양성 대장염 치료 방법에 따라 4개의 서브그룹으로 분류되었다(도 2). 본 발명자들은 다른 기술(Immunochip v1.0, Immunochip v2.0 및 GWAS chip)로 구별된 3개의 한국인 코호트에 대해 별도로 결측치 추정을 수행하였는데, 1,324명의 환자에서 the Korean reference panel version 1.1 (N = 413)으로 SNP2HLA를 사용하여 전형적인 HLA alleles, 아미노산 및 SNPs로 정의된 10,159개의 이중 마커에 대해 분석하였다. 결측치 추정 품질(INFO) 점수가 <0.8인 변이는 분석에서 제외하였다(N = 3,384). 본 발명자들은 추가적으로 612명의 환자들도 재현 분석하였고, 고정-효과 메타-분석을 이용하여 3개의 발굴 집단 및 재현 집단으로부터 얻은 결과를 조합하였다(도 1).
아미노산, 전형적인 alleles 및 SNPs에 대해 모두 시험한 후, 본 발명자들은 rs9268877이 나쁜 예후 궤양성 대장염과 가장 강하게 연관되어 있는 것으로 확인하였다(카테고리 3의 나쁜 예후 vs. 좋은 예후; OR = 1.70; 95% CI = 1.41-2.05; P combined = 3.54×10-8; 표 2 및 도 3). 또한, 4개의 독립적인 코호트 각각에 대해 카테고리 1 내지 카테고리 4의 나쁜 예후 케이스에서 OR은 점차적으로 증가하였다(표 2). rs9268877의 조건화에 있어서, 어떠한 의존적 연관성도 관측되지 않았다(P > 10-4; 도 3). 가장 강력하게 연관된 전형적인 allele는 HLA DRB4*0101(카테고리 3의 나쁜 예후 vs. 좋은 예후; OR = 0.57; P discovery = 5.88×10- 5)이지만, rs9268877 조건화 결과에서 HLA DRB4*0101는 통계적으로 구별할 수 없었다. 임상적 이질성을 반영하기 위해서, 본 발명자들은 궤양성 대장염 진단시 질병 정도 및 유병 기간에 대해 조절한 통계적 접근법을 적용하였고, 일관성 있는 연관성을 확인하였다(표 3).
Figure 112017047871920-pat00002
Figure 112017047871920-pat00003
GTEx v6p dataset을 기반으로, 대장 조직 및 전혈에서 HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB1-AS1 및 HLA-DRB1을 포함하는 class II 유전자들의 발현에 있어, rs9268877은 시스 작용(cis-acting)을 한다. 또한, 7q34 상 TCRβ 유전자좌의 일부분인 T cell receptor beta variable 18 (TRBV18) 및 acyloxyacyl hydrolase (AOAH)를 포함하는 가능성 있는 후보 유전자들의 발현에 있어, rs9268877은 트랜스 작용(trans-acting)을 한다. TCRβ 돌연변이 마우스는 자발적인 대장염이 발병한 것으로 보고되었다. AOAH는 Th17 반응 및 점막 T-세포 면역성에 영향을 미치는 마이크로비오타(microbiota) 신호를 조절하는 것으로 알려졌다. 트랜스-유전자 발현에 있어, rs9268877은 LIMS1, ARHGAP24, RPL34, DEF8, KRT18, B4GALT2 및 ASB5를 포함하는 가능성 있는 다른 후보 유전자들에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 하지만, 궤양성 대장염의 예후를 결정하는 생물학적 기작은 아직 불명확하고, 정확한 기작을 밝히기 위한 추후 연구가 필요하다.
임상적 관련성을 확인하기 위해서, rs9268877에 대한 장기간 결과를 분석하였다. 한국인 궤양성 대장염 환자에 있어서, rs9268877에 대한 위험 allele는 결장절제술 및 약물 사용에 대한 높은 누적 확률과 연관되어 있었다(도 4). 결장절제술은 동형접합체(AA)에서 9.9% (38/382), 이형접합체(AG)에서 5.7% (48/840) 및 비-보균자(GG)에서 2.9% (21/714)가 시행되었다. 결장절제술의 누적 확률은 비-보균자(GG)에 비해 동형접합체(AA)에서 상당히 높았다. 10년에서는 9.8% vs. 2.6%, 20년에서는 19.5% vs. 4.6% 및 30년에서는 27.5% vs. 6.1% 였다(P <0.0001; 도 4a). 또한, 항-TNF 제제, 티오퓨린 및 코르티코스테로이드의 사용에 있어서도 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타냈다(도 4b, 도 4c 및 도 4d). 다변량 콕스 분석(Multivariate Cox analysis) 결과, 결장절제술 및 약물 사용에 있어 rs9268877는 독립적인 예측자인 것으로 나타났다.
감수성 변이들이 종합적으로 예후에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 한국인 개체군에서 확인된 29개의 궤양성 대장염 위험 유전자좌를 이용하여 각 환자들에 대해 유전 위험 점수를 계산하였다. 발굴 코호트 1 및 2에 있어서 좋은- 및 나쁜-예후 서브그룹 사이의 유전 위험 점수에 대한 유의적 차이는 없었다(도 5). 더구나, 발굴 코호트 3에서는 좋은-예후 케이스가 나쁜 예후 케이스 보다 더 높은 유전적 책임을 보였다(도 5c). 예후와 연관된 rs9268877은 한국인에서의 궤양성 대장염 감수성과는 연관되지 않았으나, 흥미롭게도 백인에서는 궤양성 대장염 감수성 위험 SNP로 나타났다(표 4). 또한, 발굴 데이터세트에서 유전 위험 점수 이질성을 조절한 후에도, 본 발명자들은 rs9268877에서 유사한 효과를 확인하였다(표 3). 상기 효과는 재현되었을 뿐만 아니라, rs9268877의 효과 범위도 상당히 일치하였다(조절 후; OR = 1.82; P discovery = 6.55×10-7). 상기 결과는 궤양성 대장염의 예후과 연관된 유전적 구조가 질병 감수성과는 차이가 난다는 것을 강력하게 나타낸다.
결론적으로, 본 발명자들은 궤양성 대장염의 예후와 관련되어 있는 HLA-DRA 및 HLA-DRB 사이에 존재하는 유전자 사이 영역 변이를 확인하였는데, 이는 질병 감수성과는 차이가 있었다. 본 발명은 궤양성 대장염의 예후 진단에 있어 새로운 시야를 제공할 수 있으며, 치료 전략을 수립하고 환자 맞춤 치료를 진행하는데 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명은 종단 분석을 통한 계층화된 표현형을 궤양성 대장염에 적용하였으며, 치료 반응 및 임상 과정 중 유전적 예측자를 찾기 위해서 다양한 질환으로도 범위를 확대시킬 수 있을 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Figure 112017047871920-pat00004
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Composition of single nucleotide polymorphism markers for predicting prognosis of ulcerative colitis in Asians and method for predicting prognosis of ulcerative colitis using the same <130> ADP-2017-0105 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggtctatct tattattcct aaattctctg agcaccttct tcacagataa gaatgttgaa 60 aaataaaaat atgtgaagtt gccgtcactg tagcttgcat rgttagcact gcagtctatg 120 ctcatgtgcc aagcttagat tgccatattt agcaaataaa aatagagggt gcctagttaa 180 atttggattt caaatacatt a 201

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC) 중증도(severe) 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A/G인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후는 면역억제제 투여 또는 결장절제술이 필요한 나쁜 예후인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역억제제는 코르티코스테로이드, 티오퓨린 및 항-TNF 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 동양인은 한국인인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측용 조성물.
  6. 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
    상기 확인된 유전자형으로 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후를 예측하는 단계를 포함하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후를 예측하는 단계는 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 AA 동형접합체인 경우, 궤양성 대장염 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 동양인은 한국인인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후는 면역억제제 투여 또는 결장절제술이 필요한 나쁜 예후인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역억제제는 코르티코스테로이드, 티오퓨린 및 항-TNF 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측 키트.
  12. 제9항에 있어서, 상기 동양인은 한국인인 것을 특징으로 하는 동양인의 궤양성 대장염 중증도(severe) 예후 예측 키트.
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