KR101903334B1 - Method of individual identification and paternity test using the microsatellite marker composition in dogs - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for individual identification and a paternity test of a dog using a microsatellite marker composition. According to the present invention, the method for individual identification and a paternity test of a dog using a microsatellite marker composition includes: (a) a step of multiplex PCR amplifying a nucleic acid specimen of a dog to be analyzed by using a primer having a base sequence indicated as sequence numbers 1 to 34 and being specific to the microsatellite marker composition comprising VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X, and DOG-Y; (b) a step of separating each locus allele of a product amplified in the step (a) and calculating a frequency, a heterozygosity, a polymorphism information content, discrimination, exclusion power, an accumulated concordance rate, and accumulated exclusion power of each right and left allele; and (c) a step of decoding the base sequence of each locus allele and naming an allele number based on the sum of a repeat number of the repeated base sequence.

Description

마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법{Method of individual identification and paternity test using the microsatellite marker composition in dogs}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a microsatellite marker composition for dog identification and paternity identification using a microsatellite marker composition,

본 발명은 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 개의 개체식별 및 친자확인에 사용할 수 있도록 각각의 개 개체의 유전적 다형성에 근거하여 개체식별력이 0.9 이상, 배제력 0.6 이상으로 높은 마이크로새틀라이트 마커(Microsatellite marker) 15개와 성(sex)을 구별하는 마커 2개를 동시에 증폭 가능한 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)과 반복염기서열의 반복횟수에 따른 대립유전자명명을 통한 기존의 기술보다 경제적이고 신속 정확한 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a dog identification and a paternity identification method using a microsatellite marker composition, and more particularly, to a dog identification and paternity identification method using a microsatellite marker composition, (Multiplex PCR) which can simultaneously amplify 15 microsatellite markers and two markers that distinguish sex from each other, which are higher than the exclusion value of 0.6 or more, and the number of repetitive nucleotide sequences The present invention relates to a method for identification and identification of a dog using an economical and rapid accurate microsatellite marker composition.

최근 반려견 인구가 일천 만에 이를 정도로 급속한 증가와 더불어 유기견의 대량발생 문제 및 인명과 관련한 사고가 매년 급증하고 하고 있다(소방청, 2016).Recently, the population of the dogs has increased rapidly to a level of one million, and the mass production of organic dogs and accidents related to human life are rapidly increasing every year (Fire Department, 2016).

2015년 농림축산식품부는 '동물복지 5개년 종합계획'에 따라 반려견에 대해 사육자의 인적사항이 포함된 내장형칩 또는 외장형칩 또는 인식표를 의무적으로 반려견에 장착하게 하였으며, 최근 정부에서는 동물보호법 개정으로 반려견 사육자에 대한 지자체 등록을 의무와 하였다(동물보호법 개정시행, 2018, 03, 22).In 2015, the Ministry of Food, Agriculture, Forestry and Livestock has obliged the dogs to attach to their dogs a chip or an external chip or an identification tag containing the personal information of the breeder in accordance with the "Five-Year Comprehensive Plan for Animal Welfare." Recently, (Article 2018, 03, 22) of the Animal Protection Act.

이 법률에서는 반려견 사육자의 안전조치 및 사육에 관한 의무를 다하지 않았을 경우 해당사항에 따른 벌칙을 강화적용하고 있다. This law enforces penalties for breeding dogs who do not fulfill their obligation for safety measures and breeding.

하지만 내장형 칩 등 인적사항을 확인할 수 있는 이식표가 없는 유기견이 2015년 59,633 마리, 2016년 62,742 마리, 2017년 83,838 마리로 그 발생빈도가 급등하고 있다(농림축산식품부, 2017). However, there are 59,633 dogs, 2017 dogs, 62,742 dogs, and 83,838 dogs that do not have any transplants to check personal information such as built-in chips (Food, Agriculture, Forestry and Livestock Foods, 2017).

즉 반려견의 주인을 확인할 수 있는 내장형 칩 또는 인식표가 반려견 유기 시에는 제거되어 유기 된다는 것을 반증하는 증거라 할 수 있다.In other words, it is evidence that the built-in chip or the identification tag that identifies the host of the dog is removed and the organism is removed.

이와 같은 반려견 사육자의 추적불가 문제를 극복할 수 있는 방안으로 바로 개의 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석(Microsatellite DNA genotyping)이 있다.Microsatellite DNA genotyping is a method to overcome the inability to trace such a dog breeder.

반려견을 지자체에 등록할 때 사육자의 인적사항과 함께 해당 반려견의 유전자 지문을 함께 등록하면 유기견 발생 시 인식표가 없다고 하여도 반려견의 유전자검사를 통해 유기견의 주인을 추적할 있는 것이다.When registering a dog with a dog, it is possible to trace the owner of the dog through a genetic test of a dog, even if it is said that there is no dog tag when the dog is registered.

또한 반려견의 마이크로새틀라이트 유전자지문은 어미로부터 정확히 50%, 아비로부터 정확히 50%를 유전받아 형성되는 것으로 이를 분석하면 부모 개체와의 친자확인이 가능해진다. 반려견 인구의 급증과 함께 고가 반려강아지의 혈통 위변조, 반려견 분실과 원 소유주와 현재 보호자간의 소유권 분쟁 등의 문제 또한 증가하고 있다.In addition, the microsatellite fingerprint of the dog is formed by inheriting 50% from the mother and exactly 50% from the father, which allows identification with the parent. With the surge in the number of dogs, there are also increasing problems such as the forgery of puppies, the loss of dogs, and ownership disputes between the original owner and the current protector.

이와 같이 법적으로 민감한 사항에 대해 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석(Microsatellite DNA genotyping)을 통한 개체동일성검사 또는 친자확인 검사로 그 법적인 지휘를 명확히 구별해낼 수도 있다.This legally sensitive subject may also be clearly distinguished from the legal directive by an individual identity test or paternity test through microsatellite DNA genotyping.

이를 이루기 위해선 저렴하고 신뢰성 있는 마이크로새틀라이트 유전자 지문분석 기술이 절대적으로 필요하다. In order to achieve this, an inexpensive and reliable microsatellite fingerprint analysis technology is absolutely necessary.

하지만 기존의 개의 유전자지문분석법(개체식별 및 친자확인)의 거의 대부분은 염기서열 반복군의 반복단위가 염기 2개로 이루어진 di-nucleotide repeat 마이크로새틀라이트 마커를 사용하여 유전자지문분석을 해왔다. Di-nucleotide repeat 마이크로새틀라이트 마커는 PCR 증폭산물에서 stutter 및 nonspecific peak이 다량으로 자주 발생하여 정확한 유전자형 판독에 많은 어려움이 있어 검사결과의 판독 오류의 발생문제가 빈번하게 발생하며, 그 마이크로새틀라이트 마커의 조합 수가 적어 같은 시료에 대해 각기 다른 방법으로 2~3회 반복해야 하거나 또는 그 누적식별력과 누적배제력이 낮아 검사결과를 신뢰할 수 있을 만큼 정확한 검사가 어렵다는 단점이 있다.However, almost all of the existing gene fingerprinting methods (individual identification and paternity identification) have been subjected to genetic fingerprint analysis using di-nucleotide repeat microsatellite markers consisting of two repeating units of the nucleotide repeat group. Di-nucleotide repeat Microsatellite markers are frequently encountered in the PCR amplification products due to frequent occurrence of stutter and nonspecific peaks, which makes it difficult to read correct genotypes, resulting in frequent occurrence of read errors in test results. It is necessary to repeat the same two or three times with different methods or the cumulative discrimination power and the cumulative exclusion force are low, which makes it difficult to accurately test the test results so as to be reliable.

또한, 현재 한국등록특허 제10-1156047호(발명의 명칭: 초위성체 마커 조성물 및 이를 이용한 개의 개체 식별방법)에서 개의 마이크로새틀라이트(microsatellite)을 이용한 개의 개체 식별방법을 다루고 있는데, 이 기술이 특허 등록된 기술로는 유일한 실정이다.In addition, currently Korean Patent No. 10-1156047 (titled "supsatellite marker composition and dog identification method using the same") describes dog identification methods using microsatellite, Registered technology is unique.

하지만, 상기 선행특허에서 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR) 조성물은 마이크로새틀라이트 10좌위 세트, 6좌위 세트, 11좌위 세트로 각각 나누어져 있다.However, the multiplex PCR (Multiplex PCR) composition is divided into a microsatellite 10-position set, a 6-position set, and an 11-position set in the preceding patent.

따라서 국내의 1천만에 이르는 반려견 집단에서 개별 개체를 식별해내 위해선 누적식별력을 고려해 상기 특허기술 중 최소한 2종 이상의 마이크로새틀라이트 세트를 선택해 2회 이상 분석해 결과를 종합해야 한다는 치명적 단점이 있다.Therefore, there is a fatal disadvantage that at least two microsatellite sets among the patented technologies must be selected and analyzed more than two times in order to identify individual individuals in a population of 10 million domestic dogs.

또한 선행 특허에는 성별을 구분할 수 있는 마커가 포함되어 있지 않기 때문에 암수를 구분할 수 없다는 단점이 있다.In addition, there is a disadvantage in that the prior patent can not distinguish male and female since the markers which can distinguish gender are not included.

더구나 상기의 선행특허는 각 좌위별 식별력, 배제력, 누적식별력, 누적배제력이 제시되지 않아 개의 개체식별 또는 친자확인에 사용할 없을뿐더러 대립유전자의 명명을 증폭된 DNA의 길이(bp)로 하고 있어 실험실 환경 또는 실험자에 따라 그 결과가 달라질 수 있어 상용화할 수 없다는 단점이 있다.Moreover, the above-mentioned prior patent does not use discrimination power, exclusion power, cumulative discrimination power, and cumulative exclusion power for each seat, so it is not used for dog identification or paternity identification, and the allele gene is named as amplified DNA length (bp) The results may vary depending on the laboratory environment or the experimenter, so that it can not be commercialized.

개의 친자확인 및 개체식별 검사 방법에 관해 국내에서 개발되어 상용화된 기술은 전무하며, 현재 개의 친자확인 및 개체식별에 사용되고 있는 DNA분석은 "Canine ISAG STR Parentage Kit"(Thermo Fisher scientific, USA)라는 수입 제품에 전적으로 의존하고 있는 실정이다. There is no technology developed and commercialized in Korea for the identification of paternity identification and individual identification. Currently, the DNA analysis used for parent identification and individual identification is "Canine ISAG STR Parentage Kit" (Thermo Fisher scientific, USA) It is totally dependent on the product.

이 수입제품은 총 22개의 마이크로새틀라이트 DNA 좌위를 multiplex PCR을 통해 동시 증폭하는 방식을 취하고 있는 것이 특징이다.This imported product is characterized by the simultaneous amplification of 22 microsatellite DNA loci by multiplex PCR.

좌위의 수가 많은 만큼 개체식별력과 배제력이 높을 것으로 예상되지만 아쉽게도 현재까지 국내의 반려견 집단에서의 개체식별력과 배제력이 얼마나 되는지와 각 좌위의 대립유전자 빈도가 어떻게 분포되는지에 대한 연구가 전문한 상태이다.Although it is expected that individual discrimination and exclusion power will be high as the number of seats is high, unfortunately, studies on how individual discrimination and elimination power are distributed in the domestic dog group and how the allele frequency of each seat is distributed are specialized to be.

따라서 이 검사방법으로 실제로 개의 개체식별 또는 친자확인에 법과학적 용도로 사용하기에는 집단유전학적 오류의 위험이 따르며, 이 제품을 구성하고 있는 마이크로새틀라이트 좌위 22개중 21개가 디-뉴클레오타이드 반복(di-nucleotide repeat) 마이크로새틀라이트 마커로 이루어져 있어 유전자 분석 시 증폭산물에서 중복밀림현상(stutter) 및 비특이적(nonspecific)인 DNA 증폭 산물이 자주 발생해 정확한 유전자형 판독에 많은 어려움이 있어 검사결과의 판독 오류가 발생할 수 있는 문제점이 있다.Therefore, there is a risk of population genetic error in using this test method for legal scientific purposes in dog identification or paternity identification. Of the 22 microsatellite loci constituting this product, 21 are di-nucleotide repeats repeat) and microsatellite markers, DNA amplification products are frequently generated in the amplification products during staining and nonspecific amplification products, making it difficult to accurately identify genotypes. There is a problem.

또한, 마이크로새틀라이트 좌위는 그 반복 단위를 구성하고 있는 염기의 개수에 따라 모노(mono), 디(di), 트라이(tri), 그리고 테트라-뉴클레오타이드 반복(tetra-nucleotide repeat)으로 분류되는데, 모노, 디, 트라이- 뉴클레오타이드 반복 형태인 마이크로새틀라이트는 PCR을 수행하는 동안 strand slippage현상으로 인해 실제 대립유전자보다 2bp 또는 그 이하로 길이가 짧은 PCR 산물이 다수 생성되어 실제 대립유전자의 결정에 많은 어려움을 준다. In addition, microsatellite loci are classified into mono, di, tri, and tetra-nucleotide repeats depending on the number of bases constituting the repeating unit, , Microsatellite, which is a repeating form of di-tri-nucleotide, generates many PCR products with a short length of 2 bp or shorter than the actual allele due to strand slippage during PCR, give.

이러한 현상으로 PCR 산물을 전기영동 하였을 때 나타나는 대립유전자의 중복된 밀림 현상을 shutter라고 부른다(Walsh et al., 1996).This phenomenon is referred to as shuttering (Walsh et al., 1996), which is caused by duplication of alleles when PCR products are electrophoresed.

마이크로새틀라이트 반복구간의 반복단위가 짧은 디(di)와 트라이-뉴클레오타이드(tri-nucleotide) 형태인 마이크로새틀라이트는 중복밀림현상(stutter)의 비율이 실제 대립유전자의 검출강도와 비교해 40~95%까지 발생하기 때문에 실제 대립유전자와 중복밀림현상(stutter)을 구별하기 힘들며, 특히 한 번의 반복단위 차이로 연접한 이형접합자라면 실제 대립유전자를 정확히 구별하기가 매우 힘들다.Microsatellite, which is a repeating unit of microsatellite repeats with short di and tri-nucleotide forms, has a ratio of overlapping stuttering of 40 to 95% , It is difficult to distinguish the actual allele from the overlapping stutter. Especially, it is very difficult to distinguish the true allele correctly if the heterozygote is linked by one repeat unit difference.

이러한 단점을 극복하기 위해 고안된 분석방법이 테트라-뉴클레오타이드 형태인 마이크로새틀라이트를 이용하는 방법이지만, 아쉽게도 개의 개체식별 및 친자확인과 관련하여 아직 국내는 물론이고 전 세계에 상용화할 수 있을 만큼의 경제성, 신뢰성, 정확성을 지닌 테트라-뉴클레오타이드 반복(tetra-nucleotide repeat) 마이크로새틀라이트로 구성된 기술은 전무하다.In order to overcome these drawbacks, microsatellite, which is a tetra-nucleotide type, has been used as a method of analysis designed to overcome this disadvantage. Unfortunately, regarding the identification of individual dogs and identification of paternity, , And no tetra-nucleotide repeat microsatellite with accuracy.

한국등록특허 제10-1156047호Korean Patent No. 10-1156047

상기와 같은 문제를 해결하고자, 본 발명은 기존의 디-뉴클레오타이드 반복 마이크로새틀라이트로 구성된 선행 검사방법의 결과 판독 오류 가능성을 완전히 배제할 수 있는 테트라-뉴클레오타이드 반복 마이크로새틀라이트들로 구성된 Multiplex PCR(다중중합효소연쇄반응 피씨알: 이하 멀티플렉스 PCR이라 함) 세트를 이용하고, 기존의 선행 분석방법들에서 분석기기의 변경, 분석자의 변화, 실험실의 환경조건 등에 의해 대립유전자의 분석 값이 달라지는 현상을 해결하기 위해 각 대립유전자의 염기서열을 해독하고 그 반복 염기서열의 반복횟수에 따라 대립유전자를 명명하는 것으로 항상 같은 대립유전자분석 값을 나타낼 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법을 제공하는데 있다.In order to solve the above problems, the present invention provides a multiplex PCR system consisting of tetra-nucleotide repetitive microsatellites which can completely eliminate the possibility of reading the result of a preliminary test method composed of a conventional de-nucleotide repeat microsatellite PCR assay), and the analysis results of alleles varied according to changes in analytical instrumentation, analyst change, and laboratory environmental conditions in the existing pre-analysis methods. In order to solve this problem, the base sequence of each allele is decoded and the allele is named according to the repetition number of the repeated base sequence. Therefore, the microsatellite marker composition which can always show the same allele analysis value, And to provide a verification method.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커는 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 개의 개체를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공할 수 있다.In order to solve the above problems, a micro satellite marker according to an embodiment of the present invention may include a micro satellite marker, such as VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063 , DOG-X and DOG-Y can be provided.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 개 개체식별용 키트는 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 1 내지 34로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 개 개체식별용 키트를 제공할 수 있다.Also, the dog identification kit according to the embodiment of the present invention may include a dog identification kit, such as VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG- -Y, which is specific to a microsatellite marker composition comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 34, can be provided.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법은 (a) 분석하고자 하는 개의 핵산 시료를 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 1 내지 34로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분리해 각 좌우별 대립유전자의 빈도, 이형접합률, 다형정보지수, 식별력, 배제력, 누적일치율 및 누적배제력을 산출하는 단계 및 (c) 각 좌위의 대립유전자의 염기서열을 해독하고, 반복염기서열의 반복횟수의 총합으로 대립유전자 번호를 명명하는 단계를 포함하는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법을 제공할 수 있다.In addition, the dog identification and paternity identification methods using the microsatellite marker composition according to an embodiment of the present invention can be carried out by (a) analyzing the nucleic acid samples to be analyzed with VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328 1 to 34, which is specific to a microsatellite marker composition consisting of VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG- A step of performing a PCR amplification; (b) The alleles of each locus of the product amplified in step (a) are isolated and the frequency, heterozygosity, polymorphism information index, discrimination power, exclusion power, cumulative agreement rate and accumulated exclusion power of each left and right alleles are calculated And (c) decoding the nucleotide sequence of alleles of each locus and naming the allele number by the sum of the repetition number of repeating nucleotide sequences. A verification method can be provided.

또한, 상기 (a) 단계는 상기 상기 마이트로새틀라이트 마커 조성물에 서열번호 1 및 2는 1.71 내지 1.91pM, 서열번호 3 및 4는 2.71 내지 2.91pM, 서열번호 5 및 서열번호 6은 3.26 내지 3.46pM, 서열번호 7 및 서열번호 8은 2.49 내지 2.69pM, 서열번호 9 및 10은 0.79 내지 0.99pM, 서열번호 11 및 12는 1.32 내지 1.52pM, 서열번호 13 및 14는 2.19 내지 2.39pM, 서열번호 15 및 16은 3.72 내지 3.92pM, 서열번호 17 및 18은 0.81 내지 1.01pM, 서열번호 19 및 20은 1.74 내지 1.94pM, 서열번호 21 내지 22는 2.10 내지 2.30pM, 서열번호 23 및 24는 2.08 내지 2.28pM, 서열번호 25 및 26은 0.55 내지 0.75pM, 서열번호 27 및 28은 0.50 내지 0.70pM, 서열번호 29 및 30은 1.45 내지 1.65pM, 서열번호 31 및 32는 4.01 내지 4.21pM, 서열번호 33 및 34는 2.01 내지 2.21pM의 농도로 혼합되는 것을 특징으로 한다.In the step (a), the saturation marker composition according to SEQ ID NOs: 1 and 2 is 1.71 to 1.91 pM, the peptides of SEQ ID NO: 3 and 4 are 2.71 to 2.91 pM, the peptides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: pM, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are 2.49 to 2.69 pM, SEQ ID NO: 9 and 10 are 0.79 to 0.99 pM, SEQ ID NO: 11 and 12 are 1.32 to 1.52 pM, SEQ ID NO: 13 and 14 are 2.19 to 2.39 pM, 15 and 16 are 3.72 to 3.92 pM, SEQ ID NOS 17 and 18 are 0.81 to 1.01 pM, SEQ ID NOS 19 and 20 are 1.74 to 1.94 pM, SEQ ID NOS 21 to 22 are 2.10 to 2.30 pM, SEQ ID NOs: 27 and 28 are 0.50 to 0.70 pM, SEQ ID NOs: 29 and 30 are 1.45 to 1.65 pM, SEQ ID NOs: 31 and 32 are 4.01 to 4.21 pM, SEQ ID NOs: And 34 are mixed at a concentration of 2.01 to 2.21 pM.

또한, 상기 프라이머에 FAM, VIC, NED, PET로 형광표지(Label)를 하는 단계를 더 포함할 수 있다.Further, the method may further comprise fluorescent labeling the primer with FAM, VIC, NED, or PET.

상기와 같은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법은 각각의 개 개체의 유전적 다형성에 근거하여 개체식별력이 0.9 이상, 배제력 0.6 이상으로 높은 마이크로새틀라이트 마커(Microsatellite marker) 총 15개와 성(sex)을 구별하는 마커 2개를 동시에 증폭 가능한 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)과 반복염기서열의 반복횟수에 따른 대립유전자명명을 통한 기존의 기술보다 경제적이고 신속 정확하게 개의 개체식별 및 친자확인을 할 수 있다.Based on the genetic polymorphisms of individual dogs, the individual dog identification and paternity identification methods using the microsatellite marker composition according to the present invention as described above are characterized in that the microorganism having high individual identification ability of 0.9 or more and exclusion power of 0.6 or more Microsatellite markers Multiplex PCR that can simultaneously amplify 15 markers that distinguish sex from two markers that can discriminate sex from each other and the existing technology by naming alleles according to the repetition number of repetitive nucleotide sequences More economical, faster and more accurate identification of dogs and paternity identification.

이에 따라, 동시에 성도 판별할 수 있고, 분석마다 항상 같은 대립유전자분석 값을 얻을 수 있도록 한다.Thus, simultaneous discrimination can be made, and the same allelic analysis value can always be obtained for each analysis.

이를 통해, 각 개체마다의 고유한 마이크로새틀라이트 유전자지문을 확보할 수 있고, 이 정보를 반려견 지자체 등록 시 함께 등록하면 반려견에 삽입되었던 내장형 칩이 제거되어도 사육자를 정확히 찾아낼 수 있어 사육자의 반려동물 보호 의무에 위반에 따른 법적책임 소재를 명확히 할 수 있다.In this way, it is possible to obtain a unique microsatellite fingerprint for each individual, and when this information is registered together with the registration of the local dog, the dog can be accurately identified even if the embedded chip inserted in the dog is removed. It is possible to clarify the legal responsibility for violating the protection obligation.

또한, 고가에 거래되는 반려견 강아지의 혈통 위변조 시 생물학적 친생자확인 및 반려견 분실시 반려견의 원 소유주와 현재 보호자간의 소유권 분쟁등과 같은 법적인 문제 발생에 과학적인 결정적 증거를 제시해줄 수 있다.In addition, it is possible to provide scientific and conclusive evidence for the occurrence of legal problems such as the confirmation of the biological siblings and the dispute between the original owner of the dog and the present guardian when the dog is breached.

이와 같은 본 발명의 개의 개체식별 및 친자확인 방법은 현재 국내에서 개의 개체식별 및 친자확인에 사용할 수 있는 상용화된 유전자검사 기술이 전문한 상태이기 때문에, 키트화하여 공급한다면 대한민국의 반려견 관리 및 진위여부 판별에 혁신적인 발전을 가져올 것으로 기대된다.The dog identification and paternity identification methods of the present invention are currently in a state of being specialized in commercial genetic testing techniques that can be used for dog identification and paternity identification in Korea. Therefore, if kits are supplied and supplied, It is expected that innovative development will be made in the discrimination.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트를 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법을 이용하여 얻어진 임의로 선택된 수놈 개체의 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물의 모세관전기영동 결과.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트를 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법을 이용하여 얻어진 임의로 선택된 암놈 개체의 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물의 모세관전기영동 결과.FIG. 1 is a result of capillary electrophoresis of products amplified by multiplex PCR of randomly selected male genomes obtained using a microsatellite-based individual identification and paternity identification method according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a result of capillary electrophoresis of products amplified by multiplex PCR of arbitrarily selected female genome obtained by dog identification and paternity identification using microsatellite according to an embodiment of the present invention.

본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.As used herein, the singular forms "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It is also to be understood that the terms " comprising, " " comprising, " or " having ", and the like are intended to designate the presence of stated features, integers, And should not be construed to preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the relevant art and are to be interpreted in an ideal or overly formal sense unless explicitly defined in the present application Do not.

여기서, 반복되는 설명, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능, 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명의 실시형태는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, a repeated description, a known function that may obscure the gist of the present invention, and a detailed description of the configuration will be omitted. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

이하, 도면을 참조한 본 발명의 설명은 특정한 실시 형태에 대해 한정되지 않으며, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 또한, 이하에서 설명하는 내용은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the description of the present invention with reference to the drawings is not limited to a specific embodiment, and various transformations can be applied and various embodiments can be made. It is to be understood that the following description covers all changes, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the present invention.

이하, 본 발명의 실시 예를 첨부한 도 1 및 도 2를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 1 and 2.

본 발명은 개의 개체식별 및 친자확인에 유용하게 사용될 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물, 상기 마커 조성물을 포함하고 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 키트 및 상기 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a kit comprising a microsatellite marker composition useful for dog identification and paternity identification, a kit comprising the marker composition and a primer capable of amplifying the gene, and a kit containing the microsatellite marker composition Identification and paternity identification methods.

즉, 개체식별력이 0.9 이상 및 배제력 0.6 이상으로 높은 마이크로새틀라이트 마커 15개와 성(sex)을 구별하는 마커 2개를 포함하는 총 17개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용하여 개체식별 및 친자확인의 정확성을 높이고, 동시에 성별도 판별할 수 있으며, 염기서열을 해독하고 반복염기서열의 반복횟수에 따라 대립유전자를 명명하여 분석 시 항상 같은 값을 얻을 수 있도록 할 수 있다.That is, a microsatellite marker composition consisting of 17 microsatellite markers including 15 microsatellite markers and 2 sex discrimination markers having an individuality of 0.9 or more and an exclusion value of 0.6 or more is used for object identification and paternity identification , And at the same time gender can be discriminated and the allele is named according to the repetition frequency of the repetitive nucleotide sequence so that the same value can always be obtained in the analysis.

일반적으로 "마이크로새틀라이트(Microsatellites)"란 진핵세포(eukaryotes) 유전자 전역에 걸쳐 분포하는 모노-, 디-, 트리- 및 테트라 뉴클레오타이드 형태의 짧은 반복 염기서열을 의미한다. 일반적으로 이러한 반복 서열은 염색체 내에서 10 내지 40 번 정도 단순반복(tandem repeat)된 형태로 존재한다.In general, " Microsatellites " refers to short repeating nucleotide sequences in the form of mono-, di-, tri-, and tetra-nucleotides distributed throughout the eukaryotes gene. Generally, these repeating sequences exist in a tandem repeat form about 10 to 40 times in the chromosome.

또한, "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌(genetic locus)를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌로 일컬어진다.A " marker " refers to a base sequence used as a reference point when identifying a genetically locus that is genetically unrelated. The term also applies to nucleic acid sequences complementary to marker sequences such as nucleic acids used as primers capable of amplifying marker sequences. The location of a molecular marker on a gene map is referred to as a locus.

또한, "프라이머"는 본 발명에서 선발한 마이크로새틀라이트의 핵산서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleo tide)를 의미하는 것으로, 본 발명에서 선발한 마이크로새틀라이트 마커의 핵산서열을 증폭할 수 있는 것이라면 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 이에 해당된다.The term " primer " means an oligonucleotide capable of specifically amplifying the nucleic acid sequence of microsatellite selected in the present invention. The nucleic acid sequence of the microsatellite marker selected in the present invention is amplified Any primer that can be designed by a person skilled in the art is applicable to this.

본 발명에서는 개의 개체식별 및 친자확인을 위한 마이크로새틀라이트 마커를 찾기 위하여, Francisco et al., (1996), Eichmann et al., Elizabeth. et. al., (2013), Cordula et al., (2005), Melody et al., (2009)등의 논문을 참조하고 미국국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 게놈 유전자은행 데이터베이스에서 회색늑대(Canis lupus) 게놈 전체 염기서열을 토대로 tetra-nucleotide repeat 마이크로새틀라이트만을 검색하여 마커를 선별하였다.In the present invention, Francisco et al., (1996), Eichmann et al., Elizabeth et al., (1996), for microsatellite markers for dog identification and paternity identification, et. (2005), Melody et al., (2009), and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Markers were selected by searching tetra-nucleotide repeat microsatellite only based on the entire nucleotide sequence of the wolf ( Canis lupus ) genome.

여기서, 선별된 마커는 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063이고, 성별을 판별하기 위하여 DOG-X 및 DOG-Y를 포함시켰다.X and DOG-Y are used to discriminate between the sexes, and the selected markers are VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, .

따라서, 본 발명의 개의 개체식별용 마이크로새틀라이트 마커 조성물은 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어질 수 있다.Therefore, the microsatellite markers for identification of individual dogs of the present invention can be used for identification of dogs, such as VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG- -Y. ≪ / RTI >

이후, 개의 개체식별용 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 대하여 프라이머를 제작하였다. 이때, 마커 해당부분의 앞 염기서열 400bp와 후 염기서열 400bp를 포함한 염기서열을 기초로 하여 프라이머를 제작하였다.Thereafter, a primer was prepared for the microsatellite marker composition for dog identification. At this time, a primer was prepared based on the base sequence including 400bp of the forward base sequence and 400bp of the back base sequence of the corresponding part of the marker.

이는 프라이머는 마커가 존재하는 염기서열 내부에서 제작할 수 없기 때문에, 마커가 있는 위치에서 앞쪽 염기서열 중 DNA 증폭이 가장 적합한 곳과 뒤쪽 염기서열 중 앞쪽서열에서 제작한 프라이머와 비 상보적이며 DNA 증폭이 우수한 지점에서 프라이머를 제작하여 한 쌍의 프라이머를 제작하는 것이다.This is because the primer can not be produced within the nucleotide sequence in which the marker exists. Therefore, in the position where the marker is located, it is incompatible with the primer prepared in the forward sequence of the back sequence and the DNA amplification is most suitable in the forward sequence, A primer is produced at a superior point to produce a pair of primers.

이에 따라, 마커 앞쪽 염기서열 일부와 마커 그리고 마커 뒤쪽 염기서열 일부를 포함하는 DNA를 PCR을 통해 증폭할 수 있다.Thus, DNA containing part of the base sequence in front of the marker, a marker, and a part of the base sequence behind the marker can be amplified by PCR.

이때, 프라이머는 DNASIS MAX 3.0 (MiraiBio, USA) 프로그램으로 제작하였다.At this time, primers were prepared by DNASIS MAX 3.0 (MiraiBio, USA) program.

또한, 각 프라이머 끝에 생물학적 분석용 형광물질인 FAM, VIC, NED, PET로 표지(Label)할 수 있다.In addition, labels can be labeled with FAM, VIC, NED, and PET, which are fluorescent materials for biological analysis, at the ends of each primer.

프라이머는 멀티플렉스 PCR을 통해 유전자를 증폭하기 위한 것으로, 개발된 프라이머는 서열번호 1 내지 34를 가지며, 표 1과 같이 프라이머 서열을 나타낸다.The primers are for amplifying the gene through multiplex PCR. The developed primers have SEQ ID NOS: 1 to 34 and show primer sequences as shown in Table 1.

이와 같은 프라이머는 각 마커에 대하여 정방향(F, forward) 및 역방향(R, reverse) 프라이머 쌍으로 이루어질 수 있는데, 상기 마이크로새틀라이트 마커 조성물은 VGL3235(서열목록 1 및 2), FH2001(서열목록 3 및 4), VGL1165(서열목록 5 및 6), FH2054(서열목록 7 및 8), VGL2136(서열목록 9 및 10), VGL3438(서열목록 11 및 12), VGL3008(서열목록 13 및 14), FHC2328(서열목록 15 및 16), FH2016(서열목록 17 및 18), PEZ02(서열목록 19 및 20), VGL1828(서열목록 21 및 22), VGL1541(서열목록 23 및 24), VGL2009(서열목록 25 및 26), VGL2409(서열목록 27 및 28), VGL1063(서열목록 29 및 30), DOG-X(서열목록 31 및 32), DOG-Y(서열목록 33 및 34)로 이루어진 정방향(F, forward) 및 역방향(R, reverse) 프라이머로 증폭될 수 있다.Such a primer can be composed of a pair of forward (F), forward and reverse (R) reverse primers for each marker, wherein the microsatellite marker composition comprises VGL3235 (SEQ ID NOS: 1 and 2), FH2001 4), VGL1165 (SEQ ID NOS: 5 and 6), FH2054 (SEQ ID NOS: 7 and 8), VGL2136 (SEQ ID NOS: 9 and 10), VGL3438 (SEQ ID NOS: 11 and 12), VGL3008 (SEQ ID NOS: 13 and 14), FHC2328 (SEQ ID NOS: 15 and 16), FH2016 (SEQ ID NOS: 17 and 18), PEZ02 (SEQ ID NOS: 19 and 20), VGL1828 (SEQ ID NOS: 21 and 22), VGL1541 (SEQ ID NOS: 23 and 24), VGL2009 F, forward and reverse sequences consisting of VGL2409 (SEQ ID NOS 27 and 28), VGL1063 (SEQ ID NOS 29 and 30), DOG-X (SEQ ID NOS 31 and 32), DOG- Can be amplified with reverse (R) reverse primers.

표 1은 개 개체식별용 마이크로새틀라이트 마커의 이름, 형광물질의 표지종류, 프라이머의 염기 서열 및 염기 서열번호를 나타낸 것이다.Table 1 shows the names of the microsatellite markers for identifying individuals, the type of fluorescent substance, the base sequence of the primers, and the base sequence number.

Figure 112018043015848-pat00001
Figure 112018043015848-pat00001

상기와 같은 개 개체식별용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 프라이머를 포함하는 개 개체식별용 시트를 제공할 수 있다.It is possible to provide a dog identification sheet comprising the above microsatellite marker composition for dog identification and a primer.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법은 (a) 분석하고자 하는 개의 핵산 시료를 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 1 내지 34로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분리해 각 좌우별 대립유전자의 빈도, 이형접합률, 다형정보지수, 식별력, 배제력, 누적일치율 및 누적배제력을 산출하는 단계 및 (c) 각 좌위의 대립유전자의 염기서열을 해독하고, 반복염기서열의 반복횟수의 총합으로 대립유전자 번호를 명명하는 단계를 포함할 수 있다.In addition, the dog identification and paternity identification methods using the microsatellite marker composition according to an embodiment of the present invention can be carried out by (a) analyzing the nucleic acid samples to be analyzed with VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328 1 to 34, which is specific to a microsatellite marker composition consisting of VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG- (B) isolating the alleles of each locus of the amplified products in step (a) and determining the frequency, heterozygosity, polymorphism information index, discrimination power, exclusion power, cumulative concordance And (c) decoding the nucleotide sequence of each locus, and naming the allele number with the sum of the number of repetitions of the repeated nucleotide sequence The.

더욱 구체적으로, (a) 단계에서 분석하고자 하는 개의 핵산 시료는 품종을 구분하지 않고 전국에서 수집된 총 100마리의 반려견의 전혈 약 50㎕를 DNA에 사용하여, Lysis buffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM EDTA, pH8.0, 1.4M NaCl, 100mM sodium acetate) 300㎕와 10㎕ 프로테인나아제 K(proteinase K, 20m㎎/㎖)를 혼합하고 55℃에서 2시간 반응을 시킨 후, 600㎕의 6M의 GuHCl(pH6.1)를 넣어 혼합하고 핵산을 magnetic bead에 바인딩(binding)시켜 분리시키고, Bead를 70% 에탄올(ethanol) 700㎕로 2회 세척하고 건조시킨 후 50㎕의 TE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)에 핵산을 용출시키는 것으로 얻을 수 있다.More specifically, in the step (a), 50 μl of whole blood of 100 dogs collected from all over the country was used for DNA analysis without discrimination of the breed, and lysis buffer (100 mM Tris-HCl, (pH 8.0, 20 mM EDTA, pH 8.0, 1.4 M NaCl, 100 mM sodium acetate) and 10 μl proteinase K (20 mg / ml) were mixed and reacted at 55 ° C. for 2 hours. The beads were washed twice with 700 μl of 70% ethanol and dried, and then 50 μl of TE buffer (pH 7.4) was added to each well. (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).

또한, (a) 단계의 멀티플렉스 PCR을 수행하기 위하여, 개의 개체식별 및 친자확인을 할 수 있는 상기 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용할 수 있고, 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 프라이머를 포함하는 키트를 이용할 수도 있다.In order to carry out the multiplex PCR of step (a), the microsatellite marker composition capable of identifying individual dogs and parents and the primers capable of amplifying the microsatellite markers can be used. The microsatellite marker composition and the primer May be used.

이러한 (a) 단계의 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR)은 주형 게놈 DNA 10ng, Hot start Taq 중합효소(GenetBio, Korea) 1 unit, 2㎕의 10X PCR buffer, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 각각의 프라이머 쌍을 혼합하고 증류수를 넣어 총량 20㎕로 혼합하여 반응물을 제조한 후, 반응물을 GeneAmp PCR® system 9700(ThermoFisher scientific, USA)에서 94℃에서 10분간 per-denaturation시킨 후 94℃에서 30초, 56℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 설정하여 31 사이클(cycle)을 수행하고 72℃에서 30분간 최종적인 신장(extension) 반응을 하는 것으로 수행될 수 있다.Multiplex PCR of this step (a) consisted of 10 ng of template genomic DNA, 1 unit of Hot start Taq polymerase (GenetBio, Korea), 2 μl of 10X PCR buffer, 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, The reaction mixture was subjected to per-denaturation at 94 ° C for 10 minutes with GeneAmp PCR® system 9700 (ThermoFisher Scientific, USA), followed by 30 seconds at 94 ° C, 56 minutes at 94 ° C, Followed by a final cycle of 31 cycles at 72 ° C for 1 minute and 72 ° C for 30 minutes.

이때, 프라이머는 1회 멀티플렉스 PCR 반응물의 량 20㎕를 기준으로, 서열번호 1 및 2는 1.71 내지 1.91pM, 서열번호 3 및 4는 2.71 내지 2.91pM, 서열번호 5 및 서열번호 6은 3.26 내지 3.46pM, 서열번호 7 및 8은 2.49 내지 2.69pM, 서열번호 9 및 10은 0.79 내지 0.99pM, 서열번호 11 및 12는 1.32 내지 1.52pM, 서열번호 13 및 14는 2.19 내지 2.39pM, 서열번호 15 및 16은 3.72 내지 3.92pM, 서열번호 17 및 18은 0.81 내지 1.01pM, 서열번호 19 및 20은 1.74 내지 1.94pM, 서열번호 21 내지 22는 2.10 내지 2.30pM, 서열번호 23 및 24는 2.08 내지 2.28pM, 서열번호 25 및 26은 0.55 내지 0.75pM, 서열번호 27 및 28은 0.50 내지 0.70pM, 서열번호 29 및 30은 1.45 내지 1.65pM, 서열번호 31 및 32는 4.01 내지 4.21pM, 서열번호 33 및 34는 2.01 내지 2.21pM의 농도로 혼합될 수 있다.In this case, the primers were primed at a rate of 1.71 to 1.91 pM in SEQ ID NOS: 1 and 2, 2.71 to 2.91 pM in SEQ ID NOS: 3 and 4, and 3.26 to 9.3 in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NOS: 7 and 8 are 2.49 to 2.69 pM, SEQ ID NOS: 9 and 10 are 0.79 to 0.99 pM, SEQ ID NOS: 11 and 12 are 1.32 to 1.52 pM, SEQ ID NOS: 13 and 14 are 2.19 to 2.39 pM, SEQ ID NOs: 19 and 20 are 1.74 to 1.94 pM, SEQ ID NOs: 21 to 22 are 2.10 to 2.30 pM, SEQ ID NOs: 23 and 24 are 2.81 to 2.28 pM, pM, SEQ ID NOs: 25 and 26 are 0.55 to 0.75 pM, SEQ ID NOs: 27 and 28 are 0.50 to 0.70 pM, SEQ ID NOs: 29 and 30 are 1.45 to 1.65 pM, SEQ ID NOs: 31 and 32 are 4.01 to 4.21 pM, 34 may be mixed at a concentration of 2.01 to 2.21 pM.

더욱 바람직하게는, 서열번호 1 및 2는 1.81pM, 서열번호 3 및 4는 2.81pM, 서열번호 5 및 서열번호 6은 3.36pM, 서열번호 7 및 8은 2.59pM, 서열번호 9 및 10은 0.89pM, 서열번호 11 및 12는 1.42pM, 서열번호 13 및 14는 2.29pM, 서열번호 15 및 16은 3.82pM, 서열번호 17 및 18은 0.91pM, 서열번호 19 및 20은 1.84pM, 서열번호 21 내지 22는 2.20pM, 서열번호 23 및 24는 2.18pM, 서열번호 25 및 26은 0.65pM, 서열번호 27 및 28은 0.60pM, 서열번호 29 및 30은 1.55pM, 서열번호 31 및 32는 4.11pM, 서열번호 33 및 34는 2.11pM의 농도로 혼합될 수 있다.More preferably, SEQ ID NOs: 1 and 2 are 1.81 pM, SEQ ID NOs: 3 and 4 are 2.81 pM, SEQ ID NOs: 5 and 6 are 3.36 pM, SEQ ID NOs: 7 and 8 are 2.59 pM, SEQ ID NOs: 11 and 12 are 1.42 pM, SEQ ID NOs: 13 and 14 are 2.29 pM, SEQ ID NOs: 15 and 16 are 3.82 pM, SEQ ID NOs: 17 and 18 are 0.91 pM, SEQ ID NOs: 19 and 20 are 1.84 pM, SEQ ID NO: 23 and 24 are 2.18 pM, SEQ ID NOs: 25 and 26 are 0.65 pM, SEQ ID NOs: 27 and 28 are 0.60 pM, SEQ ID NOs: 29 and 30 are 1.55 pM, SEQ ID NOs: 31 and 32 are 4.11 pM , SEQ ID NOS: 33 and 34 can be mixed at a concentration of 2.11 pM.

이와 같은 농도의 범위로 프라이머가 혼합되지 않을 경우 일부 마커가 증폭되지 않아 DNA 검사를 할 수 없거나, 특정 마커만 너무 많이 증폭되어 결과를 판독할 수 없는 경우가 발생할 수 있다.If the primers are not mixed in such a concentration range, some markers may not be amplified and DNA can not be assayed, or only certain markers may be amplified too much to read the results.

또한, 각 좌위별 프라이머 농도가 달라지면 변화된 좌위의 프라이머가 다른 마커의 PCR 증폭을 방해하는 현상이 발생해 DNA 검사 자체가 불가능한 경우가 발생할 수 있다.In addition, if the primer concentration of each position is changed, the primer of the altered position may interfere with the PCR amplification of the other marker, so that the DNA test itself may be impossible.

따라서, 제작된 프라이머가 상기와 같은 범위로 혼합되어야 한다.Therefore, the prepared primer should be mixed in the same range as described above.

또한, (a) 단계 전에, 프라이머의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머에 FAM, VIC, NED, PET로 형광표지(Label)를 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 대립유전자를 분리할 때 분류하기 용이하도록 할 수 있는 것이다.Further, before step (a), fluorescent labeling with FAM, VIC, NED, and PET may be further performed on the forward primer and the reverse primer of the primer. This makes it easier to classify alleles when they are isolated.

(b) 단계는 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분리해 각 좌우별 대립유전자의 빈도, 이형접합률, 다형정보지수, 식별력, 배제력, 누적일치율 및 누적배제력을 산출할 수 있다.In step (b), alleles of each locus of the product amplified in step (a) are separated, and the frequency, heterozygosity, polymorphism information index, discrimination power, exclusion power, cumulative concordance rate, Can be calculated.

자세하게는, (a) 단계에서 증폭된 멀티플렉스 PCR 반응물(산물)을 증류수로 15배 희석하고 0.2㎕를 취해 GeneScan™ 500 LIZ(Thermo Fisher Scientific, USA)와 Hi-Di™ 포름아미드(Thermo Fisher Scientific, USA)를 함께 혼합하여 98℃에서 1분간 변성시킨(denaturation) 다음, POP-7™ 폴리머(Thermo Fisher Scientific, USA)를 채운 36cm 모세관을 장착한 Applied Biosystems 3130x1 자동염기서열분석장치(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 60℃로 모세관전기영동을 하여 대립유전자를 분리한 후, 대립유전자를 분석하였다.In detail, the multiplex PCR reaction product (product) amplified in step (a) was diluted 15 times with distilled water, and 0.2 μl was taken and analyzed using GeneScan ™ 500 LIZ (Thermo Fisher Scientific, USA) and Hi-Di ™ formamide Denatured at 98 ° C for 1 minute and then purified using an Applied Biosystems 3130x1 automated sequencer (Thermo Fisher Scientific, USA) equipped with a 36 cm capillary filled with POP-7 ™ polymer (Thermo Fisher Scientific, USA) , USA) by capillary electrophoresis at 60 ° C, and alleles were analyzed.

이때, GeneMapper®ID v4.0(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 500 LIZ size standard와 비교하는 것으로 대립유전자를 분석하여, 각 15개의 마이크로세털라이트 좌위와 DGG-X, DOG-Y 성별마커의 유전자형(genotype)을 분석하였다.Alleles were analyzed by comparing with the 500 LIZ size standard in GeneMapper®ID v4.0 (Thermo Fisher Scientific, USA), and the genotypes of the 15 microsatellite loci and DGG-X and DOG-Y sex markers genotype) were analyzed.

또한, FSTAT 2.9.3 프로그램을 이용하여 각 좌위별 대립유전자 수(number of alleles)를 산출하고(Goudet, 2001), 정보력(PIC, polymorphism information content), 식별력(PD, power of discrimination), 일치율(MP, matching probability) 그리고 배제력(PE, power of exclusion) 등과 같은 주요 법과학적 지표들은 PowerState v1.2 프로그램을 이용해 산출하였다(Tereba, 1999).The number of alleles of each locus was calculated using the FSTAT 2.9.3 program (Goudet, 2001), and polymorphism information content (PIC), power of discrimination (PD) MP, matching probability, and power of exclusion (PE) were calculated using the PowerState v1.2 program (Tereba, 1999).

또한, 누적일치율은

Figure 112018043015848-pat00002
공식에 따라 산출하였고, 누적배제력은 1-
Figure 112018043015848-pat00003
공식으로 구하였다(Jones, 1972; Kr
Figure 112018043015848-pat00004
ger et al., 1968).In addition,
Figure 112018043015848-pat00002
, And the cumulative elimination power was calculated by using the 1-
Figure 112018043015848-pat00003
(Jones, 1972; Kr
Figure 112018043015848-pat00004
Ger et al., 1968).

(c) 단계는 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분리해 각 좌위의 대립유전자의 염기서열을 해독하고, 반복염기서열의 반복횟수의 총합으로 대립유전자 번호를 명명할 수 있다. 이와 같이 반복염기서열의 반복횟수의 총합으로 대립유전자 번호를 명명하여 분석 시마다 항상 동일한 값을 얻을 수 있다.In step (c), the allele of each locus of the product amplified in step (a) is isolated, the base sequence of the allele of each locus is decoded, and the allele number is designated by the sum of the repetition number of the repeated base sequence have. Thus, by assigning the allele number as the sum of the repetition number of repetitive nucleotide sequences, the same value can always be obtained for each analysis.

자세하게는, (a) 단계에서 증폭된 산물에 DNA binding buffer(6M GuHCl, 20mM Tris-HCl pH6.6, 10mM EDTA pH6.0, 100mM sodium acetate NaOAc)를 60㎕ 넣은 후 96 well glass fiber filter plate(MultiScreen® HTS, Millipore, USA)에 옮겨 넣고 진공 매니폴드(vacuum manifold)를 장착 한 후에 1분간 진공(-25 inches. mmHg)을 가하고, 200㎕의 70% 에탄올(ethanol)을 넣고 1분간 진공(-25 inches. mmHg)을 가해 2회 세척하고 0.1mM의 EDTA가 첨가된 멸균 증류수를 30㎕ 넣어 96 well U-bottom collection plates(Corning, USA)에 정제된 산물(DNA PCR 산물)을 회수 하였다.In detail, 60 μL of DNA binding buffer (6M GuHCl, 20 mM Tris-HCl pH 6.6, 10 mM EDTA pH 6.0, 100 mM sodium acetate NaOAc) was added to the amplified product in step (a) (-25 inches. MmHg) for 1 min., 200 μl of 70% ethanol was added, and vacuum (1 min) was applied -25 inches. MmHg) and washed twice. The purified product (DNA PCR product) was recovered in 96-well U-bottom collection plates (Corning, USA) by adding 30 μl of sterile distilled water containing 0.1 mM EDTA.

그 다음, 정제된 산물 20ng, 2㎕의 5Хsequnecing buffer, 한쪽 방향의 프라이머 3.75pM 그리고 1㎕의 BigDye 3.1 ready mix(ThermoFisher scientific, USA)를 혼합하여 98℃ 5초, 50℃ 5초, 60℃ 4분의 조건으로 25 사이클(cycle)을 수행한 후, 반응이 끝난 산물에 Magnesil Green(Promega, USA) 100㎕를 넣어 정제한 후 20㎕의 증류수에 dye-termination된 핵산 단편들을 용출시킨 후, 자동염기서열분석장치인 Applied Biosystems 3130xl(ThermoFisher scientific, USA)를 사용하여 염기서열을 해독할 수 있다. Then, 20 ng of the purified product, 2 μl of 5 × Sequnecing buffer, 3.75 pM of the unidirectional primer and 1 μl of BigDye 3.1 ready mix (ThermoFisher scientific, USA) were mixed and incubated at 98 ° C. for 5 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, Min. After the reaction was completed, 100 μl of Magnesil Green (Promega, USA) was added to the reaction mixture to elute the dye-terminated nucleic acid fragments into 20 μl of distilled water. The base sequence can be decrypted using Applied Biosystems 3130xl (ThermoFisher scientific, USA), a sequencing device.

또한, 염기서열이 해독된 데이터 정방향(forward)과 역방향(reverse)의 염기서열을 토대로 하나의 완성된 콘틱(contig) 염기서열을 만들고, 완성된 콘틱(contig) 염기서열을 미국국립생물정보센터 NCBI GeneBank Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 blast 검색을 통해 각 좌위별 염색체번호를 확인한 후, 각 좌위별 반복구간의 염기배열 구조를 확인하고 각 대립유전자 반복염기서열의 반복횟수를 더해 대립유전자 번호를 명명할 수 있다. In addition, a complete contig base sequence was constructed based on the forward and reverse base sequences of the decoded base sequence, and the completed contig base sequence was obtained from the National Institute of Bioinformatics (NCBI) After confirming the chromosome number of each locus using the blast search in the GeneBank Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), confirm the nucleotide sequence structure of the repeats of each locus and identify the nucleotide sequence of each allele repeat nucleotide sequence You can add an iteration number to name the allele number.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. It should be noted, however, that the following examples are provided to further illustrate the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

<< 실시예Example 1> 1>

100마리의 반려견의 전혈 약 50㎕를 DNA에 사용하였으며, Lysis buffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM EDTA, pH8.0, 1.4M NaCl, 100mM sodium acetate) 300㎕와 10㎕ 프로테인나아제 K(20m㎎/㎖)를 혼합하고 55℃에서 2시간 반응을 시킨 후, 600㎕의 6M의 GuHCl(pH6.1)을 넣어 혼합하고 핵산을 magnetic bead에 바인딩(binding)시켜 분리시키고, Bead를 70% 에탄올(ethanol) 700㎕로 2회 세척하고 건조시킨 후 50㎕의 TE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)에 핵산을 용출 시켰다.About 50 μl of whole blood of 100 dogs were used for DNA and 300 μl of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA, pH 8.0, 1.4 M NaCl, 100 mM sodium acetate) K (20mmg / ml) were mixed and reacted at 55 ° C for 2 hours. Then, 600μl of 6M GuHCl (pH 6.1) was added to the mixture and the nucleic acid was separated by binding to a magnetic bead. After washing twice with 700 μl of 70% ethanol and drying, nucleic acid was eluted into 50 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).

그 다음, 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 게놈 DNA 10ng, Hot-start Taq DNA 중합효소(GenetBio, Korea) 1 unit, 2㎕의 10X PCR buffer, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 각각 FAM, VIC, NED, PET로 형광표지된 프라이머 쌍을 혼합하고 증류수를 넣어 총량 20 ㎕로 혼합하여 반응물을 제조하였다.Multiplex PCR was performed using 10 ng of template genomic DNA, 1 unit of Hot-start Taq DNA polymerase (GenetBio, Korea), 2 μl of 10 × PCR buffer, 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, FAM , VIC, NED, and PET were mixed and distilled water was added thereto to prepare a reaction mixture in a total amount of 20 μl.

여기서, 각 형광표지된 프라이머의 농도는 표 2와 같으며, 1회 멀티플렉스 PCR 반응물의 량 20㎕를 기준으로, 서열번호 1 및 2는 VGL3235에 1.81pM, 서열번호 3 및 4는 FH2001에 2.81pM, 서열번호 5 및 서열번호 6은 VGL1165에 3.36pM, 서열번호 7 및 서열번호 8은 FH2054에 2.59pM, 서열번호 9 및 10은 VGL2136에 0.89pM, 서열번호 11 및 12는 VGL3438에 1.42pM, 서열번호 13 및 14는 VGL3008에 2.29pM, 서열번호 15 및 16은 FHC2328에 3.82pM, 서열번호 17 및 18은 FH2016에 0.91pM, 서열번호 19 및 20은 PEZ02에 1.84pM, 서열번호 21 내지 22는 VGL1828에 2.20pM, 서열번호 23 및 24는 VGL1541에 2.18pM, 서열번호 25 및 26은 VGL2009에 0.65pM, 서열번호 27 및 28은 VGL2409에 0.60pM, 서열번호 29 및 30은 VGL1063에 1.55pM, 서열번호 31 및 32는 DOG-X에 4.11pM, 서열번호 33 및 34는 DOG-Y에 2.11pM의 농도로 혼합하여 넣었다(표 2). The concentrations of the respective fluorescently labeled primers are shown in Table 2. Based on the amount of 20 μl of the multiplex PCR reaction product, SEQ ID NOS: 1 and 2 were assigned to VGL3235 to 1.81 pM, SEQ ID NOS: 3 and 4 to FH2001 to 2.81 pM, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are 3.36 pM in VGL1165, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are 2.59 pM in FH2054, SEQ ID NO: 9 and 10 are 0.89 pM in VGL2136, SEQ ID NO: 11 and 12 are 1.42 pM in VGL3438, SEQ ID NOs: 13 and 14 are 2.29 pM in VGL3008, SEQ ID NOs: 15 and 16 are 3.82 pM in FHC2328, SEQ ID NOs: 17 and 18 are 0.91 pM in FH2016, SEQ ID NOs: 19 and 20 are 1.84 pM in PEZ02, SEQ ID NOs: 25 and 26 are 0.65 pM in VGL2009, SEQ ID NOs: 27 and 28 are 0.60 pM in VGL2409, SEQ ID NOs: 29 and 30 are 1.55 pM in VGL1063, SEQ ID NOs: 23 and 24 are 2.18 pM in VGL1541, Nos. 31 and 32 were mixed with DOG-X at 4.11 pM, and SEQ ID NOS: 33 and 34 were mixed at a concentration of 2.11 pM in DOG-Y (Table 2).

이때, 하기 표 2를 보면 알 수 있듯이, VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054 좌위는 FAM(5(6)-carboxyfluorescein) 형광물질로 표지하고, VGL2136, VGL3438, VGL3008, FHC2328 좌위는 VIC(2′-chloro-7′'phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein) 형광물질로 표지하며, FH2016, PEZ02, VGL1828, VGL1541 좌위는 NED(2′-chloro-5′'-fluoro-7′',8′-benzo-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein)형광물질로 표지하고, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X, DOG-Y 좌위는 PET(Applied Biosystems사에서 개발한 화학 구조가 공개되지 않은 물질) 형광물질로 표지하였다.As shown in Table 2, VGL3235, FH2001, VGL1165 and FH2054 loci were labeled with FAM (5 (6) -carboxyfluorescein), VGL2136, VGL3438, VGL3008 and FHC2328 loci were labeled with VIC (2'-chloro-5''-fluoro-7 '', N'-chloro-5'-fluoro-7''phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein) VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG-Y loci were labeled with PET (the chemical structure developed by Applied Biosystems Inc. was not disclosed) Substance) fluorescent substance.

Figure 112018043015848-pat00005
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그 다음, 반응물을 GeneAmp PCR® system 9700(ThermoFisher scientific, USA)에서 94℃에서 10분간 per-denaturation시킨 후 94℃에서 30초, 56℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 설정하여 31 사이클(cycle)을 수행하고 72℃에서 30분간 마지막 신장 반응을 하였다.The reaction was then per-denaturation at 94 ° C for 10 minutes with GeneAmp PCR® system 9700 (ThermoFisher scientific, USA), followed by 30 cycles at 94 ° C, 45 seconds at 56 ° C and 1 minute at 72 ° C cycle), and the final extension reaction was performed at 72 ° C for 30 minutes.

그 다음, 멀티플렉스 PCR 반응물을 증류수로 15배 희석하고 0.2㎕를 취해 GeneScan™ 500 LIZ(Thermo Fisher Scientific, USA)와 Hi-Di™ 포름아미드(Thermo Fisher Scientific, USA)를 함께 혼합하여 98℃에서 1분간 변성시킨(denaturation) 다음, POP-7™ 폴리머(Thermo Fisher Scientific, USA)를 채운 36 cm 모세관을 장착한 Applied Biosystems 3130x1 자동염기서열분석장치(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 60℃로 모세관 전기영동하여 대립유전자를 분리하고, 대립유전자를 분석하였다.Then, the multiplex PCR reaction was diluted 15 times with distilled water and 0.2 μL was taken and mixed with GeneScan ™ 500 LIZ (Thermo Fisher Scientific, USA) and Hi-Di ™ formamide (Thermo Fisher Scientific, USA) Denaturation for 1 minute followed by capillary electrophoresis at 60 ° C in an Applied Biosystems 3130x1 automated sequencer (Thermo Fisher Scientific, USA) equipped with a 36 cm capillary filled with POP-7 ™ polymer (Thermo Fisher Scientific, USA) Alleles were separated by gel filtration and analyzed for alleles.

여기서, GeneMapper®ID v4.0(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 500 LIZ size standard와 비교하여 대립유전자를 분석하는 것으로, 15개 마이크로세털라이트 좌위와 DOG-X, DOG-Y의 성별마커 유전자형(genotype) 분석을 수행하였다.Here, GeneMapper®ID v4.0 (Thermo Fisher Scientific, USA) analyzed the allele gene compared to the 500 LIZ size standard, and analyzed 15 genomic loci and genotype markers of DOG-X and DOG-Y ) Analysis.

또한, FSTAT 2.9.3 프로그램을 이용하여 각 좌위별 대립유전자 수(number of alleles)를 산출하고(Goudet, 2001), 정보력(PIC, polymorphism information content), 식별력(PD, power of discrimination), 일치율(MP, matching probability) 그리고 배제력(PE, power of exclusion)의 주요 법과학적 지표들은 PowerState v1.2 프로그램을 이용해 산출하였다(Tereba, 1999).The number of alleles of each locus was calculated using the FSTAT 2.9.3 program (Goudet, 2001), and polymorphism information content (PIC), power of discrimination (PD) MP, matching probability, and power of exclusion were calculated using the PowerState v1.2 program (Tereba, 1999).

또한, 누적일치율은

Figure 112018043015848-pat00006
공식에 따라 산출하였고, 누적배제력은 1-
Figure 112018043015848-pat00007
공식으로 구하였다(Jones, 1972; Kr
Figure 112018043015848-pat00008
ger et al., 1968).In addition,
Figure 112018043015848-pat00006
, And the cumulative elimination power was calculated by using the 1-
Figure 112018043015848-pat00007
(Jones, 1972; Kr
Figure 112018043015848-pat00008
Ger et al., 1968).

그 결과는 하기 표 3 및 표 4와 같다.The results are shown in Tables 3 and 4 below.

도 1은 100마리 반려견 중 임의로 선택된 수놈 개체의 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물의 모세관전기영동 결과로, 이를 참조하면, 마이크로새틀라이트 15개와 성별 마커 2개의 고른 동시 증폭이 가능함을 확인할 수 있었다.FIG. 1 shows the results of capillary electrophoresis of amplified products of multiplexed PCR of a randomly selected male of 100 dogs. As a result, it was confirmed that 15 microsatellite and 2 sex markers could be simultaneously amplified.

도 2는 100마리 반려견 중 임의로 선택된 암놈 개체의 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물의 모세관전기영동 결과로, 이 또한 마이크로새틀라이트 15개와 성별 마커 2개의 고른 동시 증폭이 가능함을 보여준다.Figure 2 shows capillary electrophoresis of amplified products of multiplex PCR amplification of randomly selected female genomes of 100 dogs, showing that this also allows simultaneous amplification of 15 microsatellite and 2 gender markers.

또한, 도 1의 왼쪽 하단 성별마커에서 DOG-X와 DOG-Y 좌위 모두에서 증폭되어 DNA검출이 선명하게 이루어져 성별이 XY인 수놈인 것을 나타내며, 도 2의 왼쪽 하단 성별마커에서 X 좌위만 증폭되어 성별이 XX인 암놈인 것을 확인할 수 있어, 이와 같이 암놈과 수놈을 명확히 구분할 수 있음을 확인할 수 있었다.In addition, it is amplified in both the DOG-X and DOG-Y loci in the lower left sex markers in FIG. 1, and DNA detection is clearly performed to show that the sex is XY, and only the X locus is amplified in the lower left sex markers in FIG. 2 It was confirmed that the sex was XX, and thus it was confirmed that the male and female can be clearly distinguished from each other.

또한, 도 1 및 도 2의 가로축은 증폭된 DNA의 길이를 나타내고, 세로축은 검출강도를 나타내는데, 도 1은 길이가 80~500bp까지 표현되며 검출강도는 500~1,600rfu까지 나타내고, 도 2는 검출강도가 900~4,000rfu까지 나타나 다양한 검출강도에서도 각 좌위의 대립유전자를 명확히 구분할 수 있음을 확인할 수 있었다.1 shows the length of the amplified DNA and the vertical axis shows the detection intensity. In FIG. 1, the length is expressed up to 80 to 500 bp, the detection intensity is shown up to 500 to 1,600 rfu, The intensity was ranged from 900 to 4,000 rfu, indicating that alleles of each locus can be clearly distinguished at various detection intensities.

하기 표 3은 수집된 반려견 100 마리의 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물을 통해 확인된 각 좌위의 대립유전자 분포 조사결과이다.Table 3 below shows the results of allelic distribution of each locus identified through the products amplified by multiplex PCR of 100 collected dogs.

Allele는 대립유전자 번호를 나타내고, 각 좌위의 수치는 각 대립유전자의 출현 빈도이고 각 좌위의 빈도수 총합은 1이다.Allele represents the allele number, and the numerical value of each position is the frequency of occurrence of each allele and the total frequency of each position is 1.

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표 4는 상기 표 3의 각 좌위별 대립유전자 분포와 빈도를 토대로, 각 좌위별 대립유전자 수(N), 이형접합율(He, heterozygote rate), 정보력(PIC, polymorphism information content), 일치율(MP, matching probability), 식별력(PD, power of discrimination), 배제력(PE, power of exclusion) 및 각 좌위별 대립유전자의 PCR증폭 DNA 크기 범위를 나타낸 것이다.Table 4 shows the number of alleles (N), heterozygote rate (He), heterozygote rate, polymorphism information content (PIC), and matching rate (MP) of each locus based on the allele distribution and frequency of each locus in Table 3 , power of discrimination (PD), power of exclusion (PE), and amplified DNA size range of alleles of each locus.

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상기 표 4에서 알 수 있듯이, 대립유전자 수에서는 FH2016가 총 22개 발견되어 가장 많은 대립유전자를 보유하고 있고, VGL2409가 8개의 대립유전자가 확인되어 가장적은 대립유전자를 보유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Table 4, 22 alleles of FH2016 were found in allele frequencies, and the most alleles were found. VGL2409 showed 8 alleles and the least allele was confirmed.

또한, 대립유전자 이형접합률은 15개 마이크로새틀라이트 마커 모든 좌위에서 63% 이상이 나타나고, 각 좌위별의 식별력은 최소 91.4%로 매우 높은 식별력을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.In addition, allelic heterozygosity showed more than 63% in all the left side of 15 microsatellite markers, and discrimination power of each left side was at least 91.4%.

또한, 배제력은 각 좌위별로 0.318 내지 0.599까지 나타나는 것을 확인할 수 있어, 각 좌위는 높은 배제력을 지니고 있는 것으로 판단된다.In addition, it is confirmed that the exclusion force appears from 0.318 to 0.599 for each seat position, and it is judged that each seat has high exclusion force.

또한, PCR 산물의 크기는 최소 90bp에서 최대 455bp까지 이며, 각 종류별 형광표지 그룹 내에선 대립유전자의 분포가 서로 겹치지 않게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.In addition, the size of the PCR products ranged from a minimum of 90 bp to a maximum of 455 bp, and it was confirmed that the distribution of alleles in each fluorescent labeling group did not overlap with each other.

또한, DOG-X 좌위의 X 염색체 대립유전자는 90bp 이고, DOG-Y 좌위의 Y염색체 대립유전자는 100bp로, 정확히 10bp 차이를 나타내어, 성별을 한눈에 쉽게 확인할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.In addition, the X chromosome allele at DOG-X locus was 90bp, and the Y chromosome allele at DOG-Y locus was 100bp, which is exactly 10bp, confirming that gender can be easily confirmed at a glance.

또한, 누적식별력(Combined Matching Probability)은 2.597 Х 10-20이고, 누적배제력(Combined Power of Exclusion)은 99.99927인 것을 확인할 수 있었다.Also, it was confirmed that the cumulative discrimination power (Combined Matching Probability) was 2.597 Х 10 -20 and the Combined Power of Exclusion was 99.99927.

이는 본 발명의 실시예는 국내의 반려견 전체를 한 마리, 한 마리 모두 식별해 낼 수 있으며, 친자확인 시 친자확인 검사정확도는 99.99927% 이상이 되는 것을 보여주는 것이다.This shows that the embodiment of the present invention can identify all the domestic dogs, one at a time, and that the accuracy of the paternity test is 99.99927% or more at the time of parenthood confirmation.

따라서, 본 발명의 실시예는 한 개의 튜브에서 한 번의 시약 반응으로 15개의 마이크로새틀라이트 마커와 2개의 성판별 마커를 동시 증폭 검출할 수 있으며, 각 좌위별로 많은 대립유전자를 보유하고 있을 뿐만 아니라 극도로 높은 누적식별력과 누적배제력 그리고 명확히 구분되는 각 좌위의 대립유전자 분포를 가지고 있어 개의 개체식별 및 친자확인에 매우 높은 신뢰성과 정확도를 제공해줄 수 있다고 판단된다. Therefore, the embodiment of the present invention can simultaneously detect and amplify 15 microsatellite markers and two sex discrimination markers in a single tube with one reagent reaction. In addition to having many alleles at each position, , It has high cumulative discrimination power and cumulative exclusion ability and clearly distinguishes allele distribution of each locus, so it can provide very high reliability and accuracy in identification and paternity identification of dogs.

<< 실시예Example 2> 2>

100마리의 반려견의 전혈 약 50㎕를 DNA에 사용하였으며, Lysis buffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20mM EDTA, pH8.0, 1.4M NaCl, 100mM sodium acetate) 300㎕와 10㎕ proteinase K(20m㎎/㎖)를 혼합하고 55℃에서 2시간 반응을 시킨 후, 600㎕의 6M의 GuHCl(pH6.1)를 넣어 혼합하고 핵산을 magnetic bead에 바인딩(binding)시켜 분리시키고, Bead를 70% 에탄올(ethanol) 700㎕로 2회 세척하고 건조시킨 후 50㎕의 TE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)에 핵산을 용출 시켰다.About 50 μl of whole blood of 100 dogs were used for DNA and 300 μl of lysis buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA, pH 8.0, 1.4M NaCl, 100 mM sodium acetate) and 10 μl proteinase K 20mmg / ml) were mixed and reacted at 55 ° C for 2 hours. 600 μl of 6M GuHCl (pH 6.1) was added thereto, and the nucleic acid was separated by binding to a magnetic bead. After washing twice with 700 μl of ethanol and drying, nucleic acid was eluted into 50 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).

그 다음, 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 게놈 DNA 10ng, Hot-start Taq polymerase(GenetBio, Korea) 1 unit, 2㎕의 10X PCR buffer, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 각각 FAM, VIC, NED, PET로 형광표지된 프라이머 쌍을 혼합하고 증류수를 넣어 총량 20 ㎕로 혼합하여 반응물을 제조하였다.Multiplex PCR was performed using 10 ng of template genomic DNA, 1 unit of Hot-start Taq polymerase (GenetBio, Korea), 2 μl of 10 × PCR buffer, 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, FAM, VIC , NED, and PET were mixed and distilled water was added to the mixture to prepare a reaction mixture.

그 다음, 반응물을 GeneAmp PCR® system 9700(ThermoFisher scientific, USA)에서 94℃에서 10분간 per-denaturation시킨 후 94℃에서 30초, 56℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 설정하여 31 사이클(cycle)을 수행하고 72℃에서 30분간 마지막 신장 반응을 하였다.The reaction was then per-denaturation at 94 ° C for 10 minutes with GeneAmp PCR® system 9700 (ThermoFisher scientific, USA), followed by 30 cycles at 94 ° C, 45 seconds at 56 ° C and 1 minute at 72 ° C cycle), and the final extension reaction was performed at 72 ° C for 30 minutes.

그 다음 증폭된 산물에 DNA binding buffer(6M GuHCl, 20mM Tris-HCl pH6.6, 10mM EDTA pH6.0, 100mM sodium acetate NaOAc)를 60㎕ 넣은 후 96 well glass fiber filter plate(MultiScreen® HTS, Millipore, USA)에 옮겨 넣고 진공 매니폴드(vacuum manifold)를 장착 한 후에 1분간 진공(-25 inches. mmHg)을 가하고, 200㎕의 70% 에탄올(ethanol)을 넣고 1분간 진공(-25 inches. mmHg)을 가해 2회 세척하고 0.1mM의 EDTA가 첨가된 멸균 증류수를 30㎕ 넣어 96 well U-bottom collection plates (Corning, USA)에 정제된 산물(DNA PCR 산물)을 회수하였다.Then, 60 μl of DNA binding buffer (6M GuHCl, 20mM Tris-HCl pH6.6, 10mM EDTA pH 6.0, 100mM sodium acetate NaOAc) was added to the amplified product, and the plate was immersed in 96 well glass fiber filter plates (MultiScreen® HTS, Millipore, (-25 inches.mmHg) was added for 1 minute, 200 μl of 70% ethanol was added, and vacuum (-25 inches.mmHg) was added for 1 minute after the vacuum manifold was installed. Was added to each well and washed twice. The purified product (DNA PCR product) was recovered in 96-well U-bottom collection plates (Corning, USA) by adding 30 μl of sterile distilled water containing 0.1 mM EDTA.

그 다음, 정제된 산물 20ng, 2㎕의 5Хsequnecing buffer, 한쪽 방향의 프라이머 3.75pM 그리고 1㎕의 BigDye 3.1 ready mix(ThermoFisher scientific, USA)를 혼합하여 98℃ 5초, 50℃ 5초, 60℃ 4분의 조건으로 25 사이클(cycle)을 수행한 후, 반응이 끝난 산물에 Magnesil Green(Promega, USA) 100㎕를 넣어 정제한 후 20㎕의 증류수에 dye-termination된 핵산 단편들을 용출시킨 후, 자동염기서열분석장치인 Applied Biosystems 3130xl(ThermoFisher scientific, USA)를 사용하여 염기서열을 해독하였다.Then, 20 ng of the purified product, 2 μl of 5 × Sequnecing buffer, 3.75 pM of the unidirectional primer and 1 μl of BigDye 3.1 ready mix (ThermoFisher scientific, USA) were mixed and incubated at 98 ° C. for 5 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, Min. After the reaction was completed, 100 μl of Magnesil Green (Promega, USA) was added to the reaction mixture to elute the dye-terminated nucleic acid fragments into 20 μl of distilled water. The base sequence was decoded using Applied Biosystems 3130xl (ThermoFisher Scientific, USA), a sequencing apparatus.

그 다음, 염기서열이 해독된 데이터 정방향(forward)과 역방향(reverse)의 염기서열을 토대로 하나의 완성된 콘틱(contig) 염기서열을 만들고, 완성된 콘틱(contig) 염기서열을 미국국립생물정보센터 NCBI GeneBank Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 blast 검색을 통해 각 좌위별 염색체번호를 확인한 후, 각 좌위별 반복구간의 염기배열 구조를 확인하고 각 대립유전자 반복염기서열의 반복횟수를 더해 대립유전자 번호를 명명하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.Next, a complete contig base sequence was constructed based on the forward and reverse base sequences of the decoded data, and the completed contig sequence was obtained from the US National Bioinformatics Center After confirming the chromosome number of each locus using the blast search in the NCBI GeneBank Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), the nucleotide sequence structure of the repeats of each locus was confirmed, and each allele repeating base sequence And the number of alleles was added. The results are shown in Table 5 below.

Figure 112018043015848-pat00011
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상기 표 5를 보면 알 수 있듯이, 각 좌위별로 확인된 DNA 염기서열 반복구간의 염기서열 배열은 VGL3235는 [AAAG]n 반복구조를, FH2001는 [TATC]n 반복구조를, VGL1165는 [TTTC]n+TTTT+[TTTC]n 반복구조를, FH2054는 [ATCT]n 반복구조를, VGL2136은 [AAGA]n 반복구조를, VGL3438은 [AGAA]n 반복구조를, VGL3008은 [GGCT]n+[TGCT]n+[TTCT]n 반복구조를, FHC2328은 [GAAA]n+[NAGA]n+[GAAA]n 반복구조를, FH2016은 [AAGA]n 반복구조를, PEZ02는 [CCTT]n 반복구조를, VGL1828은 [TTCT]n+[TTTT]n 반복구조를, VGL1541은 [CTTT]n 반복구조를, VGL2009는 [TATC]n+[TACC]n 반복구조를, VGL2409는 [TTCT]n 반복구조를, VGL1063은 [AAAG)]n+[AAAT]n 반복구조를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Table 5, the nucleotide sequence of the DNA sequence repeating region identified for each locus was [AAAG] n repeating structure, FH2001 [TATC] n repeating structure, and VGL1165 [TTTC] n repeating structure TGTC] n + [TGCT] n repeating structure, FG2054 is [ATCT] n repeating structure, VGL2136 is [AAGA] n repeating structure, VGL3438 is [AGAA] n repeating structure, VGL3008 is [GGCT] [ATCA] n repeating structure, PEZ02 [CCTT] n repeating structure, VGL1828 [TTCT] n repeating structure, [TTCT] n repeating structure, FHC2328 [GAAA] n + [NAGA] n + (TAGC) n repeating structure, VGL2409 is the [TTCT] n repeating structure, and VGL1063 is the [AAAG] repeating structure. n + [AAAT] n repeating structure.

여기에서 [ ]안의 염기서열은 반복되는 염기배열 군을 나타내고, n은 반복 횟수를 나타낸다.Herein, the nucleotide sequence in [] represents a group of repeated nucleotide sequences, and n represents the number of repeats.

각 좌우의 대립유전자에서 나타나는 대립유전자의 반복염기군의 반복횟수(n)의 총합으로 해당하는 숫자로 대립유전자의 번호를 명명하였다.The number of alleles was designated as the total number of repeats (n) of repeating base groups of alleles in each right and left allele.

이상에서 본 발명은 기재된 특정한 실시형태 및 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Of course.

<110> CHO, kyechul <120> Method of individual identification and paternity test using the microsatellite markers in dogs <130> PA18-187 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3235 forward primer <400> 1 tctttctccc aatcattttc agg 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3235 reverse primer <400> 2 ctcagggcag ctgactttc 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2001 forward primer <400> 3 ggccagtttt ctgtacttgt tttt 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2001 reverse primer <400> 4 gagatcaaaa gtcatttcct aca 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1165 forward primer <400> 5 tgtcattcct tgtagctgta cca 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1165 reverse primer <400> 6 ggaaataggg tcttgcaaat g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2054 forward primer <400> 7 gttcccgcag tgctctactc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2054 reverse primer <400> 8 acaatgccaa gcaccataca 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2136 forward primer <400> 9 aaaggtaaca aggatgtact gatgg 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2136 reverse primer <400> 10 ggttctggca tggagaaaaa g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3438 forward primer <400> 11 ccttctatct cattagaata cacgc 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3438 reverse primer <400> 12 acactgggta tagcagtgat g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3008 forward primer <400> 13 gctctgtggt tccttggttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3008 reverse primer <400> 14 acacttgccc tattgcccta 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHC2328 forward primer <400> 15 ggcaattgct cagcactaga t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHC2328 reverse primer <400> 16 caactggcac ttgtcagctc t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2016 forward primer <400> 17 agttccaaat gctcttcttg c 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2016 reverse primer <400> 18 ggatgaagaa agaaacagat gaag 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 forward primer <400> 19 tgccctcagc ttcggggaaa 20 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 reverse primer <400> 20 gggtttttga tatttggacc ccag 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1828 forward primer <400> 21 tcaggacaaa acatgagagt gagga 25 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1828 reverse primer <400> 22 cccccaccac caactctct 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1541 forward primer <400> 23 tgagaagagg caattatctg tcca 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1541 reverse primer <400> 24 aaaggctcat cctgtccgtg 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2009 forward primer <400> 25 agctgctctt aaattttctg ggt 23 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2009 reverse primer <400> 26 gtacagcaag cccgggaaac 20 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2409 forward primer <400> 27 aatcccataa ggtaatgtgg atagg 25 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2409 reverse primer <400> 28 agaccctttc aaggatagac ctcc 24 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1063 forward primer <400> 29 gccagttgga gctttcatcc acc 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1063 reverse primer <400> 30 gttggcgaag tgcgcctttt ga 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-X forward primer <400> 31 gctacctggc tctggatgag 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-X reverse primer <400> 32 caggctctgg aacgcagg 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-Y forward primer <400> 33 gagactacag gccatgcacc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-Y reverse primer <400> 34 ggctgcaggt agcaatttgt 20 <110> CHO, kyechul <120> Method of individual identification and paternity test using the          microsatellite markers in dogs <130> PA18-187 <160> 34 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3235 forward primer <400> 1 tctttctccc aatcattttc agg 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3235 reverse primer <400> 2 ctcagggcag ctgactttc 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2001 forward primer <400> 3 ggccagtttt ctgtacttgt tttt 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2001 reverse primer <400> 4 gagatcaaaa gtcatttcct aca 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1165 forward primer <400> 5 tgtcattcct tgtagctgta cca 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1165 reverse primer <400> 6 ggaaataggg tcttgcaaat g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2054 forward primer <400> 7 gttcccgcag tgctctactc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2054 reverse primer <400> 8 acaatgccaa gcaccataca 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2136 forward primer <400> 9 aaaggtaaca aggatgtact gatgg 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > VGL2136 reverse primer <400> 10 ggttctggca tggagaaaaa g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3438 forward primer <400> 11 ccttctatct cattagaata cacgc 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > VGL3438 reverse primer <400> 12 acactgggta tagcagtgat g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL3008 forward primer <400> 13 gctctgtggt tccttggttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > VGL3008 reverse primer <400> 14 acacttgccc tattgcccta 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHC2328 forward primer <400> 15 ggcaattgct cagcactaga t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHC2328 reverse primer <400> 16 caactggcac ttgtcagctc t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2016 forward primer <400> 17 agttccaaat gctcttcttg c 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FH2016 reverse primer <400> 18 ggatgaagaa agaaacagat gaag 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 forward primer <400> 19 tgccctcagc ttcggggaaa 20 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEZ02 reverse primer <400> 20 gggtttttga tatttggacc ccag 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1828 forward primer <400> 21 tcaggacaaa acatgagagt gagga 25 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1828 reverse primer <400> 22 cccccaccac caactctct 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1541 forward primer <400> 23 tgagaagagg caattatctg tcca 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1541 reverse primer <400> 24 aaaggctcat cctgtccgtg 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2009 forward primer <400> 25 agctgctctt aaattttctg ggt 23 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2009 reverse primer <400> 26 gtacagcaag cccgggaaac 20 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL2409 forward primer <400> 27 aatcccataa ggtaatgtgg atagg 25 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > VGL2409 reverse primer <400> 28 agaccctttc aaggatagac ctcc 24 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VGL1063 forward primer <400> 29 gccagttgga gctttcatcc acc 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > VGL1063 reverse primer <400> 30 gttggcgaag tgcgcctttt ga 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-X forward primer <400> 31 gctacctggc tctggatgag 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-X reverse primer <400> 32 caggctctgg aacgcagg 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-Y forward primer <400> 33 gagactacag gccatgcacc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOG-Y reverse primer <400> 34 ggctgcaggt agcaatttgt 20

Claims (5)

VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 개의 개체를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물.
Microsatellite markers capable of identifying fourteen objects consisting of VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG- Composition.
VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 1 내지 34로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 개 개체식별용 키트.
Specific to a microsatellite marker composition consisting of VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG- 1. A kit for identifying a dog, comprising a primer consisting of a base sequence represented by 1 to 34.
(a) 분석하고자 하는 개의 핵산 시료를 VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X 및 DOG-Y로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 특이적이며 서열번호 1 내지 34로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 산물의 각 좌위의 대립유전자를 분리해 각 좌우별 대립유전자의 빈도, 이형접합률, 다형정보지수, 식별력, 배제력, 누적일치율 및 누적배제력을 산출하는 단계 및
(c) 각 좌위의 대립유전자의 염기서열을 해독하고, 반복염기서열의 반복횟수의 총합으로 대립유전자 번호를 명명하는 단계를 포함하는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법.
(a) Microbial samples to be analyzed are composed of microorganisms consisting of VGL3235, FH2001, VGL1165, FH2054, FH2016, VGL3438, VGL3008, FHC2328, VGL2136, PEZ02, VGL1828, VGL1541, VGL2009, VGL2409, VGL1063, DOG-X and DOG- Multiplex PCR amplification using a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 34, which is specific to the satellite marker composition;
(b) The alleles of each locus of the product amplified in step (a) are isolated and the frequency, heterozygosity, polymorphism information index, discrimination power, exclusion power, cumulative agreement rate and accumulated exclusion power of each left and right alleles are calculated And
(c) decoding the nucleotide sequence of each locus and naming the allele number by the sum of the repetition number of repetitive nucleotide sequences, using the microsatellite marker composition.
제3항에 있어서,
상기 (a) 단계는,
상기 마이크로새틀라이트 마커 조성물에 서열번호 1 및 2는 1.71 내지 1.91pM, 서열번호 3 및 4는 2.71 내지 2.91pM, 서열번호 5 및 서열번호 6은 3.26 내지 3.46pM, 서열번호 7 및 서열번호 8은 2.49 내지 2.69pM, 서열번호 9 및 10은 0.79 내지 0.99pM, 서열번호 11 및 12는 1.32 내지 1.52pM, 서열번호 13 및 14는 2.19 내지 2.39pM, 서열번호 15 및 16은 3.72 내지 3.92pM, 서열번호 17 및 18은 0.81 내지 1.01pM, 서열번호 19 및 20은 1.74 내지 1.94pM, 서열번호 21 내지 22는 2.10 내지 2.30pM, 서열번호 23 및 24는 2.08 내지 2.28pM, 서열번호 25 및 26은 0.55 내지 0.75pM, 서열번호 27 및 28은 0.50 내지 0.70pM, 서열번호 29 및 30은 1.45 내지 1.65pM, 서열번호 31 및 32는 4.01 내지 4.21pM, 서열번호 33 및 34는 2.01 내지 2.21pM의 농도로 혼합되는 것을 특징으로 하는 마이크로새틀라이트 마커조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법.
The method of claim 3,
The step (a)
SEQ ID NOs: 1 and 2 are 1.71 to 1.91 pM, SEQ ID NOs: 3 and 4 are 2.71 to 2.91 pM, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are 3.26 to 3.46 pM, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 11 and 12 are 1.32 to 1.52 pM, SEQ ID NOs: 13 and 14 are 2.19 to 2.39 pM, SEQ ID NOs: 15 and 16 are 3.72 to 3.92 pM, SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 19 and 20 are 1.74 to 1.94 pM, SEQ ID NOs: 21 to 22 are 2.10 to 2.30 pM, SEQ ID NOs: 23 and 24 are 2.08 to 2.28 pM, SEQ ID NOs: 25 and 26 are 0.55 SEQ ID NOs: 27 and 28 are 0.50 to 0.70 pM, SEQ ID NOs: 29 and 30 are 1.45 to 1.65 pM, SEQ ID NOs: 31 and 32 are 4.01 to 4.21 pM, SEQ ID NOs: 33 and 34 are 2.01 to 2.21 pM The microsatellite marker composition of the present invention is characterized in that the microsatellite marker composition Way.
제3항에 있어서,
상기 프라이머에 FAM, VIC, NED, PET로 형광표지(Label)를 하는 단계를 더 포함하는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 활용한 개의 개체식별 및 친자확인 방법.
The method of claim 3,
The method according to any one of claims 1 to 3, further comprising the step of fluorescently labeling the primers with FAM, VIC, NED and PET.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200100980A (en) 2019-02-19 2020-08-27 전북대학교산학협력단 Method and apparatus for paternity test using the microsatellite marker composition in dogs
KR102226281B1 (en) * 2019-12-04 2021-03-11 대한민국 Discrimination method for product traceability and identification of Felis catus using microsatellite DNA
KR20220020450A (en) 2020-08-11 2022-02-21 전북대학교산학협력단 Method and apparatus for searching real parents using the genomic information

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101156047B1 (en) 2009-09-18 2012-06-27 대한민국 Microsatellite marker and methods for identification of dogs

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101156047B1 (en) 2009-09-18 2012-06-27 대한민국 Microsatellite marker and methods for identification of dogs

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA R. SANCHEZ ARCHIDONA ET AL. JOURNAL OF STEROID BIOCHEMISTRY _ MOLECULAR BIOLOGY 104 (2007) 93_99 *
ANDREAS P. HELLMANN ET AL. J FORENSIC SCI, MARCH 2006, VOL. 51, NO. 2, PP. 274_281 *
BRADLEY K. TOM ET AL. J FORENSIC SCI, MAY 2010, VOL. 55, NO. 3, PP.597_604 *
EDWARD J. CARGILL ET AL. GENOMICS VOL. 80, NO. 3, PP.250_253 *
ELIZABETH WICTUM ET AL. FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS 7 (2013) 82_91 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200100980A (en) 2019-02-19 2020-08-27 전북대학교산학협력단 Method and apparatus for paternity test using the microsatellite marker composition in dogs
KR102226281B1 (en) * 2019-12-04 2021-03-11 대한민국 Discrimination method for product traceability and identification of Felis catus using microsatellite DNA
KR20220020450A (en) 2020-08-11 2022-02-21 전북대학교산학협력단 Method and apparatus for searching real parents using the genomic information

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