KR101889290B1 - 레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents

레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO A RETINOID RECEPTOR-SELECTIVE PATHWAY}
관련 출원
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/332,124호(출원일: 2010년 5월 6일)에 대하여 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권을 주장하며, 이 기초 출원은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.
연방 정부 지원 연구개발(R&D)에 관한 진술
본 발명은 NIH에 의해 수여된 CA109345 하 및 USAMRMC(U.S. Army Medical Research and Material Command)에 의해 수여된 W81XWH-08-1-0478 하에 정부 지원에 의해 수행되었다. 정부는 본 발명에 있어서 소정의 권한을 가진다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물의 분야에 관한 것이다.
비스테로이드성 소염제(nonsteroidal antiinflammatory drug: NSAID)의 항암 효과는 상당히 인식되어 있다(Tegeder, I. et al., FASEB J 15 (12), 2057-2072 (2001); Kashfi, K. & Rigas, B., Biochem Pharmacol 70 (7), 969-986 (2005)). NSAID는 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)(COX-1 및 COX-2)의 저해를 통해서 에이코사노이드 생산을 차단한다. NSAID는 아스피린의 규칙적인 이용이 결장암의 발생률을 저감시킨다는 발견 이래로 유망한 화학적 발암억제제로서 상당한 주목을 받아왔다. 불행하게도, NSAID의 유망한 항암 효과는, COX-2 저해와 연관된 것으로 알려진 생명을 위협하는 심혈관 합병증을 비롯한, 부수적으로 나타나는 부작용에 의해 가려졌었다. COX-2와 암형성 간의 관련성에도 불구하고, NSAID는, COX-1나 COX-2를 함유하지 않는 암 세포에서 세포자멸사를 유도하여, 다른 세포내 표적이 존재하는 것을 나타낸다(Tegeder, I. et al., FASEB J 15 (12), 2057-2072 (2001); Kashfi, K. & Rigas, B., Biochem Pharmacol 70 (7), 969-986 (2005)).
실시형태들은 레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이 경로는 종양 미세환경을 조종하도록 표적화된다. 일 실시형태에 있어서, 암 세포에서 세포자멸사를 유도하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 화학식 II의 화합물 등과 같은 암을 예방 또는 치료하기 위한 조성물이 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 화합물 K-80003 또는 K-80003 유사체를 포함하는 조성물이 암의 치료를 위하여 이용된다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 설린닥 설파이드(Sulindac sulfide)(이하 "설린닥" 또는 "설린닥 설파이드")는 임상적으로 관련된 농도에서 화합물 RXRα에 결합하고, 설린닥 작용의 세포내 표적으로서 RXRα를 확인하는, RXRα 의존적 방식에서 세포자멸사를 유도한다. 또 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 설린닥은 암 세포 내 결정적인 생존 키나제인 AKT(단백질 키나제 B)의 활성화를 강력하게 저해한다. 또한, N-말단 절두된(truncated) RXRα(tRXRα)는 암 세포에서의 생존 신호 전달을 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 설린닥은, TNFα와 조합될 경우, TNFα-유래 tRXRα/p85α 상호작용을 저해하여, 사멸 수용체-매개 세포자멸사 경로의 활성화를 초래한다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 설계되고 합성된 설린닥 유사체 K-80003은, COX 저해 활성 없이 RXRα에 대한 증가된 친화성을 발휘하며, 동물에서의 tRXRα-의존적 AKT 활성화 및 tRXRα 종양 성장을 저해함에 있어서 증가된 효능을 보인다.
암 치료를 위한 세포자멸사 경로를 표적화하는 설린닥-유래 RXRα 리간드가 본 명세서에 기재되어 있다. 일 실시형태에 있어서, 암 세포 내에 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor -α: TNFα) 활성을 상향조정함으로써, 상기 암 세포를 AKT의 억제에 대해서 감작시키는 단계; 및 상기 감작화된 암 세포를 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포에서 세포자멸사를 유도하는 방법이 제공되되, 상기 화합물은 레티노이드 X-수용체-α(retinoid X receptor-α: RXRα)와 상호작용하는 것으로 알려져 있고, 상기 화합물은 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 경로와는 독립적인 단백질 키나제 B(AKT)를 억제시키는 것으로 알려져 있다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 TNFα 활성을 상향조정하는 것은 상기 암 세포에 외인성 TNFα를 도입하는 것을 포함한다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 TNFα 활성을 상향조정하는 것은 상기 암 세포 내에 내인성 TNFα를 상향조정하는 것을 포함한다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 암 세포는 폐암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 간암 세포 및 결장암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 세포이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 암 세포는 A549 세포, H460 세포, ZR-75-1 세포, MCF-7 세포, LNCaP 세포, PC3 세포, HepG2 세포, Caco2 세포 및 SW480 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 세포이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 설린닥의 유사체이고, 상기 유사체는 RXRα에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 작은 IC50과, COX-2에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 큰 IC50으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 발휘한다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80001, K-80002, K-80003, K-80004 및 K-80005로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80003이다.
다른 실시형태에 있어서, 암 세포 내에 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별(screening)하는 방법으로서, 해당 방법은 암 세포에 후보 화합물을 제공하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 상기 암 세포에서 AKT의 활성의 억제, 카스파제(caspase)-8의 활성화, BAX의 활성화, cFLIP의 저해 및 Bid의 분해로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성을 가능하게 하는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 AKT의 활성을 억제하는 것이 가능한지의 여부를 판정하는 단계는, 상기 암 세포를 모든-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid: ATRA) 또는 9-시스-RA로 전처리함으로써 AKT를 활성화시키는 단계; 및 상기 후보 화합물의 투여 이후 상기 암 세포 내 AKT의 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 세포 내에 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 세포에 후보 화합물을 제공하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 절두된 RXRα(tRXRα) 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드, 단백질, 핵산 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다.
추가의 실시형태에 있어서, 세포 내에 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 세포에 후보 화합물을 제공하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 tRXRα 단백질을 조절할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드, 단백질, 핵산 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 tRXRα 단백질을 조절할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계는, 상기 후보 화합물이 tRXRα가 p85α단백질에 결합하는 것을 방지할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 tRXRα 단백질을 조절할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계는, 상기 후보 화합물이 tRXRα가 단백질 변성(modification)을 받는 것을 방지할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 단백질 변성은 인산화반응을 포함한다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 tRXRα 단백질을 조절할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계는, 상기 후보 화합물이 상기 tRXRα가 핵으로부터 세포질로 이동하는 것을 방지할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 세포 내에 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 tRXRα를 발현하는 세포를 확인하는 단계; 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 상기 후보 화합물이 상기 세포의 세포자멸사를 유도하는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드, 단백질, 핵산 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 소분자 라이브러리로부터의 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드 라이브러리로부터의 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 세포는 유방 혹은 간으로부터 유래된다.
추가의 실시형태에 있어서, 종양의 성장을 저해하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 tRXRα를 발현하는 종양을 확인하는 단계; 상기 종양을 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 상기 후보 화합물이 상기 종양의 성장을 저해하는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드, 단백질, 핵산 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 소분자 라이브러리로부터의 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 후보 화합물은 펩타이드 라이브러리로부터의 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 종양은 유방 혹은 간으로부터의 종양이다.
추가의 실시형태에 있어서, 대상체에서 암을 예방하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 일반적인 모집단에 비해서 암에 대한 상승된 위험을 지니는 대상체를 확인하는 단계; 및 AKT의 활성을 억제하는 제제를 상기 대상체에게 제공하는 단계를 포함하고, 상기 대상체 내에서 세포의 표면 상의 RXRα에 대한 상기 제제의 결합은 AKT 활성의 억제를 초래한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 제제를 투여하기 전에 상기 대상체에게 TNFα를 투여함으로써, 상기 대상체 내의 암 세포를 상기 제제에 의한 AKT 저해에 대해서 감작시키는 단계를 더 포함한다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 제제는 설린닥의 유사체이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80001, K-80002, K-80003, K-80004 및 K-80005로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80003이다.
추가의 실시형태에 있어서, 포유동물에서 암을 치료하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 암으로 고통받는 포유동물을 확인하는 단계; 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 경로와는 독립적인 AKT의 활성을 억제하는 것으로 알려진 제제의 치료상 유효량을 상기 포유동물에게 제공하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 제제를 투여하기 전에 상기 포유동물에게 TNFα를 투여함으로써, 상기 포유동물 내의 암 세포를 상기 제제에 의한 AKT 저해에 대해서 감작시키는 단계를 더 포함한다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 제제는 설린닥의 유사체이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80001, K-80002, K-80003, K-80004 및 K-80005로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 유사체는 K-80003이다. 본 실시형태의 추가의 양상에 있어서, 상기 포유동물은 인간이다.
추가의 실시형태에 있어서, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 식 중, A는 아릴 또는 헤테로아릴이고, A는 R3 및 0, 1 또는 2개의 R4에 의해 임의선택적으로 치환될 수 있으며; B는 아릴 또는 헤테로아릴이고, B는 0, 1 또는 2개의 R4에 의해 임의선택적으로 치환될 수 있으며; R1은 (CR5R6)nCOOH이고; R2는 H, C1-10 알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 알킬O, 알킬S 및 할로알킬O로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3 및 R4는 H, C1-10 알킬, 할로알킬, 할로, CN, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 알킬O, 알킬S, (CR4R6)nCONR7R8, OH, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 사이클로알킬O 및 알콕시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R5 및 R6는 H, C1-7알킬, OH, 알콕시, 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는 함께 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기를 형성하며; n은 0, 1, 2 또는 3이다.
추가의 실시형태에 있어서, 포유동물에서 암을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 화합물은 RXRα에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 작은 IC50과, COX-2에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 큰 IC50으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 발휘한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, R1은 CH2COOH 및 CH2CH2COOH로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 CH3 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 4-SCH3, 4-CH3, 4-CH2CH3 및 4-CH(CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, RXRα-선택적 방법에 있어서 암 세포에서 세포자멸사를 유도하는 능력에 대해서 후보 화합물을 선별하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 암 세포에 후보 화합물을 제공하는 단계; 및 상기 암 세포 내의 COX-2 활성을 저해하는 일 없이 상기 후보 화합물이 RXRα에 결합할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 RXRα에 결합할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계는 상기 암 세포 내의 키모트립신 분해에 대한 RXRα의 변경된 감도(sensitivity)를 검출하는 단계를 포함한다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 후보 화합물이 RXRα에 결합할 수 있는지의 여부를 판정하는 단계는 상기 암 세포 내의 변경된 시차 주사 열량(differential scanning calorimetry: DSC) 프로파일을 검출하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, A는 아릴 또는 헤테로아릴이고, A는 R3 및 0, 1 또는 2개의 R4에 의해 임의선택적으로 치환될 수 있으며; B는 아릴 또는 헤테로아릴이고, B는 0, 1 또는 2개의 R4에 의해 임의선택적으로 치환될 수 있으며; R1은 (CR5R6)nCOOH이고; R2는 H, C1-10 알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 알킬O, 알킬S 및 할로알킬O로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3 및 R4는 H, C1-10 알킬, 할로알킬, 할로, CN, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 알킬O, 알킬S, (CR4R6)nCONR7R8, OH, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 사이클로알킬O 및 알콕시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R5 및 R6는 H, C1-7알킬, OH, 알콕시, 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는 함께 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기를 형성하며; n은 0, 1, 2 또는 3이다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 상기 조성물은 RXRα에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 작은 IC50과, COX-2에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 큰 IC50으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 발휘한다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 CH2COOH 및 CH2CH2COOH로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 CH3 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 4-SCH3, 4-CH3, 4-CH2CH3 및 4-CH(CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 실시형태의 일 양상에 있어서, 상기 조성물은 K-80001, K-80002, K-80003, K-80004 및 K-80005로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 실시형태의 다른 양상에 있어서, 상기 조성물은 K-80003이다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 III의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 IV의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 V의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 COOH, CH2CH2COOH, CH=CHCOOH, CH2-테트라졸, CH2-CH2-테트라졸, CH2COOCH3, CH3, CH2CONH2, CH2CONHCH3, CH2OH, CH2CH2OH 및 CH2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, Cl, CH2CH3, OCH3, NH2, NHCH3, CF3, CH2NH2, CH2OH, CH2Cl, CH(CH3)2 및 OCH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 H, CH=CH2, CCH, C(CH3)3, CF3, OH, OCH3, OCH2CH3, NH2, NHCH3, CN, NHCOCH3,
Figure 112012100950912-pct00001
Figure 112012100950912-pct00002
로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4는 H, Cl, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, OCH3, OCHCH3, NH2 및 NHCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 III의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 IV의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 V의 화합물을 포함하는 조성물이 제공되되, 식 중, R1은 COOH, CH2CH2COOH, CH=CHCOOH, CH2-테트라졸, CH2-CH2-테트라졸, CH2COOCH3, CH3, CH2CONH2, CH2CONHCH3, CH2OH, CH2CH2OH 및 CH2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, Cl, CH2CH3, OCH3, NH2, NHCH3, CF3, CH2NH2, CH2OH, CH2Cl, CH(CH3)2 및 OCH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택되며; R3는 H, CH=CH2, CCH, C(CH3)3, CF3, OH, OCH3, OCH2CH3, NH2, NHCH3, CN, NHCOCH3,
Figure 112012100950912-pct00003
로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4는 H, Cl, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, OCH3, OCHCH3, NH2 및 NHCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에 있어서, 설린닥의 유사체를 포함하는 조성물이 제공되되, 상기 유사체는 RXRα에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 작은 IC50과, COX-2에 결합된 경우 설린닥의 IC50보다 큰 IC50으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 발휘한다.
추가의 실시형태에 있어서, 3-(4-플루오로페닐)-2-메틸아크릴산; 3-(4-플루오로페닐)-2-메틸프로판산, 6-플루오로-2-메틸-2,3-다이하이드로인덴-1-온; 에틸 2-(6-플루오로-2-메틸-3H-인덴-1-일)아세테이트; (Z)-2-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3H-인덴-1-일)아세트산; (Z)-2-(3-(4-메틸벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3H-인덴-1-일)아세트산; (Z)-2-(3-(4-에틸벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3H-인덴-1-일)아세트산; (Z)-2-(3-(4-아이소-프로필벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3H-인덴-1-일)아세트산; 에틸 2-(6-플루오로-3H-인덴-1-일)아세테이트; (E)-2-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-3H-인덴-1-일)아세트산; 스피로(다이하이드로-2(3H)퓨라논-5-1'(2'H)(3'H)-6-플루오로-인단; 메틸 3-(6-플루오로-3H-인덴-1-일)프로파노에이트; (E)-메틸 3-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-3H-인덴-1-일)프로파노에이트; K-80003 유사체 번호(Analog No.) 1; K-80003 유사체 번호 2; K-80003 유사체 번호 3; K-80003 유사체 번호 4; K-80003 유사체 번호 5; K-80003 유사체 번호 6; K-80003 유사체 번호 7; K-80003 유사체 번호 8; K-80003 유사체 번호 9; K-80003 유사체 번호 10; K-80003 유사체 번호 11; K-80003 유사체 번호 12; K-80003 유사체 번호 13; K-80003 유사체 번호 14; K-80003 유사체 번호 15; K-80003 유사체 번호 16; K-80003 유사체 번호 17; K-80003 유사체 번호 18; K-80003 유사체 번호 19; K-80003 유사체 번호 20; K-80003 유사체 번호 21; K-80003 유사체 번호 22; K-80003 유사체 번호 23; K-80003 유사체 번호 24; K-80003 유사체 번호 25; K-80003 유사체 번호 26; K-80003 유사체 번호 27; K-80003 유사체 번호 28; K-80003 유사체 번호 29; K-80003 유사체 번호 30; K-80003 유사체 번호 31; K-80003 유사체 번호 32; K-80003 유사체 번호 33; 및 K-80003 유사체 번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다.
도 1은 RXRα에 결합하는 설린닥을 도시한 것이다. (A) [3H]9-시스-RA 또는 미표지된 9-시스-RA로 인큐베이팅된 RXRα LBD 단백질에 결합된 설린닥. (B) HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같은 RXRα, Nur77 혹은 RARβ를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 중의 RXRα에 결합하는 설린닥. (C) 설린닥에 의한 키모트립신에 대한 RXRα LBD 또는 GST-RXRα의 변경된 감도. (D) RXRα LBD 또는 Nur77 단백질의 존재 유무에 있어서의 설린닥의 19F NMR 스펙트럼의 비교. 설린닥은 (TREpal)2-tk-CAT 활성(Zhang et al., Nature 358, 587-591 (1992a))(E) 또는 βRARE-tk-CAT 활성(Zhang et al., Nature 355, 441-446 (1992b))(F)에 의해 결정된 바와 같이 RXRα 호모다이머 및 헤테로다이머의 트랜스활성화(transactivation)를 저해한다.
도 2는 RXRα-의존적 세포자멸사 및 Bax 활성화를 유도하는 설린닥을 나타낸다. DAPI 염색(A), PARP 분할(B) 및 DNA 분절(fragmentation)(C)에 의해 분석된 바와 같은 RXRα(F9 RXRα-/-)를 결여하는 F9 혹은 F9 세포의 설린닥의 세포자멸 효과. RXRα siRNA는 설린닥에 의한 세포자멸사 유도를 저해한다. 대조군 또는 RXRα siRNA에 의해 형질감염된(transfected) H460 폐암 세포(D)는 설린닥에 의해 치료되고 세포자멸사를 위해 DAPI 염색에 의해 분석되었다(E). (F) RXRα의 형질감염은 설린닥의 세포자멸 효과를 증대시킨다. GFP-RXRα로 형질감염된 CV-1 세포는 설린닥에 의해 치료되고 DAPI 염색에 의해 분석되었다. (G) RXRα LBP의 파열은 설린닥의 세포자멸 효과를 손상시킨다. GFP-RXRα 혹은 GFP-RXRα/F313S/R316E로 형질감염된 CV-1 세포는 설린닥으로 치료되고 DAPI 염색에 의해 분석되었다. 세포자멸사는 수용체 형질감염된 세포에서 점수 매겨졌다. 세포자멸사 유도에 있어서의 Bax의 역할. HCT116 세포 혹은 Bax(Bax-/-)를 결여한 HCT116 세포는 설린닥으로 혹은 설린닥 없이 치료되었다. 세포자멸사는 PARP 분할(H) 및 DAPI 염색(I)에 의해 판정되었다. (J,K) RXRα siRNA는 설린닥-유래 Bax 활성화를 저해한다. RXRα siRNA에 의한 HCT116 세포 내 RXRα의 녹아웃은 면역 블로팅에 의해 드러났다. RXRα siRNA 혹은 대조군 siRNA 없이 혹은 이를 이용해서 형질감염된 HCT116 세포는 설린닥으로 치료되었고, Bax 올리고머화(J) 및 Bax/Δ21, Bax/6A7, 또는 항-Hsp60 항체를 이용한 면역염색/공초점 현미경수법에 의한 Bax 입체형태 변화 및 미토콘드리아 표적화(K)에 대해서 분석되었다.
도 3은 TNFα 유래 AKT 활성화 및 tRXRα-p85α 상호작용을 저해하는 설린닥을 도시한다. (A) 설린닥에 의한 AKT 활성화의 저해. 하룻밤 절식시키고 설린닥으로 치료된 HCT116, SW480, HepG2, ZR75-1, MCF-7, PC3, LNCaP, HaCat 및 RAW264.7 세포는 면역 블로팅에 의한 AKT 활성화에 대해서 분석되었다. (B) RXRα siRNA에 의한 기본적인 AKT 활성화의 저해. RXRα siRNA로 형질감염된 HepG2 세포는 설린닥으로 치료되었다. AKT 활성화 및 RXRα 발현은 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (C) 설린닥 및 RXRα siRNA에 의한 TNFα 유래 AKT 활성화의 저해. RXRα 혹은 대조군 siRNA에 의해 형질감염된 A549 폐암 세포는 설린닥에 의해 사전치료되고 TNFα에 노출되었다. AKT 활성화 및 RXRα 발현은 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (D) TNFα 및 설린닥에 의한 AKT 활성화의 상승작용적 저해. ZR-75-1 및 PC3 세포는 설린닥으로 사전치료되고, TNFα에 노출되었다. AKT 활성화는 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (E) 공면역침강 및 면역 블로팅 분석평가(assay)에서 이용된 항-RXRα 항체의 개략적 도해(위쪽). D20 항체는 N-말단 A/B 도메인 내 아미노산 2-21을 인식하는 한편, ΔN197 항체는 C-말단 E/F 도메인을 인식한다(아래쪽). 약 44 kDα을 지니는 RXR 절두된 단백질이 또한 도시되어 있다. (F) 각종 암 세포주에서의 tRXRα의 발현. 9-시스-RA를 이용해서 혹은 이것 없이 처리된 HCT116, SW480, ZR75-1, MCF-7, PC3, LNCaP, HepG2, HaCat, Caco2, MEF, RAW 및 BHK 세포주는 ΔN197 RXRα 항체를 이용한 면역 블로팅에 의해 분석되었다.
도 4는 AKT 활성화 및 비부착(anchorage-independent) 세포 성장에서의 tRXRα의 역할을 도시한다. (A) tRXRα 및 AKT 활성화의 세포 밀도-의존적 생산. 상이한 세포 밀도에서 파종된(seeded) MEF는 ΔN197 항체를 이용한 RXRα 발현에 대해서 그리고 면역 블로팅에 의한 AKT 활성화에 대해서 분석되었다. (B) MEF 내 내인성 RXRα의 세포하(subcellular) 위치는 항-RXRα(ΔN197)를 이용한 면역염색 후 공초점 현미경수법에 의해 가시화되었다. 세포는 또한 DAPI로 염색되어 핵을 가시화한다. (C) RXRα/1-134의 안정한 발현은 RXRα 분할 및 AKT 활성화를 유도한다. RXRα/1-134를 안정적으로 발현하는 HeLa 혹은 HeLa 세포는 9 시스-RA로 치료되고, AKT 활성화 및 RXRα의 발현에 대해서 분석되었다. (D) 연질 한천 내에서의 HeLa/RXRα/1-134 및 HeLa 세포의 성장. (E) 설린닥은 HeLa/RXRα/1-134 세포의 클론원성 생존을 저해한다. (F) 종양 주위 및 정상 조직과 비교한 유방(6개 중 5개) 또는 간(6개 중 4개)의 인간 종양 조직 내에서의 tRXRα의 생산. (G) ΔN197 항체에 의해 면역염색된 간 종양 검체 내에서의 RXRα의 세포질 위치. T: 종양 조직; S: 종양 주위 조직.
도 5는 TNFα에 의한 PI3K/AKT 활성화 및 암 세포 성장에서의 N-말단 절두된 RXRα의 역할을 도시한다. (A) HEK293T 세포는 플래그(Flag)-p85α 및 Myc 에피토프(epitope)로 표지된 RXRα, RXRα/Δ80, 또는 RXRα/Δ100으로 형질감염되고, TNFα로 치료되었으며, 항-플래그 항체를 이용해서 공면역침강에 의해 분석되었다. (B) RXRα의 N-말단 A/B 도메인은 p85α와 상호작용한다. 플래그-p85α는 HEK293T 세포 내로 GFP-RXRα-1-134 및 GFP-RXRα-224-462에 의해 공형질감염되고, 항-플래그 항체를 이용해서 공면역침강에 의해 그들의 상호작용에 대해서 분석되었다. (C) RXRα/Δ80은 강력한 AKT 활성자이다. 면역 블로팅에 의해 결정된 바와 같이 RXRα/Δ80 또는 RXRα/Δ100으로 형질감염된 HEK293T, HeLa, A549 및 MCF-7 세포의 AKT 활성화. (D) RXRα/Δ80 및 p85α의 세포질 중첩(co-localization). Myc-RXRα/Δ80 및 p85α는 PC3 및 ZR-75-1 세포주 내로 공형질감염되고, 항-Myc 및 항-p85α 항체로 면역염색되었으며, 그들의 세포하 위치는 공초점 현미경수법에 의해 드러났다. (E) RXRα/Δ80 면역침강에 의한 PI3K의 활성화. 플래그-p85α 및 Myc-RXRα/Δ80에 의해 형질감염된 A549 세포는 TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되었고, 항-Myc 항체로 면역침강되었으며, 시험관내 PI3K 분석평가가 실시되었다. (F) RXRα/Δ80의 안정한 발현. GFP-RXRα/Δ80 또는 대조군 GFP 벡터로 안정적으로 형질감염된 세포는 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (G) RXRα/Δ80은 암 세포의 클론원성 생존을 촉진시킨다. (H,I) RXRα/Δ80은 누드 마우스에서 암 세포 성장을 촉진시킨다.
도 6은 설린닥에 의한 TNFα 유래 외인성 세포자멸 경로의 활성화를 도시한다. (A) 설린닥/TNFα 조합에 의한 세포자멸사의 상승작용적 유도 및 RXRα 리간드에 의한 그의 저해. 1% FBS(fetal bovine serum)를 지니는 배지에서 배양된 HepG2 세포는 SR11237에 이어서, TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (B) RXRα siRNA에 의한 설린닥/TNFα 유래 카스파제-8 분할의 저해. 대조군 혹은 RXRα siRNA로 형질감염된 HepG2 세포는 TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다. 카스파제-8 저해제(C) 및 siRNA(D)에 의한 설린닥/TNFα 유래 PARP 분할의 저해. 대조군 또는 카스파제-8 siRNA로 형질감염되거나 ZIETD-fmk로 사전 치료된 HepG2 세포는 TNFα 및 설린닥으로 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (E) 설린닥 및 TNFα에 의한 활성화. TNFα 및/또는 설린닥으로 치료된 HepG2 세포는 Bax/6A7 항체로 면역염색되었다. (F) AKT에 의한 설린닥/TNFα 유래 PARP 분할의 조절. CA-AKT 또는 DN-AKT로 형질감염된 PC3 세포는 TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다. 설린닥 및 TNFα에 의한 카스파제-8(G) 및 Bax(H)의 활성화. CA-AKT로 형질감염된 HepG2 세포는 TNFα 및 설린닥으로 치료되었고, 항-분할된 카스파제-8 혹은 Bax/6A7 항체로 면역염색되었다. (I) TNFα 및 설린닥에 의한 c-FLIP 발현의 조절. TNFα 및/또는 설린닥으로 치료된 세포는 면역 블로팅에 의해 분석되었다.
도 7은 RXRα-선택적 설린닥 유사체의 설계, 합성 및 평가를 도시한다. (A) 9-시스-RA를 참조하여 RXRα의 LBP에 대한 설린닥 설파이드의 도킹(docking). 리간드의 4Å 내의 측쇄는 회색으로 표시되었다. (B) 9-시스-RA, DHA 및 BMS649의 결정 구조에 대한 도킹된 설린닥 설파이드의 배향 및 위치의 비교. (C) 설린닥 유사체에 의한 RXRα 결합 및 COX-1 및 COX-2 활성화의 저해. RXRα 결합은 경쟁적 리간드-결합 분석평가에 의해 측정되었다. (D) 설린닥 및 유사체에 의한 PGE2 생산의 저해. TNFα로 자극된 A549 세포는 설린닥 혹은 유사체로 치료되었다. (E) RXRα LBD의 존재 유무에 있어서의 K-80003의 19F NMR 스펙트럼의 비교.
도 8은 K-80003이 RXRα-의존적 AKT 활성화의 강력한 저해제인 것을 도시한다. (A) TNFα의 존재 하에 설린닥 혹은 K-80003에 의한 AKT 활성화의 저해. (B) K-80003에 의한 AKT 활성화의 RXRα-의존적 저해. RXRα 또는 RARγ siRNA로 형질감염된 PC3 세포는 TNFα(pRXRα: 인산화 RXRα)에 대한 노출 전에 K-80003으로 사전 치료되었다. (C) 설린닥 및 K-80003에 의한 p85α와의 RXRα/Δ80 상호작용의 저해. A549 세포는 플래그-p85α 및 Myc-RXRα/Δ80으로 형질감염되었고, TNFα에 노출 전에 설린닥 혹은 K-80003으로 치료되었으며, 항-플래그 항체를 이용한 공면역침강에 의해 분석되었다. (D) TNFα의 존재 하에 설린닥 혹은 K-80003에 의한 PARP 분할의 유도. TNFα 및/또는 설린닥 혹은 K-80003으로 치료된 ZR-75-1 세포는 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (E) TNFα의 존재 하에 K-80003에 의한 카스파제-8의 활성화. TNFα 및/또는 K-80003으로 치료된 세포는 면역 블로팅에 의해 분석되었다. (F) 설린닥 및 K-80003에 의한 RXRα/1-134 세포 및 RXRα/Δ80 안정화 클론의 클론원성 생존의 저해. (G) 설린닥 및 K-80003에 의한 동물에서의 RXRα/Δ80 종양 성장의 저해.
도 9A 내지 도 9C는 도 1과 관련된 것으로, 설린닥의 RXRα에 대한 결합 및 RXRα 트랜스활성화에 대한 그의 효과를 도시한다.
도 10은 도 1B와 관련된 것으로, HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같이 설린닥의 RXRα 단백질에 대한 결합을 도시한다.
도 11A 내지 도 11D는 도 2G와 관련된 것으로, 설린닥의 세포자멸 효과를 매개하기 위한 RXRα 돌연변이, RXR/F313S/R316E의 손상된 능력을 도시한다.
도 12A 내지 도 12E는 도 3과 관련된 것으로, AKT 활성화 및 tRXRα-p85α 상호작용에 대한 설린닥의 저해 효과를 도시한다.
도 13은 도 4B 및 도 5D와 관련된 것으로, 세포 분절 분석평가을 이용한 tRXRα의 세포질 위치를 도시한다.
도 14는 도 4와 관련된 것으로, RXRα/1-134의 안정한 발현에 의한 내인성 tRXRα의 생산을 도시한다.
도 15A 내지 도 15B는 도 5E와 관련된 것으로, tRXRα가 A549 폐암 세포로부터 면역침강되는 것을 도시한다.
도 16A 내지 도 16D는 도 6과 관련된 것으로, 설린닥-유래 세포자멸사가 사멸 수용체-의존적 외인성 세포자멸 경로에 의해 매개되는 것을 도시한다.
도 17A 및 도 17B는 도 6과 관련된 것으로, HepG2 및 HCT116 암 세포주 양쪽 모두에서의 설린닥/TNFα 조합에 의한 카스파제-8의 상승작용적 활성화를 도시한다.
도 18A 및 도 18B는 도 7과 관련된 것으로, 본 명세서에 기재된 RXRα-선택적 설린닥 유사체의 몇몇의 설계를 도시한다.
도 19는 도 8과 관련된 것으로, 설린닥 유사체 K-80003의 합성을 도시한다.
도 20은 도 8과 관련된 것으로, K-80003이 모든-트랜스-레티노산에 의한 AKT 활성화를 저해함에 있어서 설린닥보다 더 효율적인 것을 도시한다.
도 21A 내지 도 21C는 마우스에서 성장된 MCF-7 유방 종양에 대한 K-80003의 경구 투여의 성장 저해 효과를 도시한다. (A) 경구 K-80003 혹은 대조군으로 치료된 마우스에서의 시간 경과에 따른 유방 종양 체적. (B) 대조군으로 치료된 마우스로부터의 유방 종양 조직. (C) K-80003으로 치료된 마우스로부터의 유방 종양 조직.
도 22A 내지 도 22C는 K-80003의 임상전 연구에 대한 독성 및 PK 프로파일을 도시한다. (A) 독성 데이터. (B) 생체이용률 데이터. (C) 약동학적 데이터.
본 명세서에 개시된 각종 실시형태는 레티노이드 수용체-선택적 경로와 관련된 조성물 및 방법에 대한 것이다. 이 경로는 암을 발병할 위험을 줄이거나 치료하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 조종될 수 있다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, tRXRα는 세포질 내에 본질적으로 존재하고, p85α와 상호작용하며, AKT를 활성화시키고, 세포의 비부착 성장을 부여한다. 이들 관찰점은 암 세포 내 tRXRα-매개된 생존 경로를 나타내며, 이는 암에서의 RXRα 및 그의 리간드의 역할로의 새로운 식견을 제공한다. RXRα의 단백질 분해 처리에 의한 PI3K/AKT 생존 경로의 이러한 활성화는 절두된 비드(truncated Bid: tBid)에 의한 세포자멸 경로의 활성화 및 절두된 노치(Notch) 단백질에 의한 노치 경로의 활성화와 유사하다. 흥미롭게는, Bid 및 노치의 분할은 또한, RXRα 절두화에 대한 효과와 마찬가지로, 그들의 세포하 위치를 변경한다. RXRα가 설린닥 작용의 세포내 표적으로서 역할한다는 지견은 본 명세서에 기재된 AKT 활성을 억제하기 위하여 RXRα-선택적 설린닥 유도체의 설계를 촉진시켰다. 예를 들어, 본 명세서에서는, COX 저해 활성을 결여하고 있지만, AKT를 저해함에 있어서 증가된 효능 및 RXRα에 대한 보다 큰 친화도를 지니는, 설린닥-유래 RXRα 리간드인 K-80003의 설계와 합성이 제공된다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 내인성 TNFα의 상향조절 및/또는 외인성 TNFα의 도입은 반응성에 대한 암 세포를 일차처리함에 있어서 유용할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 I을 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 I]
Figure 112012100950912-pct00004
몇몇 실시형태에 있어서, A는 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또한 임의선택적으로 R3 및 0, 1 또는 2개의 R4로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, B is 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또한 임의선택적으로 0, 1 또는 2개의 R4로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1은 (CR5R6)nCOOH이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H, C1-10 알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 알킬O, 알킬S, 할로알킬O, NH2, 및 알킬N으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-10 알킬, 할로알킬, 할로, CN, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 알킬O, 알킬S, (CR4R6)nCONR7R8, OH, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 사이클로알킬O 및 알콕시알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R5 및 R6는 독립적으로 H, C1-7알킬, OH, 알콕시 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 함께 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기을 형성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, n은 0, 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 II를 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 II]
Figure 112012100950912-pct00005
몇몇 실시형태에 있어서, R1은 CH2COOH 및 CH2CH2COOH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 CH3 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R3는 4-SCH3, 4-CH3, 4-CH2CH3 및 4-CH(CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 화학식 III을 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 III]
Figure 112012100950912-pct00006
몇몇 실시형태에 있어서, n은 2이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, B 및/또는 D는 헤테로 고리(예컨대, 헤테로 원자로 제한됨)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 III으로부터의 COOH는 테트라졸과 대체된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 IV를 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 IV]
Figure 112012100950912-pct00007
몇몇 실시형태에 있어서, n은 2이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1은 CH3, F 및 Cl로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H, CH3, Cl 및 F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R3는 CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH2Cl, OCH3 및 SCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, B 및/또는 D는 헤테로 고리(예컨대, 헤테로 원자로 제한됨)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 V를 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 V]
Figure 112012100950912-pct00008
몇몇 실시형태에 있어서, R1은 COOH, CH2CH2COOH, CH=CHCOOH, CH2-테트라졸, CH2-CH2-테트라졸, CH2COOCH3, CH3, CH2CONH2, CH2CONHCH3, CH2OH, CH2CH2OH 및 CH2NH2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H, Cl, CH2CH3, OCH3, NH2, NHCH3, CF3, CH2NH2, CH2OH, CH2Cl, CH(CH3)2 및 OCH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, R3는 H, CH=CH2, CCH, C(CH3)3, CF3, OH, OCH3, OCH2CH3, NH2, NHCH3, CN, NHCOCH3,
Figure 112012100950912-pct00009
및
Figure 112012100950912-pct00010
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, R4는 H, Cl, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, OCH3, OCHCH3, NH2 및 NHCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, R1 내지 R4의 어느 것이라도 당업자에게 공지된 기타 임의의 적절한 기일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 화학식 VI을 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 VI]
Figure 112012100950912-pct00011
식 중, R1은 COOH, CH2CH2COOH, CH=CHCOOH, CH2-테트라졸, CH2-CH2-테트라졸, CH2COOCH3, CH3, CH2CONH2, CH2CONHCH3, CH2OH, CH2CH2OH 및 CH2NH2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 VII을 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 VII]
Figure 112012100950912-pct00012
식 중, R2는 H, Cl, CH2CH3, OCH3, NH2, NHCH3, CF3, CH2NH2, CH2OH, CH2Cl, CH(CH3)2 및 OCH2CH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 VIII을 지니는 코어 구조를 지닌다:
[화학식 VIII]
Figure 112012100950912-pct00013
식 중, R3는 H, CH=CH2, CCH, C(CH3)3, CF3, OH, OCH3, OCH2CH3, NH2, NHCH3, CN, NHCOCH3,
Figure 112012100950912-pct00014
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 IX를 지니는 코어 구조를 포함한다:
[화학식 IX]
Figure 112012100950912-pct00015
식 중, R4는 H, Cl, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, OCH3, OCHCH3, NH2 및 NHCH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 실시형태는 부가적으로 화학식 I 내지 IX, 및/또는 본 명세서에서 제공된 다른 것 중 어느 하나의 코어 구조를 지니는, 실시예 16에 표시된 화합물의 유사체 및 유도체를 포함하는, 화합물의 유사체를 제공한다. 공지된 방법을 이용해서 본 명세서에 기재된 화합물에 각종 변성이 행해질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 각종 코어 구조 내의 R기는 변경될 수 있다는 것 또한 이해될 것이다. 또, 본 명세서에 개시된 화합물의 유사체는 화학 합성의 공지된 방법을 이용하고 또한 구조 활성 관계(structure activity relationship: SAR) 연구를 수행하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한, 당업자라면 본 명세서에 기재된 방법을 이용해서 각종 유사체의 활성을 용이하게 결정할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, RXRα에 결합된 유사체의 IC50은 RXRα에 결합된 경우의 설린닥의 IC50보다 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 크다.
몇몇 실시형태에 있어서, COX-1에 결합된 유사체의 IC50은 COX-1에 결합된 경우의 설린닥의 IC50보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 크다. 몇몇 실시형태에 있어서, COX-1에 결합된 유사체의 IC50은 COX-1에 결합된 경우의 설린닥의 IC50보다 약 1.5X, 2X, 2.5X, 3X, 3.5X, 4X, 4.5X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 50X, 100X, 250X, 500X 또는 1000X 크다.
몇몇 실시형태에 있어서, COX-2에 결합된 유사체의 IC50은 COX-2에 결합된 경우의 설린닥의 IC50보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 크다. 몇몇 실시형태에 있어서, COX-2에 결합된 유사체의 IC50은 COX-2에 결합된 경우의 설린닥의 IC50보다 약 1.5X, 2X, 2.5X, 3X, 3.5X, 4X, 4.5X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 50X, 100X, 250X, 500X 혹은 1000X 크다.
이하의 정의는 본 명세서의 본 발명을 설명하는데 이용되는 각종 용어의 의미와 범위를 예시하고 정의하기 위하여 기술된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알콕시"는 산소 원자를 통해서 모 분자 부분(parent molecular moiety)에 부착된 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알콕시알킬"은 1, 2 혹은 3개의 알콕시기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬"은 1 내지 10개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 혹은 분기쇄의 포화 탄화수소로부터 유래된 기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아릴"은 페닐기, 혹은 고리들 중 한쪽 혹은 양쪽 모두가 페닐기인 이환식 융합 고리계를 의미한다. 이환식 융합 고리계는 4 내지 6원 방향족 혹은 비방향족 탄소환 고리에 융합된 페닐기로 구성된다. 본 개시내용의 아릴기는 상기 기 내의 임의의 치환가능한 탄소 원자를 통해서 모 분자 부분에 부착될 수 있다. 아릴기의 대표적인 예로는, 인다닐, 인데닐, 나프틸, 페닐 및 테트라하이드로나프틸을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아릴알킬"은 1, 2 혹은 3개의 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자와 0개의 이종원자를 지니는 포화 단환식 혹은 이환식 탄화수소 고리계를 의미한다. 사이클로알킬기의 대표적인 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸 및 사이클로펜틸을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알킬알킬"은 1, 2 혹은 3개의 사이클로알킬기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "할로" 및 "할로겐"은 F, Cl, Br 및 I를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "할로알킬"은 1, 2, 3 혹은 4개의 할로겐 원자로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 혹은 3개의 이종원자를 함유하는 5-, 6 혹은 7원 고리를 의미한다. 5-원 고리는 0 내지 2개의 이중 결합을 지니고, 6- 및 7-원 고리는 0 내지 3개의 이중 결합을 지닌다. "헤테로사이클릴"이란 용어는 또한 헤테로사이클릴 고리가 4- 내지 6-원 방향족 혹은 비방향족 탄소환 고리 혹은 다른 단환식 헤테로사이클릴기에 융합된 이환식 기를 포함한다. 본 개시내용의 헤테로사이클릴기는 해당 기 내의 탄소 원자 혹은 질소 원자를 통해서 모 분자 부분에 부착될 수 있다. 헤테로사이클릴기의 예로는 벤조티에닐, 퓨릴, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 아이소티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 몰폴리닐, 옥사졸릴, 피페라지닐, 피페리디닐, 피라졸릴, 피리디닐, 피롤리디닐, 피롤로피리디닐, 피롤릴, 티아졸릴, 티에닐 및 티오몰폴리닐을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "약제학적으로 혹은 치료학적으로 허용가능한 담체"란 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 간섭하지 않고 호스트 혹은 환자에 대해서 최소의 독성인 담체 매질을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "입체이성질체"는 다른 것과 동일한 분자량, 화학 조성 및 구성을 지니지만 원자가 상이하게 그룹화된 화학적 화합물을 의미한다. 즉, 소정의 동일한 화학적 부분은 공간 내에서 상이한 배향에 있고, 따라서, 순수한 경우, 편광 광의 평면을 회전하는 능력을 지닌다. 그러나, 몇몇 순수한 입체이성질체는 본 발명의 기구로 검출불가능한 정도로 미미한 광학 회전을 지닐 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 지닐 수 있고, 따라서 각종 입체이성질체를 포함한다. 모든 입체이성질체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, AKT의 활성을 "억제하는"이란, AKT 활성의 예방, 개선, 제거 또는 임의의 다른 저감을 지칭한다. 예를 들어, AKT의 활성을 억제하는 것은 AKT의 기본적인 수준을 감소시키거나 AKT 활성화를 저해하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 개시된 조성물에 적용되는 바와 같은 "치료학적으로 혹은 약제학적으로 허용가능한 양"이란 목적으로 하는 생물학적 결과를 유도하는데 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 그 결과는 증상, 증후군 혹은 질병의 원인의 예방, 경감 혹은 개선, 또는 생물학적 시스템의 기타 임의의 목적으로 하는 변경일 수 있다. 예를 들어, 그 결과는 암 세포 성장의 감소 및/또는 역전을 내포할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "저해제"란 용어는 "길항제"를 지칭하는데 호환적으로 이용된다. 이들 용어는 모두 소정의 효소 활성을 저감시키거나 또는 상기 효소의 기질의 활성 혹은 기능과 경쟁하는 능력을 지니는 조성물을 규정한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "암" 및 "암성"(cancerous)이란 포유동물 내 세포의 임의의 악성 증식을 의미한다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은, 당업자에게 공지된 임의의 악성종양의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 그 악성종양의 예로는 호르몬-불감성-전립선암, 전립선암, 유방암, 난소암, 결장암, 흑색종 혹은 기타 피부암, 폐암, 간암, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 위육종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 다발골수종, 골육종, 췌장암, 위암 혹은 국소 부위에서의 종양(수술불가능한 종양 혹은 종양의 국소 치료가 유익한 종양 및 고형 종양을 포함함)을 들 수 있다.
생체내 용도를 위하여, 주어진 세포독성제의 적절한 용량은 해당 제제 및 그의 제형에 의존하며, 주어진 환자에 대해서 투약량 및 제형을 최적화시키는 것은 당업자의 범위 내이다. 이와 같이 해서, 예를 들어, 이러한 제제는 경구, 피하, 비경구, 점막밑, 정맥내 또는 제형의 표준 방법을 이용한 기타 적절한 경로를 통해서 투여하기 위하여 제형화될 수 있다. 화합물의 유효량 및 투여 방법은, 그 투여가 치료적이든 예방적이든지 간에, 환자의 성별, 연령, 체중 및 질병 단계, 및 당업자에게 명백한 기타 인자에 의거해서 변화될 것이다.
당업자라면, 예컨대 대상체의 체중, 병의 중증도, 투여 방법 및 처방 환자의 판단에 따라서, 특정 환경 및 환자의 요구에 적합하도록 적절한 투약량 및 투여 스케쥴을 유도할 것이다. 전형적으로는, 환자에 대해서 투여되는 조성물의 투약 범위는 환자의 체중 약 0.5 내지 1000 ㎎/㎏일 수 있다. 투약량은 환자의 필요에 따라서 1일 이상의 과정에서 부여된 단일 혹은 2회 이상의 시리즈일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은, 유사체에 대한 확립된 인간 투약량과 동일한 투약량, 또는 상기 확립된 인간 투약량의 약 0.1% 내지 500%, 더욱 바람직하게는 약 25% 내지 250%인 투약량을 이용할 것이다. 적절한 인간 투약량은 또한, 예컨대, 동물에서의 독성 연구 및 효능 연구에 의해 정량화된 바와 같은 시험관내 혹은 생체내 연구로부터 유래된 ED50 혹은 ID50 또는 기타 적절한 값으로부터 추론될 수 있다.
정확한 투약량은 약물 대 약물 기본에 따라서 결정될 것이지만, 대부분의 경우에, 투약량에 관한 몇몇 일반화는 이루어져 있을 수 있다. 성인 인간 환자에 대한 1일 투약 요법은, 예를 들어, 0.1㎎ 내지 500㎎, 바람직하게는 약 1㎎ 내지 약 250㎎, 예컨대, 약 150 내지 약 200㎎의 경구 용량일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 경구 투약량은 약 5㎎, 10㎎, 25㎎, 50㎎, 100㎎, 125㎎, 150㎎, 175㎎, 200㎎, 225㎎, 250㎎, 300㎎, 350㎎, 400㎎, 450㎎, 500㎎, 600㎎, 700㎎, 800㎎, 900㎎ 또는 1000㎎이다. 화합물은 연속적인 요법 기간 동안, 예를 들어, 1주 이상 동안 혹은 수개월 혹은 수년 동안 투여될 수 있다.
투약량 및 간격은 조절 효과 혹은 최소 유효 농도(minimal effective concentration: MEC)를 유지하기에 충분한 활성 부분의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조절될 수 있다. MEC는 각 화합물에 대해서 변화될 것이지만, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하기 위한 투약량은 개별적인 특성 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 그러나, HPLC 분석평가 혹은 바이오분석평가가 혈장 농도를 결정하는데 이용될 수 있다.
조성물은, 필요에 따라서, 활성 성분을 함유하는 1 이상의 단위 용량 형태를 수용할 수 있는 팩 혹은 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 팩 혹은 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명서를 수반할 수 있다. 팩 혹은 디스펜서는 약제의 제조, 이용 혹은 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 관련된 안내문도 수반할 수 있고, 상기 안내문은 인간 혹은 가축 투여용의 약물의 형태의 기관에 의한 승인의 반영이다. 이러한 안내문은, 예를 들어, 처방 약물 혹은 승인 제품 삽입물에 대해서 미국 식약청에 의해 승인된 표지일 수 있다. 경쟁가능한 약제학적 담체 내에 배합되는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 또한 준비되어 적절한 용기에 놓여 표시된 병태의 치료를 위하여 표지될 수 있다.
실시예
실시예 1. RXRα에 대한 설린닥 결합
경쟁적 리간드-결합 분석평가(도 1A) 및 HEK293T 세포 내 RXRα, Nur77 혹은 RARβ에 결합하는 설린닥의 HPLC 분석(도 1B)이 수행되었다. RXRα LBD 단백질은 설린닥 또는 비표지된 9-시스-RA의 존재 유무에 있어서의 [3H]9-시스-RA를 이용해서 인큐베이팅되었다. 결합된 [3H]9-시스-RA는 액체 섬광 계수에 의해 정량화되었다(도 1A). C-말단 TAP 표지(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재)에 융합된 RXRα를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포는 3시간 동안 100mM 설린닥 설파이드 없이 혹은 이를 이용해서 치료되었다. 치료 후, 세포는 정제되었고, 설린닥 설파이드의 존재에 대해서 HPCL에 의해 분석되었다. 설린닥 설파이드의 표준 용액은 교정 곡선을 얻기 위하여 이용되었다. 특징적인 피크 스펙트럼 및 체류 시간은 확인을 위하여 이용되었고, 정량화를 위하여 이용된 max에서의 피크 영역이 계산되었다(도 1B 및 도 10). 설린닥 설파이드는 세포자멸사를 유발하는 농도 범위인 80μM의 IC50을 지니는 RXRα에 결합되었다(도 1A). HPLC 분석은 RXRα에 대한 설린닥의 직접 결합을 보였지만, 세포 내의 RAR 및 Nur77 등과 같은 다른 핵 수용체는 그렇지 않았다(도 1B 및 도 10).
정제된 RARγ 단백질은 설린닥의 존재 유무에 있어서 [3H]모든-트랜스-RA, 혹은 비표지된 모든-트랜스 RA를 이용해서 인큐베이팅되었다. 결합된 [3H]모든-트랜스-RA는 액체 섬광 계수에 의해 정량화되었다. 설린닥은 RARγ에 결합되지 않았고, 이는 도 1B에 도시된 세포기반 실험과 일치하였다(도 9A).
수용체 발현 벡터 및 정보제공 유전자(RXRα/TRα 헤테로다이머용의 TREpal2-tk-CAT(도 9B), 및 RXRα/PPARγ헤테로다이머용의 DR1 tk-CAT(도 9C))는 CV-1 세포 내에 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 설린닥의 존재 유무에 있어서 리간드(시글리타존, 10-6M; T3, 10-7M) 없이 혹은 이를 이용해서 치료되었다. CAT 활성이 결정되었다. 설린닥은 RXRα/PPARγ 헤테로다이머의 트랜스활성화를 저해하였지만, RXR/TR 헤테로다이머는 그렇지 않았다(도 9B 및 도 9C).
설린닥(100μM)에 의한 키모트립신(ug/㎖)에 대한 RXRα 리간드-결합 도메인(LBD)의 변경된 감도(도 1C) 및 10μM RXRα LBD 혹은 Nur77 단백질의 존재 유무에 있어서의 설린닥(100μM)의 19F NMR 스펙트럼과 비교한 시차 주사 열량(DSC) 주사(도 1D)가 또한 결정되었다. RXRα에 대한 결합은 설린닥에 의한 키모트립신 분해에 대한 RXRα의 변경된 감도(도 1C) 및 시차 주사 열량(DSC)(도 1D)에 의해 확인되었다. 또한, 설린닥에 의한 SR11237(10-6 M)-활성화된 RXRα 트랜스활성화의 저해가 측정되었다(도 1F, 실시예 2 참고).
Nur77 및/또는 RXRα는 CV-1 세포 내에 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 설린닥의 존재 유무에 있어서 RXR-선택적 작용제인 SR11237(10-6 M) 없이 혹은 이를 이용해서 치료되었다. (TREpal)2-tk-CAT(Zhang et al., Nature 358, 587-591 (1992a)))(도 1E) 및 βRARE-tk-CAT(Zhang et al., Nature 355, 441-446 (1992b))(도 1F) CAT 활성이 결정되었다. 설린닥 결합은 정보제공 분석평가에 있어서 RXRα 호모다이머 및 헤테로다이머 트랜스활성화를 저해하였고(도 1E 및 도 1F, 및 도 10), 이는 설린닥이 RXRα 전사 길항제인 것을 입증한다.
실시예 2. 설린닥의 사멸 효능
설린닥-유래 세포자멸사에서의 RXRα의 역할을 결정하기 위하여, F9 세포 및 RXRα를 결여하는 F9 세포(F9-RXRα-/-)에서의 설린닥의 사멸 효능이 조사되었다.
핵 형태학적 변화 분석을 위하여, 세포는 트립신화되고, PBS로 세척되며, 3.7% 파라포름알데하이드로 고정되고, DAPI(4,6-다이아미디노-2-페닐인돌)(1㎎/㎖)로 염색되어 형광 현미경에 의해 핵을 가시화하였다. 세포자멸성 세포의 백분율은 핵 분절 및/또는 염색질 응축을 지니는 적어도 300개의 GFP-양성 세포를 계수함으로써 결정되었다. DNA 분절의 결정을 위하여, 세포 사멸 검출(Cell Death Detection) ELISAPLUS(Roche Applied Science, 독일 바바리아주의 펜츠베르크시에 소재)가 이용되었다.
RXRα siRNA siGENOME SMARpool(M-003443-02), RARγ siRNA siGENOME SMARpool(M-003439-01), 및 siRNA 비특이적 대조군 IX(D-001206-09-05)가 DHARMACON(콜로라도주의 라파예트시에 소재)으로부터 구입되었다. 웰당 20mM siRNA의 2.5㎕ 분량을 제조사의 권장 사항에 따라서 올리고펙타민 시약(oligofectamine reagent)(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용해서 12-웰 플레이트 내에서 성장된 세포 내로 형질감염되었다. 형질감염 후 2일째에, 세포는 웨스턴 블로팅을 위해 수확되었다.
F9 세포, 혹은 RXRα(F9 RXRα-/-)를 결여하고 있는 F9 세포는 설린닥(75μM)으로 24시간 동안 치료되었고, DAPI 염색(도 2A), 폴리(ADP-리보스)폴리메라제(PARP) 분할(도 2B) 및 DNA 분절(도 2C)에 의해 분석되었다. H460 폐암 세포는 대조군 혹은 RXRα siRNA로 형질감염되었고, 설린닥(75μM)으로 24시간 동안 치료되고 나서 세포자멸사에 대해서 DAPI 염색에 의해 분석되었다(도 2D 및 도 2E).
CV-1 세포는 GFP-RXRα(도 2F) 또는 GFP-RXRα/F313S/R316E(도 2G)로 형질감염되었고, 설린닥(75μM)으로 24시간 치료되었으며, DAPI 염색에 의해 분석되었다. GFP-RXRα-형질감염된 세포는 광범위하게 핵 분절되고 응축되었다(도 2F). 세포자멸사는 수용체-형질감염된 세포(도 2G 및 도 11)에서 점수 매겨졌다. RXRα 리간드-결합 포켓의 파열은 그의 호모다이머 트랜스활성화를 손상시켰다(도 11A 및 도 11B). 또한, RXRα 리간드-결합 포켓의 파열은 그의 헤테로다이머 트랜스활성화를 손상시켰다(도 11C 및 도 11D). RXRα(20ng), RXRα/F313S/R316E(20ng), β-갈락토시다제(100ng) 및/또는 Nur77(100ng) 발현 벡터는 CV-1 세포 내로 (TREpal)2-tk-CAT(100ng)(도 11A 및 도 11B) 또는 βRARE-tk-CAT(100ng)(도 11C 및 도 11D)와 함께 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 설린닥(10, 37.5 75, 150 300μM)의 증가하는 농도의 존재 유무에 있어서 SR11237(10-6M) 없이 혹은 이를 이용해서 치료되었다. CAT 활성이 결정되었다.
설린닥은 F9 세포 내에서 광범위한 세포자멸사를 유발한 반면, F9-RXRα-/- 세포에서는 적은 효과를 지녔다(도 2A 내지 도 2C). 설린닥의 세포자멸 효과는 RXRα siRNA로 형질감염된 세포에서 또한 저감된 반면(도 2E), RXRα의 형질감염은 그의 사멸 효과를 증대시켰다(도 2F 및 도 2G). RXRα/F313S/R316E는 리간드 유래 호모다이머 혹은 헤테로다이머 트랜스활성화에 반응하는데 실패하였고(도 11), 설린닥에 대한 저감된 세포자멸 반응을 보였다(도 2G). 이와 같이 해서, RXRα는 설린닥-유래 세포자멸사에 관여하는 것을 판명되었다.
HCT116 세포 또는 Bax(Bax-/-)를 결여하고 있는 HCT116 세포는 설린닥(75μM) 없이 혹은 이를 이용해서 24시간 동안 치료되었다. 세포자멸사는 PARP 분할(도 2H) 및 DAPI 염색(도 2I)에 의해 결정되었다. RXRα siRNA 혹은 대조군 siRNA 없이 혹은 이를 이용해서 48시간 형질감염된 HCT116 세포는 설린닥으로 6시간 동안 치료되었고, Bax/Δ21, Bax/6A7 또는 항-Hsp60 항체를 이용해서 면역염색/공초점 현미경수법에 의해 표적화된 Bax 올리고머화(도 2J) 및 Bax 입체형태 변화 및 미토콘드리아 표적화에 대해서 분석되었다(도 2K). 세포의 60%는 BAX 입체형태 변화를 보였다.
설린닥은 HCT116 결장암 세포에서 PARP의 분할(도 2H) 및 세포자멸사(도 2I)를 유발하였지만, Bax(Bax-/-)를 결여하고 있는 HCT116 세포에서는 그렇지 않았다. HCT116 세포가 COX-2를 결손하고 있다는 사실은, 설린닥-유래 세포자멸사가 COX-2-독립적일 수 있다는 것을 입증하였다. 면역 블로팅 분석평가는 Bax가 미토콘드리아 상에서의 광범위 올리고머화를 받았던 것을 보였으며, 이는 RXRα siRNA에 의해 제거되었다(도 2J). 또한, 항-Bax 항체(BaxΔ21)를 이용한 면역염색 및 Bax 입체구조 민감성 항체 Bax/6A7(Nechushtan et al., Biochem Biophys Res Commun 254, 388-394 (1999))은 설린닥 유래 Bax 입체형태 변화 및 미토콘드리아 표적화가 RXRα siRNA에 의해 손상된 것을 입증하였다(도 2K). 동시에, 이들 결과는 RXRα가 설린닥의 세포자멸 효과를 매개하는 세포내 표적으로서 작용할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3. RXRα 돌연변이
RXRα에 결합하는 설린닥의 역할에 대처하기 위하여, RXRα 돌연변이(RXRα/F313S/R316E)는, RXRα 리간드-결합-포켓(LBP)(Bourguet, W. et al., Mol Cell 5 (2), 289-298 (2000))의 기능적 무결성(functional integrity)을 유지하기 위하여 필수적인 아미노산이 변경된 상태로 구축되었다.
플래그-p85α는, 순방향 프라이머 5'-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3'(서열번호 1)와 역방향 프라이머 5'-acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3'(서열번호 2)을 이용해서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 구축되었다. PCR 산물은 Eco RI 및 Sal I로 분해되고 pCMV-플래그 벡터로 클로닝되었다. RXRα 돌연변이는 프라이머로서 이하의 올리고뉴클레오타이드를 지니는 QUIKCHANGE(등록상표) 돌연변이유발 키트(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재)를 이용해서 구축되었다: RXRα/F313S/R316E, 5'-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCATAGCTGTGAAAGATGGG(순방향 - 서열번호 3) 및 5'- CCCATCTTTCACAGCTATGGACTCGTGGGAGGAGGAGGCGATCAGCAGCTCGTTCC(역방향 - 서열번호 4); RXRα/Δ80, 5'-CCGGAATTCGGaccacacccaccctgggc-3'(순방향 - 서열번호 5); 및 5'-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3'(역방향 - 서열번호 6); RXRα/Δ100, 5'-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3'(순방향 - 서열번호 5); 및 5'- CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3'(역방향 - 서열번호 6). PCR 산물은 EcoR I 및 Xho I로 분해되고, pCMV-Myc 벡터로 결찰되었다.
RXRα(20ng), RXRα/F313S/R316E(20ng), β-갈락토시다제(100ng) 및/또는 Nur77(100ng) 발현 벡터는 (TREpal) 2-tk-CAT(100ng)(도 11A) 또는 βRARE-tk-CAT(100ng)(도 11B)와 함께 CV-1 세포 내로 일시적으로 형질감염되었다. 세포는 SR11237(10-6M) 없이 혹은 이를 이용해서 치료되었다. CAT 활성이 결정되었다.
돌연변이는 리간드-유래 트랜스활성화에 대해서 반응하는데 실패하였고(도 11), 설린닥에 대한 감소된 반응을 보였다(도 2G)(실시예 2 참조).
실시예 4. 설린닥에 의한 AKT 활성화의 저해
설린닥에 의한 AKT(암 세포 생존을 담당하는 주된 단백질) 활성화의 저해가 연구되었다.
HepG2, SW480, RAW264.7, HCT116, LNCaP, PC3, ZR-75-1 및 HaCat 세포는 하룻밤 절식되었고, 설린닥(100μM)으로 1시간 치료되었으며, 면역 블로팅에 의해 AKT 활성화에 대해서 분석되었다(도 3A). HepG2 세포는 또한 RXRα siRNA로 48시간 형질감염되었고, 설린닥(100μM)으로 1시간 동안 치료되었으며, 면역 블로팅에 의해 AKT 활성화 및 RXRα 발현에 대해서 분석되었다(도 3B).
MEF 및 MCF-7 세포는 하룻밤 절식되었고, 설린닥으로 1시간 사전 치료되었으며, EGF(100 ng/㎖)로 15분 동안 자극되었다. AKT 활성화는 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 12A). MEF 및 Caco-2 세포는 하룻밤 절식되었고, 모든-트랜스-레티노산(ATRA)(10-7 M)에 30분 동안 노출시키기 전에 설린닥으로 30분간 사전 치료되었으며, AKT 활성화에 대해서 분석되었다(도 12B). 30분 동안 9-시스-RA(10-7 M)에 대해서 노출하기 전에 48시간 동안 RXRα siRNA로 형질감염된 ZR-75-1 유방암 세포 내 AKT 활성화는 또한 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 13C). RXRα 또는 대조군 siRNA(도 3C) 그리고 ZR-75-1 및 PC3 세포(도 3D)로 형질감염된 A549 폐암 세포는 30분 동안 TNFα(10 ng/㎖)에 노출시키기 전에 1시간 동안 설린닥(100μM)으로 사전 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 AKT 활성화 및 RXRα 발현에 대해서 분석되었다.
설린닥에 의한 기본적 AKT 활성화의 상당한 저해는 COX-2-음성 SW480 및 HCT116 결장암 세포를 비롯한 각종 암 세포주에서 관찰되었고(도 3A), 이는 COX-2-독립적 메카니즘을 시사한다. 설린닥은 EGF에 의한 AKT 활성화를 저해하는데 실패하였지만, 레티노산에 의한 AKT 활성화를 강력하게 저해하였다. RXRα siRNA의 형질감염은, 설린닥의 효과와 유사하게, 연속적인 AKT 활성화를 상당히 저감시켰다(도 3B). 30분 동안 모든-트랜스-RA(ATRA)에 의한 세포의 치료는 AKT 활성화를 강력하게 유발하였고, 이는 용량 의존적 방식으로 설린닥에 의해(도 12B) 그리고 RXRα siRNA에 의해(도 12C) 저해되었다. 설린닥은 상피 성장 인자에 의해 유발된 KT 활성화를 저해하는데 실패하였고(도 12A), 이것은 RXRα-의존적 방식에 있어서 레티노산에 의해 유발된 AKT 활성화를 강력하게 저해하였다(도 12B 및 도 12C). 이와 같이 해서, 설린닥은 RA-유발 신속 RXRα-의존적 AKT 활성화를 간섭할 수 있다.
설린닥은 TNFα 유래 AKT 활성화의 억제에 대해 조사되었다. TNFα는 A549 폐암 세포에서 AKT를 강력하게 활성화시켰고, 이는 설린닥 및 RXRα siRNA에 의해 강력하게 저해되었으며(도 3C), 이것은 AKT의 TNFα 활성화가 RXRα-의존적이었던 것을 시사한다. TNFα는 높은 기본적인 AKT 활성화를 지니는 세포(ZR-75-1 및 PC3 세포 등)를 활성화시키는데 실패하였고 설린닥은 이들 세포에서 AKT 활성화에 대한 적은 저해 효과를 보였지만, TNFα와의 설린닥 조합은 상승적으로 또한 거의 완전하게 AKT 활성화를 저해하였다(도 3D). 이와 같이 해서, TNFα는 설린닥에 의한 AKT 저해에 대해서 암 세포를 감작시킬 수 있으며, 이는, TNFα가, 가능하게는 RXRα-독립적 방식에서 RXRα-의존적 방식으로 AKT 활성화를 전환시킴으로써, 설린닥에 대한 그들의 반응성에 대해서 암 세포를 일차처리할 수 있는 것을 시사한다.
9-시스-RA(10-7M)로 30분간 치료된 MCF-7 및 베이비 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK) 세포는 D20 혹은 ΔN197 항-RXRα 항체를 이용한 공면역침강에 의한 RXRα-p85α 상호작용에 대해서 분석되었다(도 12D). 9-시스-RA 및/또는 설린닥(100μM)으로 30분간 치료된 H292 폐암 세포는 ΔN197 항체를 이용한 공면역침강에 의한 RXRα-p85α 상호작용에 대해서 분석되었다(도 12E). 설린닥은 EGF에 의한 AKT 활성화를 저해하는데 실패하였지만, 레티노산에 의한 AKT 활성화는 강력하게 저해하였다. 또한, 9-시스-레티노산은 D20 항-RXRα 항체가 아니라 ΔN197 항-RXRα가 이용된 경우 p85α와의 tRXRα 상호작용을 촉진시켰다.
실시예 5. p85α의 tRXRα 및 RXRα와의 상호작용
p85α와의 RXRα 상호작용이 조사되었다. 항-RXRα 항체(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주 산타크루즈시에 소재)는 공면역침강(Co-IP) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting: WB) 분석평가에서 이용되었다. BHK 세포는 ATRA(10-7 M)로 30분 동안 치료되었다. 용해물이 준비되었고, D20 항-RXRα 혹은 ΔN197 항-RXRα 항체를 이용해서 RXRα-p85α상호작용에 대해서 분석되었다(도 12D).
공면역침강 분석평가에 의한 RXRα(D20)의 NH2 말단에서의 서열에 대항하는 항-RXRα 항체를 이용한 초기 시도는, 해당 항체가 RXRα 단백질을 효과적으로 면역침장시켰음에도 불구하고, 명확한 상호작용을 검출하는데 실패하였다. 그러나, RXRα(ΔN197)의 COOH-말단 리간드-결합 도메인(LBD)에 대항하는 다른 항-RXRα 항체가 이용된 경우, p85α는 TNFα(도 3E) 또는 RA-의존적 방식(도 12D 및 도 12E)에서 용이하게 공면역침강되었다. D20 항-RXRα 항체는 N-말단 A/B 도메인에서 아미노산 2 내지 21개를 인식한 반면, ΔN197 항-RXRα 항체는 C-말단 E/F 도메인을 인식하였다(도 3E). ΔN197 항-RXRα 항체에 의한 p85α의 공면역침강은 절두된 RXRα(tRXRα)의 면역침강에 의해 수반되었고, 이것은 D20 RXRα 항체에 의해 검출되지 않았으며, 이는 N-말단 서열의 그의 결실을 나타낸다(도 12D). ΔN197 항-RXRα 항체를 이용해서, tRXRα 및/또는 RXRα와의 p85α의 상호작용은 TNFα에 의해 증대되었고, 설린닥에 의해 저해되었다(도 3E). TNFα의 존재 하에 p85α의 tRXRα와의 상호작용은 또한 설린닥에 의해 저해되었다(도 12E). 이들 결과는 tRXRα가 p85α에 결합하여 AKT 활성화를 유발하는 것을 시사한다.
실시예 6. RXRα의 아미노산 80 내지 100개가 p85α에 결합하기 위하여 임계적이다
세포내 단백질 분해성 분할이 조사되었다. 세포는 9-시스-RA(10-7 M) 없이 혹은 이를 이용해서 30분 동안 치료되었고, 용해물은 ΔN197 RXRα 항체를 이용해서 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 3F). 면역 블로팅은, RXRα가 상이한 세포 맥락 및 생물학적 처리에 있어서 그의 아미노 말단에서 종종 분할된 것을 입증하였다(도 3F).
A549 폐암 세포는 또한 9-시스-RA 없이 혹은 이를 이용해서 30분 동안 치료되었다. 핵(Nu) 및 세포질(Cyt) 분획은 D20 혹은 ΔN197 항-RXRα 항체를 이용해서 면역 블로팅에 의해 분석되었다. 제제의 순도를 확실하게 하기 위하여, 분획들은 또한 Hsp60(세포질 특이적) 및 PARP(핵 특이적) 단백질의 존재에 대해서 면역블로팅되었다(도 13). MEF 내의 내인성 RXRα의 세포하 위치는 항-RXRα(ΔN197)를 이용한 면역염색 후 공초점 현미경수법에 의해 가시화되었다. 세포는 또한 핵을 가시화하기 위하여 DAPI로 염색되었다(도 4B).
RXRα는 세포막에서 발견되었고(도 4A, 상부 패널), 몇몇 세포에 있어서 세포막의 천공 구조를 나타내었다(도 4A, 하부 패널). MEF 내에서의 44-kDa tRXRα의 생산은 또한 세포 밀도에 의해 조절되었다(도 4A). 저밀도에서 배양된 세포에서 관찰된 44-kDa tRXRα의 수준은 세포가 고밀도에서 성장된 경우 감소되었으며, 이것은 보다 작은 RXRα 단편의 출현과 함께 수반된다. 흥미롭게도, 44-kDa tRXRα 단백질의 수준은 AKT 활성화와 상관이 있었고(도 4A), 이것은 RXRα의 세포 밀도-의존적 단백질 분해성 분할이 AKT 활성화와 관련된 중요한 메카니즘일 수도 있음을 시사한다. tRXRα의 세포질 위치와 일치하여(도 13), RXRα는 MEF 세포가 ΔN197 항-RXRα 항체에 의해 면역염색되었을 때 세포질 내에서 주로 발견되었다(도 4B). 이와 같이 해서, RXRα의 정확히 N-말단 단부 서열의 결손은 그의 세포하 위치를 변경시킬 수 있고, 이는 p85α와 상호작용하는 그의 능력을 부여한다. p85α가 본 명세서에 기재된 바와 같은 tRXRα로 공면역침강되었다는 관찰은, tRXRα가 p85α에 결합할 수 있어, tRXRα-의존적 AKT 활성화를 초래할 수도 있었던 것을 시사한다.
MEF 세포는 상이한 세포 밀도에서 파종되었고, 용해물이 준비되었으며, 면역 블로팅에 의해 AKT 활성화에 대해서 분석되었다. 용해물은 또한 ΔN197 항-RXRα 항체를 이용해서 면역 블로팅에 의해 조사되었다(도 4A). 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast: MEF) 내의 tRXRα의 수준은 세포 밀도-의존적 방식에서의 AKT 활성화와 상관이 있었다(도 4A). tRXRα의 세포질 위치와 일치하여, MEF는 RXRα의 세포막 위치를 종종 나타내었다(도 4B).
p85α 상호작용 및 AKT 활성화에서의 tRXRα의 역할에 직접 대처하기 위하여, 그의 N-말단 80 아미노산을 결여하고 있는 RXRα 돌연변이(RXRα/Δ80)가 구축되었고, 이는 내인성 tRXRα와 유사한 분자량을 지니는 RXRα 돌연변이 단백질을 생산하였다. Myc-표지된 RXRα/Δ80이 세포 내로 플래그-p85α와 함께 공형질감염될 경우, 이들은 강력하게 상호작용하여, TNFα에 의해 더욱 증대되었다(도 5A). 이와 대조적으로, 전체-길이 RXRα 또는 100 N-말단 아미노산을 결여하고 있는 RXRα 돌연변이(RXRα/Δ100)는 동일한 조건 하에서 플래그-p85α와 상호작용하는데 실패하였다. 이와 같이 해서, RXRα의 아미노산 80 내지 100개가 p85α에 결합하는데 임계적이다. 이것의 뒷받침에 있어서, RXRα N-말단 A/B 도메인(RXRα/1-134)은 p85α와 상호작용하였지만, 그의 LBD(RXRα/224-462)는 그러하지 않았다(도 5B). tRXRα의 세포질 위치와 일치하여(도 13), RXRα/Δ80은 세포질에 우선적으로 존재하고, 분산되고 때로는 천공된 세포막 위치를 나타낸다(도 5D). RXRα/Δ100이 아니라 RXRα/Δ80의 형질감염은 각종 세포 유형에서 AKT를 강력하게 활성화시켰다(도 5C).
RXRα/Δ80 면역복합체는 시험관내에서 PI3K 활성에 대해서 조사되었다. Myc-표지된 RXRα/Δ80 및 p85α는 A549 세포 내로 공형질감염되었고, Myc-RXRα/Δ80-함유 복합체는 항-Myc 항체에 의하여 면역침강되었고 PI3K 활성에 대해서 분석평가되었다. 세포로부터 준비된 특이적 Myc-RXRα/Δ80 면역공침물은 TNFα 의존적 방식에서 강력한 PI3K 활성을 보였고(도 5E 및 도 15), 이는 p85α와 상호작용하는 그의 능력(도 5A) 및 AKT의 활성화(도 5C)와 적절하게 상관되어 있었다. 이와 같이 해서, TNFα 유래 tRXRα/p85α 상호작용은 PI3K/AKT 신호전달을 활성화시키는 것으로 판명되었다.
RXRα/Δ80은 SW480 및 HCT116 결장암 세포에서 안정적으로 발현되었고, 얻어진 안정적인 클론인 SW480/ RXRα/Δ80 및 HCT116/ RXRα/Δ80은 상승된 AKT 활성화 및 그의 하류 표적 c-Myc 및 사이클린 D1의 유도를 보였다(도 5F). 클론원성 생존 분석평가는 SW480/RXRα/Δ80 및 HCT116/ RXRα/Δ80의 성장을 평가하는데 이용되었다. 안정적인 클론은 대조군 세포보다 훨씬 많은 클론을 형성하였다(도 5G). 암 세포의 성장에 대한 RXRα/Δ80의 효과가 동물에서 조사되었다. 이를 위하여, 동일한 수의 RXRα/Δ80-발현 세포 혹은 대조군 세포가 동일한 누드 마우스의 상이한 옆구리 내로 주입되어, 그들의 성장이 결정되었다. SW480/RXRα/Δ80 및 HCT116/ RXRα/Δ80에 의해 형성된 종양은 동물 내에서 대조군 세포에 의해 형성된 것보다 훨씬 빨리 성장되었다(도 5H 내지 도 5I). 이와 동시에, 이들 결과는 N-말단 절두된 RXRα가 생체내에서 암 세포 성장의 강력한 프로모터인 것을 입증한다.
실시예 7. AKT 활성화 및 세포 형질전환에서의 내인성 tRXRα
전체-길이 RXRα가 p85α와 상호작용하는데 실패한 것의 관찰은 A/B 도메인 내의 p85α-결합 모티프가 RXRα에서 마스킹되는 것을 시사한다. 이와 같이 해서, RXRα의 N-말단 A/B 도메인은 전체-길이 RXRα와 상호작용할 수 있어(도 8A 참조), 분자내 상호작용을 드러낸 보인다.
발현 벡터 GFP-RXRα/1-134 및 Myc-RXRα가 HEK293T 세포 내로 형질감염되었다. 상호작용은 항-Myc 항체를 이용해서 Co-IP에 의해 분석되었다(도 8A 참조). 그의 N-말단 단부에서 GFP와 융합된 전체-길이 RXRα 혹은 RXRα/1-134 및 그의 C-말단 단부에서 Myc 에피토프로 표지된 전체-길이 RXRα가 HEK293T 세포 내로 공형질감염되었다. 36시간 후, 세포 용해물은 항-Myc 항체에 대해 IP 및 WB에 의해 분석되었다.
RXRα에 결합된 N-말단 A/B 도메인(도 8A 참조). RXRα N-말단 단편 유래 RXRα 분할의 발현(도 8B 참조). tRXRα의 수준이 증가된 전체-길이 RXRα와 함께 RXRα/1-134의 형질감염(도 8B 참조)은, 경쟁에 의한 분자내 상호작용의 그의 파열로 인해 마찬가지로, RXRα N-말단에서의 단백질 분해성 부위의 노출을 초래한다.
RXRα의 N-말단 영역인 RXRα/1-134의 형질감염은 tRXRα수준을 증대시킬 수 있었다(도 14). 내인성 tRXRα의 역할을 연구하기 위하여, RXRα/1-134는 HeLa 세포 내에서 안정적으로 발현되었고, RXRα/1-134를 안정적으로 발현하는 세포 내에서 tRXRα 단백질을 유의하게 증가시키며, 이것은 내인성 전체-길이 RXRα 단백질의 감소에 의해 수반되었다(도 4C). 부모 HeLa 세포와 비교해서, HeLa/RXRα/1-134 안정적 클론은 보다 높은 AKT 활성화를 지녔고(도 4C), 연질 한천에서 신속하게 성장하였는 바(도 4D), 이것은 AKT 활성화 및 세포 형질전환 활성에 있어서의 내인성 tRXRα에 대한 역할을 시사한다. 콜로니 형성 분석평가에 있어서, 설린닥은 안정적 클론에 의해 형성된 콜로니를 강하게 저해하였다(도 4E). tRXRα의 임상적 관련성은 유방암 환자로부터의 종양 조직 내의 tRXRα의 존재에 의해 설명되었지만, 대응하는 종양 주위 조직과 정상 조직에 있어서는 그러하지 않았다(도 4F). 마찬가지 결과가 간암 환자에서 얻어졌다. 인간 간암 검체 내 RXRα의 면역조직화학적 분석은 종양 조직 내 강력한 세포질 RXRα 염색을 드러내었지만, 대응하는 종양 주위 조직에서는 그러하지 않았다(도 4G). 이와 동시에, 이들 결과는, tRXRα가 AKT를 활성화시킴으로써 암 세포의 성장과 생존에 기여할 수 있고, tRXRα-매개 활성은 설린닥에 의해 부정적으로 조절될 수 있는 것을 입증한다.
실시예 8. 설린닥 유사체의 합성
RXRα가 설린닥 작용의 세포내 표적으로서 역할한다는 지견은 AKT 활성을 억제하기 위하여 RXRα-선택적 설린닥 유도체를 확인할 기회를 제공하였다. RXRα 및 COX-2에 대한 설린닥의 결합(도 7A 및 도 18B)은, RXRα 결합을 선호하지만 COX-결합을 선호하지 않는, 설린닥 유사체를 설계하도록 비교되었다. 설린닥 설파이드 및 인도메타신의 2차원 구조가 비교되었다(도 18A). COX-2의 활성 부위에서 결합된 설린닥 및 인도메타신의 오버레이(overlay)가 발생되었다(도 18B). 설린닥은 인도메타신과 유사한 COX-2에 결합하도록 직관적으로 모델링되었다.
유사체가 설계되고 합성되었다(도 19). 치환된 인다논 유도체(4)는 출발 물질로서 치환된 벤즈알데하이드(1)를 이용해서 제조되었다. 퍼킨-반응(Perkin-reaction)에 있어서, 유도체(1)는 적절한 무수물로 처리되어 유도체(2)를 부여하고, 이것은 이어서 촉매식 수소화에 의해 환원되어 유도체(3)를 부여한다. 폴리인산(PPA)-촉매화 분자내 프리델-크라프트 아실화는 5-원 고리를 폐환하여 1-인다논 유도체(4)를 부여한다. 에틸 아세테이트 및 리튬 헥사메틸다이실릴아마이드(LHMDS)로부터 생성된 에놀레이트에 의한 유도체(4)의 처리에 이어서 산성 조건 하에서의 탈수소화는 목적으로 하는 아세테이트(5)를 부여한다. 생성된 인덴-3-아세테이트(5)는 치환된 벤즈알데하이드와 반응하여(클라이젠-슈미트(Claisen-Schmidt)-반응), 산성화 후, 설린닥 유사체(Z-6)를 부여한다. 설린닥 유사체(9)의 합성을 위한 1단계는 1-인다논유도체(4)와 메틸 아크릴레이트와의 이요오드화사마륨(SmI2)-매개 환원성 커플링이며, 이에 의해 스피로락톤(7)을 부여하였다. 촉매량의 파라-톨루엔설폰산(p-TsOH)에 의한 (7)의 메탄올 용액의 처리는 탈수소화 생성물(8)을 수득하였고, 이는 클레이젠-슈미트 반응 및 산성화에 의해 설린닥 유사체(9)를 부여하였다. 주목할 만한 것은, 화합물(5/8)의 클라이젠-슈미트- 반응에 있어서, R2 = CH3일 경우, 화합물(6/9) 중 시스 (Z)-이성질체가 주도적으로 생성되는 한편, R2 = H인 경우에는 화합물(6/9) 중 트랜스 (E)-이성질체가 주도적으로 형성된다는 점이다.
실시예 9. 설린닥 유사체의 평가
9-시스-RA를 기준으로 해서 RXRα의 LBP에 대한 설린닥의 도킹은 설린닥의 구조적 변성을 위한 전략을 확인하여 그의 COX 저해를 RXRα-결합 활성과 분리하여 고려하도록 평가되었다. RXRα에 대한 설린닥의 도킹은 도 7A에 도시되어 있다. 도킹된 설린닥의 배향과 위치는 9-시스-RA, DHA 및 BMS649의 결정 구조와 비교되었다(도 7B). 설린닥은, 그의 카복실레이트기가 조사된 모든 RXRα 리간드에서 발견된 카복실레이트기와 정렬되고 있던 모드에서 결합되어(도 7B), RXRα LBP에서 Arg316과 상호작용한다. 설린닥의 벤질 메틸 설파이드 부분은 RXRα LBP의 소수성 영역에 결합되어, 9-시스-RA의 a-이오논 고리와 중첩된다. 이 결합 모드에서, 4번 위치에 있는 -SCH3기(도 7C)와 RXRα 단백질과의 반데르발스 상호작용은 최적이 아니었고, RXRα에 대한 결합을 향상시키기 위하여 변성에 대한 여지가 있었다. RXRα-선택적 유사체를 설계하기 위하여 4번 위치를 이용한다는 사상은, 설린닥 전구체(prodrug), 설린닥 설폭사이드 및 대사산물인 설린닥 설폰이 COX-저해 활성을 보이지 않는 한편, 대사산물인 설린닥 설파이드(본 명세서에서 이용됨)가 강력한 COX 저해제라고 하는 사실에 의해 완전히 뒷받침되었다(Haanen, 2001). 도 7A에 도시된 바와 같이, 설린닥의 카복실레이트기는 RXRα 리간드인 DHA, BMS649 및 9-시스-RA에서 등가의 것과 비교되는 Arg316로부터 멀리 위치되어 있었다. D 위치에 있는 -CH2COOH를 -CH2CH2COOH 등과 같은 보다 큰 기로 교체하는 것은 Arg316에 보다 가깝게 카복실레이트기를 위치시켜 9-시스-RA에서 관찰된 바와 같은 RXRα와의 양호한 전하-전하 상호작용을 달성하는 것을 돕는다.
후보 화합물은 또한 COX-2의 결정 구조에의 도킹에 의해(도 18) 비-COX 바인더를 확인하기 위하여 조사되었다. 이들 고려사항에 의거해서, 5개의 유사체가 설계되고 합성되었다(도 7C 및 도 19). 그들의 평가는, 모든 유사체가 RXRα-결합 활성을 보유하고, 4번 위치에 있는 그의 아이소-프로필(i-Pr)기로 인해 마찬가지로, K-80003이 가장 강력하여(설린닥보다 약 34배 높음), RXRα의 Helix7 상의 소수성 잔기와의 상호작용을 개선시킨다는 것을 나타내었다. 유의하게는, K-80003 및 K-80005는 COX 활성의 검출가능한 저해를 지니지 않았고(도 7C), 연속적으로 또한 TNFα(도 7D) 또는 IL-1β(도시생략)-유래 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생산을 저해하는데 실패하였다. RXRα에 대한 K-80003의 결합은 또한 19F NMR 결합 분석평가에 의해 확인되었다(도 7E). 이와 같이 해서, 설린닥의 RXRα-결합은 그의 COX-결합으로부터 해리될 수 있다.
A549 세포는 10% 소태아혈청을 지니는 DMEM에서 24-웰 플레이트에 파종되었다. 하룻밤 배양 후, 세포는 24시간 동안 혈청 없는 DMEM 배치에서 10ng/㎖ IL-1β로 자극되었다. 설린닥 혹은 유사체의 지시된 농도에서의 10분간 전처리 후, 세포는 10μM 아라키돈산 및 설린닥 혹은 그의 유사체로 37℃에서 30분 동안 함께 처리되었다. 배지는 수집되었고 즉시 분석평가되었다. PGE2 생산은 제조사의 지시에 따라서 프로스타글란딘 E2 EIA 키트-모노클로날로 측정되었다(Cayman Chemical, 미시간주 앤아버시에 소재). PGE2 생산(%)은 비히클 단독에 의해 생산된 PGE2에 대한 화합물의 존재에서 생산된 PGE2의 비로서 표현된다.
유사체의 평가는, 이들이 RXRα-결합 활성을 보유하며, 4번 위치에 있는 아이소-프로필(i-Pr)기로 인한 것과 마찬가지로, K-80003이 가장 강력한 것(설린닥보다 34배 높음)(도 7C)을 나타냈고, 이는 RXRα의 Helix7 상의 소수성 잔기와의 상호작용을 개선시킨다는 것을 나타내었다. K-80003 및 K-80005는 COX 활성의 검출가능한 저해를 지니지 않았고(도 7C), 연속적으로 혹은 TNFα(도 7D) 또는 IL-1β유래 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생산(도시생략)을 저해하지 못했다. K-80003(100μM)의 19F NMR 스펙트럼은 10μM RXRα LBD의 존재 유무에 있어서 비교되었다(도 7E).
Caco-2 및 MEF 세포는 설린닥 혹은 K-80003의 지시된 농도로 30분 동안 치료되었고, 이어서 모든-트랜스-RA(10-7 M)로 15분 동안 자극되었다. AKT 활성화는 면역 블로팅에 의해 분석되었다. RXRα 혹은 RARγ siRNA로 형질감염된 PC3 세포는 TNFα(10 ng/㎖)에 30분 동안 노출되기 전에 K-80003(50μM)로 1시간 동안 사전 치료되었다(pRXRα: 인산화 RXRα). A549 세포는 플래그-p85α 및 Myc-RXRα/Δ80으로 형질감염되었고, 설린닥(50μM) 혹은 K-80003(50μM)로 1시간 동안 치료되고 나서, 30분 동안 TNFα에 노출되고, 항-플래그 항체를 이용한 공면역침강에 의해 분석되었다. K-80003(50μM)은 ATRA-유래 AKT 활성화(도 20) 및 TNFα-유래 AKT 활성화(도 8A), HeLa/RXRα/1-134 안정적 클론의 콜로니 형성(도 8B), 및 p85α의 RXRα/Δ80과의 상호작용(도 8C)을 저해함에 있어서 설린닥(50μM)보다 훨씬 더 효과적이었다. siRNA에 의해 RXRα 발현을 저감시키는 것은, PC3 세포 내에서 AKT 활성화에 대한 K-80003의 저해 효과를 크게 손상시켰다. 비교에 있어서, RARα siRNA에 의한 RARα 발현의 저감은 그러한 효과를 보이지 않았다. 이와 같이 해서, K-80003에 의한 AKT 활성화의 억제는 또한 RXRα 발현에 의존적이었다(도 8B).
공면역침강 분석평가는, TNFα의 존재 유무에 있어서 RXRα/Δ80의 p85α와의 상호작용이 설린닥의 효과와 비교해서 K-80003에 의해 강력하게 저해되었음을 입증하였다(도 8C).
ZR-75-1 세포는 TNFα 및/또는 설린닥(75μM) 또는 K-80003(50μM)으로 6시간 동안 치료되었고 면역 블로팅에 의해 분석되었다. K-80003은 또한 ZR-75-1 세포 내의 TNFα와 함께 이용될 경우 PARP 분할을 유발함에 있어서 설린닥보다 더 효과적이었다(도 8D). 설린닥과 마찬가지로, K-80003은 TNFα와 조합하여 HepG2 및 PC3 세포에 있어서 PARP 분할과 카스파제-8 활성화를 상승적으로 유발시켰다(도 8E).
클론원성 생존 분석평가에 있어서, HeLa/RXRα/1-134 안정적 클론 및 RXRα/Δ80 안정적 클론의 콜로니 형성은 K-80003에 의해 거의 완전히 억제되어, 세포 성장을 저해하는 그의 능력을 드러내보였다(도 8F). AKT 활성화에 대한 K-80003의 저해 효과는 RXRα에 의해 제거되었지만, RARγ siRNA에 의해서는 그러하지 않았는 바(도 8F), 이는 그의 효과를 매개함에 있어서의 RXRα의 역할을 시사한다.
마우스(n=6)는 옥수수유, 설린닥(60㎎/kg) 혹은 K-80003(60㎎/kg)으로 2주 동안 복강내 치료되었다. 종양이 제거되고 측정되었다. 유의하게는, K-80003은 동물에서의 RXRα/Δ80 종양의 성장에 대해서 설린닥보다 훨씬 더 강력한 저해 효과를 발휘하였다(도 8G). 이와 동시에, RXRα-선택적 설린닥 유사체 K-80003은 RXRα-매개 PI3K/AKT 신호전달 및 암 세포 성장의 강력한 저해제이다.
실시예 10. 포유동물에서의 설린닥 유사체의 선별
설린닥 유사체의 패널은 세포 내 세포자멸사를 유발하는 능력을 지니는 화합물에 대해서 선별되도록 선택된다. 각 후보 화합물이 마우스에 도입되어, AKT의 활성의 억제, 카스파제-8의 활성화, BAX의 활성화, cFLIP의 저해 및/또는 세포 내 Bid의 열화를 가능하게 하는지의 여부를 판정하기 위하여 분석된다. 선별 동안 확인된 화합물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 분석평가 혹은 방법을 더욱 선별하기 위하여 이용될 수 있다.
실시예 11. 인간 환자의 암의 치료
암의 치료를 필요로 하는 인간 환자가 확인되고, COX-2 경로와는 독립적으로 기능하고 RXRα와 상호작용하는 것으로 알려진 화합물이 투여된다. 이 환자는 상기 화합물의 투여로부터 기인되는 암의 안정화 혹은 개선에 대해서 모니터링되었다. 항종양형성 효과는 화합물의 투여 후 환자에서 관찰된다.
실시예 12. 인간 환자에서의 암의 예방
일반적인 모집단에 비해서 암을 발병할 위험이 높은 인간 환자가 확인되고, 활성 성분 K-80003을 함유하는 150㎎ 정제를 1일 2회 복용하도록 지시된다. 이 환자는 모니터링되었지만 화합물의 투여 후 암을 발병하지 않는다.
실시예 13. TNFα 유래 외인성 세포자멸성 경로의 설린닥 활성화
1% FBS를 지니는 배지 중에서 배양된 HepG2 세포는 SR11237(1μM)로 1시간 동안, 이어서, TNFα(10 ng/㎖) 및/또는 설린닥(75μM)으로 4시간 동안 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다. 대조군 또는 RXRα siRNA으로 형질감염된 HepG2 세포는 TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되었고 면역 블로팅에 의해 분석되었다.
설린닥 및 TNFα에 의한 HepG2 간암 세포(도 6A) 및 기타 암 세포주(도 16 및 도 17)의 치료는 PARP 분할 및 카스파제-8 활성화(분할된 카스파제-8 생성물, p43/p41로 표시됨)를 효율적으로 유발한 한편, 설린닥 혹은 TNFα 단독에 의한 이들 세포의 치료는 거의 효과가 없었다. 설린닥/TNFα 조합의 세포자멸 효과는 RXRα-선택적 리간드 SR11237(도 6A) 혹은 RXRα siRNA(도 6B)의 형질감염에 의해 부분적으로 억제되었고, 이는 재차 RXRα의 역할을 입증한다.
대조군 혹은 카스파제-8 siRNA로 형질감염되거나 ZIETD-fmk(40μM)로 1시간 동안 사전 치료된 HepG2 세포는 TNFα 및 설린닥으로 치료되었고 설린닥/TNFα 유래 PARP 분할의 완전한 억제에 대해서 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 6C 및 도 16B 내지 도 16C). 유사한 결과는, 세포가 카스파제-8 siRNA에 의해 형질감염된 경우에 얻어졌다(도 6D 및 도 16D). 이와 같이 해서, 설린닥/TNFα 유래 세포자멸사는 외인성 세포자멸 경로에 의해 매개되었다.
설린닥 및 TNFα에 의한 Bax의 활성화. TNFα 및/또는 설린닥으로 치료된 HepG2 세포는 Bax/6A7 항체로 면역염색되었다. 약 15% 설린닥-치료된 세포와 한편 약 60% 설린닥/TNFα 치료된 세포는 Bax 염색을 보였다. Bax 활성화를 초래하는 외인성 세포자멸 경로의 잠재적인 설린닥 활성화가 또한 조사되었다. TNFα 혹은 설린닥으로 단독으로 혹은 함께 치료된 HepG2 세포는 입체형태-민감성 Bax/6A7 항체를 이용해서 Bax 활성화에 대해서 조사되었다. 유의한 Bax 염색은 세포가 TNFα 및 설린닥의 둘 모두로 치료된 경우에만 관찰되었다(도 6E). 외인성 세포자멸 경로와 내인성 세포자멸 경로 간의 누설은 Bid 분할 및 활성화를 통해 연결될 수 있다(Li et al., Cell 94 (4), 491-501 (1998)). 실제로, Bid는 TNFα 및 설린닥으로 치료된 세포에서 유의하게 저하되었으며(도 6A), 이는 설린닥/TNFα 유래 Bax 활성화가 Bid 활성화를 통해 매개될 수 있었음을 시사한다.
CA-AKT 혹은 DN-AKT로 형질감염된 PC3 세포는 TNFα 및/또는 설린닥으로 치료되었고, 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 6F). 설린닥 및 TNFα에 의한 카스파제-8(도 6G) 및 Bax(도 6H)의 활성화. CA-AKT로 형질감염된 HepG2 세포는 TNFα 및 설린닥으로 치료되었고, 항-분할된 카스파제-8 또는 Bax/6A7 항체로 면역염색되었다. 약 80% 비형질감염되고 15% CA-AKT-형질감염된 세포는 카스파제-8 염색을 보였다. 약 60% 비형질감염되고 약 13% CA-AKT-형질감염된 세포는 Bax 염색을 보였다. 설린닥/TNFα 유래 PARP 분할은 연속적-활성 AKT(constitutive-active AKT: CA-AKT)의 형질감염에 의해 저해되었지만, 우성-음성적 AKT(dominant-negative AKT: DN-AKT)의 형질감염에 의해 증대되었다(도 6F). 이어서, 설린닥/TNFα 조합에 의한 세포자멸사(도 17B)의 유도, 그리고 카스파제-8(도 6G) 및 Bax(도 6H)의 활성화는 CA-AKT에 의해 저해되었다.
TNFα 및/또는 설린닥으로 6시간 동안 치료된 세포는 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 6I). 카스파제-8 활성화를 저해함으로써 외인성 세포자멸 경로의 강력한 저해제로서 작용하는 AKT 신호전달의 하류 표적 유전자인 c-FLIP의 발현이 조사되었다. TNFα에 의한 HepG2, A549 및 SW480 세포의 치료는 c-FLIP의 짧은 형태(c-FLIPS)와 긴 형태(c-FLIPL)의 양쪽 모두의 강력한 유발을 초래하였고, 이는 설린닥에 의해 저해되었다(도 6I). 이와 같이 해서, 설린닥은 c-FLIP 발현에 대한 TNFα의 유도 효과를 억제함으로써 세포자멸사를 유발하였다.
실시예 14. K-80003에 의한 유방 종양에서의 성장 저해
마우스에서 성장된 MCF-7 유방 종양 조직에 대한 K-80003의 경구 투여의 성장 저해 효과가 조사되었다. K-80003은 NaHCO3(pH 8.0) 중에 용해되었다. MCF-7 유방 종양 조직을 지니는 마우스는 1일 1회 위관영양법에 의해 100 ul 총 체적 중 15㎎/㎏ K-80003, 30㎎/kg K-80003, 60㎎/kg K-80003, 또는 대조군이 투여되었다. 20일에 걸쳐서 측정된 종양 체적은, 경구 K-80003으로 치료된 마우스가 대조군으로 치료된 마우스에 비해서 종양 체적의 용량-의존적 감소를 보인 것을 나타내었다(도 21A).
실시예 15. K-80003의 임상전 연구
독성, 생체이용률 및 약동학의 조사를 비롯하여, K-80003의 임상전 연구가 수행되었다. K-80003은 매우 낮은 독성(도 22A), 정맥내 제형에 비해서 경구에 있어서 증가된 생체이융률(도 22B) 및 목적으로 하는 PK 프로파일(도 22C)을 보였다.
실시예 16. 유사체의 생산
3-(4-플루오로페닐)-2-메틸아크릴산(2a)
Figure 112012100950912-pct00016
무수프로피온산(31.0㎖, 242 m㏖)을 탄산칼륨(18.2g, 132 m㏖)에 0℃에서 가하였다. 5분간 교반하여 혼합 후, p-플루오로벤즈알데하이드(1a)(13.0㎖, 120m㏖)를 가하였다. 이 혼합물을 160℃에서 12시간 가열하였다. 빙욕을 이용한 냉각 후, 이 반응 혼합물에 물을 가하였다. 얻어진 황색 침전물을 여과하고, EtOAc로 세척하여 조질의 산 2a를 수득하였고, 이를 그대로 다음 단계에서 이용하였다. 기지의 아크릴산 2a(40)의 분석적 샘플은 MeOH로부터의 재결정에 의해 얻었다. 2a: 담황색 결정. M.p. 155-158℃ (MeOH). IR (KBr): ν max = 3429, 3076, 2972, 1665, 1596, 1508, 1425, 1313, 1298, 1224 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CD3OD) δ: 2.09 (s, 3H, CCH 3 ), 7.22-7.11 (m, 2H, Ph-H), 7.52-7.43 (m, 1H, Ph-H), 7.69 (s, 1H, CH=CCH3) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CD3OD) δ: 12.7, 114.8, 115.1, 131.4, 131.5, 132.1, 132.2, 137.5, 161.3, 163.75, 170.4 ppm; MS (ESI) m/z 179 (M-H+).
3-(4-플루오로페닐)-2-메틸프로판산(3a)
Figure 112012100950912-pct00017
메탄올(190㎖) 중 조질의 아크릴산 2a(14.3g, 79.4 m㏖) 및 10% Pd/C(1.35g)의 혼합물을 10시간 동안 수소의 20 atm 하에 수소화시켰다. 촉매를 여과 제거하고, 그 여과액을 농축시켜 조질품 3a를 얻었고, 이것은 다음 단계에서 그대로 이용하였다. 화합물 3a(40)의 분석 샘플은 실리카겔(에틸 아세테이트:PE, 1:2) 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻었다. 3a: 무색 오일. IR (필름): ν max = 3406, 2972, 2933, 1701, 1560, 1509, 1460, 1406, 1223 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 1.17 (d, J = 6.82 ㎐, 3H, CHCH 3 ), 2.77-2.61 (m, 2H, CH 2 CH), 3.02 (dd, J = 13.18, 6.35 ㎐, 1H, CH2CH), 7.00-6.93 (m, 2H, Ph-H), 7.16-7.11 (m, 2H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 16.4, 38.4, 41.4, 115.1, 115.1, 130.3, 130.4, 134.5, 134.6, 160.4, 162.8, 182.6 ppm; MS (ESI) m/z 181 (M-H+).
6-플루오로-2-메틸-2,3-다이하이드로인덴-1-온(4a)
Figure 112012100950912-pct00018
프로판산 유도체 3a(3.20g)와 폴리인산(47.0g)의 혼합물을 80℃에서 4시간 가열하였다. 얻어진 혼합물을 빙수에 붓고 EtOAc로 추출하였다. 추출물을 합해서 포화 수성 NaHCO3로 세척하여 출발 산들을 제거하고 나서, 염수로 세척 후, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 나서 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 플래시 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:PE, 1:30)에 의해 정제시켜 화합물 4a(40)를 담황색 오일로서 수득하였다(1.44g, 50%). NaHCO3 층을 진한 HCl로 산성화시키고 나서 EtOAc(3×30㎖)로 추출하였다. 추출물을 합해서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 후, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 회수된 출발 물질 3a(34%)를 얻었다. 4a에 대한 데이터: IR(필름) ν max = 3064, 2968, 2932, 2873, 1716, 1611, 1509, 1486, 1444, 1264, 1158 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 1.32 (d, J = 7.37 ㎐, 3H, CHCH 3 ), 2.82-2.65 (m, 2H, CH 2 CH), 3.37 (dd, J = 16.71, 7.55 ㎐, 1H, CH2CH), 7.33-7.26 (m, 1H, Ph-H), 7.44-7.36 (m, 2H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 16.2, 34.4, 42.9, 76.3, 109.7, 109.9, 122.2, 122.5, 127.8, 127.9, 138.1, 148.8, 149.6, 161.1, 163.6, 208.5 ppm; MS (ESI) m/z 187 (M+Na+).
에틸 2-(6-플루오로-2-메틸-3 H -인덴-1-일)아세테이트(5a)
Figure 112012100950912-pct00019
0℃에서 무수 THF(38.0㎖) 중 HMDS(15.0㎖, 56.9 m㏖)의 용액에 n-BuLi(n-헥산 중 2.5M 용액, 17.0㎖, 42.8 m㏖)를 적가하였다. 약 30초 동안 교반한 후, 이 혼합물을 -78℃까지 냉각시키고 EtOAc(4.20㎖, 42.8 m㏖)를 가하였다. 이 혼합물을 -78℃에서 더욱 30분 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물에 무수 THF(40㎖) 중 인데논 4a의 용액을 적가하였다. 이 혼합물을 -78℃에서 더욱 4시간 교반하고 나서 포화 수성 NH4Cl로 반응 중지시켰다. 이 혼합물을 EtOAc(3×20㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔사에 HOAc/H2SO4(10/1, 55㎖)를 가하였다. 5시간 동안 실온에서 교반 후, 이 혼합물을 CH2Cl2(3×15㎖)로 추출하였다. 추출물을 합하고 이어서 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조 후, 여과시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 실리카겔(에틸 아세테이트:PE, 1:30) 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 화합물 5a(40)를 무색 오일로서 수득하였다(3.26g, 70%). IR (필름) ν max =2981, 2911, 1736, 1614, 1590, 1473, 1368, 1329, 1308, 1256, 1154, 1034 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 1.25 (t, J = 7.13 ㎐, 3H, COOCH2 CH 3 ), 2.12 (s, 3H, CCH 3 ), 3.29 (s, 2H, PhCH 2 C), 3.48 (s, 2H, PhCCH 2 ), 4.14 (q, J = 7.13 ㎐, 2H, COOCH 2 CH3), 6.79 (ddd, J = 9.62, 8.12, 2.41 ㎐, 1H, Ph-H), 6.96 (dd, J = 9.33, 2.40 ㎐, 1H, Ph-H), 7.25 (dd, J = 8.17, 4.93 ㎐, 1H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 14.1, 14.3, 31.5, 42.1, 60.9, 105.6, 105.9, 110.2, 110.4, 123.6, 123.7, 129.6, 129.6, 137.2, 137.2, 144.6, 147.8, 147.9, 161.2, 163.6, 170.7 ppm; MS (ESI) m/z 257 (M+Na+).
(Z)-2-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3 H -인덴-1-일)아세트산(설린닥 설파이드)(6a)
Figure 112012100950912-pct00020
MeOH(4.6㎖) 중 인덴 5a(650㎎, 3 m㏖)의 용액에, 2N NaOMe(4.6㎖, 9 m㏖)를 실온에서 가하여 유기 혼합물을 얻었다. 20분 동안 교반 후, 이 혼합물에 p-(메틸티오)벤즈알데하이드(0.8㎖, 7.5m㏖)를 가하였다. 얻어진 혼합물을 80℃에서 3.5시간 동안 환류시켰다. 감압 하에 농축 후, 잔사를 1N HCl 용액에 부었다. 실온에서 더욱 10시간 교반 후, 이 혼합물을 EtOAc(3×15㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피(에틸 아세테이트:PE, 1:2.5)에 의해 정제시켜 시스 (Z) 이성질체 6a(설린닥 설파이드)(40)를 황색 고체로서 주로 수득하였다(868㎎, 85%). 트랜스 (E) 이성질체는 약 2% 수득되었다. M.p. 182-185℃(EtOAc)(lit. (40) M.p. 180-184℃). IR (KBr) ν max = 3445, 3012, 2914, 2850, 1702, 1602, 1589, 1465, 1410, 1320, 1240, 1171, 1085 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6 ) δ: 2.15 (s, 3H, C=CCH 3 ), 2.54 (s, 3H, SCH 3 ), 3.57 (s, 2H, CH2COO), 6.77-6.71 (m, 1H, 비닐 H), 7.01 (dd, J = 9.31, 2.25 ㎐, 1H, 비닐 H), 7.25-7.46 (m, 5H, Ph-H), 12.40 (s, 1H, COOH) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 10.7, 14.7, 31.5, 106.1, 106.4, 110.6, 110.8, 123.4, 123.5, 125.8, 130.0, 130.3, 131.0, 132.1, 132.6, 138.5, 139.5, 139.5, 139.5, 147.2, 147.3, 161.5, 161.6, 172.1 ppm; MS (ESI) m/z 331 (M+Na+).
설린닥 설파이드(6a)에 대해서 기재된 절차에 따라서, 이어서 적절한 방향족 알데하이드로 인덴 5a의 응축을 실시하여, 화합물 K-80001 내지 K-80003을 각각 합성하였다.
(Z)-2-(3-(4-메틸벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3 H -인덴-1-일)아세트산(6b) (K-80001)
Figure 112012100950912-pct00021
황색 고체. M.p. 155-158℃. 수율: 87%. IR (KBr) ν max = 3426, 3022, 2959, 2915, 1733, 1717, 1655, 1599, 1512, 1470, 1408, 1381, 1214, 1172 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 2.19 (s, 3H, C=CCH 3 ), 2.41 (s, 3H, Ph-CH 3 ), 3.58 (s, 2H, CH2CO2H), 6.59-6.53 (m, 1H, 비닐 H), 6.87 (dd, J = 8.98, 2.40 ㎐, 1H, 비닐 H), 7.44-7.16 (m, 6H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 10.61, 21.43, 29.73, 31.44, 105.54, 105.77, 110.48, 110.71, 123.73, 123.83, 129.21, 129.32, 129.78, 129.80, 129.84, 129.87, 131.00, 131.02, 133.48, 138.29, 138.95, 139.76, 146.13, 146.22, 161.84, 164.29, 176.68 ppm; MS (ESI) m/z 363 (M+Na+). C20H17FO2에 대한 분석 계산치: C, 77.90; H, 5.56. 확인치: C, 77.88; H, 5.99.
(Z)-2-(3-(4-에틸벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3 H -인덴-1-일)아세트산(6c)(K-80002)
Figure 112012100950912-pct00022
황색 고체. M.p. 159-162℃. 수율: 83%. IR (KBr) ν max = 3082, 3024, 2965, 2923, 1705, 1604, 1473, 1465, 1413, 1312, 1229, 1168 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 1.29 (t, J = 7.61 ㎐, 3H, CH2 CH 3 ), 2.20 (s, 3H, C=CCH 3 ), 2.71 (q, J = 7.60 ㎐, 2H, CH 2 CH3), 3.59 (s, 2H, CH 2 COO), 6.60-6.54 (m, 1H, 방향족 비닐 H), 6.88 (dd, J = 8.97, 2.39 ㎐, 1H, 방향족 비닐 H), 7.19-7.44 (m, 5H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 10.6, 15.4, 28.7, 31.4, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7, 123.8, 128.0, 129.4, 129.7, 129.9, 131.0, 133.7, 138.9, 139.7, 144.6, 161.8, 164.2, 176.4 ppm; MS (ESI) m/z 345 (M+Na+). C21H19FO2대한 분석 계산치: C, 78.24; H, 5.94. 확인치: C, 78.21; H, 5.55.
(Z)-2-(3-(4-아이소-프로필벤질리덴)-6-플루오로-2-메틸-3 H -인덴-1-일)아세트산(6d)(K-80003)
Figure 112012100950912-pct00023
황색 고체. M.p. 146-149℃; 수율: 79%. IR (KBr) ν max = 3025, 2958, 2871, 1701, 1629, 1603, 1507, 1464, 1412, 1315, 1293, 1171, 1134 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ:1.31 (d, J = 6.95 ㎐, 6H, CH(CH 3 ) 2 ), 2.20 (s, 3H, C=CCH 3 ), 2.97 (td, J = 13.81, 6.91 ㎐, 1H, CH(CH3)2), 3.59 (s, 2H, CH 2 COO), 6.61-6.88 (m, 2H, 방향족 비닐 H), 7.19-7.46 (m, 6H, Ph-H); 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 10.6, 23.9, 31.3, 34.0, 76.7, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7, 123.8, 126.5, 129.4, 129.7, 129.8, 131.0, 133.7, 139.0, 139.6, 146.1, 146.2, 149.3, 161.8, 164.2, 176.1 ppm; MS (ESI) m/z 359 (M+Na+). C22H21FO2에 대한 분석 계산치: C, 78.55; H, 6.29. 확인치: C, 78.13; H, 6.02.
에틸 2-(6-플루오로-3 H -인덴-1-일)아세테이트(5b)
Figure 112012100950912-pct00024
0℃에서 무수 THF(4㎖) 중 아이소-프로필아민(0.27㎖, 2 m㏖)의 용액에 n-BuLi(n-헥산 중 2.5M 용액, 0.8㎖, 2 m㏖)를 적가하였다. 약 30분 교반 후, 이 혼합물을 -78℃까지 냉각시키고, EtOAc(0.2㎖, 2 m㏖)를 가하였다. -78℃에서 더욱 30분 동안 교반 후, 무수 THF(0.7㎖) 중 인데논 4b(150㎎, 1 m㏖)를 적가하였다. 이 혼합물을 -78℃에서 더욱 2시간 교반하고 나서 포화 NH4Cl로 반응 중지시켰다. 이 혼합물을 EtOAc(3×5㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 AcOH/H2SO4(10/1, 3㎖)로 취하였다. 실온에서 3시간 교반 후, 이 혼합물을 CH2Cl2(3×5㎖)로 추출하였다. 추출물을 합해서 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 순차로 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 실리카겔(에틸 아세테이트:PE, 1:30) 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 5b를 무색 오일로서 수득하였다(99㎎, 49%). IR (필름) ν max = 3054, 2982, 2931, 1704, 1636, 1486, 1446, 1369, 1345, 1288, 1276 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 1.28 (t, J = 7.15 ㎐, 3H, CH2CH 3 ), 3.35 (s, 2H, CH 2 CO2Et), 3.56 (dd, J = 2.93, 1.51 ㎐, 2H, CH 2 CH), 4.19 (q, J = 7.15 ㎐, 2H, CH3CH 2 ), 6.52 (s, 1H, C=CH), 6.93-7.36 (m, 3H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 14.2, 34.1, 37.4, 61.0, 106.4, 106.7, 111.4, 111.6, 124.3, 124.4, 134.1, 136.3, 136.4, 139.2, 139.3, 146.3, 146.4, 161.1, 163.5, 170.72 ppm. C13H=FO=에 대한 분석 계산치: C, 70.90; H, 5.95. 확인치: C, 71.30; H, 6.23.
(E)-2-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-3 H -인덴-1-일)아세트산(6e) (K-80004)
Figure 112012100950912-pct00025
MeOH(4㎖) 중 인덴 유도체 5b(506㎎, 2.50m㏖)의 용액에 실온에서 2N NaOMe(4㎖, 4 m㏖)를 가하였다. 20분간 교반 후, 얻어진 용액에 p-(메틸티오)벤즈알데하이드(0.65㎖, 2.50m㏖)를 가하였다. 얻어진 혼합물을 80℃에서 3.5시간 동안 환류시켰다. 얻어진 용액을 감압 하에 농축시키고, 1N HCl 속에 부었다. 실온에서 10시간 교반 후, 이 혼합물을 EtOAc(3×10㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 실리카겔(에틸 아세테이트:PE, 1:2.5) 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 트랜스 (E) 이성질체 6e(K-80004)를 황색 고체(429㎎, 48%)로서 수득하였다. M.p. 180-182℃ (EtOAc). 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 2.54 (s, 3H, SCH 3 ), 3.69 (s, 2H, CH 2 COO), 7.09-7.84 (m, 9H, Ph-H), 12.52 (s, 1H, COOH) ppm; 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 13.6, 115.5, 115.7, 127.3, 131.7, 131.8, 139.9, 161.5, 163.9, 174.0 ppm. C19H15FO2S에 대한 분석 계산치: C, 69.92; H, 4.63; F, 5.82; O, 9.80; S, 9.82. 확인치: C, 70.16; H, 4.92.
스피로(다이하이드로-2(3 H )퓨라논-5-1'(2'H)(3'H)-6-플루오로-인단(7a)
Figure 112012100950912-pct00026
THF(10㎖) 중 6-플루오로-1-인다논 4b(75.0㎎, 0.50m㏖), 아이소-프로판올(0.190㎖, 2.50m㏖) 및 메틸 아크릴레이트(0.45㎖, 5m㏖)의 용액을 아르곤으로 20분 동안 퍼지시키고 0℃까지 냉각시켰다. THF(15㎖) 중 Sml2(1.50m㏖) 용액을 트랜스퍼 니들(transfer needle)을 통해서 가하였다. 5분 후, 이 반응은 포화 K2CO3(2㎖)로 반응중지시켰다. 얻어진 혼합물을 EtOAc(3×3㎖)로 추출하였다. 유기상을 합하여 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 후, 여과시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 EtOAc-PE(1:6)로 용리되는 실리카겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 화합물 7a(74.5㎎, 0.37 m㏖, 73%)를 무색 오일로서 수득하였다; IR(필름) ν max: 3058, 2945, 2856, 1766, 1603, 1494, 1155 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 2.28-2.52 (m, 4H, ArCCH 2 ), 2.77 (dt, J = 8.0, 1.2 ㎐, 2H, ArCCH 2 CH 2 CO), 2.81-2.90 (m, 1H, ArCH 2 ), 3.00-3.09 (m, 1H, ArCH 2 ), 6.96-7.03 (m, 2H, Ar-H), 7.18-7.23 (m, 1H, Ar-H); 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 28.7, 29.5, 33.3, 39.4, 94.1, 109.7 (d, J C-F = 22.4 ㎐) 116.6 (d, J C-F = 22.5 ㎐), 126.2 (d, J C-F = 8.3 ㎐), 138.8, 144.7 (d, J C-F = 7.4 ㎐), 162.2 (d, J C-F = 233.5 ㎐), 176.0 ppm; C12H11FO2에 대한 분석 계산치: C, 69.89; H, 5.38. 확인치: C, 69.97; H, 5.62.
메틸 3-(6-플루오로-3 H -인덴-1-일)프로파노에이트(8a)
Figure 112012100950912-pct00027
CH3OH(1.5㎖) 중의 스피로(다이하이드로-2(3H)퓨라논-5-1'(2'H)(3'H)-6-플루오로-인단 7a(61㎎, 3 m㏖)의 용액에 p-TsOH(6㎎)를 가하였다. 얻어진 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 이 반응은 NaHCO3의 포화 수성 용액(2.0㎖)으로 반응중지시켰다. 얻어진 혼합물을 EtOAc(3×2㎖)로 추출하였다. 유기상을 합하여 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 후, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 EtOAc-PE(1:300)로 용리되는 실리카겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 화합물 8a(61㎎, 0.28 m㏖, 94%)를 담황색 오일로서 수득하였다. IR (필름) ν max: 2959, 2901, 1739, 1585, 1606, 1473, 1254, 1162 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 2.68-2.73 (m, 2H, CH 2 COO), 2.82-2.88 (m, 2H, ArCCH 2 ), 3.28-3.31 (m, 2H, ArCH 2 ), 3.71 (s, 3H, COOCH 3 ), 6.30 (t, 1H, J = 1.6 ㎐, ArC=CH), 6.83-6.91 (m, 1H, Ar-H), 7.02-7.06 (m, 1H, Ar-H), 7.33-7.38 (m, 1H, Ar-H); 13C NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 22.9, 32.4, 37.3, 51.7, 106.0 (d, J C-F = 23.1 ㎐), 111.4 (d, J C-F = 22.8 ㎐), 124.4 (d, J C-F = 8.9 ㎐), 130.3, 139.5, 142.4 (d, J C-F = 3.0 ㎐), 146.9 (d, J C-F = 8.5 ㎐), 162.4 (d, J C-F = 240.6 ㎐), 173.4 ppm; C13H13FO2에 대한 분석 계산치: C, 70.90; H, 5.95. 확인치: C, 70.50; H, 5.97.
(E)-메틸 3-(3-(4-(메틸티오)벤질리덴)-6-플루오로-3 H -인덴-1-일)프로파노에이트(9a)(K-80005)
Figure 112012100950912-pct00028
CH3OH(1㎖) 중 메틸 3-(6-플루오로-3H-인덴-1-일)프로파노에이트 8a(110㎎, 0.5m㏖)의 용액을 질소로 10분 동안 퍼지시키고 0℃까지 냉각시켰다. CH3OH(1㎖) 중 신선하게 제조된 CH3ONa(0.75m㏖)를 적가하였다. 30분간 교반 후, 4-(메틸티오)벤즈알데하이드(63㎕, 0.6 m㏖)를 적가하였다. 얻어진 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 냉각 후, 이 반응물은 물(3㎖)로 반응 중지시키고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 pH = 4에 도달할 때까지 1M HCl로 산성화시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔사를 EtOAc(3×5㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 염수(2㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조 후, 진공 중 농축시켰다. 잔사를 EtOAc-PE(1:4)로 용리되는 실리카겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 트랜스 (E)-이성질체 9a(112㎎, 66%)를 황색 고체로서 수득하였다. M.p.: 182-184℃ (EtOAc); IR (KBr) ν max: 3055, 2988, 2925, 1711, 1640, 1488, 1445, 1656, 1290, 1277 ㎝-1; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ: 2.53 (s, 3H, SCH 3 ), 2.68 (t, 2H, J = 7.6 ㎐, CH 2 COO), 2.84 (t, 2H, J = 7.6 ㎐, ArCCH 2 ), 6.96-7.84 (m, 9H, Ar-H), 12.21 (s, COOH); 13C　NMR (100 ㎒, CDCl3) δ: 14.3, 22.6, 32.0, 106.1 (d, J C-F = 23.4 ㎐), 111.5 (d, J C-F = 23.0 ㎐), 120.5 (d, J C-F = 9.2 ㎐), 122.6, 125.8 (2C), 127.3, 130.4 (2C), 132.8, 134.1, 136.4, 139.4, 143.2 (d, J C-F = 8.8 ㎐), 146.3, 162.2 (d, J C-F = 240.5 ㎐), 173.8 ppm; C20H17FO2S에 대한 분석 계산치: C, 70.57; H, 5.03; S, 9.42. 확인치: C, 70.20; H, 4.62; S, 9.01.
K-80003 유사체 번호 1 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00029
K-80003 유사체 번호 2 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00030
K-80003 유사체 번호 3 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00031
K-80003 유사체 번호 4 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00032
K-80003 유사체 번호 5 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00033
K-80003 유사체 번호 6 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00034
K-80003 유사체 번호 7 (R1 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00035
K-80003 유사체 번호 8 (R2 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00036
K-80003 유사체 번호 9 (R2 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00037
K-80003 유사체 번호 10 (R2 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00038
K-80003 유사체 번호 11 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00039
K-80003 유사체 번호 12 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00040
K-80003 유사체 번호 13 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00041
K-80003 유사체 번호 14 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00042
K-80003 유사체 번호 15 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00043
K-80003 유사체 번호 16 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00044
K-80003 유사체 번호 17 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00045
K-80003 유사체 번호 18 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00046
K-80003 유사체 번호 19 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00047
K-80003 유사체 번호 20 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00048
K-80003 유사체 번호 21 (R3 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00049
K-80003 유사체 번호 22 (R4 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00050
K-80003 유사체 번호 23 (R4 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00051
K-80003 유사체 번호 24 (R4 변이체; 황색 고체):
Figure 112012100950912-pct00052
K-80003 유사체 번호 25 (R1 변이체):
Figure 112012100950912-pct00053
K-80003 유사체 번호 26 (R1 변이체):
Figure 112012100950912-pct00054
K-80003 유사체 번호 27 (R3 변이체):
Figure 112012100950912-pct00055
식 중, R3 = 2-CN.
K-80003 유사체 번호 28 (R3 변이체):
Figure 112012100950912-pct00056
식 중 R3 = 2-CF3.
K-80003 유사체 번호 29 (R3 변이체):
Figure 112012100950912-pct00057
식 중, R3 =
Figure 112012100950912-pct00058
K-80003 유사체 번호 30 (R3 변이체):
Figure 112012100950912-pct00059
식 중, R3 =
Figure 112012100950912-pct00060
K-80003 유사체 번호 31 (R4 변이체):
Figure 112012100950912-pct00061
식 중, R4 = Et.
K-80003 유사체 번호 32 (R4 변이체):
Figure 112012100950912-pct00062
식 중, R4 = EtO.
K-80003 유사체 번호 33 (R4 변이체):
Figure 112012100950912-pct00063
식 중 R4 = i-Pr.
K-80003 유사체 번호 34 (R4 변이체):
Figure 112012100950912-pct00064
식 중, R4 = Cl.
방법의 개요
플라스미드
RXRα 및 Myc-RXRα의 구성은 문헌[Kolluri, S.K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102 (7), 2525-2530 (2005); Cao, X., et al., Retinoid X receptor regulates Nur77/TR3-dependent apoptosis [corrected] by modulating its nuclear export and mitochondrial targeting. Mol Cell Biol 24(22), 9705-9725 (2004); Masia, S. et al., Rapid, nongenomic actions of retinoic acid on phosphatidylinositol-3-kinase signaling pathway mediated by the retinoic acid receptor. Mol Endocrinol 21 (10), 2391-2402 (2007); Ohashi, E. et al., Cancer Res 69 (8), 3443-3450 (2009); Balkwill, F., Nat Rev Cancer 9 (5), 361-371 (2009); Han, Y.H. et al., Oncogene 25 (21), 2974-2986 (2006)]에 기재되어 있다. 플래그-p85α는 순방향 프라이머인 5'-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머인 5'- acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3'(서열번호 2)를 이용해서 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 구축되었다. PCR 산물은 Eco RI 및 Sal I을 이용해서 분해되었고, pCMV-플래그 벡터 내로 클로닝되었다. RXRα 돌연변이는 이하의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 지니는 QUICKCHANGE(등록상표) 돌연변이유발 키트(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재)를 이용해서 구축되었다: RXRα/F313S/R316E, 5'-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCATAGCTGTGAAAGATGGG(순방향 - 서열번호 3) 및 5'-CCCATCTTTCACAGCTATGGACTCGTGGGAGGAGGAGGCGATCAGCAGCTCGTTCC(역방향 - 서열번호 4); RXRα/Δ80, 5'-CCGGAATTCGGaccacacccaccctgggc-3(순방향 - 서열번호 5) 및 5'-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3'(역방향 - 서열번호 6); RXRα/Δ100, 5'-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3'(순방향 - 서열번호 5) 및 5'- CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3'(역방향 - 서열번호 6). PCR 산물은 EcoR I 및 Xho I을 이용해서 분해되었고, pCMV-Myc 벡터 내로 결찰되었다.
세포 배양
ZR-75-1 인간 유방암, LNCaP 및 PC3 전립선암, 및 H460 폐암 세포는 10% 소태아혈청(FBS)으로 보충된 RPMI 1640에서 배양되었다. HepG2 간암 및 MCF-7 인간 암 세포는 10% FBS를 함유하는 MEM에서 유지되었다. HEK293T 인간 태아 신장 세포, CV-1 사바나원숭이 신장 세포, MEF 세포, A549 인간 폐암 세포, HaCat 인간 각질세포 세포, BHK 베이비 햄스터 신장 세포, Caco2 인간 결장암 암종 세포, SW480 인간 결장샘암종 세포, 및 HCT116 인간 결장 세포는 10% FBS로 보충된 DMEM에서 유지되었다. F9 쥐의 배아 암종 세포주는 파열된 RXRα의 두 대립형질을 지녔다(Clifford, J. et al., Embo J 15 (16), 4142-4155 (1996)). 세포 배양액은 5% CO2 가습 분위기 중에서 37℃에서 유지되었다.
항체 및 시약
항-포스포-Akt(Ser 473, D9E, #4060)는 Cell Signaling Technology(메사추세츠주의 단버스시에 소재)로부터 입수하였다. 항-β액틴(A1978) 및 항-플래그(M2, F3165) 항체는 Sigma-Aldrich(미조리주의 세인트루이스시에 소재)로부터 입수하였다. 항-p85α(#06-195) 항체는 Millipore(메사추세츠주의 빌레리카시에 소재)로부터 입수하였다. Akt1(C-20) sc-1618, GFP(B-2) sc-9996, HSP60(N-20) sc-1052, c-Myc(9E10) sc-40PI3, RARγ(C-19) sc-550, RXRα(D20) sc-553, RXRα(ΔN197) sc-774, PARP(H-250) sc-7150에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(캘리포니아주 산타크루즈시에 소재)로부터 입수하였다. ECL, 항-토끼 및 항-마우스 IgG, 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-결합된 종-특이적 항체는 GE Healthcare(Little Chalfont, 영국 버킹엄셰어주에 소재)로부터 입수하였다. ALEXA FLUOR(등록상표) 594 염소 항-토끼 IgG(A-11012) 및 ALEXA FLUOR(등록상표) 488 염소 항-마우스 IgG(A-10667)는 Invitrogen(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 구입하였다. 단백질 A/G Plus-Agarose(sc-2003)는 Santa Cruz Biotechnology(캘리포니아주 산타크루즈시에 소재)로부터 입수하였다. 재조합 인간 TNFα(210-TA)는 R&D Systems(미네소타주의 미니애폴리스시에 소재)로부터 입수하였다. 단백질분해효소 저해제 칵테일 테블릿(Protease Inhibitor Cocktail Tablets)은 Roche(스위스 바젤에 소재)로부터 입수하였다. 9-시스-레티노산(9-시스-RA)(R4643), 설린닥 설파이드 및 그의 유사체는 100mM의 스톡 용액 중 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 중에 용해되었다. 모든-트랜스-레티노산(ATRA)(R2625) 및 키모트립신은 Sigma-Aldrich(미조리주의 세인트루이스시에 소재)로부터 입수하였다. SR11237은 Dr. Marcia I. Dawson(Burnham Institute)에 의해 호의적으로 제공되었다.
리간드-결합 분석평가
박테리아식으로 발현된 His-표지된 RXRα 리간드-결합 도메인(LBD)(aa 223-462)은 비표지된 9-시스-RA 혹은 설린닥 설파이드의 각종 농도의 유무에 있어서의 리간드 결합 분석평가 버퍼에서 [3H]-9-시스-RA(Amersham Biosciences, 영국 아머샴 소재)를 이용해서 인큐베이팅되었다. RXRα LBD 단백질은 니켈-코팅된 비즈에 의해 포획되었다. 결합된 방사성표지된 9-시스-RA는 문헌[Kolluri, S.K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102 (7), 2525-2530 (2005)]에 기재된 바와 같은 섬광 계수기에서 결정되었다.
세포 내 RXRα 단백질에 결합하는 설린닥 설파이드의 HPLC 분석
C-말단 TAP 융합물(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재)에 융합된 발현 벡터 함유 수용체는 FuGene 6 형질감염 시약(Roche, 스위스 바젤에 소재)을 이용해서 HEK293 세포 내에 형질감염되었다. 세포는 10% 송아지 혈청(SCS, 유타주의 하이클론 로간시에 소재), 2mM 글루타민, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)으로 보충된 완전 배지인 DMEM(Mediatech Inc., 버지니아주의 헤른던시에 소재)에서 지수적 성장으로 유지되었다. 형질감염 후 2일째에, 세포는, 접시들이 약물 내성 콜로니에 대해서 등급매겨질 때, 형질감염 후 20일까지 400㎎/㎖ G418을 함유하는 배지 내로 전환되었다. RXRα 융합 단백질의 발현은 면역 블로팅에 의해 결정되었다. 세포는 4개의 150㎜ 플레이트에서 컨플루언시(confluency)로 성장되었고, 이어서 100mM 설린닥 설파이드 없이 혹은 이를 이용해서 3시간 치료되었다. 치료 후, 세포는 50㎖ 냉 PBS 중에서 2회 세척되었고, 스트렙타비딘 기반 정제는, 제공된 스트렙타비딘 결합 버퍼를 이용한 스트렙타비딘의 초기 세척을 통한 INTERPLAY(상표명) Mammalian TAP System(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재) 메뉴얼 업(manual up)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이어서, 묽은 황산 용액(pH 2) 0.1㎖ 부분이 첨가되고 나서 아세토나이트릴 1.0㎖가 첨가되었다. 그 후, 샘플들은 보텍스 믹서 상에서 30초 동안 소용돌이 교반되었고, 이어서 원심분리되었다(1000g × 5분). 액체 샘플은 이어서 제2관으로 옮겨져서 질소 흐름 하에 건조 상태로 증발되었다. 잔사는 크로마토그래피 이동상 0.12㎖에 용해되었고, 그 중 0.1㎖ 부분은 HPLC에 주입되었다. HPLC 분석은 microsorb-mv 100-3 C18 100×4.6 칼럼(캘리포니아주의 팔토알토시 바리안에 소재)을 이용해서 수행되었다. 이동상은 1.0 ㎖/분의 유량으로 펌핑되는 4% v/v 수성 아세트산 및 아세토나이트릴(30:70)로 이루어져 있었다. 설린닥 설파이드의 검출은 포토어레이 검출기(Waters model 2996, Waters Corporation, 메사추세츠주의 밀포드시에 소재)를 이용해서 수행되었고, 200 내지 450nM 사이의 스펙트럼에서 수집되었다. 설린닥 설파이드의 표준 용액을 이용해서 교정 곡선을 얻었다. 특징적인 피크 스펙트럼 및 체류 시간은 확인용으로 이용되었고, 정량화를 위하여 이용되는 4max에서의 피크 면적은 MILLENNIUM CHROMATOGRAPHY MANAGER 소프트웨어(Waters Corporation, 메사추세츠주의 밀포드시에 소재)를 이용해서 계산되었다. 3가지 유사한 실험 중 하나가 도시되어 있다.
단백질 분해성 보호 분석평가
RXRα LBD는 앞서 기재된 바와 같은 토끼 망상적혈구 용해물(Promega, 위스콘신주의 피치버그시에 소재)을 이용해서 시험관내 전사-암호해독에 의해 합성되었다(Kolluri, S.K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102 (7), 2525-2530 (2005); Zhang, X.K. et al., Nature 355 (6359), 441-446 (1992); Zhang, X.-K. et al., Nature. 358 (6387), 587-591 (1992)). 시험관내 암호해독된 35[S]메티오닌 표지된 RXRα-LBD는 용매(1% DMSO), 설린닥(100μM) 혹은 9-시스-RA(10-7M)를 이용해서 30분 동안 사전 인큐베이팅되었고, 이어서 키모트립신의 지시된 농도에서 분해되었다. 분해된 단편은 PAGE에 의해 분리되었다.
일시적 형질감염 분석평가
24-웰 플레이트에 파종된 세포(1×105 세포/웰)는 문헌[Kolluri, S.K. et al., Proc Natl Acad Sci USA 102 (7), 2525-2530 (2005); Cao, X., et al., Mol Cell Biol 24(22), 9705-9725 (2004)]에 기재된 바와 같이 변성된 인산칼슘 침강 절차를 이용해서 일시적으로 형질감염되었다.
세포자멸사 분석평가
핵 형태학적 변화 분석을 위하여, 세포는 트립신화되고, PBS로 세척되었으며, 3.7% 파라포름알데하이드로 고정되고, DAPI(4,6-다이아미디노-2-페닐인돌)(1㎎/㎖)로 염색하여 형광 현미경검사에 의해 핵을 가시화하였다(Masia, S. et al., Rapid, nongenomic actions of retinoic acid on phosphatidylinositol-3-kinase signaling pathway mediated by the retinoic acid receptor. Mol Endocrinol 21 (10), 2391-2402 (2007); Ohashi, E. et al., Cancer Res 69 (8), 3443-3450 (2009); Balkwill, F., Nat Rev Cancer 9 (5), 361-371 (2009)). 세포자멸사 세포의 백분율은 핵 분절 및/또는 염색질 응축을 지니는 적어도 300개의 GFP-양성 세포를 계수함으로써 결정되었다. DNA 분절의 결정을 위하여, 세포 사멸 검출 ELISAPLUS(Roche Applied Science, 독일 바바리아주의 펜츠베르크시에 소재)이 이용되었다. 3가지 유사한 실험 중 하나가 도시되어 있다.
RXRα 및 RARγ siRNA
RXRα siRNA siGENOME SMARpool(M-003443-02), RARγ siRNA siGENOME SMARpool(M-003439-01), 및 siRNA 비특이적 대조군 IX(D-001206-09-05)는 DHARMACON(콜로라도주의 라파예트시에 소재)으로부터 구입하였다. 웰 당 20mM siRNA의 2.5㎕ 부분이 제조사의 권장 사항에 따라서 올리고펙타민 시약(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 이용해서 12-웰 플레이트 내에서 성장된 세포 내로 형질감염되었다. 형질 감염 2일 후, 세포는 웨스턴 블로팅을 위하여 수확되었다.
면역 블로팅
면역 블로팅을 위하여, 세포 용해물이 SDS 샘플 버퍼 중에서 비등되었고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 용해되어, 나이트로셀룰로스로 전이되었다. 전이 후, 멤브레인은 TBST(10mM Tris-HCl, pH.8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20) 함유 항체 중 5% 밀크 중에서 차단되었다. 멤브레인은 이어서 TBST로 3회 세척되고 나서, 실온에서 TBST 함유 홀스래디쉬 퍼옥사이드(horseradish peroxide)-결합된 항-면역글로불린 중 5% 밀크 중에서 1시간 인큐베이팅되었다.
공면역침강(CoIP) 분석평가
CoIP 분석평가에 대해서, 세포 또는 지시된 발현 벡터로 형질감염된 세포는 용해 버퍼(50mM Tris-HCI, pH 7.4; 150mM NaCl; 20mM EDTA; 1% NP-40; 1mM PMSF; 50㎎/㎖ 류펩틴; 20㎎/㎖ 아프로티닌; 0.1mM Na3VO4; 및 1mM DTT)에 현탁되었다. 세포 추출물은 단백질 A/G 플러스 아가로스 비즈(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주 산타크루즈시에 소재)를 이용한 인큐베이션에 의해 투명하게 되었고, 이어서 적절한 항체 및 단백질 A 혹은 G 플러스 아가로스 비즈 30㎖를 이용해서 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅되었다. 비즈는 이어서 세척되고, 다클론성 혹은 단클론성 항체를 이용해서 SDS-PAGE/면역 블로팅을 수행하기 전에 라엠리 겔(Laemmli gel)-장전 용액 중에서 비등되었다. 면역반응성 산물이 증강된 화학발광 시스템(enhanced chemiluminescence system)(ECL(상표명))(Amersham Biosciences, 영국 아머샴 소재)에 의한 화학발광에 의해 검출되었다.
HeLa-RXRα/1-134 안정적 클론 및 연질 한천 분석평가
RXRα N-말단 단편, 1-134는 pNTAP 벡터(Stratagene, 캘리포니아주의 라호야시에 소재) 내에 클로닝되었다. 얻어진 pNTAP-RXRα/1-134는 HeLa 세포 내로 형질감염되었다. 형질감염 48시간 후, 세포는 2주 동안 400㎎/㎖ G418로 선택되었다. 단일 클론은 픽업되었고, 면역 블로팅에 의해 조사되었다. 대조군 pNTAP 벡터로 형질감염된 HeLa RXR/α1-134 안정적 클론 및 HeLa 세포는 0.5% 베드 한천을 구비한 0.35% 아가로스 및 10% FBS로 보충된 DMEM 내에서 5 × 103 세포/웰(6 웰 플레이트)에 파종되었다. 37℃에서 12일 인큐베이션 후, 콜로니는 1시간 동안 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색되고 계수되었다.
콜로니 형성 분석평가
HeLa RXR/α1-134 안정적 클론 및 대조군 HeLa 세포는 6-웰 플레이트에서 350 세포/웰 파종되었다. 5일 후, 세포는 0.5% 혈청 배지 중에서 설린닥(50μM) 및 K-80003(25μM)으로 3일간 치료되었다. 세포는, PBS로 세척 후, PBS 중 4% 파라포름알데하이드로 20분 동안 고정되었다. 콜로니는 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 30분 동안 염색되었고, 화상이 촬영되었으며 콜로니가 계수되었다.
인간 조직 및 평가
유방 및 간 종양 조직 및 그들의 주위 조직은 암 환자로부터의 수술적 절제에 의해 얻었다. 종양 결절로부터 약 적어도 3 내지 5㎝ 거리에 있던 조직학적 정상 검체는 대응하는 환자로부터 얻었다. 이 연구는 생물의약적 연구 윤리 위원회(Biomedical Research Ethics Committee)에 대한 시아먼 유니버시티 연구소에 의해 승인되었고, 모든 환자는 정보 동의서를 제공하였다.
원발성 간 암종(HCC, n=6) 혹은 유방암(n=6)을 지닌 환자로부터의 조직은 RXRα의 발현을 검출하기 위하여 수집되었다. 면역 블로팅 분석평가를 위하여, 종양 및 그의 주위 조직은 개별적으로 준비되었고, 변성된 RIPA 버퍼에 용해되었다. 용해물은 8% SDS-PAGE 겔 상에 전기영동되고, PVDF 멤브레인 상에 옮겼다. 해당 멤브레인은 순차로 ΔN197 항-RXRα 항체(1:1000)와 함께 4℃에서 하룻밤 그리고 홀스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게트된 항-토끼 IgG 항체(1:5000)와 함께 실온에서 1시간 순차로 인큐베이팅되었고, 증강된 화학발광(ECL(상표명))(Amersham Biosciences, 영국 아머샴 소재)에 의해 검출되었다. 스트립된 블롯은 장입 대조군에 대해서 단클론성 항-GAPDH 항체(1:2000)로 리프로빙되었다. 면역조직화학 분석을 위하여, 조직 단면은 ΔN197 항-RXRα 항체(1:500)를 이용해서 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅되고, 염소 항토끼-특이적 면역글로불린(1:100)을 이용해서 실온에서 30분 동안 검출되었다. 슬라이드는 헤마토자일린으로 대비염색되었다.
공초점 현미경수법
Myc-표지된 RXRα/Δ80 및 플래그-표지된 p85α로 형질감염된 세포는 하룻밤 챔버 슬라이드 상에 파종되었다. 세포는 3.7% 파라포름알데하이드 함유 PBS에 10분 동안 고정되었고, PBS로 2회 세척되었다. 이어서, 세포는 PBS 중 0.1% 트리톤(triton) X-100으로 5분 동안 투과되었다(permeabilized). 고정된 세포는 실온에서 5% BSA 함유 PBS 중에서 30분 동안 사전 인큐베이팅되었다. 세포는 다클론성 항-Myc 항체(1:500 희석) 및 항-플래그 항체(1:500 희석)에 이어서 Cy3-컨쥬게이트된 항토끼 IgG(1:1000, Sigma-Aldrich, 미조리주의 세인트루이스시에 소재) 혹은 FITC-표지된 항-마우스 IgG(1:500, Sigma-Aldrich, 미조리주의 세인트루이스시에 소재)로 염색되었다. 필사본(manuscript)에 표시된 공초점 현미경수법 데이터는 적어도 3개의 유사한 실험을 나타낸다.
세포하 분절
세포하 분절은 최소 변성에서 설명된 바와 같이 수행되었다(Cao, X., et al., Mol Cell Biol 24(22), 9705-9725 (2004); Ohashi, E. et al., Cancer Res 69 (8), 3443-3450 (2009)).
간략하게는, 단백질분해효소 저해제를 지니는 0.5㎖ 저장성(hypotonic) 버퍼(250mM 수크로스, 20mM HEPES-KOH, pH 7.4, 10mM KCl, 10mM MgCl2, 0.5mM EGTA, 1.5mM EDTA, pH 8.0 및 1mM DTT) 중에 현탁된 세포(1×107 세포)는 균질화되었고, 10분 동안 800 x g에서 원심분리되었다. 핵을 함유하는 펠릿이 저장성 버퍼 플러스 단백질분해효소 저해제 중 1.6M 수크로스 200㎕에 재현탁되었고, 동일 버퍼 중 2.0M 수크로스 1㎖ 위에 놓인 후, 4℃에서 90분 동안 150,000 x g에서 원심분리되어 핵 분획을 얻었다. 상청액은 4℃에서 30분 동안 10,000 x g에서 원심분리되어 세포질 분획을 얻었다. 핵 및 세포질 분획은 면역 블로팅 분석을 위하여 단백질분해효소 저해제의 칵테일과 함께 용해 버퍼(10mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 5mM EDTA, pH 8.0) 100㎕ 중에 재현탁되었다.
COX 분석평가
COX 형광 활성 분석평가 키트(Fluorescent Activity Assay Kit)(700200), COX 형광 저해제 선별 분석평가 키트(700100) 및 프로스타글란딘 E2 효소 면역분석평가(EIA) 키트(514010)는 Cayman Chemical(미시간주 앤아버시에 소재)로부터 입수되었다. COX-1 및 COX-2 활성 분석평가는 제조사의 프로토콜에 따라서 수행되었다.
화학적 합성
1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼이 브루커(Bruker) AV 400 분광계(영국 브레멘 소재) 상에 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼은 지시된 용매 중에서 등록되었고, 화학적 이동은 내부 Me4Si에 대한 ppm(parts per million)(δ)으로 표현된다. IR 스펙트럼은 니콜렛 아바타(Nicolet Avatar) 360 FT-IR 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, 메사추세츠주의 월섬시에 소재) 상에 기록되었다. 질량 스펙트럼은 브루커 달톤 에스콰이어(Bruker Dalton Esquire) 3000 플러스(ESI 직접 주입)(영국 브레멘 소재)를 이용해서 기록되었다. 원소 분석은 바리오 RL 분석기(Vario RL analyzer)를 이용해서 수행되었다. 융점은 X-4 마이크로융점 장치 상에서 결정되었고, 교정되지 않는다. 이 연구에서 이용된 6-플루오로-1-인다논 4b는 상업적으로 입수가능하다. 테트라하이드로퓨란은 소듐 벤조페놀 케틸로부터 사용 전에 증류되었다. 다이클로로메탄은 오산화인으로부터 증류되었다. 메탄올은 마그네슘 터닝 및 요오드로부터 증류되었다. 옌타이 실리카겔 팩토리(Yantai 실리카겔 Factory)(중국)로부터의 실리카겔(zhifu, 300-400 매시)이 (달리 언급되지 않는 한) 에틸 아세테이트/석유에터(PE)(60-90℃) 혼합물 또는 다이클로로메탄/메탄올로 용리되는 칼럼 크로마토그래피를 위하여 이용되었다.
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본 발명은 명확화와 이해를 목적으로 일부 상세하게 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일없이 형태와 상세의 각종 변경을 행할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 도면, 표, 특허, 특허 출원, 및 공보는 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 병합된다.

Claims (55)

  1. 하기 구조를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 I]
    Figure 112017031966096-pct00098

    식 중 A는 페닐이고, A는 C2-3 알킬, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸, -CF3, C3-C4 시클로알킬, 및 C4-C5 시클로알킬알킬로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 혹은 두 개의 치환기로 치환되고 있고;
    B는 융합된 페닐이고, B는 플루오로에 의해 치환되어 있고;
    R1은 -(CR5R6)nCOOH;
    R2는 CH3;
    R5 및 R6는 H; 및
    n은 1 또는 2이다.
  2. 하기 구조를 갖는 화학식 II의 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 II]
    Figure 112017031966096-pct00099

    식 중 R1은 CH2COOH 및 CH2CH2COOH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 CH3 이고;
    R3는 4-CH2CH3 및 4-CH(CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  3. 제2항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112017031966096-pct00100
    및
    Figure 112017031966096-pct00101
  4. 제2항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112017031966096-pct00102
    및
    Figure 112017031966096-pct00103

  5. 제2항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112017031966096-pct00104
  6. 하기 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112017031966096-pct00105
  7. 제1항의 화합물 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  8. 제2항의 화합물 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  9. 제6항의 화합물 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
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  11. 삭제
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