JP2017008050A - レチノイド受容体に選択的な経路に関する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】がんを予防又は治療する組成物の提供。
【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬学的に許容される塩或いはエステル及びそれらを含む組成物。

［ＡはＲ3及び０又は１個のＲ4によって置換されたフェニル；ＢはＦ置換された縮合したフェニル；Ｒ1は−（ＣＲ5Ｒ6）nＣＯＯＨ；Ｒ2はＣＨ3；Ｒ3及びＲ4は夫々独立にＣ2〜3アルキル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、−ＣＦ3、Ｃ3〜4シクロアルキル、Ｃ4〜Ｃ5シクロアルキルアルキル；Ｒ5及びＲ6はＨ；ｎは１又は２］
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、その全体が参照により本明細書に
援用される、２００１０年５月６日出願の米国仮特許出願連番第６１／３３２，１２４号
の優先権を主張する。

連邦政府が支援した研究開発に関する記述
本発明は、ＮＩＨより授与されたＣＡ１０９３４５、および米陸軍医学研究物資司令部
（Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｃｏｍｍａｎｄ）より授与されたＷ８１ＸＷＨ−０８−１−０４７８による政府の支援の
もとになされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、レチノイド受容体に選択的な経路に関する方法および組成物の分野にある。

非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の抗がん効果は、十分に受け入れられている（
Ｔｅｇｅｄｅｒ，Ｉ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ １５（１２）、２０５７〜２０７２（２００
１）；Ｋａｓｈｆｉ，Ｋ．およびＲｉｇａｓ，Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ ７０（７）、９６９〜９８６（２００５））。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ
（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）を阻害することで、エイコサノイド産生をブロックする
。ＮＳＡＩＤは、アスピリンの規則的な使用によって結腸がんの発生率が低下するという
発見以来、有望ながん化学予防薬としてかなり注目されたことがある。残念ながら、ＣＯ
Ｘ−２阻害と関連することがわかっている命にかかわる心血管合併症を始めとした、付随
して出現する副作用が、ＮＳＡＩＤの有望な抗がん効果に影を落としている。ＣＯＸ−２
と発癌の関連にもかかわらず、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−１もＣＯＸ−２も含まないがん細
胞においてアポトーシスを誘発しており、他の細胞内ターゲットが存在することが示され
ている（Ｔｅｇｅｄｅｒ，Ｉ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ １５（１２）、２０５７〜２０７２
（２００１）；Ｋａｓｈｆｉ，Ｋ．およびＲｉｇａｓ，Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ ７０（７）、９６９〜９８６（２００５））。

諸実施形態は、レチノイド受容体に選択的な経路に関する方法および組成物に関する。
一部の実施形態では、この経路をターゲットとして、腫瘍微小環境を操作する。一実施形
態では、がん細胞においてアポトーシスを誘発する方法を提供する。たとえば、本明細書
に記載の式（ＩＩ）の化合物などの、がんを予防または治療する組成物を提供することが
できる。一部の実施形態では、本明細書に記載する、化合物Ｋ−８０００３またはＫ−８
０００３類似体を含む組成物を、がん治療に使用する。

本明細書で示すように、スリンダク硫化物（以下では、「スリンダク」または「スルジ
ナク硫化物（Ｓｕｌｄｉｎａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）」）は、臨床的に妥当な濃度で化合物
ＲＸＲαに結合し、ＲＸＲα依存的な形でアポトーシスを誘発しており、ＲＸＲαが、ス
リンダク作用の細胞内ターゲットであることが確認される。同じく本明細書で示すように
、スリンダクは、がん細胞において、肝要な生存キナーゼであるＡＫＴ（プロテインキナ
ーゼＢ）の活性化を強力に阻害する。さらに、Ｎ末端切断型ＲＸＲα（ｔＲＸＲα）は、
がん細胞において、生存シグナル伝達を媒介することも示されている。本明細書で示すよ
うに、スリンダクは、ＴＮＦαと組み合わされると、ＴＮＦαが誘発するｔＲＸＲα／ｐ
８５α相互作用を阻害して、この細胞死受容体によって媒介されるアポトーシス経路の活
性化をもたらす。さらに、本明細書に記載のとおりに設計および合成したスリンダク類似
体Ｋ−８０００３は、ＣＯＸ阻害活性なしに、ＲＸＲαに対する親和性が増大しており、
動物におけるｔＲＸＲα依存的なＡＫＴ活性化およびｔＲＸＲα腫瘍成長の阻害において
、効力が強化されている。

本明細書では、がん治療のためにアポトーシス経路をターゲットとする、スリンダクか
ら誘導されたＲＸＲαリガンドについて記載する。一実施形態では、がん細胞において腫
瘍壊死因子α（ＴＮＦα）活性を上向き調節し、それによって、がん細胞のＡＫＴの抑制
に対する感受性を高める工程と、感受性が高められたがん細胞を化合物と接触させる工程
とを含み、ここで、化合物は、レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）と相互作用することが
わかっており、また化合物は、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）の活性を、シクロオキシ
ゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）経路とは無関係に抑制することがわかっている、がん細胞に
おいてアポトーシスを誘発する方法を提供する。この実施形態の一態様では、ＴＮＦα活
性の上向き調節は、がん細胞への外因性ＴＮＦαの導入を含む。この実施形態の別の態様
では、ＴＮＦα活性の上向き調節は、がん細胞における内因性ＴＮＦαの上向き調節を含
む。この実施形態の別の態様では、がん細胞は、肺がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細
胞、肝臓がん細胞、および結腸がん細胞からなる群から選択されたがん細胞である。この
実施形態の別の態様では、がん細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＺＲ−７５−１細
胞、ＭＣＦ−７細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃａｃｏ２細胞、
およびＳＷ４８０細胞からなる群から選択されたがん細胞である。この実施形態の別の態
様では、候補化合物が、スリンダクの類似体であり、前記類似体は、ＲＸＲαに結合させ
たときＩＣ₅₀がスリンダクよりも小さいこと、およびＣＯＸ−２に結合させたときＩＣ₅₀
がスリンダクよりも大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す。
この実施形態の別の態様では、類似体が、Ｋ−８０００１、Ｋ−８０００２、Ｋ−８００
０３、Ｋ−８０００４、およびＫ−８０００５からなる群から選択された化合物である。
この実施形態の別の態様では、類似体がＫ−８０００３である。

別の実施形態では、がん細胞に候補化合物を供給する工程と、前記候補化合物が、前記
がん細胞におけるＡＫＴの活性の抑制、カスパーゼ８の活性化、ＢＡＸの活性化、ｃＦＬ
ＩＰの阻害、およびＢｉｄの分解からなる群から選択された少なくとも１つの活性の能力
を有するかどうかを判定する工程とを含む、がん細胞においてアポトーシスを誘発する能
力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様では
、前記候補化合物がＡＫＴの活性を抑制し得るかどうかの判定が、前記がん細胞を全トラ
ンス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）または９−シス−ＲＡで前処理することによりＡＫＴを
活性化する工程と、前記候補化合物を投与した後の前記がん細胞におけるＡＫＴのレベル
の変化を測定する工程とを含む。

別の実施形態では、細胞に候補化合物を供給する工程と、前記候補化合物が切断型ＲＸ
Ｒα（ｔＲＸＲα）タンパク質に選択的に結合し得るかどうかを判定する工程とを含む、
細胞においてアポトーシスを誘発する能力について候補化合物をスクリーニングする方法
を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核
酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。

別の実施形態では、細胞に候補化合物を供給する工程と、前記候補化合物がｔＲＸＲα
タンパク質を調節し得るかどうかを判定する工程とを含む、細胞においてアポトーシスを
誘発する能力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の
一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核酸、および小分子からなる群
から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記候補化合物がｔＲＸＲ
αタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前記候補化合物により、ｔＲＸＲαがｐ８
５αタンパク質に結合するのを妨げ得るかどうかの判定を含む。この実施形態の別の態様
では、前記候補化合物がｔＲＸＲαタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前記候補
化合物により、ＲＸＲαがタンパク質修飾を受けるのを妨げ得るかどうかの判定を含む。
この実施形態の別の態様では、前記タンパク質修飾がリン酸化を含む。この実施形態の別
の態様では、前記候補化合物がｔＲＸＲαタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前
記候補化合物により、前記ｔＲＸＲαタンパク質が核から細胞質に移動するのを妨げ得る
かどうかの判定を含む。

別の実施形態では、ｔＲＸＲαを発現する細胞を特定する工程と、前記細胞を候補化合
物と接触させる工程と、前記候補化合物が前記細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを
判定する工程とを含む、細胞においてアポトーシスを誘発する能力について候補化合物を
スクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペ
プチド、タンパク質、核酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。この
実施形態の別の態様では、前記候補化合物が小分子ライブラリーからの化合物である。こ
の実施形態の別の態様では、前記候補化合物がペプチドライブラリーからの化合物である
。この実施形態の別の態様では、前記細胞が乳房または肝臓からのものである。

別の実施形態では、ｔＲＸＲαを発現する腫瘍を特定する工程と、前記腫瘍を候補化合
物と接触させる工程と、前記候補化合物が前記腫瘍の成長を阻害するかどうかを判定する
工程とを含む、腫瘍の成長を阻害する能力について候補化合物をスクリーニングする方法
を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核
酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では
、前記候補化合物が小分子ライブラリーからの化合物である。この実施形態の別の態様で
は、前記候補化合物がペプチドライブラリーからの化合物である。この実施形態の別の態
様では、前記腫瘍が乳房または肝臓の腫瘍である。

別の実施形態では、がんのリスクが一般集団に比べて高まっている対象を特定する工程
と、前記対象に、ＡＫＴの活性を抑制する薬剤を提供する工程とを含み、前記対象の細胞
の表面上で前記薬剤がＲＸＲαに結合する結果、ＡＫＴ活性が抑制される、対象において
がんを予防する方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記薬剤を投与する前に、
前記対象にＴＮＦαを投与し、それによって、前記薬剤によるＡＫＴ阻害に対する、前記
対象のがん細胞の感受性を高める工程をさらに含む。この実施形態の別の態様では、前記
薬剤がスリンダクの類似体である。この実施形態の別の態様では、前記類似体が、Ｋ−８
０００１、Ｋ−８０００２、Ｋ−８０００３、Ｋ−８０００４、およびＫ−８０００５か
らなる群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記類似体がＫ−
８０００３である。

別の実施形態では、がんに罹患している哺乳動物を特定する工程と、前記哺乳動物に、
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）経路とは無関係にＡＫＴの活性を抑制すること
がわかっている薬剤を治療有効量与える工程とを含む、哺乳動物においてがんを治療する
方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記薬剤を投与する前に、前記哺乳動物に
ＴＮＦαを投与し、それによって、前記薬剤によるＡＫＴ阻害に対する、前記哺乳動物の
がん細胞の感受性を高める工程をさらに含む。この実施形態の別の態様では、前記薬剤が
スリンダクの類似体である。この実施形態の別の態様では、前記類似体が、Ｋ−８０００
１、Ｋ−８０００２、Ｋ−８０００３、Ｋ−８０００４、およびＫ−８０００５からなる
群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記類似体がＫ−８００
０３である。この実施形態の別の態様では、前記哺乳動物がヒトである。

別の実施形態では、その必要のある哺乳動物に、式（Ｉ）の化合物［式中、Ａは、アリ
ールまたはヘテロアリールであり、Ａは、Ｒ₃、および０、１または２個のＲ₄によって任
意に置換されていてもよく、Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり、Ｂは、０、１
または２個のＲ₄によって任意に置換されていてもよく、Ｒ₁は、（ＣＲ₅Ｒ₆）_nＣＯＯＨ
であり、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃ₁〜₁₀アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアル
キルアルキル、ハロアルキル、アルキルＯ、アルキルＳ、およびハロアルキルＯからなる
群から選択され、Ｒ₃およびＲ₄は、Ｈ、Ｃ₁〜₁₀アルキル、ハロアルキル、ハロ、ＣＮ、
アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキルＯ、
アルキルＳ、（ＣＲ₄Ｒ₆）_nＣＯＮＲ₇Ｒ₈、ＯＨ、シクロアルキル、シクロアルキルアル
キル、シクロアルキルＯ、およびアルコキシアルキルからなる群から独立に選択され、Ｒ
₅およびＲ₆は、Ｈ、Ｃ₁〜₇アルキル、ＯＨ、アルコキシ、シクロアルキルからなる群から
独立に選択され、または一緒になって、シクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形
成しており、ｎは、０、１、２または３である］を含む組成物を投与する工程を含む、哺
乳動物においてがんを予防または治療する方法を提供する。

別の実施形態では、その必要のある哺乳動物に、式（ＩＩ）の化合物を含む組成物を投
与する工程を含み、前記化合物は、ＲＸＲαに結合させたときＩＣ₅₀がスリンダクよりも
小さいこと、およびＣＯＸ−２に結合させたときＩＣ₅₀がスリンダクよりも大きいことか
らなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す、哺乳動物においてがんを予防また
は治療する方法を提供する。この実施形態の一態様では、Ｒ₁が、ＣＨ₂ＣＯＯＨおよびＣ
Ｈ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｒ₂が、ＣＨ₃およびＨからなる群から選択さ
れ、Ｒ₃が、４−ＳＣＨ₃、４−ＣＨ₃、４−ＣＨ₂ＣＨ₃、および４−ＣＨ（ＣＨ₃）₂から
なる群から選択される。

別の実施形態では、がん細胞に候補化合物を供給する工程と、前記候補化合物が、前記
がん細胞において、ＣＯＸ−２活性を阻害することなくＲＸＲαに結合し得るかどうかを
判定する工程とを含む、がん細胞においてＲＸＲα選択的な形でアポトーシスを誘発する
能力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様で
は、前記候補化合物がＲＸＲαに結合し得るかどうかの判定が、前記がん細胞におけるＲ
ＸＲαのキモトリプシン消化に対する感受性の変化の検出を含む。この実施形態の別の態
様では、前記候補化合物がＲＸＲαに結合し得るかどうかの判定が、前記がん細胞におけ
る示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルの変化の検出を含む。

別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物［式中、Ａは、アリールまたはヘテロアリールで
あり、Ａは、Ｒ₃、および０、１または２個のＲ₄によって任意に置換されていてもよく、
Ｂは、アリールまたはヘテロアリールであり、Ｂは、０、１または２個のＲ₄によって任
意に置換されていてもよく、Ｒ₁は、（ＣＲ₅Ｒ₆）_nＣＯＯＨであり、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃ₁〜₁₀
アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル
、アルキルＯ、アルキルＳ、およびハロアルキルＯからなる群から選択され、Ｒ₃および
Ｒ₄は、Ｈ、Ｃ₁〜₁₀アルキル、ハロアルキル、ハロ、ＣＮ、アリール、ヘテロアリール、
アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキルＯ、アルキルＳ、（ＣＲ₄Ｒ₆）_n
ＣＯＮＲ₇Ｒ₈、ＯＨ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルＯ、お
よびアルコキシアルキルからなる群から独立に選択され、Ｒ₅およびＲ₆は、Ｈ、Ｃ₁〜₇ア
ルキル、ＯＨ、アルコキシ、シクロアルキルからなる群から独立に選択され、または一緒
になって、シクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形成しており、ｎは、０、１、
２または３である］を含む組成物を提供する。

別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物を含み、ＲＸＲαに結合させたときＩＣ₅₀がス
リンダクよりも小さいこと、およびＣＯＸ−２に結合させたときＩＣ₅₀がスリンダクより
も大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す組成物を提供する。

別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＨ₂ＣＯＯＨおよびＣＨ₂Ｃ
Ｈ₂ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｒ₂は、ＣＨ₃およびＨからなる群から選択され、
Ｒ₃は、４−ＳＣＨ₃、４−ＣＨ₃、４−ＣＨ₂ＣＨ₃、および４−ＣＨ（ＣＨ₃）₂からなる
群から選択される］を含む組成物を提供する。この実施形態の一態様では、前記組成物が
、Ｋ−８０００１、Ｋ−８０００２、Ｋ−８０００３、Ｋ−８０００４、およびＫ−８０
００５からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、前記組成物がＫ−８０
００３である。

別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、およびＣｌから
なる群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、およびＦからなる群から選択され、Ｒ₃
は、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、および
ＳＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を提供する。

別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、およびＣｌからな
る群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、およびＦからなる群から選択され、Ｒ₃は
、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、およびＳ
ＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を提供する。

別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ
、ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂−ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂ＣＯ
ＯＣＨ₃、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、
およびＣＨ₂ＮＨ₂からなる群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、Ｎ
Ｈ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＦ₃、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、および
ＯＣＨ₂ＣＨ₃からなる群から選択され、Ｒ₃は、Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ₂、ＣＣＨ、Ｃ（ＣＨ₃）₃
、ＣＦ₃、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＮ、ＮＨＣＯＣＨ₃、
、および
からなる群から選択され、Ｒ₄は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＯＣ
Ｈ₃、ＯＣＨＣＨ₃、ＮＨ₂、およびＮＨＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を
提供する。

別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、およびＣｌから
なる群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、およびＦからなる群から選択され、Ｒ₃
は、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、および
ＳＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を提供する。

別の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、およびＣｌからな
る群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、およびＦからなる群から選択され、Ｒ₃は
、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、およびＳ
ＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を提供する。

別の実施形態では、式（Ｖ）の化合物［式中、Ｒ₁は、ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ
、ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂−ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂ＣＯ
ＯＣＨ₃、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、
およびＣＨ₂ＮＨ₂からなる群から選択され、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、Ｎ
Ｈ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＦ₃、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、および
ＯＣＨ₂ＣＨ₃からなる群から選択され、Ｒ₃は、Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ₂、ＣＣＨ、Ｃ（ＣＨ₃）₃
、ＣＦ₃、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＮ、ＮＨＣＯＣＨ₃、
、および
からなる群から選択され、Ｒ₄は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＯＣ
Ｈ₃、ＯＣＨＣＨ₃、ＮＨ₂、およびＮＨＣＨ₃からなる群から選択される］を含む組成物を
提供する。

別の実施形態では、スリンダクの類似体を含み、前記類似体は、ＲＸＲαに結合させた
ときＩＣ₅₀がスリンダクよりも小さいこと、およびＣＯＸ−２に結合させたときＩＣ₅₀が
スリンダクよりも大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す組成
物を提供する。

別の実施形態では、３−（４−フルオロフェニル）−２−メチルアクリル酸；３−（４
−フルオロフェニル）−２−メチルプロパン酸、６−フルオロ−２−メチル−２，３−ジ
ヒドロインデン−１−オン；エチル２−（６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−インデン−
１−イル）アセテート；（Ｚ）−２−（３−（４−（メチルチオ）ベンジリデン）−６−
フルオロ−２−メチル−３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸；（Ｚ）−２−（３−（４−メ
チルベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸；（
Ｚ）−２−（３−（４−エチルベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−イン
デン−１−イル）酢酸；（Ｚ）−２−（３−（４−イソ−プロピルベンジリデン）−６−
フルオロ−２−メチル−３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸；エチル２−（６−フルオロ−
３Ｈ−インデン−１−イル）アセテート；（Ｅ）−２−（３−（４−（メチルチオ）ベン
ジリデン）−６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸；スピロ（ジヒドロ−２（
３Ｈ）フラノン−５−１’（２’Ｈ）（３’Ｈ）−６−フルオロ−インダン；メチル３−
（６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）プロパノエート；（Ｅ）−メチル３−（３
−（４−（メチルチオ）ベンジリデン）−６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）プ
ロパノエート；Ｋ−８０００３類似体第１号；Ｋ−８０００３類似体第２号；Ｋ−８００
０３類似体第３号；Ｋ−８０００３類似体第４号；Ｋ−８０００３類似体第５号；Ｋ−８
０００３類似体第６号；Ｋ−８０００３類似体第７号；Ｋ−８０００３類似体第８号；Ｋ
−８０００３類似体第９号；Ｋ−８０００３類似体第１０号；Ｋ−８０００３類似体第１
１号；Ｋ−８０００３類似体第１２号；Ｋ−８０００３類似体第１３号；Ｋ−８０００３
類似体第１４号；Ｋ−８０００３類似体第１５号；Ｋ−８０００３類似体第１６号；Ｋ−
８０００３類似体第１７号；Ｋ−８０００３類似体第１８号；Ｋ−８０００３類似体第１
９号；Ｋ−８０００３類似体第２０号；Ｋ−８０００３類似体第２１号；Ｋ−８０００３
類似体第２２号；Ｋ−８０００３類似体第２３号；Ｋ−８０００３類似体第２４号；Ｋ−
８０００３類似体第２５号；Ｋ−８０００３類似体第２６号；Ｋ−８０００３類似体第２
７号；Ｋ−８０００３類似体第２８号；Ｋ−８０００３類似体第２９号；Ｋ−８０００３
類似体第３０号；Ｋ−８０００３類似体第３１号；Ｋ−８０００３類似体第３２号；Ｋ−
８０００３類似体第３３号；およびＫ−８０００３類似体第３４号からなる群から選択さ
れた化合物を含む組成物を提供する。

図１は、ＲＸＲαに結合するスリンダクを示す図およびグラフである。（ａ）［³Ｈ］９−シス−ＲＡまたは未標識９−シス−ＲＡと共にインキュベートしたＲＸＲα ＬＢＤタンパク質に結合するスリンダク。（ｂ）ＨＰＬＣ分析によって明らかにした、ＲＸＲα、Ｎｕｒ７７、またはＲＡＲβを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞においてＲＸＲαに結合するスリンダク。（ｃ）スリンダクによる、ＲＸＲα ＬＢＤまたはＧＳＴ−ＲＸＲαのキモトリプシンに対する感受性の変更。（ｄ）ＲＸＲα ＬＢＤまたはＮｕｒ７７タンパク質の非存在下および存在下での、スリンダクの¹⁹Ｆ ＮＭＲスペクトルの比較。スリンダクは、（ＴＲＥｐａｌ）２−ｔｋ−ＣＡＴ活性（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５８、５８７〜５９１（１９９２ａ））（ｅ）、またはβＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ活性（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５、４４１〜４４６（１９９２ｂ））（ｆ）によって求められる、ＲＸＲαホモ二量体およびヘテロ二量体のトランス活性化を阻害する。 図２は、ＲＸＲα依存的なアポトーシスおよびＢａｘ活性化を誘発するスリンダクを示す図およびグラフである。ＤＡＰＩ染色（ａ）、ＰＡＲＰ切断（ｂ）、およびＤＮＡ断片化（ｃ）によって分析した、Ｆ９細胞またはＲＸＲα欠如Ｆ９細胞（Ｆ９ ＲＸＲα^-/-）におけるスリンダクのアポトーシス効果。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡは、スリンダクによるアポトーシス誘発を阻害する。対照またはＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移入したＨ４６０肺がん細胞（ｄ）をスリンダクで処理し、アポトーシスについてＤＡＰＩ染色によって分析したもの（ｅ）。（ｆ）ＲＸＲαの形質移入によって、スリンダクのアポトーシス効果が強化される。ＧＦＰ−ＲＸＲαを形質移入したＣＶ−１細胞をスリンダクで処理し、ＤＡＰＩ染色によって分析した。（ｇ）ＲＸＲα ＬＢＰの崩壊によって、スリンダクのアポトーシス効果が損なわれる。ＧＦＰ−ＲＸＲαまたはＧＦＰ−ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅを形質移入したＣＶ−１細胞を、スリンダクで処理し、ＤＡＰＩ染色によって分析した。受容体を形質移入した細胞において記録したアポトーシス。アポトーシス誘発におけるＢａｘの役割。ＨＣＴ１１６細胞またはＢａｘ欠如ＨＣＴ１１６細胞（Ｂａｘ^-/-）をスリンダクで処理し、またはこれなしで処理した。ＰＡＲＰ切断（ｈ）およびＤＡＰＩ染色（ｉ）によって明らかにしたアポトーシス。（ｊ、ｋ）ＲＸＲα ｓｉＲＮＡは、スリンダクが誘発するＢａｘ活性化を阻害する。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによってＨＣＴ１１６細胞中のＲＸＲαがノックダウンされることが、免疫ブロット法によって明らかになった。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡもしくは対照ｓｉＲＮＡを形質移入し、またはこれなしで形質移入したＨＣＴ１１６細胞を、スリンダクで処理し、Ｂａｘオリゴマー化（ｊ）について、およびＢａｘ／Δ２１、Ｂａｘ／６Ａ７、または抗Ｈｓｐ６０抗体を使用する免疫染色／共焦点顕微鏡観察によるＢａｘ立体構造変化およびミトコンドリア標的化（ｋ）について分析した。 図３は、ＴＮＦαが誘発するＡＫＴ活性化およびｔＲＸＲα−ｐ８５α相互作用を阻害するスリンダクを示す図である。（ａ）スリンダクによるＡＫＴ活性化の阻害。一晩栄養欠乏させ、スリンダクで処理したＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＨｅｐＧ２、ＺＲ７５−１、ＭＣＦ−７、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＨａＣａｔ、およびＲＡＷ２６４．７細胞を、ＡＫＴ活性化について免疫ブロット法で分析した。（ｂ）ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによる基礎ＡＫＴ活性化の阻害。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移入したＨｅｐＧ２細胞をスリンダクで処理した。ＡＫＴ活性化およびＲＸＲα発現を免疫ブロット法によって分析した。（ｃ）ＴＮＦαが誘発するＡＫＴ活性化の、スリンダクおよびＲＸＲα ｓｉＲＮＡによる阻害。ＲＸＲαまたは対照ｓｉＲＮＡを形質移入したＡ５４９肺がん細胞をスリンダクで前処理し、ＴＮＦαに曝した。ＡＫＴ活性化およびＲＸＲα発現を免疫ブロット法によって分析した。（ｄ）ＴＮＦαとスリンダクとによる、ＡＫＴ活性化の相乗的な阻害。ＺＲ−７５−１およびＰＣ３細胞をスリンダクで前処理し、ＴＮＦαに曝した。ＡＫＴ活性化を免疫ブロット法によって分析した。（ｅ）免疫共沈降および免疫ブロット法アッセイで使用した抗ＲＸＲα抗体の概略図（上）。Ｄ２０抗体は、Ｎ末端側Ａ／Ｂドメイン中のアミノ酸２〜２１を認識したが、ΔＮ１９７抗体は、Ｃ末端側Ｅ／Ｆドメインを認識する（下）。約４４ｋＤαのＲＸＲ切断型タンパク質も示す。（ｆ）様々ながん細胞系におけるｔＲＸＲαの発現。９−シス−ＲＡで処理し、またはこれなしで処理したＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＺＲ７５−１、ＭＣＦ−７、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＨｅｐＧ２、ＨａＣａｔ、Ｃａｃｏ２、ＭＥＦ、ＲＡＷ、およびＢＨＫ細胞系を、ΔＮ１９７ ＲＸＲα抗体を使用する免疫ブロット法によって分析した。 図４は、ＡＫＴ活性化および足場非依存的細胞増殖におけるｔＲＸＲαの役割を示す図およびグラフである。（ａ）ｔＲＸＲαの細胞密度依存的な産生およびＡＫＴ活性化。異なる細胞密度で播いたＭＥＦを、ΔＮ１９７抗体を使用してのＲＸＲα発現およびＡＫＴ活性化について、免疫ブロット法で分析した。（ｂ）ＭＥＦにおける内因性ＲＸＲαの細胞内局在を、抗ＲＸＲα（ΔＮ１９７）を使用した免疫染色後の共焦点顕微鏡観察によって可視化した。細胞をＤＡＰＩで染色して、核も可視化した。（ｃ）ＲＸＲα／１〜１３４の安定した発現は、ＲＸＲα切断およびＡＫＴ活性化を誘発する。ＨｅＬａ細胞またはＲＸＲα／１〜１３４を安定して発現するＨｅＬａ細胞を９シス−ＲＡで処理し、ＡＫＴ活性化およびＲＸＲαの発現について分析した。（ｄ）軟寒天におけるＨｅＬａ／ＲＸＲα／１〜１３４細胞およびＨｅＬａ細胞の増殖。（ｅ）スリンダクは、ＨｅＬａ／ＲＸＲα／１〜１３４細胞のクローン原性生存を阻害する。（ｆ）乳房（６のうち５）または肝臓（６のうち４）のヒト腫瘍組織におけるｔＲＸＲαの産生を、腫瘍周囲および正常組織と比較したもの。（ｇ）ΔＮ１９７抗体によって免疫染色した肝臓腫瘍標本におけるＲＸＲαの細胞質局在。Ｔ：腫瘍組織、Ｓ：腫瘍周囲組織。 図５は、ＴＮＦαによるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化およびがん細胞増殖におけるＮ末端切断型ＲＸＲαの役割を示す図およびグラフである。（ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ−ｐ８５αおよび、Ｍｙｃエピトープでタグ付けしたＲＸＲα、ＲＸＲα／Δ８０、またはＲＸＲα／Δ１００を形質移入し、ＴＮＦαで処理し、抗Ｆｌａｇ抗体を使用する免疫共沈降によって分析した。（ｂ）ＲＸＲαのＮ末端側Ａ／Ｂドメインがｐ８５αと相互作用する。Ｆｌａｇ−ｐ８５αを、ＧＦＰ−ＲＸＲα−１〜１３４およびＧＦＰ−ＲＸＲα−２２４〜４６２と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時形質移入し、その相互作用について、抗Ｆｌａｇ抗体を使用する免疫共沈降によって分析した。（ｃ）ＲＸＲα／Δ８０は、強力なＡＫＴ活性化因子である。免疫ブロット法によって判定される、ＲＸＲα／Δ８０またはＲＸＲα／Δ１００を形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ａ５４９、およびＭＣＦ−７細胞のＡＫＴ活性化。（ｄ）ＲＸＲα／Δ８０およびｐ８５αの細胞質同時局在。Ｍｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０およびｐ８５αを、ＰＣ３およびＺＲ−７５−１細胞系に同時形質移入し、抗Ｍｙｃおよび抗ｐ８５α抗体で免疫染色し、これらの細胞内局在を共焦点顕微鏡観察によって明らかにした。（ｅ）ＲＸＲα／Δ８０免疫沈降物によるＰＩ３Ｋの活性化。Ｆｌａｇ−ｐ８５αおよびＭｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０を形質移入したＡ５４９細胞を、ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理し、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させ、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＰＩ３Ｋアッセイにかけた。（ｆ）ＲＸＲα／Δ８０の安定した発現。ＧＦＰ−ＲＸＲα／Δ８０または対照ＧＦＰベクターを安定的に形質移入した細胞を、免疫ブロット法によって分析した。（ｇ）ＲＸＲα／Δ８０は、がん細胞のクローン原性生存を促進する。（ｈ、ｉ）ＲＸＲα／Δ８０は、ヌードマウスにおいてがん細胞増殖を促進する。 図６は、ＴＮＦαが誘導する外因性アポトーシス経路の、スリンダクによる活性化を示す図である。（ａ）スリンダク／ＴＮＦαの組合せによるアポトーシスの相乗的な誘発、およびＲＸＲαリガンドによるその阻害。１％ＦＢＳを含有する培地で培養したＨｅｐＧ２細胞をＳＲ１１２３７、次いでＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した。（ｂ）スリンダク／ＴＮＦαが誘発するカスパーゼ８切断の、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによる阻害。対照またはＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移入したＨｅｐＧ２細胞を、ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した。スリンダク／ＴＮＦαが誘発するＰＡＲＰ切断の、カスパーゼ８阻害剤（ｃ）およびｓｉＲＮＡ（ｄ）による阻害。対照またはカスパーゼ８ ｓｉＲＮＡを形質移入し、またはＺＩＥＴＤ−ｆｍｋで前処理したＨｅｐＧ２細胞を、ＴＮＦαおよびスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した。（ｅ）スリンダクおよびＴＮＦαによるＢａｘの活性化。ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理したＨｅｐＧ２細胞を、Ｂａｘ／６Ａ７抗体で免疫染色した。（ｆ）スリンダク／ＴＮＦαが誘発するＰＡＲＰ切断の、ＡＫＴによる調節。ＣＡ−ＡＫＴまたはＤＮ−ＡＫＴを形質移入したＰＣ３細胞を、ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した。スリンダクおよびＴＮＦαによる、カスパーゼ８（ｇ）およびＢａｘ（ｈ）の活性化。ＣＡ−ＡＫＴを形質移入したＨｅｐＧ２細胞を、ＴＮＦαおよびスリンダクで処理し、抗切断型カスパーゼ８またはＢａｘ／６Ａ７抗体で免疫染色した。（ｉ）ＴＮＦαおよびスリンダクによるｃ−ＦＬＩＰ発現の調節。ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理した細胞を、免疫ブロット法によって分析した。 図７は、ＲＸＲα選択的スリンダク類似体の設計、合成、および評価を示す図およびグラフである。（ａ）９−シス−ＲＡに関しての、スリンダク硫化物のＲＸＲα ＬＢＰへのドッキング。リガンドから４（Å）内にある側鎖を灰色で示す。（ｂ）ドッキングしたスリンダク硫化物の配向および位置の、９−シス−ＲＡ、ＤＨＡ、およびＢＭＳ６４９の結晶構造との比較。（ｃ）スリンダク類似体による、ＲＸＲα結合ならびにＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性の阻害。ＲＸＲα結合は、競合リガンド結合アッセイによって測定した。（ｄ）スリンダクおよび類似体による、ＰＧＥ２産生の阻害。ＴＮＦαで刺激したＡ５４９細胞をスリンダクまたは類似体で処理した。（ｅ）Ｋ−８０００３の¹⁹Ｆ ＮＭＲスペクトルの、ＲＸＲα ＬＢＤ非存在下と存在下とでの比較。 図８は、Ｋ−８０００３がＲＸＲα依存的なＡＫＴ活性化の強力な阻害剤であることを示す図およびグラフである。（ａ）ＴＮＦα存在下でのスリンダクまたはＫ−８０００３によるＡＫＴ活性化の阻害。（ｂ）Ｋ−８０００３による、ＡＫＴ活性化のＲＸＲα依存的阻害。ＲＸＲαまたはＲＡＲγ ｓｉＲＮＡを形質移入したＰＣ３細胞を、Ｋ−８０００３で前処理した後、ＴＮＦαに曝した（ｐＲＸＲα：リン酸化型ＲＸＲα）。（ｃ）スリンダクおよびＫ−８０００３による、ＲＸＲα／Δ８０のｐ８５αとの相互作用の阻害。Ａ５４９細胞にＦｌａｇ−ｐ８５αおよびＭｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０を形質移入し、スリンダクまたはＫ−８０００３で処理した後、ＴＮＦαに曝し、抗Ｆｌａｇ抗体を使用する免疫共沈降によって分析した。（ｄ）ＴＮＦα存在下でのスリンダクまたはＫ−８０００３によるＰＡＲＰ切断の誘発。ＴＮＦαおよび／またはスリンダクもしくはＫ−８０００３で処理したＺＲ−７５−１細胞を、免疫ブロット法によって分析した。（ｅ）ＴＮＦα存在下でのＫ−８０００３によるカスパーゼ８の活性化。ＴＮＦαおよび／またはＫ−８０００３で処理した細胞を、免疫ブロット法によって分析した。（ｆ）スリンダクおよびＫ−８０００３による、ＲＸＲα／１〜１３４細胞およびＲＸＲα／Δ８０安定クローンのクローン原性生存の阻害。（ｇ）スリンダクおよびＫ−８０００３による、動物におけるＲＸＲα／Δ８０腫瘍成長の阻害。 図９Ａ〜Ｃは、図１に関連し、スリンダクのＲＸＲαへの結合およびＲＸＲαトランス活性化に対するその効果を示すグラフである。 図１０は、図１Ｂに関連し、ＨＰＬＣ分析によって求めた、スリンダクのＲＸＲαタンパク質への結合を示すグラフである。 図１１Ａ〜Ｄは、図２Ｇに関連し、ＲＸＲα突然変異体であるＲＸＲ／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅの、スリンダクのアポトーシス効果を媒介する能力が低下したことを示すグラフである。 図１２Ａ〜Ｅは、図３に関連し、スリンダクがＡＫＴ活性化およびｔＲＸＲα−ｐ８５α相互作用に与える阻害効果を示す図である。 図１３は、図４Ｂおよび図５Ｄに関連し、細胞分画アッセイを使用してｔＲＸＲαの細胞質局在を示す図である。 図１４は、図４に関連し、ＲＸＲα／１〜１３４の安定した発現による内因性ｔＲＸＲαの産生を示す図である。 図１５Ａ〜Ｂは、図５Ｅに関連し、ｔＲＸＲαがＡ５４９肺がん細胞から免疫沈降することを示す図である。 図１６Ａ〜Ｄは、図６に関連し、スリンダクが誘発するアポトーシスが、細胞死受容体依存的な外因性アポトーシス経路によって媒介されることを示す図である。 図１７Ａ〜Ｂは、図６に関連し、ＨｅｐＧ２およびＨＣＴ１１６の両方のがん細胞系における、スリンダク／ＴＮＦαの組合せによるカスパーゼ８の相乗的な活性化、およびＡＫＴの活性化が、スリンダク／ＴＮＦαの組合せによって誘発されるアポトーシスを阻害することを示す図である。 図１８Ａ〜Ｂは、図７に関連し、本明細書に記載のＲＸＲα選択的なスリンダク類似体の一部の設計を示す図である。 図１９は、図８に関連し、スリンダク類似体Ｋ−８０００３の合成を示す図である。 図２０は、図８に関連し、Ｋ−８０００３が、全トランス型レチノイン酸によるＡＫＴ活性化の阻害において、スリンダクよりも有効であることを示す図である。 図２１Ａ〜Ｃは、Ｋ−８０００３の経口投与がマウスにおけるＭＣＦ−７乳房腫瘍成長に与える成長阻害効果を示すグラフである。（Ａ）経口Ｋ−８０００３または対照で処置したマウスにおける経時的な乳房腫瘍体積。（Ｂ）対照で処置したマウスからの乳房腫瘍組織。（Ｃ）Ｋ−８０００３で処置したマウスからの乳房腫瘍組織。 図２２Ａ〜Ｃは、Ｋ−８０００３の前臨床研究について、毒性およびＰＫプロファイルを示す表およびグラフである。（Ａ）毒性データ。（Ｂ）生物学的利用能データ。（Ｃ）薬物動態データ。

本明細書で開示する種々の実施形態は、一般に、レチノイド受容体に選択的な経路に関
する組成物および方法を対象とする。この経路を本明細書に記載のとおりに操作して、が
んを治療し、またはがんになるリスクを低減することができる。

本明細書で示すように、ｔＲＸＲαは、細胞質中に構成性に存在し、ｐ８５αと相互作
用し、ＡＫＴを活性化し、足場非依存的な細胞の増殖をもたらす。これらの知見から、が
ん細胞におけるｔＲＸＲαを媒介とする生存経路が明かになり、ＲＸＲαおよびそのリガ
ンドのがんにおける役割の新たな見通しが示されている。ＲＸＲαのタンパク質プロセシ
ングによるこのようなＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ生存経路の活性化は、切断型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ）
によるアポトーシス経路の活性化および切断型Ｎｏｔｃｈタンパク質によるＮｏｔｃｈ経
路の活性化に類似している。興味深いことに、ＢｉｄおよびＮｏｔｃｈの切断も、ＲＸＲ
α切断での影響と同様に、その細胞内局在を変化させる。ＲＸＲαがスリンダク作用の細
胞内ターゲットとして働くという発見は、本明細書に記載の、ＡＫＴ活性を抑制するＲＸ
Ｒα選択的なスリンダク誘導体を設計する刺激となった。たとえば、本明細書では、ＲＸ
Ｒαに対する親和性がより高く、ＡＫＴの阻害において効力が強化されているが、ＣＯＸ
阻害活性は欠如している、スリンダクから導いたＲＸＲαリガンドのＫ−８０００３の設
計および合成を示す。加えて、本明細書に記載するように、内因性ＴＮＦαの上向き調節
および／または外因性ＴＮＦαの導入は、反応性を得るためのがん細胞の予備刺激におい
て有用となり得る。

一部の実施形態では、組成物は、式Ｉを有するコア構造を含む。

一部の実施形態では、Ａは、アリールまたはヘテロアリールであり、任意に、Ｒ₃、お
よび０、１または２個のＲ₄で置換されていてもよい。一部の実施形態では、Ｂは、アリ
ールまたはヘテロアリールであり、０、１または２個のＲ₄によって任意に置換されてい
てもよい。一部の実施形態では、Ｒ₁は、（ＣＲ₅Ｒ₆）_nＣＯＯＨである。一部の実施形態
では、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃ₁〜₁₀アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキ
ルアルキル、ハロアルキル、アルキルＯ、アルキルＳ、ハロアルキルＯ、ＮＨ₂、および
アルキルＮからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₃およびＲ₄は、Ｈ、Ｃ₁
〜₁₀アルキル、ハロアルキル、ハロ、ＣＮ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキ
ル、ヘテロアリールアルキル、アルキルＯ、アルキルＳ、（ＣＲ₄Ｒ₆）_nＣＯＮＲ₇Ｒ₈、
ＯＨ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルＯ、およびアルコキシ
アルキルからなる群から独立に選択される。一部の実施形態では、Ｒ₅およびＲ₆は、Ｈ、
Ｃ₁〜₇アルキル、ＯＨ、アルコキシ、およびシクロアルキルからなる群から独立に選択さ
れ、または、一緒になってシクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形成する。一部
の実施形態では、ｎは、０、１、２および３からなる群から選択される。

一部の実施形態では、組成物は、式ＩＩ：
を有するコア構造を含む。

一部の実施形態では、Ｒ₁は、ＣＨ₂ＣＯＯＨおよびＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨからなる群から
選択される。一部の実施形態では、Ｒ₂は、ＣＨ₃およびＨからなる群から選択される。一
部の実施形態では、Ｒ₃は、４−ＳＣＨ₃、４−ＣＨ₃、４−ＣＨ₂ＣＨ₃、および４−ＣＨ
（ＣＨ₃）₂からなる群から選択される。

一部の実施形態では、組成物は、式ＩＩＩ：
を有するコア構造を含む。

一部の実施形態では、ｎ＝２である。一部の実施形態では、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、および
Ｃｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、および
Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₃は、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（
ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、およびＳＣＨ₃からなる群から選択され
る。一部の実施形態では、Ｂおよび／またはＤは、ヘテロ環である（たとえば、ヘテロ原
子に限定される）。

一部の実施形態では、式ＩＩＩのＣＯＯＨが、テトラゾールで置き換えられる。たとえ
ば、一部の実施形態では、組成物は、式ＩＶを有するコア構造を含む。

一部の実施形態では、ｎ＝２である。一部の実施形態では、Ｒ₁は、ＣＨ₃、Ｆ、および
Ｃｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₂は、Ｈ、ＣＨ₃、Ｃｌ、および
Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₃は、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（
ＣＨ₃）₂、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂Ｃｌ、ＯＣＨ₃、およびＳＣＨ₃からなる群から選択され
る。一部の実施形態では、Ｂおよび／またはＤは、ヘテロ環である（たとえば、ヘテロ原
子に限定される）。

一部の実施形態では、組成物は、式Ｖを有するコア構造を含む。

一部の実施形態では、Ｒ₁は、ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、
ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂−ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂ＣＯＯＣＨ₃、ＣＨ₃、ＣＨ₂
ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、およびＣＨ₂ＮＨ₂からな
る群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₂は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、Ｎ
Ｈ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＦ₃、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、および
ＯＣＨ₂ＣＨ₃からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ₃は、Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ₂
、ＣＣＨ、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＦ₃、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、Ｃ
Ｎ、ＮＨＣＯＣＨ₃、
、および
からなる群から選択される。

一部の実施形態では、Ｒ₄は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＯＣＨ
₃、ＯＣＨＣＨ₃、ＮＨ₂、およびＮＨＣＨ₃からなる群から選択される。さらに、Ｒ₁〜Ｒ₄
は、当業者に知られている任意の他の適切な基であってもよい。

一部の実施形態では、組成物は、式ＶＩを有するコア構造を含み、
Ｒ₁は、ＣＯＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、ＣＨ₂−テトラゾール、Ｃ
Ｈ₂−ＣＨ₂−テトラゾール、ＣＨ₂ＣＯＯＣＨ₃、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＯＮＨ
ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、およびＣＨ₂ＮＨ₂からなる群から選択される。

一部の実施形態では、組成物は、式ＶＩＩを有するコア構造を含み、
Ｒ₂は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＦ₃、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂
ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、およびＯＣＨ₂ＣＨ₃からなる群から選択される。

一部の実施形態では、組成物は、式ＶＩＩＩを有するコア構造を含み、
Ｒ₃は、Ｈ、ＣＨ＝ＣＨ₂、ＣＣＨ、Ｃ（ＣＨ₃）₃、ＣＦ₃、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃
、ＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、ＣＮ、ＮＨＣＯＣＨ₃、
、および
からなる群から選択される。

一部の実施形態では、組成物は、式ＩＸを有するコア構造を含み、
Ｒ₄は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＯＣＨ₃、ＯＣＨＣＨ₃、ＮＨ₂
、およびＮＨＣＨ₃からなる群から選択される。

本発明の一部の実施形態は、実施例１６に示し、かつ／または本明細書で別な形で提供
する化合物の類似体および誘導体を含めて、式Ｉ〜ＩＸのいずれかのコア構造を有する、
化合物の類似体をさらに提供する。既知の方法を使用して、本明細書に記載の化合物に様
々な変更を加えて、類似体を生成してもよいことが理解される。さらに、種々のコア構造
のＲ基は、様々に変えてよいことも理解される。また、本明細書で開示する化合物の類似
体は、既知の化学合成法を使用し、構造活性相関（ＳＡＲ）研究を実施して、当業者が容
易に調製できることも理解される。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の方法を使
用して、様々な類似体の活性を容易に判定することができる。

一部の実施形態では、ＲＸＲαに結合した類似体のＩＣ₅₀は、ＲＸＲαに結合したとき
のスリンダクのＩＣ₅₀の約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５
％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５
％、９０％、９５％、または９９％である。

一部の実施形態では、ＣＯＸ−１に結合した類似体のＩＣ₅₀は、ＣＯＸ−１に結合した
ときのスリンダクのＩＣ₅₀より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５
％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５
％、９０％、９５％、または１００％大きい。一部の実施形態では、ＣＯＸ−１に結合し
た類似体のＩＣ₅₀は、ＣＯＸ−１に結合したときのスリンダクのＩＣ₅₀の約１．５倍、２
倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０
倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍である。

一部の実施形態では、ＣＯＸ−２に結合した類似体のＩＣ₅₀は、ＣＯＸ−２に結合した
ときのスリンダクのＩＣ₅₀より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５
％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５
％、９０％、９５％、または１００％大きい。一部の実施形態では、ＣＯＸ−２に結合し
た類似体のＩＣ₅₀は、ＣＯＸ−２に結合したときのスリンダクのＩＣ₅₀の約１．５倍、２
倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０
倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍である。

以下の定義は、本明細書で本発明を説明するのに使用する種々の用語の意味および範囲
を例示および規定するために記載する。

本明細書では、「アルコキシ」とは、親分子部分に酸素原子を介して結合しているアル
キル基を指す。

本明細書では、「アルコキシアルキル」とは、１個、２個、または３個のアルコキシ基
で置換されているアルキル基を指す。

本明細書では、「アルキル」とは、１個〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の
飽和炭化水素から誘導された基を指す。

本明細書では、「アリール」とは、フェニル基、または環の一方もしくは両方がフェニ
ル基である二環式縮合環系を指す。二環式縮合環系は、４〜６員の芳香環または非芳香族
炭素環に縮合したフェニル基からなる。本開示のアリール基は、その基の任意の置換可能
な炭素原子を介して親分子部分に結合することができる。アリール基の典型例として、そ
れに限らないが、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、およびテトラヒドロナ
フチルが挙げられる。

本明細書では、「アリールアルキル」とは、１個、２個、または３個のアリール基で置
換されているアルキル基を指す。

本明細書では、「シクロアルキル」とは、３個〜１０個の炭素原子および０個のヘテロ
原子を有する単環式または二環式の飽和炭化水素環系を指す。シクロアルキル基の典型例
として、それに限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、およびシクロペンチルが挙
げられる。

本明細書では、「シクロアルキルアルキル」とは、１個、２個、または３個のシクロア
ルキル基で置換されているアルキル基を指す。

本明細書では、「ハロ」および「ハロゲン」とは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを指す。

本明細書では、「ハロアルキル」とは、１個、２個、３個、または４個のハロゲン原子
で置換されているアルキル基を指す。

本明細書では、「ヘテロシクリル」とは、窒素、酸素、および硫黄から独立に選択され
た１個、２個、または３個のヘテロ原子を含む５員、６員、または７員環を指す。５員環
は、０個〜２個の二重結合を有し、６員環および７員環は、０個〜３個の二重結合を有す
る。用語「ヘテロシクリル」は、ヘテロシクリル環が、４〜６員の芳香環もしくは非芳香
族炭素環または別の単環式ヘテロシクリル基に縮合している二環式の基も包含する。本開
示のヘテロシクリル基は、その基の炭素原子または窒素原子を介して親分子部分に結合す
ることができる。ヘテロシクリル基の例として、それらに限らないが、ベンゾチエニル、
フリル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル
、モルホリニル、オキサゾリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピリジニル
、ピロリジニル、ピロロピリジニル、ピロリル、チアゾリル、チエニル、およびチオモル
ホリニルが挙げられる。

本明細書では、「薬学的にまたは治療上許容される賦形剤」とは、活性成分の生物学的活
性の有効性の妨げとならず、宿主または患者に対する毒性が最小限に抑えられている賦形剤
媒質を指す。

本明細書では、「立体異性体」とは、分子量、化学組成、および構造は別のものと同じ
であるが、原子が異なって集まっている化学化合物を指す。すなわち、特定の同一の化学
的部分が、空間において異なる配向をとっており、したがって、純粋であるとき、偏光面
を回転させる能力を有する。しかし、一部の純粋な立体異性体は、旋光が、本計装では検
出不可能なほどかすかである場合がある。本明細書に記載の化合物は、１個または複数の
不斉炭素原子を有し、したがって種々の立体異性体を含むことがある。すべての立体異性
体が本発明の範囲内に含まれる。

本明細書では、ＡＫＴの活性を「抑制する」とは、ＡＫＴ活性の予防、寛解、消失、ま
たは他のいずれかの低減を指す。たとえば、ＡＫＴの活性を抑制することとして、ＡＫＴ
の基礎レベルを低下させ、またはＡＫＴ活性化を阻害することが挙げられる。

本明細書では、「治療上または薬学的に有効な量」とは、開示する組成物に適用すると
き、所望の生物学的成果を引き出すのに十分な組成物の量を指す。その成果は、疾患の徴
候、症状、原因の予防、緩和、もしくは寛解、または所望される他のいずれかの生体系の
変化でよい。たとえば、成果には、がん性細胞増殖の減少および／または逆転を含めるこ
とができる。

本明細書では、用語「阻害剤」は、「アンタゴニスト」を表すのに区別なく使用する。
これらの用語は両方とも、特定の酵素活性を低下させ、または前記酵素の基質の活性もし
くは機能と競合する能力を有する組成物を規定する。

本明細書では、「がん」および「がん性」とは、哺乳動物における任意の悪性の細胞増
殖を指す。

本明細書で開示する医薬組成物は、ホルモン不応性前立腺がん、前立腺がん、乳がん、
卵巣がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の皮膚がん、肺がん、肝臓がん、急性骨髄性白血
病、膀胱がん、子宮頚がん、胆管がん、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、胃肉腫、神経
膠腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、膵臓がん、胃がん、または局部の腫瘍
（手術不能の腫瘍、または腫瘍の局所治療が有益となる腫瘍、および固形腫瘍を含める）
を始めとする、当業者に知られている任意の悪性腫瘍の予防および治療に使用することが
できる。

インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）適用では、所与の細胞傷害性薬物の適切な用量は、その薬
剤およびその製剤によりけりであり、投与量および製剤を所与の患者のために最適化する
ことは、十分に当業者の技量の範囲内である。したがって、たとえば、そのような薬剤は
、標準の製剤方法を使用して、経口、皮下、非経口、粘膜下、静脈内、または他の適切な
経路による投与用に製剤することができる。化合物の有効量および投与方法は、患者の性
別、年齢、体重、および疾患段階、投与が治療的であるか予防的であるか、ならびに当業
者には明白な他の要素に基づき様々となる。

当業者は、たとえば、対象の体重、苦痛の重症度、投与方式、および処方を出す医師の
判断に応じて、患者の詳細な状況およびニーズに合わせるべく、適切な投与量および投与
スケジュールを導き出すであろう。通常、患者に投与する組成物の用量範囲は、患者の体
重１ｋｇあたり約０．５〜１０００ｍｇとし得る。投与量は、患者の必要に応じて、単回
のものでも、または１日またはそれ以上の日程で投与する２回以上の連続したものでもよ
い。一部の実施形態では、本発明は、類似物について確立されたヒト投与量と同じ投与量
、またはその約０．１％〜５００％の間、より好ましくは約２５％〜２５０％の間にある
投与量を使用する。適切なヒト投与量は、たとえば、動物における毒性および効力研究に
よって適格とされるような、ＥＤ₅₀値もしくはＩＤ₅₀値、またはインビトロ（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）もしくはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究から導かれた他の適切な値から推測す
ることもできる。

正確な投与量は、個々の薬物に応じて決定されるものの、ほとんどの場合、投与量に関
して多少の一般化を行うことができる。成人患者のための日用投与計画は、たとえば、０
．１ｍｇ〜５００ｍｇの間、好ましくは約１ｍｇ〜約２５０ｍｇの間、たとえば約１５０
ｍｇ〜約２００ｍｇの経口用量でよい。一部の実施形態では、経口投与剤形は、約５ｍｇ
、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、
２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍ
ｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、または１０００ｍ
ｇである。化合物は、継続的な治療の期間、たとえば、１週間以上、または数ヶ月もしく
は数年間投与することができる。

投与量および投与間隔は、モジュレート効果（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）
を維持するのに十分である、活性部分の血漿レベル、すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を
得るために、個々に調節することができる。ＭＥＣは、各化合物で様々となるが、インビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）データから推定することができる。ＭＥＣを実現する投与量は
、個体の特徴および投与経路によりけりである。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたは生物検
定を使用して、血漿濃度を求めることができる。

組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１または複数の単位剤形を収容すること
のできる包装品または分注装置の体裁にすることができる。包装品または分注装置には、
投与の説明書を添付することができる。包装品または分注装置には、医薬品の製造、使用
、または販売を取り締まる政府機関によって定められた形で容器に添えられた、薬物の形
態がヒトまたは動物への投与についてその機関に認可されていることを反映する公告を添
付する場合もある。そのような公告は、たとえば、米国食品医薬局によって処方薬用に認
可されたラベル、または認可された製品挿入物でよい。本発明の化合物を含む組成物を、
適合性のある医薬賦形剤中に製剤化したものを、適応症である状態の治療用に調製し、適切
な容器に入れ、ラベルを貼ることもできる。

実施例１ ＲＸＲαに結合するスリンダク

競合的リガンド結合アッセイ（図１Ａ）、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＲＸＲα
、Ｎｕｒ７７、またはＲＡＲβに結合するスリンダクのＨＰＬＣ分析（図１Ｂ）を行った
。ＲＸＲα ＬＢＤタンパク質を、スリンダクまたは未標識９−シス−ＲＡの存在下また
は非存在下で［³Ｈ］９−シス−ＲＡと共にインキュベートした。結合した［³Ｈ］９−シ
ス−ＲＡを、液体シンチレーション計数によって定量化した（図１Ａ）。Ｃ末端側ＴＡＰ
タグに融合したＲＸＲαを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を、１００μＭのスリンダク硫化物で、またはこ
れなしで３時間処理した。処理後、細胞を精製し、スリンダク硫化物の存在についてＨＰ
ＬＣで分析した。スリンダク硫化物の標準溶液を使用して検量線を得た。特徴的なピーク
スペクトルおよび保持時間を同定に使用し、定量化に使用する最大のピーク面積を算出し
た（図１Ｂおよび図１０）。スリンダク硫化物はＲＸＲαに結合し、ＩＣ₅₀は、アポトー
シスを誘発する濃度範囲にある８０μＭであった（図１Ａ）。ＨＰＬＣ分析では、スリン
ダクはＲＸＲαに直接結合するが、ＲＡＲやＮｕｒ７７などの、細胞中の他の核内受容体
には結合しないことが示された（図１Ｂおよび図１０）。

精製したＲＡＲγタンパク質を、スリンダクまたは未標識全トランス型ＲＡの存在下ま
たは非存在下で、［³Ｈ］全トランス型ＲＡと共にインキュベートした。結合した［³Ｈ］
全トランス型ＲＡを、液体シンチレーション計数によって定量化した。スリンダクは、図
１Ｂで示した細胞ベースの実験と一致して、ＲＡＲγに結合しなかった（図９Ａ）。

受容体発現ベクターおよびレポーター遺伝子（ＲＸＲα／ＴＲαヘテロ二量体（図９Ｂ
）用のＴＲＥｐａｌ₂−ｔｋ−ＣＡＴ、および、ＲＸＲα／ＰＰＡＲγヘテロ二量体（図
９Ｃ）用のＤＲ１ ｔｋ−ＣＡＴ）を、ＣＶ−１細胞に一過性に形質移入した。スリンダ
クの存在下または非存在下で、細胞をリガンド（シグリタゾン、１０^-6Ｍ；Ｔ₃、１０^-7
Ｍ）で処理し、またはそれなしで処理した。ＣＡＴ活性を求めた。スリンダクは、ＲＸＲ
α／ＰＰＡＲγヘテロ二量体のトランス活性化を阻害したが、ＲＸＲ／ＴＲヘテロ二量体
の方は阻害しなかった（図９Ｂ、Ｃ）。

スリンダク（１００μＭ）による、ＲＸＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）のキモト
リプシン（ｕｇ／ｍｌ）に対する感受性の変更（図１Ｃ）、および１０μＭのＲＸＲα
ＬＢＤまたはＮｕｒ７７タンパク質の非存在下および存在下でのスリンダク（１００μＭ
）の¹⁹Ｆ ＮＭＲスペクトルを比較する、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）走査データ（図１
Ｄ）も明らかにした。ＲＸＲαへの結合は、スリンダクによる、ＲＸＲαのキモトリプシ
ン消化に対する感受性の変更（図１Ｃ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（図１Ｄ）に
よって確認した。加えて、ＳＲ１１２３７（１０^-6Ｍ）によって活性化されたＲＸＲαト
ランス活性化の、スリンダクによる阻害も測定した（図１Ｆ、実施例２参照）。

Ｎｕｒ７７および／またはＲＸＲαを、ＣＶ−１細胞に一過性に形質移入した。スリン
ダクの存在下または非存在下において、細胞をＲＸＲ選択的アゴニストであるＳＲ１１２
３７（１０^-6Ｍ）で処理し、またはこれなしで処理した。（ＴＲＥｐａｌ）２−ｔｋ−Ｃ
ＡＴ（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５８、５８７〜５９１（１９９２ａ）））（図１
Ｅ）およびβＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５、４４１〜
４４６（１９９２ｂ））（図１Ｆ）ＣＡＴ活性を明らかにした。レポーターアッセイにお
いて、スリンダク結合は、ＲＸＲαホモ二量体およびヘテロ二量体トランス活性化を阻害
し（図１Ｅ、Ｆ、および図１０）、スリンダクがＲＸＲα転写アンタゴニストであること
が示された。

実施例２ スリンダクの細胞死効果

スリンダクが誘発するアポトーシスにおけるＲＸＲαの役割を明らかにするために、Ｆ
９細胞およびＲＸＲα欠如Ｆ９細胞（Ｆ９−ＲＸＲα−／−）におけるスリンダクの細胞
死効果を調べた。

核形態変化分析に向けて、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、３．７％パラホ
ルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（
１ｍｇ／ｍｌ）で染色して、核を蛍光顕微鏡で可視化した。核の断片化および／またはク
ロマチンの凝縮を伴う少なくとも３００個のＧＦＰ陽性細胞をカウントすることにより、
アポトーシス細胞のパーセンテージを求めた。ＤＮＡ断片化の判定には、Ｃｅｌｌ Ｄｅ
ａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ^PLUS（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、ドイツ国バイエルン州Ｐｅｎｚｂｅｒｇ）を使用した。

ＲＸＲα ｓｉＲＮＡ ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲｐｏｏｌ（Ｍ−００３４４３−０
２）、ＲＡＲγ ｓｉＲＮＡ ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲｐｏｏｌ（Ｍ−００３４３９
−０１）、およびｓｉＲＮＡ非特異的対照ＩＸ（Ｄ−００１２０６−０９−０５）をＤＨ
ＡＲＭＡＣＯＮ（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）から購入した。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を製造者の勧
めに従って使用することにより、１ウェルあたり分割量２．５μｌの２０ｍＭ ｓｉＲＮ
Ａを、１２ウェルプレートで増殖させた細胞に形質移入した。形質移入してから２日後、
ウエスタンブロット法用に細胞を回収した。

Ｆ９細胞またはＲＸＲα欠如Ｆ９細胞（Ｆ９ ＲＸＲα−／−）をスリンダク（７５μ
Ｍ）で２４時間処理し、ＤＡＰＩ染色（図２Ａ）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラー
ゼ（ＰＡＲＰ）切断（図２Ｂ）、およびＤＮＡ断片化（図２Ｃ）によって分析した。Ｈ４
６０肺がん細胞に対照またはＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移入し、スリンダク（７５μＭ
）で２４時間処理し、アポトーシスについてＤＡＰＩ染色で分析した（図２Ｄおよび２Ｅ
）。

ＣＶ−１細胞にＧＦＰ−ＲＸＲα（図２Ｆ）またはＧＦＰ−ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ
３１６Ｅ（図２Ｇ）を形質移入し、スリンダク（７５μＭ）で２４時間処理し、ＤＡＰＩ
染色によって分析した。ＧＦＰ−ＲＸＲαを形質移入した細胞では、広範な核の断片化お
よび凝縮が起こった（図２Ｆ）。受容体を形質移入した細胞において、アポトーシスを記
録した（図２Ｇおよび１１）。ＲＸＲαリガンド結合ポケットの崩壊によって、そのホモ
二量体トランス活性化が弱められた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＲＸＲαリガンド結合ポ
ケットの崩壊によって、さらに、そのヘテロ二量体トランス活性化も弱められた（図１１
Ｃ、１１Ｄ）。ＲＸＲα（２０ｎｇ）、ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅ（２０ｎｇ）
、β−ガラクトシダーゼ（１００ｎｇ）、および／またはＮｕｒ７７（１００ｎｇ）発現
ベクターを、（ＴＲＥｐａｌ）２−ｔｋ−ＣＡＴ（１００ｎｇ）（図１１Ａ、１１Ｂ）ま
たはβＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ（１００ｎｇ）（図１１Ｃ、Ｄ）と共に、ＣＶ−１細胞に
一過性に形質移入した。漸増濃度のスリンダク（１０、３７．５ ７５、１５０ ３００
μＭ）の存在下または非存在下において、細胞をＳＲ１１２３７（１０^-6Ｍ）で処理し、
またはこれなしで処理した。ＣＡＴ活性を求めた。

スリンダクは、Ｆ９細胞において広範なアポトーシスを誘発したが、Ｆ９−ＲＸＲα−
／−細胞においてはほとんど効果を示さなかった（図２Ａ〜２Ｃ）。スリンダクのアポト
ーシス効果は、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移入した細胞においても低下したが（図２Ｅ
）、ＲＸＲαの形質移入によって、その細胞死効果は強化された（図２Ｆ、Ｇ）。ＲＸＲ
α／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅは、リガンドが誘発するホモ二量体またはヘテロ二量体トラ
ンス活性化に反応せず（図１１）、スリンダクに対するアポトーシス反応の低下を示した
（図２Ｇ）。したがって、ＲＸＲαは、スリンダクが誘発するアポトーシスに関与するこ
とがわかった。

ＨＣＴ１１６細胞またはＢａｘ欠如ＨＣＴ１１６細胞（Ｂａｘ−／−）を、スリンダク
（７５μＭ）で、またはこれなしで２４時間処理した。アポトーシスをＰＡＲＰ切断（図
２Ｈ）およびＤＡＰＩ染色（図２Ｉ）によって明らかにした。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡもし
くは対照ｓｉＲＮＡを４８時間かけて形質移入し、またはこれなしで形質移入したＨＣＴ
１１６細胞を、スリンダクで６時間処理し、Ｂａｘオリゴマー化（図２Ｊ）について、ま
たＢａｘ／Δ２１、Ｂａｘ／６Ａ７、または抗Ｈｓｐ６０抗体を使用する免疫染色／共焦
点顕微鏡観察によるＢａｘ立体構造変化およびミトコンドリア標的化（図２Ｋ）について
分析した。約６０％の細胞が、ＢＡＸ立体構造変化を示した。

スリンダクは、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞においてＰＡＲＰの切断（図２Ｈ）およびア
ポトーシス（図２Ｉ）を誘発したが、Ｂａｘ欠如ＨＣＴ１１６細胞（Ｂａｘ−／−）では
誘発しなかった。ＨＣＴ１１６細胞は、ＣＯＸ−２を欠損しているという事実により、ス
リンダクが誘発するアポトーシスが、ＣＯＸ−２非依存的であり得ることが示された。免
疫ブロット法アッセイによって、Ｂａｘは、ミトコンドリア上で広範なオリゴマー化を経
たが、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによって抑止されたことが示された（図２Ｊ）。加えて、抗
Ｂａｘ抗体（Ｂａｘ／Δ２１）およびＢａｘ立体構造に感受性のある抗体Ｂａｘ／６Ａ７
（Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ
２５４、３８８〜３９４（１９９９））を使用した免疫染色によって、スリンダクが誘発
するＢａｘ立体構造変化およびミトコンドリア標的化が、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによって
弱められたことが実証された（図２Ｋ）。総合して、これらの結果は、ＲＸＲαが、スリ
ンダクのアポトーシス効果を媒介する細胞内ターゲットとして働く可能性があることを示
している。

実施例３ ＲＸＲα突然変異体

ＲＸＲαに結合するスリンダクの役割に対応するために、ＲＸＲαリガンド結合ポケッ
ト（ＬＢＰ）の機能の完全性の維持に不可欠なアミノ酸（Ｂｏｕｒｇｕｅｔ，Ｗ．ら、Ｍ
ｏｌ Ｃｅｌｌ ５（２）、２８９〜２９８（２０００））を変えた、ＲＸＲα突然変異
体（ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅ）を構築した。

Ｆｌａｇ−ｐ８５αは、順方向プライマー5’-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3’お
よび逆方向プライマー5’-acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’を使用するポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し
、ｐＣＭＶ−Ｆｌａｇベクターにクローン化した。ＲＸＲα突然変異体は、ＱＵＩＫＣＨ
ＡＮＧＥ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ）を使用し、次のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて構築した
。ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅ、5’-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCAT
AGCTGTGAAAGA

TGGG（順方向−配列番号１）および5’-CCCATCTTTCACAGCTATGGACTCGTGGGAGGAGGAGGCGATCA
GCAGCTCGTTCC（逆方向−配列番号２）；ＲＸＲα／Δ８０、5’-CCGGAATTCGGaccacacccac
cctgggc-3’（順方向−配列番号３）および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’（逆
方向−配列番号４）；ＲＸＲα／Δ１００、5’-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3’（
順方向−配列番号５）；および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’（逆方向−配列
番号６）。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター
に連結した。

ＲＸＲα（２０ｎｇ）、ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３１６Ｅ（２０ｎｇ）、β−ガラク
トシダーゼ（１００ｎｇ）、および／またはＮｕｒ７７（１００ｎｇ）発現ベクターを、
（ＴＲＥｐａｌ）２−ｔｋ−ＣＡＴ（１００ｎｇ）（図１１Ａ）またはβＲＡＲＥ−ｔｋ
−ＣＡＴ（１００ｎｇ）（図１１Ｂ）と共に、ＣＶ−１細胞に一過性に形質移入した。細
胞をＳＲ１１２３７（１０^-6Ｍ）で、またはこれなしで処理した。ＣＡＴ活性を求めた。

突然変異体は、リガンドが誘発するトランス活性化に反応せず（図１１）、スリンダク
に対する反応の低下を示した（図２Ｇ）（実施例２参照）。

実施例４ スリンダクによるＡＫＴ活性化の阻害

ＡＫＴ（がん細胞生存の原因である鍵タンパク質）活性化のスリンダクによる阻害を調
査した。

ＨｅｐＧ２、ＳＷ４８０、ＲＡＷ２６４．７、ＨＣＴ１１６、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、Ｚ
Ｒ−７５−１、およびＨａＣａｔ細胞を一晩栄養欠乏させ、スリンダク（１００μＭ）で
１時間処理し、ＡＫＴ活性化について免疫ブロット法で分析した（図３Ａ）。ＨｅｐＧ２
細胞にはまた、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを４８時間かけて形質移入し、スリンダク（１００
μＭ）で１時間処理し、ＡＫＴ活性化およびＲＸＲα発現について免疫ブロット法で分析
した（図３Ｂ）。

ＭＥＦおよびＭＣＦ−７細胞を一晩栄養欠乏させ、スリンダクで１時間前処理し、ＥＧ
Ｆ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ＡＫＴ活性化を免疫ブロット法によって分
析した（図１２Ａ）。ＭＥＦおよびＣａｃｏ−２細胞を一晩栄養欠乏させ、スリンダクで
３０分間前処理した後、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（１０^-7Ｍ）に３０分間
曝し、ＡＫＴ活性化について分析した（図１２Ｂ）。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを４８時間か
けて形質移入した後、９−シス−ＲＡ（１０^-7Ｍ）に３０分間曝したＺＲ−７５−１乳が
ん細胞におけるＡＫＴ活性化も、免疫ブロット法によって分析した（図１３Ｃ）。ＲＸＲ
αまたは対照ｓｉＲＮＡを形質移入したＡ５４９肺がん細胞（図３Ｃ）、ならびに、ＺＲ
−７５−１およびＰＣ３細胞（図３Ｄ）を、スリンダク（１００μＭ）で１時間前処理し
た後、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）に３０分間曝し、ＡＫＴ活性化およびＲＸＲα発現に
ついて免疫ブロット法で分析した。

基礎ＡＫＴ活性化のスリンダクによる有意な阻害が、ＣＯＸ−２陰性のＳＷ４８０およ
びＨＣＴ１１６結腸がん細胞を始めとする種々のがん細胞系で観察され（図３Ａ）、ＣＯ
Ｘ−２非依存的な機序が示された。スリンダクは、ＥＧＦによるＡＫＴ活性化を阻害しな
かったが、レチノイン酸によるＡＫＴ活性化を強力に阻害した。ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを
形質移入すると、スリンダクの効果と同様に、構成性のＡＫＴ活性化が有意に低下した（
図３Ｂ）。細胞を全トランス型ＲＡ（ＡＴＲＡ）で３０分間処理すると、ＡＫＴ活性化が
強力に誘発されたが、スリンダクによって用量依存的に（図１２Ｂ）、またＲＸＲα ｓ
ｉＲＮＡによって（図１２Ｃ）阻害された。スリンダクは、上皮増殖因子が誘発するＡＫ
Ｔ活性化を阻害しなかったが（図１２Ａ）、レチノイン酸が誘発するＡＫＴ活性化を、Ｒ
ＸＲα依存的な形で強力に阻害した（図１２Ｂ、Ｃ）。したがって、スリンダクは、ＲＡ
が誘発する急速なＲＸＲα依存的ＡＫＴ活性化を妨げることができる。

ＴＮＦαが誘発するＡＫＴ活性化の抑制についてスリンダクを調べた。ＴＮＦαは、Ａ
５４９肺がん細胞においてＡＫＴを強力に活性化したが、スリンダクおよびＲＸＲα ｓ
ｉＲＮＡによって強力に阻害され（図３Ｃ）、ＴＮＦαによるＡＫＴの活性化がＲＸＲα
依存的であることが示唆された。ＴＮＦαは、基礎ＡＫＴ活性化の高い細胞（ＺＲ−７５
−１細胞やＰＣ３細胞など）においてＡＫＴを活性化せず、またスリンダクは、これら細
胞においてＡＫＴ活性化に対する阻害効果をほとんど示さなかったが、スリンダクをＴＮ
Ｆαと組み合わせると、相乗的に、またほぼ完全に、ＡＫＴ活性化が阻害された（図３Ｄ
）。したがって、ＴＮＦαは、スリンダクによるＡＫＴ阻害に対するがん細胞の感受性を
高めることができ、ＴＮＦαは、可能性としてはＡＫＴ活性化をＲＸＲα非依存的な形か
らＲＸＲα依存的な形へと変換することにより、がん細胞のスリンダクに対する反応性を
予備刺激し得ることが示唆される。

９−シス−ＲＡ（１０^-7Ｍ）で３０分間処理したＭＣＦ−７細胞およびベビーハムスタ
ー腎臓（ＢＨＫ）細胞を、Ｄ２０またはΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体を使用する免疫共沈降
によって、ＲＸＲα−ｐ８５α相互作用について分析した（図１２Ｄ）。９−シス−ＲＡ
および／またはスリンダク（１００μＭ）で３０分間処理したＨ２９２肺がん細胞を、Δ
Ｎ１９７抗体を使用する免疫共沈降によって、ＲＸＲα−ｐ８５α相互作用について分析
した（図１２Ｅ）。スリンダクは、ＥＧＦによるＡＫＴ活性化を阻害しなかったが、レチ
ノイン酸によるＡＫＴ活性化を強力に阻害した。さらに、９−シス−レチノイン酸は、ｔ
ＲＸＲαのｐ８５αとの相互作用を、ΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体を使用したときには促進
したが、Ｄ２０抗ＲＸＲα抗体を使用したときには促進しなかった。

実施例５ ｐ８５αのｔＲＸＲαおよびＲＸＲαとの相互作用

ＲＸＲαのｐ８５αとの相互作用を調べた。抗ＲＸＲα抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）を免疫共沈降（Ｃｏ−
ＩＰ）およびウエスタンブロット法（ＷＢ）アッセイで使用した。ＢＨＫ細胞をＡＴＲＡ
（１０^-7Ｍ）で３０分間処理した。可溶化液を調製し、Ｄ２０抗ＲＸＲα抗体またはΔＮ
１９７抗ＲＸＲα抗体を使用してＲＸＲα−ｐ８５α相互作用について分析した（図１２
Ｄ）。

免疫共沈降アッセイによってＲＸＲαのＮＨ２末端側にある配列に対する抗ＲＸＲα抗
体（Ｄ２０）を使用した最初の試みでは、抗体がＲＸＲαタンパク質を有効に免疫沈降さ
せたものの、明確な相互作用が検出されなかった。しかし、ＲＸＲαのＣＯＯＨ末端側の
リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に対する別の抗ＲＸＲα抗体（ΔＮ１９７）を使用した
とき、ｐ８５αが、ＴＮＦα（図３Ｅ）またはＲＡ（図１２Ｄ、Ｅ）に依存的な形で容易
に免疫共沈降した。Ｄ２０抗ＲＸＲα抗体は、Ｎ末端側のＡ／Ｂドメインのアミノ酸２〜
２１を認識し、ΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体は、Ｃ末端側のＥ／Ｆドメインを認識するもの
であった（図３Ｅ）。ΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体によるｐ８５αの免疫共沈降には、Ｄ２
０ ＲＸＲα抗体によって検出されなかった切断型ＲＸＲα（ｔＲＸＲα）の免疫沈降が
伴い、切断型ＲＸＲαがＮ末端側の配列を欠いていることが示された（図１２Ｄ）。ΔＮ
１９７抗ＲＸＲα抗体を使用すると、ｐ８５αのｔＲＸＲαおよび／またはＲＸＲαとの
相互作用は、ＴＮＦαによって強化され、スリンダクによって阻害された（図３Ｅ）。Ｔ
ＮＦα存在下でのｐ８５αのｔＲＸＲαとの相互作用も、スリンダクによって阻害された
（図１２Ｅ）。これらの結果は、ｔＲＸＲαがｐ８５αに結合し、ＡＫＴを活性化するこ
とを示唆するものである。

実施例６ ＲＸＲαのアミノ酸８０から１００は、ｐ８５αへの結合にとって極めて重要
である

細胞内でのタンパク質切断を調べた。細胞を９−シス−ＲＡ（１０^-7Ｍ）で、またはこ
れなしで３０分間処理し、可溶化液を、ΔＮ１９７ ＲＸＲα抗体を使用する免疫ブロッ
ト法によって分析した（図３Ｆ）。免疫ブロットにより、ＲＸＲαは、異なる細胞内状況
および生物学的過程で、そのアミノ末端において切断される場合が多いことが実証された
（図３Ｆ）。

Ａ５４９肺がん細胞も、９−シス−ＲＡで、またはこれなしで３０分間処理した。核（
Ｎｕ）および細胞質（Ｃｙｔ）画分を、Ｄ２０またはΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体を使用す
る免疫ブロット法によって分析した。調製物の純度を保証するために、画分は、Ｈｓｐ６
０（細胞質特異的）およびＰＡＲＰ（核特異的）タンパク質の存在に対しても免疫ブロッ
トした（図１３）。ＭＥＦにおける内因性ＲＸＲαの細胞内局在を、抗ＲＸＲα（ΔＮ１
９７）を使用した免疫染色後の共焦点顕微鏡観察によって可視化した。細胞をＤＡＰＩで
染色して、核も可視化した（図４Ｂ）。

ＲＸＲαは、形質膜で見受けられ（図４Ａ、上部パネル）、一部の細胞において細胞膜
上で点状構造を示した（図４Ａ、下部パネル）。ＭＥＦにおける４４ｋＤａのｔＲＸＲα
の産生は、細胞密度によっても調節された（図４Ａ）。低密度で培養した細胞で観察され
た４４ｋＤａのｔＲＸＲαのレベルは、細胞を高密度で増殖させたとき低下し、より小さ
いＲＸＲα断片の出現を伴った。興味深いことに、４４ｋＤａのｔＲＸＲαタンパク質の
レベルは、ＡＫＴ活性化と相関しており（図４Ａ）、ＲＸＲαの細胞密度依存的なタンパ
ク質切断が、ＡＫＴ活性化を調節する重要な機序であるかもしれないことが示唆された。
ｔＲＸＲαの細胞質局在（図１３）と一致して、ＭＥＦ細胞をΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体
によって免疫染色したとき、ＲＸＲαは主として細胞質中に見られた（図４Ｂ）。したが
って、ＲＸＲαの極めてＮ末端側の末端配列が欠失すると、その細胞内局在が変更され、
ｐ８５αと相互作用するその能力が付与され得ることになる。本明細書に記載するように
、ｐ８５αがｔＲＸＲαと免疫共沈降したという知見は、ｔＲＸＲαがｐ８５αに結合し
、ｔＲＸＲα依存的なＡＫＴ活性化をもたらす可能性があることを示唆するものである。

ＭＥＦ細胞を異なる細胞密度で播き、可溶化液を調製し、ＡＫＴ活性化について免疫ブ
ロット法で分析した。可溶化液は、ΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗体を使用する免疫ブロット法
によっても調べた（図４Ａ）。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるｔＲＸＲαのレ
ベルは、細胞密度依存的な形でＡＫＴ活性化と相関した（図４Ａ）。ｔＲＸＲαの細胞質
局在と矛盾せず、ＭＥＦは、多くの場合、ＲＸＲαの形質膜局在を示した（図４Ｂ）。

ｐ８５α相互作用およびＡＫＴ活性化におけるｔＲＸＲαの役割に直接対応するために
、そのＮ末端側の８０個のアミノ酸（ＲＸＲα／Δ８０）を欠いているＲＸＲα突然変異
体を構築し、これによって、内因性ｔＲＸＲαと類似した分子量のＲＸＲα突然変異体タ
ンパク質が産生された。Ｍｙｃタグ付きＲＸＲα／Δ８０をＦｌａｇ−ｐ８５αと共に細
胞に同時形質移入したとき、これらは強力に相互作用し、相互作用は、ＴＮＦαによって
さらに強化された（図５Ａ）。対照的に、全長ＲＸＲαまたは１００個のＮ末端側アミノ
酸を欠いているＲＸＲα突然変異体（ＲＸＲα／Δ１００）は、同じ条件下でＦｌａｇ−
ｐ８５αと相互作用しなかった。したがって、ＲＸＲαのアミノ酸８０から１００は、ｐ
８５αへの結合にとって極めて重要である。これを裏付けて、そのＬＢＤ（ＲＸＲα／２
２４〜４６２）でなく、ＲＸＲα Ｎ末端側Ａ／Ｂドメイン（ＲＸＲα／１〜１３４）が
、ｐ８５αと相互作用した（図５Ｂ）。ｔＲＸＲαの細胞質局在（図１３）と一致して、
ＲＸＲα／Δ８０は、多くが細胞質に存在し、拡散した、時には点状の形質膜局在を示し
た（図５Ｄ）。ＲＸＲα／Δ１００でなくＲＸＲα／Δ８０を形質移入すると、種々の細
胞タイプにおいてＡＫＴも強力に活性化された（図５Ｃ）。

ＲＸＲα／Δ８０免疫複合体をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＰＩ３Ｋ活性につい
て調べた。Ｍｙｃタグ付きＲＸＲα／Δ８０およびｐ８５αをＡ５４９細胞に同時形質移
入し、Ｍｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０を含有する複合体を抗Ｍｙｃ抗体によって免疫沈降させ
、ＰＩ３Ｋ活性について検定した。細胞から調製した特異的なＭｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０
免疫沈降物は、ＴＮＦα依存的な形で強力なＰＩ３Ｋ活性を示し（図５Ｅおよび１５）、
ｐ８５αと相互作用するその能力（図５Ａ）およびＡＫＴの活性化（図５Ｃ）と十分に相
関した。したがって、ＴＮＦαが誘発するｔＲＸＲα／ｐ８５α相互作用は、ＰＩ３Ｋ／
ＡＫＴシグナル伝達を活性化することがわかった。

ＲＸＲα／Δ８０は、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６結腸がん細胞において安定に発現
され、得られる安定なクローンＳＷ４８０／ＲＸＲα／Δ８０およびＨＣＴ１１６／ＲＸ
Ｒα／Δ８０は、ＡＫＴ活性化の上昇およびその下流ターゲットであるｃ−Ｍｙｃおよび
サイクリンＤ１の誘導を示した（図５Ｆ）。クローン原性生存アッセイを使用して、ＳＷ
４８０／ＲＸＲα／Δ８０およびＨＣＴ１１６／ＲＸＲα／Δ８０の増殖を評価した。安
定なクローンは、対照細胞よりはるかに多くのコロニーを形成した（図５Ｇ）。ＲＸＲα
／Δ８０ががん細胞の増殖に及ぼす影響を動物において調べた。このために、同じ数のＲ
ＸＲα／Δ８０発現細胞または対照細胞を、同じヌードマウスの異なる側腹部に注射し、
その増殖を明らかにした。動物において、ＳＷ４８０／ＲＸＲα／Δ８０およびＨＣＴ１
１６／ＲＸＲα／Δ８０によって形成された腫瘍は、対照細胞によって形成された腫瘍よ
りもはるかに速く成長した（図５Ｈ〜Ｉ）。総合して、これらの結果は、Ｎ末端切断型Ｒ
ＸＲαがインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのがん細胞増殖の強力なプロモーターであること
を実証するものである。

実施例７ ＡＫＴ活性化および細胞形質転換における内因性ｔＲＸＲα

全長ＲＸＲαがｐ８５αと相互作用しなかったという知見から、Ａ／Ｂドメインにある
ｐ８５α結合モチーフがＲＸＲαでは遮蔽されることが示唆された。したがって、ＲＸＲ
αのＮ末端側Ａ／Ｂドメインは、全長ＲＸＲαと相互作用することがあり（補足図８ａ）
、分子内相互作用が明らかになった。

発現ベクターＧＦＰ−ＲＸＲα／１〜１３４およびＭｙｃ−ＲＸＲαをＨＥＫ２９３Ｔ
細胞に形質移入した。相互作用を、抗Ｍｙｃ抗体を使用するＣｏ−ＩＰによって分析した
（補足図８ａ）。そのＮ末端においてＧＦＰと融合させた全長ＲＸＲαまたはＲＸＲα／
１〜１３４、およびそのＣ末端においてＭｙｃエピトープでタグ付けした全長ＲＸＲαを
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時形質移入した。３６時間後、細胞可溶化液を、ＩＰおよび抗Ｍ
ｙｃ抗体でのＷＢによって分析した。

Ｎ末端側Ａ／Ｂドメインは、ＲＸＲαに結合した（補足図８ａ）。ＲＸＲα Ｎ末端側
断片の発現は、ＲＸＲα切断を誘発した（補足図８ｂ）。ＲＸＲα／１〜１３４を全長Ｒ
ＸＲαと共に形質移入すると、おそらくは競合により分子内相互作用が崩壊する結果とし
てＲＸＲα Ｎ末端にあるタンパク質分解部位が露出するために、ｔＲＸＲαのレベルが
高まった（補足図８ｂ）。

ＲＸＲαのＮ末端領域であるＲＸＲα／１〜１３４を形質移入すると、ｔＲＸＲαレベ
ルを高めることができた（図１４）。内因性ｔＲＸＲαの役割を研究するために、ＲＸＲ
α／１〜１３４をＨｅＬａ細胞において安定して発現させ、ＲＸＲα／１〜１３４を安定
して発現させる細胞では、ｔＲＸＲαタンパク質が有意に増加し、これに伴って内因性全
長ＲＸＲαタンパク質は減少した（図４Ｃ）。親ＨｅＬａ細胞と比べて、ＨｅＬａ／ＲＸ
Ｒα／１〜１３４安定クローンは、より高いＡＫＴ活性化を伴い（図４Ｃ）、軟寒天にお
いて急速に増殖し（図４Ｄ）、ＡＫＴ活性化における内因性ｔＲＸＲαの役割および細胞
形質転換活性が示唆された。コロニー形成アッセイでは、スリンダクは、安定クローンが
形成したコロニーを強力に阻害した（図４Ｅ）。ｔＲＸＲαの臨床的関連性は、乳がん患
者からの腫瘍組織中にはｔＲＸＲαが存在するが、対応する腫瘍周辺組織および正常組織
中には存在しないことによって例証された（図４Ｆ）。同様の結果が肝臓がん患者でも得
られた。ヒト肝臓がん検体におけるＲＸＲαの免疫組織化学分析では、腫瘍組織において
強い細胞質ＲＸＲα染色が明らかになったが、対応する腫瘍周辺組織においては明らかに
ならなかった（図４Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ｔＲＸＲαが、ＡＫＴを活性化
することによりがん細胞の増殖および生存の一因となり得ること、ならびにｔＲＸＲαに
よって媒介される活性は、スリンダクによって負に調節できることを実証するものである
。

実施例８ スリンダク類似体の合成

ＲＸＲαがスリンダク作用の細胞内ターゲットの働きをするという発見は、ＡＫＴ活性
を抑制するためのＲＸＲα選択的なスリンダク誘導体を特定する機会をもたらした。スリ
ンダクのＲＸＲαおよびＣＯＸ−２への結合（図７Ａ、１８Ｂ）を比較して、ＲＸＲα結
合には好都合であるが、ＣＯＸ結合には不都合であるスリンダク類似体を設計した。スリ
ンダク硫化物とインドメタシンとの二次元構造を比較した（図１８Ａ）。ＣＯＸ−２の活
性部位において結合したスリンダクとインドメタシンのオーバーレイ画像を作成した（図
１８Ｂ）。スリンダクは、インドメタシンと同様にＣＯＸ−２に結合するように直感的に
モデルが作られたものである。

類似体を設計し、合成した（図１９）。置換ベンズアルデヒド（１）を出発材料として
使用して、置換インダノン誘導体（４）を調製した。パーキン反応において、誘導体（１
）を適切な無水物で処理して誘導体（２）を得、次いでこれを接触水素化によって還元し
て誘導体（３）を得た。ポリリン酸（ＰＰＡ）を触媒とする分子内のフリーデル−クラフ
ツアシル化によって５員環を閉環して、１−インダノン誘導体（４）を得た。誘導体（４
）を、酢酸エチルとリチウムヘキサメチルジシリルアミド（ＬＨＭＤＳ）とから発生させ
たエノレートで処理した後、酸性条件下で脱水すると、所望のアセテート（５）が得られ
た。生成したインデン−３−アセテート（５）を置換ベンズアルデヒドと反応させて（ク
ライゼン−シュミット反応）、酸性化した後、スリンダク類似体（Ｚ−６）を得た。スリ
ンダク類似体（９）の合成の一工程は、１−インダノン誘導体（４）のアクリル酸メチル
との、二ヨウ化サマリウム（ＳｍＩ₂）を介した還元カップリングであり、これによって
スピロラクトン（７）が得られた。（７）のメタノール溶液を触媒量のｐａｒａ−トルエ
ンスルホン酸（ｐ−ＴｓＯＨ）で処理すると、脱水生成物（８）が得られ、これをクライ
ゼン−シュミット反応にかけ、酸性化して、スリンダク類似体（９）を得た。注目すべき
は、化合物（５／８）のクライゼン−シュミット反応において、Ｒ₂＝ＣＨ₃であるとき、
化合物（６／９）のシス（Ｚ）異性体が主に生成し、一方Ｒ₂＝Ｈである場合、化合物（
６／９）のトランス（Ｅ）異性体が主に生成した。

実施例９ スリンダク類似体の評価

９−シス−ＲＡを基準とした、スリンダクのＲＸＲα ＬＢＰへのドッキングを評価し
て、ＲＸＲα結合活性からそのＣＯＸ阻害を切り離すための、スリンダクの構造を改変す
る戦略を割り出した。スリンダクのＲＸＲαへのドッキングを図７Ａに示す。ドッキング
したスリンダクの配向および位置を、９−シス−ＲＡ、ＤＨＡ、およびＢＭＳ６４９の結
晶構造と比較した（図７Ｂ）。スリンダクは、ＲＸＲα ＬＢＰにあるＡｒｇ３１６と相
互作用しながら、そのカルボキシレート基が、調べたすべてのＲＸＲαリガンドで見られ
るカルボキシレート基と一直線に並んだ方式で結合した（図７Ｂ）。スリンダクのベンジ
ルメチルスルフィド部分は、９−シス−ＲＡのａ−イオノン環と一部重なりながら、ＲＸ
Ｒα ＬＢＰの疎水性領域に結合した。この結合方式では、４位にある−ＳＣＨ３基（図
７Ｃ）のＲＸＲαタンパク質とのファンデルワールス相互作用は最適でなく、ＲＸＲαへ
の結合を改善するための改変の余地があった。ＲＸＲα選択的類似体の設計に４位を使用
する発想は、スリンダクプロドラッグ、スリンダクスルホキシド、および代謝産物のスリ
ンダクスルホンがＣＯＸ阻害活性を示さない一方で、代謝産物のスリンダク硫化物（本明
細書で使用するもの）が強力なＣＯＸ阻害剤である（Ｈａａｎｅｎ、２００１）という事
実によって十分に裏付けられた。図７Ａに示すように、スリンダクのカルボキシレート基
は、ＲＸＲαリガンドのＤＨＡ、ＢＭＳ６４９、および９−シス−ＲＡにおける同等の基
と比べて、Ａｒｇ３１６から離れた位置にあった。Ｄ位にある−ＣＨ２ＣＯＯＨを、−Ｃ
Ｈ２ＣＨ２ＣＯＯＨなどのより嵩のある基で置き換えれば、カルボキシレート基をＡｒｇ
３１６により近づけて配置して、ＲＸＲαで、９−シス−ＲＡで観察されたような良好な
電荷−電荷相互作用を実現する助けになることになる。

候補化合物は、ＣＯＸ−２の結晶構造（図１８）にもドッキングさせて調べて、非ＣＯ
Ｘ結合化合物を特定した。これらの検討に基づき、５種の類似体を設計し、合成した（図
７Ｃおよび図１９）。それらを評価すると、すべての類似体がＲＸＲα結合活性を保持し
ていたことが示され、Ｋ−８０００３が、おそらくは４位にあるそのイソプロピル（ｉ−
Ｐｒ）基においてＲＸＲαのヘリックス７上の疎水性残基との相互作用が改善されている
ために、最も強力であった（スリンダクの約３４倍）。意義深いことに、Ｋ−８０００３
およびＫ−８０００５は、ＣＯＸ活性の検出可能な阻害を伴わず（図７Ｃ）、構成性の、
ＴＮＦα（図７Ｄ）またはＩＬ−１β（示さない）によって誘発されるプロスタグランジ
ンＥ２（ＰＧＥ２）産生を阻害しなかった。Ｋ−８０００３のＲＸＲαへの結合は、１９
Ｆ ＮＭＲ結合アッセイによっても確認された（図７Ｅ）。したがって、スリンダクのＲ
ＸＲα結合は、そのＣＯＸ結合から切り離すことができる。

２４ウェルプレートにおいて、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにＡ５４９細胞
を播いた。一晩培養した後、血清を含まないＤＭＥＭ培地において細胞を１０ｎｇ／ｍｌ
のＩＬ−１βで２４時間刺激した。細胞を、表示する濃度のスリンダクまたは類似体で１
０分間前処理した後、１０μＭのアラキドン酸、およびスリンダクまたはその類似体で、
３７℃にて３０分間同時に処理した。培地を集め、直ちにアッセイにかけた。ＰＧＥ２産
生を、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌを用
い、製造者の説明書に従って測定した（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州Ａ
ｎｎ Ａｒｂｏｒ）。ＰＧＥ２産生（％）は、化合物の存在下で産生されたＰＧＥ２の、
媒体のみでのＰＧＥ２に対する比として示す。

類似体を評価すると、それらはすべて、ＲＸＲα結合活性を保持していたことが示され
、Ｋ−８０００３が、おそらくは４位にあるイソプロピル（ｉ−Ｐｒ）基においてＲＸＲ
αのヘリックス７上の疎水性残基との相互作用が改善されているために、最も強力であっ
た（スリンダクの約３４倍）（図７Ｃ）。Ｋ−８０００３およびＫ−８０００５は、ＣＯ
Ｘ活性の検出可能な阻害を伴わず（図７Ｃ）、構成性の、またはＴＮＦα（図７Ｄ）もし
くはＩＬ−１β（示さない）によって誘発されるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産
生を阻害しなかった。Ｋ−８０００３（１００μＭ）の¹⁹Ｆ ＮＭＲスペクトルを、１０
μＭのＲＸＲα ＬＢＤの非存在下と存在下とで比較した（図７Ｅ）。

Ｃａｃｏ−２およびＭＥＦ細胞を、表示する濃度のスリンダクまたはＫ−８０００３で
３０分間処理し、次いで全トランス型ＲＡ（１０^-7Ｍ）で１５分間刺激した。ＡＫＴ活性
化を免疫ブロット法によって分析した。ＲＸＲαまたはＲＡＲγ ｓｉＲＮＡを形質移入
したＰＣ３細胞を、Ｋ−８０００３（５０μＭ）で１時間前処理した後、ＴＮＦα（１０
ｎｇ／ｍｌ）に３０分間曝した（ｐＲＸＲα：リン酸化ＲＸＲα）。Ａ５４９細胞にＦｌ
ａｇ−ｐ８５αおよびＭｙｃ−ＲＸＲα／Δ８０を形質移入し、スリンダク（５０μＭ）
またはＫ−８０００３（５０μＭ）で１時間処理し、ＴＮＦαに３０分間曝し、抗Ｆｌａ
ｇ抗体を使用する免疫共沈降によって分析した。Ｋ−８０００３（５０μＭ）は、ＡＴＲ
Ａが誘発するＡＫＴ活性化（図２０）およびＴＮＦαが誘発するＡＫＴ活性化（図８Ａ）
、ＨｅＬａ／ＲＸＲα／１〜１３４安定クローンのコロニー形成（図８Ｂ）、ならびにｐ
８５αのＲＸＲα／Δ８０との相互作用（図８Ｃ）の阻害において、スリンダク（５０μ
Ｍ）よりもはるかに有効であった。ｓｉＲＮＡによってＲＸＲα発現を減少させることで
、ＰＣ３細胞におけるＡＫＴ活性化に対するＫ−８０００３の阻害効果は、大幅に弱まっ
た。比較において、ＲＡＲα発現がＲＡＲα ｓｉＲＮＡによって減少すると、そのよう
な効果は示されなかった。したがって、ＡＫＴ活性化のＫ−８０００３による阻害も、Ｒ
ＸＲα発現に依存的であった（図８Ｂ）。

免疫共沈降アッセイでは、ＴＮＦαの非存在下または存在下におけるＲＸＲα／Δ８０
のｐ８５αとの相互作用が、Ｋ−８０００３によって、スリンダクの効果と比べて強力に
阻害されたことが実証された（図８Ｃ）。

ＺＲ−７５−１細胞をＴＮＦαおよび／またはスリンダク（７５μＭ）もしくはＫ−８
０００３（５０μＭ）で６時間処理し、免疫ブロット法によって分析した。Ｋ−８０００
３は、ＺＲ−７５−１細胞においてＴＮＦαと共に使用したとき、ＰＡＲＰ切断の誘発で
もスリンダクより有効であった（図８Ｄ）。スリンダクと同様に、ＴＮＦαと組み合わせ
たＫ−８０００３は、ＨｅｐＧ２およびＰＣ３細胞において、ＰＡＲＰ切断およびカスパ
ーゼ８活性化を相乗的に誘発した（図８Ｅ）。

クローン原性生存アッセイでは、ＨｅＬａ／ＲＸＲα／１〜１３４安定クローンおよび
ＲＸＲα／Δ８０安定クローンのコロニー形成が、Ｋ−８０００３によってほぼ完全に抑
制され、Ｋ−８０００３の細胞増殖阻害能が明らかになった（図８Ｆ）。Ｋ−８０００３
がＡＫＴ活性化に与える阻害効果は、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡによって消失したが、ＲＡＲ
γ ｓｉＲＮＡでは消失せず（図８Ｆ）、Ｋ−８０００３の効果の媒介におけるＲＸＲα
の役割が示唆された。

マウス（ｎ＝６）をトウモロコシ油、スリンダク（６０ｍｇ／ｋｇ）、またはＫ−８０
００３（６０ｍｇ／ｋｇ）で２週間腹腔内処置した。腫瘍を取り出し、測定した。意義深
いことに、Ｋ−８０００３は、動物におけるＲＸＲα／Δ８０腫瘍の成長に対してスリン
ダクよりはるかに強力な阻害効果を示した（図８Ｇ）。まとめると、ＲＸＲα選択的なス
リンダク類似体Ｋ−８０００３は、ＲＸＲαを媒介とするＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達
およびがん細胞増殖の強力な阻害剤である。

実施例１０ 哺乳動物におけるスリンダク類似体のスクリーニング

一群のスリンダク類似体を選択して、細胞においてアポトーシスを誘発する能力を有す
る化合物をスクリーニングする。各候補化合物をマウスに導入し、分析して、候補化合物
が、細胞においてＡＫＴの活性化を抑制し、カスパーゼ８を活性化し、ＢＡＸを活性化し
、ｃＦＬＩＰを阻害し、かつ／またはＢｉｄを分解し得るかどうかを判定した。スクリー
ニングの際に特定された化合物は、本明細書で開示するさらなるスクリーニングアッセイ
または治療方法に使用することができる。

実施例１１ ヒト患者においてがんを治療する

がんの治療を必要とするヒト患者を特定し、ＲＸＲαと相互作用し、ＣＯＸ−２経路と
無関係に機能することがわかっている化合物を投与する。化合物を投与した結果としてが
んが安定化または改善するかについて患者をモニターする。化合物を投与した後の患者に
おいて抗腫瘍性効果が認められる。

実施例１２ ヒト患者においてがんを予防する

がんになるリスクが一般集団に比べて高まっているヒト患者を特定し、活性成分のＫ−
８０００３を含有する１５０ｍｇの錠剤を１日２回服用するように指示する。患者はモニ
ターされ、化合物投与後にがんにならない。

実施例１３ ＴＮＦαが誘導する外因性アポトーシス経路のスリンダクによる活性化

１％ＦＢＳを含有する培地で培養したＨｅｐＧ２細胞をＳＲ１１２３７（１μＭ）で１
時間、次いでＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）および／またはスリンダク（７５μＭ）で４時
間処理し、免疫ブロット法によって分析した。対照またはＲＸＲα ｓｉＲＮＡを形質移
入したＨｅｐＧ２細胞をＴＮＦαおよび／またはスリンダクで処理し、免疫ブロット法に
よって分析した。

ＨｅｐＧ２肝臓がん細胞（図６Ａ）および他のがん細胞系（図１６および図１７）をス
リンダクおよびＴＮＦαで処理すると、ＰＡＲＰ切断およびカスパーゼ８活性化（カスパ
ーゼ８切断産物であるｐ４３／ｐ４１を指標とする）が有効に誘発されたが、これらの細
胞をスリンダクまたはＴＮＦαのどちらか単独で処理すると、効果がほとんどなかった。
スリンダク／ＴＮＦαの組合せのアポトーシス効果は、ＲＸＲα選択的リガンドのＳＲ１
１２３７（図６Ａ）またはＲＸＲα ｓｉＲＮＡの形質移入（図６Ｂ）によって部分的に
抑制され、ＲＸＲαの役割が重ねて実証された。

対照またはカスパーゼ８ｓｉＲＮＡを形質移入し、またはＺＩＥＴＤ−ｆｍｋ（４０μ
Ｍ）で１時間前処理したＨｅｐＧ２細胞を、ＴＮＦαおよびスリンダクで処理し、免疫ブ
ロット法によって分析した。スリンダク／ＴＮＦαが誘発するＰＡＲＰ切断の完全な抑制
（図６Ｃおよび１６Ｂ〜Ｃ）。細胞にカスパーゼ８ ｓｉＲＮＡを形質移入した場合も同
様の結果が得られた（図６Ｄおよび１６Ｄ）。したがって、スリンダク／ＴＮＦαが誘発
するアポトーシスは、外因性のアポトーシス経路を媒介とする。

スリンダクおよびＴＮＦαによるＢａｘの活性化。ＴＮＦαおよび／またはスリンダク
で処理したＨｅｐＧ２細胞をＢａｘ／６Ａ７抗体で免疫染色した。スリンダク処理細胞で
は約１５％、スリンダク／ＴＮＦα処理細胞では約６０％が、Ｂａｘ染色を示した。Ｂａ
ｘ活性化をもたらした、外因性アポトーシス経路のスリンダクによる潜在的な活性化も調
べた。ＴＮＦαもしくはスリンダク単独で、または合わせて処理したＨｅｐＧ２細胞を、
立体構造に感受性のあるＢａｘ／６Ａ７抗体を使用する免疫染色によって、Ｂａｘ活性化
について調べた。細胞をＴＮＦαとスリンダク両方で処理した場合にだけ、有意なＢａｘ
染色が観察された（図６Ｅ）。外因性アポトーシス経路と内因性アポトーシス経路のクロ
ストークは、Ｂｉｄの切断および活性化によって結び付けることができる（Ｌｉら、Ｃｅ
ｌｌ ９４（４）、４９１〜５０１（１９９８））。実際に、Ｂｉｄは、ＴＮＦαおよび
スリンダクで処理した細胞で有意に分解され（図６Ａ）、スリンダク／ＴＮＦαが誘発す
るＢａｘ活性化に、Ｂｉｄ活性化が介在している可能性があることが示唆された。

ＣＡ−ＡＫＴまたはＤＮ−ＡＫＴを形質移入したＰＣ３細胞を、ＴＮＦαおよび／また
はスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した（図６Ｆ）。カスパーゼ８（図
６Ｇ）およびＢａｘ（図６Ｈ）のスリンダクおよびＴＮＦαによる活性化。ＣＡ−ＡＫＴ
を形質移入したＨｅｐＧ２細胞をＴＮＦαおよびスリンダクで処理し、抗切断型カスパー
ゼ８またはＢａｘ／６Ａ７抗体で免疫染色した。約８０％の非形質移入細胞および１５％
のＣＡ−ＡＫＴ形質移入細胞がカスパーゼ８染色を示した。約６０％の非形質移入細胞お
よび約１３％のＣＡ−ＡＫＴ形質移入細胞がＢａｘ染色を示した。スリンダク／ＴＮＦα
が誘発するＰＡＲＰ切断は、構成的活性型ＡＫＴ（ＣＡ−ＡＫＴ）の形質移入によって阻
害されたが、ドミナントネガティブＡＫＴ（ＤＮ−ＡＫＴ）（図６Ｆ）の形質移入によっ
て強化された。スリンダク／ＴＮＦαの組合せによるアポトーシスの誘発（図１７Ｂ）な
らびにカスパーゼ８（図６Ｇ）およびＢａｘ（図６Ｈ）の活性化は、一貫して、ＣＡ−Ａ
ＫＴによって阻害された。

ＴＮＦαおよび／またはスリンダクで６時間処理した細胞を、免疫ブロット法によって
分析した（図６Ｉ）。カスパーゼ８活性化を阻害することにより外因性アポトーシス経路
の強力な阻害剤として働く、ＡＫＴシグナル伝達の下流ターゲット遺伝子であるｃ−ＦＬ
ＩＰの発現を調べた。ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、およびＳＷ４８０細胞をＴＮＦαで処理す
ると、短鎖型（ｃ−ＦＬＩＰＳ）と長鎖型（ｃ−ＦＬＩＰＬ）との両方のｃ−ＦＬＩＰが
強力に誘導されたが、スリンダクによって阻害された（図６Ｉ）。したがって、スリンダ
クは、ＴＮＦαがｃ−ＦＬＩＰ発現に与える誘導効果を抑制することにより、アポトーシ
スを誘発し得る。

実施例１４ Ｋ−８０００３による乳房腫瘍の成長阻害

Ｋ−８０００３の経口投与が、マウスにおけるＭＣＦ−７乳房腫瘍組織成長に与える成
長阻害効果を調査した。Ｋ−８０００３をＮａＨＣＯ₃に溶解させた（ｐＨ８．０）。Ｍ
ＣＦ−７乳房腫瘍組織を有するマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのＫ−８０００３、３０ｍｇ／
ｋｇのＫ−８０００３、６０ｍｇ／ｋｇのＫ−８０００３、または対照を、総体積１００
ｕｌにして、１日１回胃管栄養法によって投与した。２０日間にわたり測定した腫瘍体積
から、経口Ｋ−８０００３で処置したマウスは、対照で処置したマウスと比べて、腫瘍体
積の用量依存的な縮小を見せたことが示された（図２１Ａ）。

実施例１５ Ｋ−８０００３の前臨床研究

毒性、生物学的利用能、および薬物動態の調査を含めた、Ｋ−８０００３の前臨床研究
を行った。Ｋ−８０００３は、毒性が非常に低く（図２２Ａ）、静脈内製剤と比べて経口
での生物学的利用能が高くなっており（図２２Ｂ）、ＰＫプロファイルは望ましかった（
図２２Ｃ）。

実施例１６ 類似体の生成
３−（４−フルオロフェニル）−２−メチルアクリル酸（２ａ）

炭酸カリウム（１８．２ｇ、１３２ｍｍｏｌ）に、０℃でプロピオン酸無水物（３１．
０ｍＬ、２４２ｍｍｏｌ）を加えた。５分間撹拌してよく混合した後、ｐ−フルオロベン
ズアルデヒド（１ａ）（１３．０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１６０℃で
１２時間加熱した。氷浴で冷却した後、反応混合物に水を加えた。得られた黄色の沈殿を
濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄して、未精製の酸２ａを得、これをそのまま次の工程で使用し
た。既知のアクリル酸２ａ（４０）の分析用サンプルを、ＭｅＯＨから再結晶させて取得
した。２ａ：淡黄色の結晶。融点155-158℃ (MeOH). IR (KBr): ν_max = 3429, 3076, 2
972, 1665, 1596, 1508,1425, 1313, 1298, 1224 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 2
.09 (s, 3H, CCH₃), 7.22-7.11 (m, 2H, Ph-H), 7.52-7.43 (m, 1H, Ph-H), 7.69 (s, 1H
, CH=CCH₃) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 12.7, 114.8, 115.1, 131.4, 131.5, 1
32.1, 132.2, 137.5, 161.3, 163.75, 170.4 ppm; MS (ESI) m/z 179 (M-H⁺).

３−（４−フルオロフェニル）−２−メチルプロパン酸（３ａ）

未精製アクリル酸２ａ（１４．３ｇ、７９．４ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（１．
３５ｇ）をメタノール（１９０ｍＬ）に混ぜた混合物を、２０気圧の水素中で１０時間水
素化した。触媒を濾別し、濾液を濃縮して未精製の３ａを得、これをそのまま次の工程で
使用した。化合物３ａ（４０）の分析用サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムク
ロマトグラフィー（酢酸エチル：ＰＥ、１：２）によって取得した。３ａ：無色の油状物
。IR (フィルム): ν_max = 3406, 2972, 2933, 1701, 1560, 1509, 1460, 1406, 1223 cm
^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ:1.17 (d, J = 6.82 Hz, 3H, CHCH₃), 2.77-2.61 (m, 2
H, CH₂CH), 3.02 (dd, J = 13.18, 6.35 Hz, 1H, CH₂CH), 7.00-6.93 (m, 2H, Ph-H), 7.
16-7.11 (m, 2H, Ph-H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 16.4, 38.4, 41.4, 115.1,
115.1, 130.3, 130.4, 134.5, 134.6, 160.4, 162.8, 182.6 ppm; MS (ESI) m/z 181 (M
-H⁺).

６−フルオロ−２−メチル−２，３−ジヒドロインデン−１−オン（４ａ）

未精製のプロパン酸誘導体３ａ（３．２０ｇ）とポリリン酸（４７．０ｇ）の混合物を
８０℃で４時間加熱した。得られる混合物を氷水中に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。抽出
物を合わせてＮａＨＣＯ₃飽和水溶液で洗浄して、出発材料の酸を除去し、次いでブライ
ンで洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュ
カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＰＥ、１：３０）によって精製して、化合物４
ａ（４０）を淡黄色の油状物（１．４４ｇ、５０％）として得た。ＮａＨＣＯ₃層を濃Ｈ
Ｃｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。抽出物を合わせてブラインで
洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、回収された出発材料３
ａ（３４％）を得た。４ａについてのデータ：IR (フィルム) ν_max = 3064, 2968, 2932
, 2873, 1716, 1611, 1509, 1486, 1444, 1264, 1158 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)
δ: 1.32 (d, J = 7.37 Hz, 3H, CHCH₃), 2.82-2.65 (m, 2H, CH₂CH), 3.37 (dd, J = 16
.71, 7.55 Hz, 1H, CH₂CH), 7.33-7.26 (m, 1H, Ph-H), 7.44-7.36 (m, 2H, Ph-H) ppm;
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 16.2, 34.4, 42.9, 76.3, 109.7, 109.9, 122.2, 122.5,
127.8, 127.9, 138.1, 148.8, 149.6, 161.1, 163.6, 208.5 ppm; MS (ESI) m/z 187 (M
+Na⁺).

エチル２−（６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−インデン−１−イル）アセテート（５ａ
）

ＨＭＤＳ（１５．０ｍＬ、５６．９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３８．０ｍＬ）に溶かし
た０℃の溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍのｎ−ヘキサン溶液、１７．０ｍＬ、４２．８
ｍｍｏｌ）を滴下した。約３０分間撹拌した後、混合物を−７８℃に冷却し、ＥｔＯＡｃ
（４．２０ｍＬ、４２．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を−７８℃でもう３０分間撹拌し
た。得られる混合物に、インデノン４ａの無水ＴＨＦ溶液（４０ｍＬ）を滴下した。混合
物を−７８℃でもう４時間撹拌し、次いでＮＨ₄Ｃｌ飽和水溶液で失活させた。混合物を
ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、
濾過し、減圧下で濃縮した。残渣にＨＯＡｃ／Ｈ₂ＳＯ₄（１０／１、５５ｍＬ）を加えた
。室温で５時間撹拌した後、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（３×１５ｍＬ）で抽出した。抽出物を
合わせて水、飽和ＮａＨＣＯ₃、およびブラインで続けて洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ
、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフ
ィー（酢酸エチル：ＰＥ、１：３０）によって精製して、化合物５ａ（４０）を無色の油
状物（３．２６ｇ、７０％）として得た。IR (フィルム) ν_max =2981, 2911, 1736, 161
4, 1590, 1473, 1368, 1329, 1308, 1256, 1154, 1034 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)
δ: 1.25 (t, J = 7.13 Hz, 3H, COOCH₂CH₃), 2.12 (s, 3H, CCH₃), 3.29 (s, 2H, PhCH₂
C), 3.48 (s, 2H, PhCCH₂), 4.14 (q, J = 7.13 Hz, 2H, COOCH₂CH₃), 6.79 (ddd, J = 9
.62, 8.12, 2.41 Hz, 1H, Ph-H), 6.96 (dd, J = 9.33, 2.40 Hz, 1H, Ph-H), 7.25 (dd,
J = 8.17, 4.93 Hz, 1H, Ph-H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ:14.1, 14.3, 31.5,
42.1, 60.9, 105.6, 105.9, 110.2, 110.4, 123.6, 123.7, 129.6, 129.6, 137.2, 137.
2, 144.6, 147.8, 147.9, 161.2, 163.6, 170.7 ppm; MS (ESI) m/z 257 (M+Na⁺).

（Ｚ）−２−（３−（４−（メチルチオ）ベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−
３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸
（スリンダク硫化物）（６ａ）

インデン５ａ（６５０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４．６ｍＬ）溶液に、室温で２
Ｎ ＮａＯＭｅ（４．６ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を加えて、橙色の混合物を得た。２０分間撹
拌した後、混合物にｐ−（メチルチオ）ベンズアルデヒド（０．８ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ
）を加えた。得られる混合物を８０℃で３．５時間還流させた。減圧下で濃縮した後、残
渣を１Ｎ ＨＣｌ溶液中に注いだ。室温でもう１０時間撹拌した後、混合物をＥｔＯＡｃ
（３×１５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減
圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＰＥ、１：２．５
）によって精製して、主としてシス（Ｚ）異性体の６ａ（スリンダク硫化物）（４０）を
黄色の固体（８６８ｍｇ、８５％）として得た。トランス（Ｅ）異性体は、約２％得られ
た。融点182-185℃ (EtOAc) (文献(40) 融点180-184℃). IR (KBr) ν_max = 3445, 3012
, 2914, 2850, 1702, 1602, 1589, 1465, 1410, 1320, 1240, 1171, 1085 cm^-1; ¹H NMR
(400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.15 (s, 3H, C=CCH₃), 2.54 (s, 3H, SCH₃), 3.57 (s, 2H, CH
₂COO), 6.77-6.71 (m, 1H, ビニル H), 7.01 (dd, J = 9.31, 2.25 Hz, 1H, ビニル H),
7.25-7.46 (m, 5H, Ph-H), 12.40 (s, 1H, COOH) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 1
0.7, 14.7, 31.5, 106.1, 106.4, 110.6, 110.8, 123.4, 123.5, 125.8, 130.0, 130.3,
131.0, 132.1, 132.6, 138.5, 139.5, 139.5, 139.5, 147.2, 147.3, 161.5, 161.6, 172
.1 ppm; MS (ESI) m/z 331 (M+Na⁺).

スリンダク硫化物（６ａ）について記載した手順に従い、インデン５ａを適切な芳香族
アルデヒドと縮合させることにより、化合物Ｋ−８０００１〜Ｋ−８０００３をそれぞれ
合成した。

（Ｚ）−２−（３−（４−メチルベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−イ
ンデン−１−イル）酢酸（６ｂ）
（Ｋ−８０００１）

黄色の固体。融点155-158℃. 収率: 87%. IR (KBr) ν_max = 3426, 3022, 2959, 291
5, 1733, 1717, 1655, 1599, 1512, 1470, 1408, 1381, 1214, 1172 cm^-1; ¹H NMR (400
MHz, CDCl₃) δ: 2.19 (s, 3H, C=CCH₃), 2.41 (s, 3H, Ph-CH₃), 3.58 (s, 2H, CH₂CO₂H
), 6.59-6.53 (m, 1H, ビニル H), 6.87 (dd, J = 8.98, 2.40 Hz, 1H, ビニル H), 7.44
-7.16 (m, 6H, Ph-H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 10.61, 21.43, 29.73, 31.44
, 105.54, 105.77, 110.48, 110.71, 123.73, 123.83, 129.21, 129.32, 129.78, 129.80
, 129.84, 129.87, 131.00, 131.02, 133.48, 138.29, 138.95, 139.76, 146.13, 146.22
, 161.84, 164.29, 176.68 ppm; MS (ESI) m/z 363 (M+Na⁺). 元素分析:C₂₀H₁₇FO₂の計
算値: C, 77.90; H, 5.56. 実測値: C, 77.88; H, 5.99.

（Ｚ）−２−（３−（４−エチルベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−イ
ンデン−１−イル）酢酸（６ｃ）
（Ｋ−８０００２）

黄色の固体。融点 159-162℃. 収率: 83%. IR (KBr) ν_max =3082, 3024, 2965, 29
23, 1705, 1604, 1473, 1465, 1413, 1312, 1229, 1168 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)
δ: 1.29 (t, J = 7.61 Hz, 3H, CH₂CH₃), 2.20 (s, 3H, C=CCH₃), 2.71 (q, J = 7.60
Hz, 2H, CH₂CH₃), 3.59 (s, 2H, CH₂COO), 6.60-6.54 (m, 1H, 芳香族ビニル H), 6.88 (
dd, J = 8.97, 2.39 Hz, 1H, 芳香族ビニル H), 7.19-7.44 (m, 5H, Ph-H) ppm; ¹³C NMR
(100 MHz, CDCl₃) δ: 10.6, 15.4, 28.7, 31.4, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7,
123.8, 128.0, 129.4, 129.7, 129.9, 131.0, 133.7, 138.9, 139.7, 144.6, 161.8, 16
4.2, 176.4 ppm; MS (ESI) m/z 345 (M+Na⁺). 元素分析:C₂₁H₁₉FO₂の計算値: C, 78.24;
H, 5.94. 実測値: C, 78.21; H, 5.55.

（Ｚ）−２−（３−（４−イソ−プロピルベンジリデン）−６−フルオロ−２−メチル−
３Ｈ−インデン−１−イル）酢酸（６ｄ）
（Ｋ−８０００３）

黄色の固体。融点146-149℃; 収率: 79%. IR (KBr) ν_max = 3025, 2958, 2871, 1701
, 1629, 1603, 1507, 1464, 1412, 1315, 1293, 1171, 1134 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CD
Cl₃) δ:1.31 (d, J = 6.95 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 2.20 (s, 3H, C=CCH₃), 2.97 (td, J =
13.81, 6.91 Hz, 1H, CH(CH₃)2), 3.59 (s, 2H, CH₂COO), 6.61-6.88 (m, 2H, 芳香族ビ
ニル H), 7.19-7.46 (m, 6H, Ph-H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ:10.6, 23.9, 31.3,
34.0, 76.7, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7, 123.8, 126.5, 129.4, 129.7, 129.8
, 131.0, 133.7, 139.0, 139.6, 146.1, 146.2, 149.3, 161.8, 164.2, 176.1 ppm; MS (
ESI) m/z 359 (M+Na⁺). 元素分析:C₂₂H₂₁FO₂の計算値: C, 78.55; H, 6.29. 実測値: C
, 78.13; H, 6.02.

エチル２−（６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）アセテート（５ｂ）

イソプロピルアミン（０．２７ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶かした
０℃の溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍのｎ−ヘキサン溶液、０．８ｍＬ、２ｍｍｏｌ）
を滴下した。約３０分間撹拌した後、混合物を−７８℃に冷却し、ＥｔＯＡｃ（０．２ｍ
Ｌ、２ｍｍｏｌ）を加えた。−７８℃でもう３０分間撹拌した後、インデノン４ｂ（１５
０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含有する無水ＴＨＦ（０．７ｍＬ）を滴下した。混合物を−７８
℃でもう２時間撹拌し、次いで飽和ＮＨ₄Ｃｌで失活させた。混合物をＥｔＯＡｃ（３×
５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣をＡｃＯＨ／Ｈ₂ＳＯ₄（１０／１、３ｍＬ）で溶かした。室温で３時間撹拌
した後、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（３×５ｍＬ）で抽出した。抽出物を合わせて水、飽和Ｎａ
ＨＣＯ₃、およびブラインで続けて洗浄した。有機相を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過
し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（
酢酸エチル：ＰＥ、１：３０）によって精製して、５ｂを無色の油状物（９９ｍｇ、４９
％）として得た。IR (フィルム) ν_max = 3054, 2982, 2931, 1704, 1636, 1486, 1446,
1369, 1345, 1288, 1276 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1.28 (t, J = 7.15 Hz, 3
H, CH₂CH₃), 3.35 (s, 2H, CH₂CO₂Et), 3.56 (dd, J = 2.93, 1.51 Hz, 2H, CH₂CH), 4.1
9 (q, J = 7.15 Hz, 2H, CH₃CH₂), 6.52 (s, 1H, C=CH), 6.93-7.36 (m, 3H, Ph-H) ppm;
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 14.2, 34.1, 37.4, 61.0, 106.4, 106.7, 111.4, 111.6
, 124.3, 124.4, 134.1, 136.3, 136.4, 139.2, 139.3, 146.3, 146.4, 161.1, 163.5, 1
70.72 ppm. 元素分析:C₁₃H=FO=の計算値: C, 70.90; H, 5.95. 実測値: C, 71.30; H,
6.23.

（Ｅ）−２−（３−（４−（メチルチオ）ベンジリデン）−６−フルオロ−３Ｈ−インデ
ン−１−イル）酢酸（６ｅ）
（Ｋ−８０００４）

インデン誘導体５ｂ（５０６ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）溶液に、
室温で２Ｎ ＮａＯＭｅ（４ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を加えた。２０分間撹拌した後、得られ
る混合物に、ｐ−（メチルチオ）ベンズアルデヒド（０．６５ｍＬ、２．５０ｍｍｏｌ）
を加えた。混合物を８０℃で３．５時間還流させた。得られる溶液を減圧下で濃縮し、次
いで１Ｎ ＨＣｌ中に注いだ。室温で１０時間撹拌した後、混合物をＥｔＯＡｃ（３×１
０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＰＥ
、１：２．５）によって精製して、トランス（Ｅ）異性体の６ｅ（Ｋ−８０００４）を黄
色の固体（４２９ｍｇ、４８％）として得た。融点180-182℃ (EtOAc). ¹H NMR (400 MH
z, CDCl₃) δ: 2.54 (s, 3H, SCH₃), 3.69 (s, 2H, CH₂COO), 7.09-7.84 (m, 9H, Ph-H),
12.52 (s, 1H, COOH) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 13.6, 115.5, 115.7, 127.3
, 131.7, 131.8, 139.9, 161.5, 163.9, 174.0 ppm. 元素分析:C₁₉H₁₅FO₂Sの計算値: C,
69.92; H, 4.63; F, 5.82; O, 9.80; S, 9.82. 実測値: C, 70.16; H, 4.92.

スピロ（ジヒドロ−２（３Ｈ）フラノン−５−１’（２’Ｈ）（３’Ｈ）−６−フルオロ
−インダン（７ａ）

６−フルオロ−１−インダノン４ｂ（７５．０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、イソプロパ
ノール（０．１９０ｍＬ、２．５０ｍｍｏｌ）、およびアクリル酸メチル（０．４５ｍＬ
、５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かした溶液を、アルゴンで２０分間パージし、
０℃に冷却した。Ｓｍｌ₂（１．５０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を、トランス
ファーニードルで加えた。５分後、飽和Ｋ₂ＣＯ₃（２ｍＬ）で反応を失活させた。得られ
る混合物をＥｔＯＡｃ（３×３ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し、
無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ−ＰＥ（１
：６）を溶離液とするシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製
して、化合物７ａ（７４．５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、７３％）を無色の油状物として得
た。IR (フィルム) ν_max: 3058, 2945, 2856, 1766, 1603, 1494, 1155 cm^-1; ¹H NMR (
400 MHz, CDCl₃) δ: 2.28-2.52 (m, 4H, ArCCH₂), 2.77 (dt, J = 8.0, 1.2 Hz, 2H, Ar
CCH₂CH₂CO), 2.81-2.90 (m, 1H, ArCH₂), 3.00-3.09 (m, 1H, ArCH₂), 6.96-7.03 (m, 2H
, Ar-H), 7.18-7.23 (m, 1H, Ar-H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 28.7, 29.5, 33.3,
39.4, 94.1, 109.7 (d, J_C-F = 22.4 Hz) 116.6 (d, J_C-F = 22.5 Hz), 126.2 (d, J_C-F
= 8.3 Hz), 138.8, 144.7 (d, J_C-F = 7.4 Hz), 162.2 (d, J_C-F = 233.5 Hz), 176.0 p
pm; 元素分析:C₁₂H₁₁FO₂の計算値: C, 69.89; H, 5.38. 実測値: C, 69.97; H, 5.62.

メチル３−（６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）プロパノエート（８ａ）

スピロ（ジヒドロ−２（３Ｈ）フラノン−５−１’（２’Ｈ）（３’Ｈ）−６−フルオ
ロ−インダン７ａ（６１ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のＣＨ₃ＯＨ（１．５ｍＬ）溶液に、ｐ−Ｔ
ｓＯＨ（６ｍｇ）を加えた。混合物を２時間還流させた。ＮａＨＣＯ₃の飽和水溶液（２
．０ｍＬ）で反応を失活させた。得られる混合物をＥｔＯＡｃ（３×２ｍＬ）で抽出した
。有機相を合わせてブラインで洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ−ＰＥ（１：３００）を溶離液とするシリカゲルでのフラッ
シュカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物８ａ（６１ｍｇ、０．２８ｍｍ
ｏｌ、９４％）を淡黄色の油状物として得た。IR (フィルム) ν_max: 2959, 2901, 1739,
1585, 1606, 1473, 1254, 1162 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 2.68-2.73 (m, 2H
, CH₂COO), 2.82-2.88 (m, 2H, ArCCH₂), 3.28-3.31 (m, 2H, ArCH₂), 3.71 (s, 3H, COO
CH₃), 6.30 (t, 1H, J = 1.6 Hz, ArC=CH), 6.83-6.91 (m, 1H, Ar-H), 7.02-7.06 (m, 1
H, Ar-H), 7.33-7.38 (m, 1H, Ar-H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 22.9, 32.4, 37.3
, 51.7, 106.0 (d, J_C-F = 23.1 Hz), 111.4 (d, J_C-F = 22.8 Hz), 124.4 (d, J_C-F = 8
.9 Hz), 130.3, 139.5, 142.4 (d, J_C-F = 3.0 Hz), 146.9 (d, J_C-F = 8.5 Hz), 162.4
(d, J_C-F = 240.6 Hz), 173.4 ppm; 元素分析:C₁₃H₁₃FO₂の計算値: C, 70.90; H, 5.95.
実測値: C, 70.50; H, 5.97.

（Ｅ）−メチル３−（３−（４−（メチルチオ）ベンジリデン）−６−フルオロ−３Ｈ−
インデン−１−イル）プロパノエート（９ａ）
（Ｋ−８０００５）

メチル３−（６−フルオロ−３Ｈ−インデン−１−イル）プロパノエート８ａ（１１０
ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＣＨ₃ＯＨ（１ｍＬ）溶液を、窒素で１０分間パージし、０℃
に冷却した。新たに調製したＣＨ₃ＯＮａ（０．７５ｍｍｏｌ）含有ＣＨ₃ＯＨ（１ｍＬ）
を滴下した。３０分間撹拌した後、４−（メチルチオ）ベンズアルデヒド（６３μＬ、０
．６ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を２時間還流させた。冷却した後、水（３ｍＬ）で反
応を失活させ、室温で１０分間撹拌した。混合物を１Ｍ ＨＣｌで酸性化してｐＨ＝４と
した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（３×５ｍＬ）で抽出した。有機層を合
わせてブライン（２ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮
した。残渣を、ＥｔＯＡｃ−ＰＥ（１：４）を溶離液とするシリカゲルでのフラッシュカ
ラムクロマトグラフィーによって精製して、トランス（Ｅ）異性体の９ａ（１１２ｍｇ、
６６％）を黄色の固体として得た。融点:182-184℃ (EtOAc); IR (KBr) ν_max: 3055, 29
88, 2925, 1711, 1640, 1488, 1445, 1656, 1290, 1277 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)
δ: 2.53 (s, 3H, SCH₃ ), 2.68 (t, 2H, J = 7.6 Hz, CH₂COO), 2.84 (t, 2H, J = 7.6
Hz, ArCCH₂), 6.96-7.84 (m, 9H, Ar-H), 12.21 (s, COOH); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃)
δ: 14.3, 22.6, 32.0, 106.1 (d, J_C-F = 23.4 Hz), 111.5 (d, J_C-F = 23.0 Hz), 120
.5 (d, J_C-F = 9.2 Hz), 122.6, 125.8 (2C), 127.3, 130.4 (2C), 132.8, 134.1, 136.4
, 139.4, 143.2 (d, J_C-F = 8.8 Hz), 146.3, 162.2 (d, J_C-F = 240.5 Hz), 173.8 ppm;
元素分析:C₂₀H₁₇FO₂Sの計算値: C, 70.57; H, 5.03; S, 9.42. 実測値: C, 70.20; H,
4.62; S, 9.01.

Ｋ−８０００３類似体第１号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第３号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第４号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第５号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第６号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第７号（Ｒ１変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第８号（Ｒ２変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第９号（Ｒ２変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１０号（Ｒ２変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１１号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１２号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１３号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１４号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１５号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１６号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１７号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１８号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第１９号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２０号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２１号（Ｒ３変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２２号（Ｒ４変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２３号（Ｒ４変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２４号（Ｒ４変形形態、黄色の固体）：

Ｋ−８０００３類似体第２５号（Ｒ１変形形態）：

Ｋ−８０００３類似体第２６号（Ｒ１変形形態）：

Ｋ−８０００３類似体第２７号（Ｒ３変形形態）：
（Ｒ₃＝２−ＣＮである）。

Ｋ−８０００３類似体第２８号（Ｒ３変形形態）：
（Ｒ₃＝２−ＣＦ₃である）。

Ｋ−８０００３類似体第２９号（Ｒ３変形形態）：
（Ｒ₃＝
である。）

Ｋ−８０００３類似体第３０号（Ｒ３変形形態）：
（Ｒ₃＝
である）。

Ｋ−８０００３類似体第３１号（Ｒ４変形形態）：
（Ｒ₄＝Ｅｔである）。

Ｋ−８０００３類似体第３２号（Ｒ４変形形態）：
（Ｒ₄＝ＥｔＯである）。

Ｋ−８０００３類似体第３３号（Ｒ４変形形態）：
（Ｒ₄＝ｉ−Ｐｒである）。

Ｋ−８０００３類似体第３４号（Ｒ４変形形態）：
（Ｒ₄＝Ｃｌである）。

方法の概略
プラスミド

ＲＸＲαおよびＭｙｃ−ＲＸＲαの構築については、記載されている（Ｋｏｌｌｕｒｉ
，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２（７）、２
５２５〜２５３０（２００５）；Ｃａｏ，Ｘ．ら、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｎｕｒ７７／ＴＲ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓ
ｉｓ ［ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ］ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ
ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４（２２）、９７０５〜９７２５（２００４）；Ｍａｓｉａ，Ｓ
．ら、Ｒａｐｉｄ， ｎｏｎｇｅｎｏｍｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ
ａｃｉｄ ｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉ
ｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２１（１０）、２３
９１〜２４０２（２００７）；Ｏｈａｓｈｉ，Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（８
）、３４４３〜３４５０（２００９）；Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａ
ｎｃｅｒ ９（５）、３６１〜３７１（２００９）；Ｈａｎ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ ２５（２１）、２９７４〜２９８６（２００６））。Ｆｌａｇ−ｐ８５αは、順方
向プライマー5’-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3’および逆方向プライマー5’-acgcg
tcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構
築した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｆｌａｇベクター
にクローン化した。ＲＸＲα突然変異体は、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）突然変異
誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用し、次
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて構築した。ＲＸＲα／Ｆ３１３Ｓ／Ｒ３
１６Ｅ、5’-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCATAGCTGTGAAAGATGGG（順方向−配
列番号１）および5’-CCCATCTTTCACAGCTATGGACTCGTGGGAGGAGGAGGCGATCAGCAGCTCGTTCC（逆
方向−配列番号２）；ＲＸＲα／Δ８０、5’-CCGGAATTCGGaccacacccaccctgggc-3’（順
方向−配列番号３）および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’（逆方向−配列番号
４）；ＲＸＲα／Δ１００、5’-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3’（順方向−配列番
号５）および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’（逆方向−配列番号６）。ＰＣＲ
産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクターに連結した。

細胞培養

ＺＲ−７５−１ヒト乳がん、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３前立腺がん、ならびにＨ４６０肺
がん細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した。Ｈ
ｅｐＧ２肝臓がんおよびＭＣＦ−７ヒトがん細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭで維
持した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト胚性腎細胞、ＣＶ−１ミドリザル腎臓細胞、ＭＥＦ細胞、Ａ
５４９ヒト肺がん細胞、ＨａＣａｔヒトケラチノサイト細胞、ＢＨＫベビーハムスター腎
臓細胞、Ｃａｃｏ２ヒト結腸がん癌腫細胞、ＳＷ４８０ヒト結腸腺癌細胞、およびＨＣＴ
１１６ヒト結腸細胞は、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで維持した。Ｆ９ネズミ胎児性
癌細胞系は、両方の対立遺伝子がＲＸＲα崩壊型であった（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｊ．ら、
Ｅｍｂｏ Ｊ １５（１６）、４１４２〜４１５５（１９９６））。細胞培養物は、５％
ＣＯ₂加湿雰囲気中にて３７℃で維持した。

抗体および試薬

抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３、Ｄ９Ｅ、＃４０６０）は、セルシグナリングテクノロ
ジー（マサチューセッツ州ダンヴァーズ）からのものであった。抗β−アクチン抗体（Ａ
１９７８）および抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２、Ｆ３１６５）は、シグマ−アルドリッチ（ミズ
ーリ州セントルイス）から入手した。抗ｐ８５α（＃０６〜１９５）抗体は、ミリポア（
マサチューセッツ州ビルリカ）から購入した。Ａｋｔ１（Ｃ−２０）ｓｃ−１６１８、Ｇ
ＦＰ（Ｂ−２）ｓｃ−９９９６、ＨＳＰ６０（Ｎ−２０）ｓｃ−１０５２、ｃ−Ｍｙｃ（
９Ｅ１０）ｓｃ−４０ＰＩ３、ＲＡＲγ（Ｃ−１９）ｓｃ−５５０、ＲＸＲα（Ｄ２０）
ｓｃ−５５３、ＲＸＲα（ΔＮ１９７）ｓｃ−７７４、ＰＡＲＰ（Ｈ−２５０）ｓｃ−７
１５０の抗体は、サンタクルーズバイオテクノロジー（カリフォルニア州サンタクルーズ
）からのものであった。ＥＣＬ、抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合種特異的抗体は、ＧＥ ヘルスケア（英国バッキンガムシア州リトルチャルフ
ォント）からのものであった。アレクサ フルオル（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ａ−１１０１２）およびアレクサ フルオル（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ａ−１０６６７）は、インビトロジェン（カリフォルニア州カールズバッド）から購入
した。プロテイン Ａ／Ｇ プラス−アガロース（ｓｃ−２００３）は、サンタクルーズ
バイオテクノロジー（カリフォルニア州サンタクルーズ）からのものであった。リコンビ
ナントヒトＴＮＦα（２１０−ＴＡ）は、Ｒ＆Ｄ システムズ（ミネソタ州ミネアポリス
）からのものであった。プロテアーゼインヒビターカクテルタブレッツは、ロッシュ（ス
イス国バーゼル）からのものであった。９−シス−レチノイン酸（９−シス−ＲＡ）（Ｒ
４６４３）。スリンダク硫化物およびその類似体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
に溶解させて１００ｍＭの保存液とした。全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（Ｒ２
６２５）およびキモトリプシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイ
ス）からのものであった。ＳＲ１１２３７は、マルシア Ｉ．ドーソン（Ｍａｒｃｉａ
Ｉ．Ｄａｗｓｏｎ）博士（バーナムインスティテュート）の厚意により提供を受けた。

リガンド結合アッセイ

細菌中で発現させたＨｉｓタグ付きＲＸＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（ａａ２
２３〜４６２）を、リガンド結合アッセイ緩衝液中にて、様々な濃度の未標識９−シス−
ＲＡまたはスリンダク硫化物の存在下または非存在下で［³Ｈ］−９−シス−ＲＡ（アマ
シャムバイオサイエンス、英国アマシャム）と共にインキュベートした。ＲＸＲα ＬＢ
Ｄタンパク質を、ニッケルコーティングされたビーズによって捕捉した。結合された放射
標識９−シス−ＲＡを、記載されているとおりにシンチレーションカウンターで定量した
（Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ
１０２（７）、２５２５〜２５３０（２００５））。

細胞中のＲＸＲαタンパク質に結合するスリンダク硫化物のＨＰＬＣ分析

Ｃ末端ＴＡＰ融合物（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホ−ヤ）に融合させた受容
体を含む発現ベクターを、ＦｕＧｅｎｅ ６形質移入試薬（ロッシュ、スイス国バーゼル
）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。１０％の仔ウシ血清（ＳＣＳ、ユタ州
ハイクロンローガン）、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびス
トレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した完全培地ＤＭＥＭ（メディアテックＩ
ｎｃ．、バージニア州ハーンドン）において、細胞を指数増殖で維持した。形質移入後２
日目に、細胞を、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地に入れ替えて、形質移入後
２０日目に達したとき、薬物耐性コロニーについてシャーレの記録をつけた。ＲＸＲα融
合タンパク質の発現を、免疫ブロット法によって明らかにした。細胞を４枚の１５０ｍｍ
プレートにおいて集密に増殖させ、引き続いて１００ｍＭのスリンダク硫化物で、または
これなしで３時間処理した。処理後、細胞を５０ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄し、ストレプ
トアビジンベースの精製を、ストレプトアビジンビーズを、提供されたストレプトアビジ
ン結合緩衝液で最初に洗浄するまでは、インタープレイ（商標）ママリアンＴＡＰシステ
ム（ストラトジーン、カリフォルニア州ラホーヤ）マニュアルに記載のとおりに実施した
。次いで０．１ｍｌ分の希硫酸溶液（ｐＨ２）を加えた後、１．０ｍｌのアセトニトリル
を加えた。次いで、サンプルをボルテックスミキサーで３０秒間ボルテックス撹拌し、引
き続いて遠心分離した（１０００ｇ×５分）。次いで液体サンプルを第２の試験管に移し
、窒素流中で蒸発乾燥させた。残渣を０．１２ｍｌのクロマトグラフィー用移動相に溶解
し直し、０．１ｍｌ分をＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣ分析は、ミクロソーブ−ｍｖ １
００〜３ Ｃ１８ １００×４．６カラム（バリアン、カリフォルニア州パロアルト）を
使用して実施した。移動相は、１．０ｍｌ／分の流量でポンプ注入される４％ｖ／ｖ酢酸
水溶液とアセトニトリル（３０：７０）からなるものとした。スリンダク硫化物の検出は
、フォトアレイ検出装置（Ｗａｔｅｒｓ ｍｏｄｅｌ ２９９６、ウォーターズ社、マサ
チューセッツ州ミルフォード）を使用して実施し、これにより２００〜４５０ｎＭの間の
スペクトルを収集した。スリンダク硫化物の標準液を使用して検量線を得た。同定には特
徴的なピークスペクトルおよび保持時間を使用し、定量化に使用する４ｍａｘのピーク面
積を、ミレニアムクロマトグラフィマネージャーソフトウェア（ウォーターズ社、マサチ
ューセッツ州ミルフォード）を使用して算出した。同様の３通りの実験の１つを示した。

タンパク質分解保護アッセイ

ウサギ網状赤血球可溶化液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州フィッチバーグ）を使
用するインビボ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写−翻訳によって、以前に記載されているとおり
にＲＸＲα ＬＢＤを合成した（Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２（７）、２５２５〜２５３０（２００５）；Ｚｈａ
ｎｇ，Ｘ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５（６３５９）、４４１〜４４６（１９９２）；
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．−Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３５８（６３８７）、５８７〜５９１（１９
９２））。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳された³⁵［Ｓ］メチオニン標識ＲＸＲα
−ＬＢＤを、溶媒（１％ＤＭＳＯ）、スリンダク（１００μＭ）、または９−シス−ＲＡ
（１０^-7Ｍ）と共に３０分間プレインキュベートし、次いで示した濃度のキモトリプシン
で消化した。消化された断片をＰＡＧＥによって分離した。

一過性形質転換アッセイ

２４ウェルプレートに播いた細胞（１×１０⁵細胞／ウェル）に、変法のリン酸カルシ
ウム沈殿手順を使用して、記載されているとおりに一過性に形質移入した（Ｋｏｌｌｕｒ
ｉ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２（７）、
２５２５〜２５３０（２００５）；Ｃａｏ，Ｘ．，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２
４（２２）、９７０５〜９７２５（２００４））。

アポトーシスアッセイ

核形態変化分析に向けて、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、３．７％パラホ
ルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（
１ｍｇ／ｍｌ）で染色して、核を蛍光顕微鏡で可視化した（Ｍａｓｉａ，Ｓ．ら、Ｒａｐ
ｉｄ， ｎｏｎｇｅｎｏｍｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ
ｏｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２１（１０）、２３９１〜２４０
２（２００７）；Ｏｈａｓｈｉ，Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（８）、３４４３
〜３４５０（２００９）；Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ９
（５）、３６１〜３７１（２００９））。核の断片化および／またはクロマチンの凝縮を
伴う少なくとも３００個のＧＦＰ陽性細胞をカウントすることにより、アポトーシス細胞
のパーセンテージを求めた。ＤＮＡ断片化の判定には、セルデスディテクションＥＬＩＳ
Ａ^PLUS（ロシュアプライドサイエンス、ドイツ国バイエルン州ペンツブルク）を使用した
。同様の３通りの実験の１つを示した。

ＲＸＲαおよびＲＡＲγ ｓｉＲＮＡ

ＲＸＲα ｓｉＲＮＡ ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲｐｏｏｌ（Ｍ−００３４４３〜０
２）、ＲＡＲγ ｓｉＲＮＡ ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲｐｏｏｌ（Ｍ−００３４３９
〜０１）、およびｓｉＲＮＡ非特異的対照ＩＸ（Ｄ−００１２０６〜０９−０５）をダル
マコロン（コロラド州ラファイエット）から購入した。オリゴフェクトアミン試薬（イン
ビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を製造者の勧めに従って使用すること
により、１ウェルあたり分割量２．５μｌの２０ｍＭ ｓｉＲＮＡを、１２ウェルプレー
トで増殖させた細胞に形質移入した。形質移入してから２日後、ウエスタンブロット法用
に細胞を回収した。

免疫ブロット法

免疫ブロット法については、細胞可溶化液をＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移した。移した
後、抗体を含む５％乳含有ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ．８．０、１５
０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で膜をブロックした。次いで膜をＴＢ
ＳＴで３回洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗免疫グロブリンを含む５
％乳含有ＴＢＳＴ中にて室温で１時間インキュベートした。

免疫共沈降（ＣｏＩＰ）アッセイ

ＣｏＩＰアッセイについては、細胞、または示した発現ベクターを形質移入した細胞を
、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ；２０
ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＮＰ−４０；１ｍＭのＰＭＳＦ；５０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン
；２０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン；０．１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄；および１ｍＭのＤＴＴ）に
懸濁させた。プロテイン Ａ／Ｇ プラス アガロース ビーズ（サンタクルーズバイオ
テクノロジー、カリフォルニア州サンタクルーズ）と共にインキュベートして細胞抽出物
を清澄にし、次いで適切な抗体および３０ｍｌのプロテイン ＡまたはＧ プラス アガ
ロース ビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次いでレムリゲル添加液において
ビーズを洗浄および煮沸した後、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用してＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット法を実施した。強化型化学発光系（ＥＣＬ（商標））（ア
マシャムバイオサイエンス、英国アマシャム）を用い、化学発光によって免疫反応産物を
検出した。

ＨｅＬａ−ＲＸＲα／１〜１３４安定クローンおよび軟寒天アッセイ

ＲＸＲα Ｎ末端側断片１〜１３４を、ｐＮＴＡＰベクター（ストラトジーン、カリフ
ォルニア州ラホーヤ）にクローン化した。得られるｐＮＴＡＰ−ＲＸＲα／１〜１３４を
ＨｅＬａ細胞に形質移入した。形質移入から４８時間後、細胞を４００ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８で２週間かけて選択した。単一クローンを取り出し、免疫ブロット法によって調べた
。ＨｅＬａ ＲＸＲ／α１〜１３４安定クローン、および対照ｐＮＴＡＰベクターを形質
移入したＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳおよび０．３５％アガロースを０．５％床寒天と
共に補充したＤＭＥＭに５×１０³細胞／ウェル（６ウェルプレート）で播いた。３７℃
で１２日間インキュベートした後、コロニーを０．００５％クリスタルバイオレットで１
時間染色し、カウントした。

コロニー形成アッセイ

ＨｅＬａ ＲＸＲ／α１〜１３４安定クローンおよび対照ＨｅＬａ細胞を、６ウェルプ
レートに３５０細胞／ウェルで播いた。５日後、細胞を、０．５％血清培地中のスリンダ
ク（５０μＭ）およびＫ−８０００３（２５μＭ）で３日間処理した。ＰＢＳで洗浄した
後、細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間かけて固定した。コロニーを０
．１％クリスタルバイオレットで３０分間染色し、写真を撮り、コロニーをカウントした
。

ヒト組織および評価

乳房および肝臓腫瘍組織ならびにこれらの周囲組織を、がん患者からの外科的切除によ
って取得した。組織学的正常検体は、腫瘍小結節から少なくとも約３〜５ｃｍ離れたもの
としたが、対応する患者から取得した。当研究は、生物医学研究倫理委員会に対してシア
メンユニバーシティインスティテュートが認可しており、患者は全員、説明を受けた上で
同意した。

ＲＸＲαの発現を検出するために、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ、ｎ＝６）または乳がん（
ｎ＝６）患者からの組織を集めた。免疫ブロット法アッセイに向けて、腫瘍およびその周
囲組織を別個に調製し、変更型ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。可溶化液を８％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル上で電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に移した。膜は、引き続いて、ΔＮ１９７抗
ＲＸＲα抗体（１：１０００）と共に４℃で一晩、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウ
サギＩｇＧ抗体（１：５０００）と共に室温で１時間インキュベートし、強化型化学発光
（ＥＣＬ（商標））（アマシャムバイオサイエンス、英国アマシャム）によって検出した
。はがしたブロットを、負荷対照についてモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：２００
０）で探索し直した。免疫組織化学分析については、組織切片をΔＮ１９７抗ＲＸＲα抗
体（１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートし、ヤギ抗ウサギ特異的免疫グロブリ
ン（１：１００）を用いて室温で３０分間検出した。スライドをヘマトキシリンで対比染
色した。

共焦点顕微鏡観察

Ｍｙｃタグ付きＲＸＲα／Δ８０およびＦｌａｇタグ付きｐ８５αを形質移入した細胞
を、一晩チャンバースライドに播いておいた。細胞を、３．７％パラホルムアルデヒドを
含有するＰＢＳで１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで細胞を、ＰＢＳ中０．
１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間透過処理した。固定された細胞を、５％ＢＳＡを
含有するＰＢＳ中にて室温で３０分間プレインキュベートした。細胞を、ポリクローナル
抗Ｍｙｃ抗体（１：５００希釈）および抗Ｆｌａｇ抗体（１：５００希釈）に続いて、Ｃ
ｙ３結合抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、シグマ−アルドリッチ、ミズーリ州セントルイ
ス）またはＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（１：５００、シグマ−アルドリッチ、ミズーリ
州セントルイス）で染色した。原稿において示す共焦点顕微鏡観察データは、少なくとも
３通りの同様の実験を代表するものである。

細胞成分分画

細胞成分分画は、それほど変更せずに記載されているとおりに実施した（Ｃａｏ，Ｘ．
，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４（２２）、９７０５〜９７２５（２００４）；
Ｏｈａｓｈｉ，Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（８）、３４４３〜３４５０（２０
０９））。

簡潔に述べると、０．５ｍｌの低張性緩衝液（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭ
のＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、および１ｍＭのＤＴＴ）にプロテイナ
ーゼ阻害剤と共に懸濁させた細胞（１×１０⁷細胞）をホモジナイズし、細胞抽出物を８
００×ｇで１０分間遠心分離した。核を含むペレットを、２００μｌの１．６Ｍスクロー
スを含有するプロテアーゼ阻害剤を加えた低張性緩衝液に再懸濁し、２．０Ｍのスクロー
スを含有する同じ緩衝液１ｍｌをかけ、次いで４℃で９０分間１５０，０００×ｇで遠心
分離して、核画分を得た。上清を４℃で３０分間１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞
質画分を得た。核画分および細胞質画分を１００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ
、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）にプロテイナーゼ阻害剤カクテルと共に再懸濁して、免疫ブロット法分
析に備えた。

ＣＯＸアッセイ
ＣＯＸ 蛍光活性（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）アッセイキット（７
００２００）、ＣＯＸ 蛍光阻害（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）スク
リーニングアッセイキット（７００１００）、およびプロスタグランジンＥ２エンザイム
イムノアッセイ（ＥＩＡ）キット（５１４０１０）を、ケイマンケミカル（ミシガン州ア
ナーバー）から入手した。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性アッセイは、製造者のプロト
コールに従って実施した。

化学合成
¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ブルカーＡＶ ４００分光計（ドイツ
国ブレーメン州）で記録した。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、示した溶媒中で記録したもの
であり、化学シフトは、内部Ｍｅ₄Ｓｉを基準とした百万分率（δ）で表示する。ＩＲス
ペクトルは、ニコレットアベーター（Ｎｉｃｏｌｅｔ Ａｖａｔａｒ）３６０ ＦＴ−Ｉ
Ｒ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサ
ム）で記録した。質量スペクトルは、ブルカーダルトンエスクワイア３０００プラス（Ｅ
ＳＩ直接注入）（ドイツ国ブレーメン州）で記録した。元素分析は、Ｖａｒｉｏ ＲＬ分
析装置を使用して行った。融点は、Ｘ−４ マイクロメルティングポイント装置で決定し
、補正はしていない。この研究で使用した６−フルオロ−１−インダノン４ｂは、市販さ
れている。テトラヒドロフランは、使用前にナトリウムベンゾフェノンケチルから蒸留し
た。ジクロロメタンは、五酸化リンから蒸留した。メタノールは、マグネシウム旋削くず
およびヨウ素から蒸留した。ヤンタイシリカゲル工場（中国）のシリカゲル（ｚｈｉｆｕ
、３００〜４００メッシュ）を、（別段記載しない限り）酢酸エチル／石油エーテル（Ｐ
Ｅ）（６０〜９０℃）混合物またはジクロロメタン／メタノールを溶離液とするカラムク
ロマトグラフィーに使用した。

本発明について、明確にし、理解してもらう目的で多少詳しく記載してきたが、当業者
であれば、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および細部に様々な変更を施し
てよいことを理解するであろう。本明細書で言及するすべての図、表、特許、特許出願、
および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (9)

1. 以下の構造を有する式（Ｉ）の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル：
   ［式中、
   Ａは、フェニルであり、Ａは、Ｒ₃、および０または１個のＲ₄によって置換されており、
   Ｂは、縮合したフェニルであり、Ｂは、フルオロによって置換されており、
   Ｒ₁は、−（ＣＲ₅Ｒ₆）_nＣＯＯＨであり、
   Ｒ₂は、ＣＨ₃であり、
   Ｒ₃およびＲ₄は、Ｃ₂〜₃アルキル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、−ＣＦ₃、Ｃ₃〜Ｃ₄シクロアルキルおよびＣ₄〜Ｃ₅シクロアルキルアルキルからなる群から独立に選択され、
   Ｒ₅およびＲ₆は、Ｈであり、
   ｎは、１または２である］。
2. 以下の構造を有する式（ＩＩ）の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル：
   ［式中、
   Ｒ₁は、ＣＨ₂ＣＯＯＨおよびＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨからなる群から選択され、
   Ｒ₂は、ＣＨ₃であり、
   Ｒ₃は、４−ＣＨ₂ＣＨ₃および４−ＣＨ（ＣＨ₃）₂からなる群から選択される］。
3. 前記化合物が、
   からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル。
4. 前記化合物が、
   からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル。
5. 前記化合物が、
   である、請求項２に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル。
6. 以下の構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル：
   
7. 請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
8. 請求項２に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
9. 請求項６に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。