JP2017008050A - レチノイド受容体に選択的な経路に関する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】式(I)で表される化合物、又は、その薬学的に許容される塩或いはエステル及びそれらを含む組成物。
[AはR3及び0又は1個のR4によって置換されたフェニル;BはF置換された縮合したフェニル;R1は−(CR5R6)nCOOH;R2はCH3;R3及びR4は夫々独立にC2〜3アルキル、n−ブチル、iso−ブチル、sec−ブチル、−CF3、C3〜4シクロアルキル、C4〜C5シクロアルキルアルキル;R5及びR6はH;nは1又は2]
【選択図】なし
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に従い、その全体が参照により本明細書に
援用される、20010年5月6日出願の米国仮特許出願連番第61/332,124号
の優先権を主張する。
本発明は、NIHより授与されたCA109345、および米陸軍医学研究物資司令部
(U.S.Army Medical Research and Material
Command)より授与されたW81XWH−08−1−0478による政府の支援の
もとになされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、レチノイド受容体に選択的な経路に関する方法および組成物の分野にある。
Tegeder,I.ら、FASEB J 15(12)、2057〜2072(200
1);Kashfi,K.およびRigas,B.、Biochem Pharmaco
l 70(7)、969〜986(2005))。NSAIDは、シクロオキシゲナーゼ
(COX−1およびCOX−2)を阻害することで、エイコサノイド産生をブロックする
。NSAIDは、アスピリンの規則的な使用によって結腸がんの発生率が低下するという
発見以来、有望ながん化学予防薬としてかなり注目されたことがある。残念ながら、CO
X−2阻害と関連することがわかっている命にかかわる心血管合併症を始めとした、付随
して出現する副作用が、NSAIDの有望な抗がん効果に影を落としている。COX−2
と発癌の関連にもかかわらず、NSAIDは、COX−1もCOX−2も含まないがん細
胞においてアポトーシスを誘発しており、他の細胞内ターゲットが存在することが示され
ている(Tegeder,I.ら、FASEB J 15(12)、2057〜2072
(2001);Kashfi,K.およびRigas,B.、Biochem Phar
macol 70(7)、969〜986(2005))。
一部の実施形態では、この経路をターゲットとして、腫瘍微小環境を操作する。一実施形
態では、がん細胞においてアポトーシスを誘発する方法を提供する。たとえば、本明細書
に記載の式(II)の化合物などの、がんを予防または治療する組成物を提供することが
できる。一部の実施形態では、本明細書に記載する、化合物K−80003またはK−8
0003類似体を含む組成物を、がん治療に使用する。
ナク硫化物(Suldinac sulfide)」)は、臨床的に妥当な濃度で化合物
RXRαに結合し、RXRα依存的な形でアポトーシスを誘発しており、RXRαが、ス
リンダク作用の細胞内ターゲットであることが確認される。同じく本明細書で示すように
、スリンダクは、がん細胞において、肝要な生存キナーゼであるAKT(プロテインキナ
ーゼB)の活性化を強力に阻害する。さらに、N末端切断型RXRα(tRXRα)は、
がん細胞において、生存シグナル伝達を媒介することも示されている。本明細書で示すよ
うに、スリンダクは、TNFαと組み合わされると、TNFαが誘発するtRXRα/p
85α相互作用を阻害して、この細胞死受容体によって媒介されるアポトーシス経路の活
性化をもたらす。さらに、本明細書に記載のとおりに設計および合成したスリンダク類似
体K−80003は、COX阻害活性なしに、RXRαに対する親和性が増大しており、
動物におけるtRXRα依存的なAKT活性化およびtRXRα腫瘍成長の阻害において
、効力が強化されている。
ら誘導されたRXRαリガンドについて記載する。一実施形態では、がん細胞において腫
瘍壊死因子α(TNFα)活性を上向き調節し、それによって、がん細胞のAKTの抑制
に対する感受性を高める工程と、感受性が高められたがん細胞を化合物と接触させる工程
とを含み、ここで、化合物は、レチノイドX受容体α(RXRα)と相互作用することが
わかっており、また化合物は、プロテインキナーゼB(AKT)の活性を、シクロオキシ
ゲナーゼ−2(COX−2)経路とは無関係に抑制することがわかっている、がん細胞に
おいてアポトーシスを誘発する方法を提供する。この実施形態の一態様では、TNFα活
性の上向き調節は、がん細胞への外因性TNFαの導入を含む。この実施形態の別の態様
では、TNFα活性の上向き調節は、がん細胞における内因性TNFαの上向き調節を含
む。この実施形態の別の態様では、がん細胞は、肺がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細
胞、肝臓がん細胞、および結腸がん細胞からなる群から選択されたがん細胞である。この
実施形態の別の態様では、がん細胞は、A549細胞、H460細胞、ZR−75−1細
胞、MCF−7細胞、LNCaP細胞、PC3細胞、HepG2細胞、Caco2細胞、
およびSW480細胞からなる群から選択されたがん細胞である。この実施形態の別の態
様では、候補化合物が、スリンダクの類似体であり、前記類似体は、RXRαに結合させ
たときIC50がスリンダクよりも小さいこと、およびCOX−2に結合させたときIC50
がスリンダクよりも大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す。
この実施形態の別の態様では、類似体が、K−80001、K−80002、K−800
03、K−80004、およびK−80005からなる群から選択された化合物である。
この実施形態の別の態様では、類似体がK−80003である。
がん細胞におけるAKTの活性の抑制、カスパーゼ8の活性化、BAXの活性化、cFL
IPの阻害、およびBidの分解からなる群から選択された少なくとも1つの活性の能力
を有するかどうかを判定する工程とを含む、がん細胞においてアポトーシスを誘発する能
力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様では
、前記候補化合物がAKTの活性を抑制し得るかどうかの判定が、前記がん細胞を全トラ
ンス型レチノイン酸(ATRA)または9−シス−RAで前処理することによりAKTを
活性化する工程と、前記候補化合物を投与した後の前記がん細胞におけるAKTのレベル
の変化を測定する工程とを含む。
Rα(tRXRα)タンパク質に選択的に結合し得るかどうかを判定する工程とを含む、
細胞においてアポトーシスを誘発する能力について候補化合物をスクリーニングする方法
を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核
酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。
タンパク質を調節し得るかどうかを判定する工程とを含む、細胞においてアポトーシスを
誘発する能力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の
一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核酸、および小分子からなる群
から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記候補化合物がtRXR
αタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前記候補化合物により、tRXRαがp8
5αタンパク質に結合するのを妨げ得るかどうかの判定を含む。この実施形態の別の態様
では、前記候補化合物がtRXRαタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前記候補
化合物により、RXRαがタンパク質修飾を受けるのを妨げ得るかどうかの判定を含む。
この実施形態の別の態様では、前記タンパク質修飾がリン酸化を含む。この実施形態の別
の態様では、前記候補化合物がtRXRαタンパク質を調節し得るかどうかの判定が、前
記候補化合物により、前記tRXRαタンパク質が核から細胞質に移動するのを妨げ得る
かどうかの判定を含む。
物と接触させる工程と、前記候補化合物が前記細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを
判定する工程とを含む、細胞においてアポトーシスを誘発する能力について候補化合物を
スクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペ
プチド、タンパク質、核酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。この
実施形態の別の態様では、前記候補化合物が小分子ライブラリーからの化合物である。こ
の実施形態の別の態様では、前記候補化合物がペプチドライブラリーからの化合物である
。この実施形態の別の態様では、前記細胞が乳房または肝臓からのものである。
物と接触させる工程と、前記候補化合物が前記腫瘍の成長を阻害するかどうかを判定する
工程とを含む、腫瘍の成長を阻害する能力について候補化合物をスクリーニングする方法
を提供する。この実施形態の一態様では、前記候補化合物が、ペプチド、タンパク質、核
酸、および小分子からなる群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では
、前記候補化合物が小分子ライブラリーからの化合物である。この実施形態の別の態様で
は、前記候補化合物がペプチドライブラリーからの化合物である。この実施形態の別の態
様では、前記腫瘍が乳房または肝臓の腫瘍である。
と、前記対象に、AKTの活性を抑制する薬剤を提供する工程とを含み、前記対象の細胞
の表面上で前記薬剤がRXRαに結合する結果、AKT活性が抑制される、対象において
がんを予防する方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記薬剤を投与する前に、
前記対象にTNFαを投与し、それによって、前記薬剤によるAKT阻害に対する、前記
対象のがん細胞の感受性を高める工程をさらに含む。この実施形態の別の態様では、前記
薬剤がスリンダクの類似体である。この実施形態の別の態様では、前記類似体が、K−8
0001、K−80002、K−80003、K−80004、およびK−80005か
らなる群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記類似体がK−
80003である。
シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)経路とは無関係にAKTの活性を抑制すること
がわかっている薬剤を治療有効量与える工程とを含む、哺乳動物においてがんを治療する
方法を提供する。この実施形態の一態様では、前記薬剤を投与する前に、前記哺乳動物に
TNFαを投与し、それによって、前記薬剤によるAKT阻害に対する、前記哺乳動物の
がん細胞の感受性を高める工程をさらに含む。この実施形態の別の態様では、前記薬剤が
スリンダクの類似体である。この実施形態の別の態様では、前記類似体が、K−8000
1、K−80002、K−80003、K−80004、およびK−80005からなる
群から選択された化合物である。この実施形態の別の態様では、前記類似体がK−800
03である。この実施形態の別の態様では、前記哺乳動物がヒトである。
ールまたはヘテロアリールであり、Aは、R3、および0、1または2個のR4によって任
意に置換されていてもよく、Bは、アリールまたはヘテロアリールであり、Bは、0、1
または2個のR4によって任意に置換されていてもよく、R1は、(CR5R6)nCOOH
であり、R2は、H、C1〜10アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアル
キルアルキル、ハロアルキル、アルキルO、アルキルS、およびハロアルキルOからなる
群から選択され、R3およびR4は、H、C1〜10アルキル、ハロアルキル、ハロ、CN、
アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキルO、
アルキルS、(CR4R6)nCONR7R8、OH、シクロアルキル、シクロアルキルアル
キル、シクロアルキルO、およびアルコキシアルキルからなる群から独立に選択され、R
5およびR6は、H、C1〜7アルキル、OH、アルコキシ、シクロアルキルからなる群から
独立に選択され、または一緒になって、シクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形
成しており、nは、0、1、2または3である]を含む組成物を投与する工程を含む、哺
乳動物においてがんを予防または治療する方法を提供する。
与する工程を含み、前記化合物は、RXRαに結合させたときIC50がスリンダクよりも
小さいこと、およびCOX−2に結合させたときIC50がスリンダクよりも大きいことか
らなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す、哺乳動物においてがんを予防また
は治療する方法を提供する。この実施形態の一態様では、R1が、CH2COOHおよびC
H2CH2COOHからなる群から選択され、R2が、CH3およびHからなる群から選択さ
れ、R3が、4−SCH3、4−CH3、4−CH2CH3、および4−CH(CH3)2から
なる群から選択される。
がん細胞において、COX−2活性を阻害することなくRXRαに結合し得るかどうかを
判定する工程とを含む、がん細胞においてRXRα選択的な形でアポトーシスを誘発する
能力について候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この実施形態の一態様で
は、前記候補化合物がRXRαに結合し得るかどうかの判定が、前記がん細胞におけるR
XRαのキモトリプシン消化に対する感受性の変化の検出を含む。この実施形態の別の態
様では、前記候補化合物がRXRαに結合し得るかどうかの判定が、前記がん細胞におけ
る示差走査熱量測定(DSC)プロファイルの変化の検出を含む。
あり、Aは、R3、および0、1または2個のR4によって任意に置換されていてもよく、
Bは、アリールまたはヘテロアリールであり、Bは、0、1または2個のR4によって任
意に置換されていてもよく、R1は、(CR5R6)nCOOHであり、R2は、H、C1〜10
アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル
、アルキルO、アルキルS、およびハロアルキルOからなる群から選択され、R3および
R4は、H、C1〜10アルキル、ハロアルキル、ハロ、CN、アリール、ヘテロアリール、
アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキルO、アルキルS、(CR4R6)n
CONR7R8、OH、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルO、お
よびアルコキシアルキルからなる群から独立に選択され、R5およびR6は、H、C1〜7ア
ルキル、OH、アルコキシ、シクロアルキルからなる群から独立に選択され、または一緒
になって、シクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形成しており、nは、0、1、
2または3である]を含む組成物を提供する。
リンダクよりも小さいこと、およびCOX−2に結合させたときIC50がスリンダクより
も大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す組成物を提供する。
H2COOHからなる群から選択され、R2は、CH3およびHからなる群から選択され、
R3は、4−SCH3、4−CH3、4−CH2CH3、および4−CH(CH3)2からなる
群から選択される]を含む組成物を提供する。この実施形態の一態様では、前記組成物が
、K−80001、K−80002、K−80003、K−80004、およびK−80
005からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、前記組成物がK−80
003である。
なる群から選択され、R2は、H、CH3、Cl、およびFからなる群から選択され、R3
は、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、および
SCH3からなる群から選択される]を含む組成物を提供する。
る群から選択され、R2は、H、CH3、Cl、およびFからなる群から選択され、R3は
、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、およびS
CH3からなる群から選択される]を含む組成物を提供する。
、CH=CHCOOH、CH2−テトラゾール、CH2−CH2−テトラゾール、CH2CO
OCH3、CH3、CH2CONH2、CH2CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、
およびCH2NH2からなる群から選択され、R2は、H、Cl、CH2CH3、OCH3、N
H2、NHCH3、CF3、CH2NH2、CH2OH、CH2Cl、CH(CH3)2、および
OCH2CH3からなる群から選択され、R3は、H、CH=CH2、CCH、C(CH3)3
、CF3、OH、OCH3、OCH2CH3、NH2、NHCH3、CN、NHCOCH3、
からなる群から選択され、R4は、H、Cl、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、OC
H3、OCHCH3、NH2、およびNHCH3からなる群から選択される]を含む組成物を
提供する。
なる群から選択され、R2は、H、CH3、Cl、およびFからなる群から選択され、R3
は、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、および
SCH3からなる群から選択される]を含む組成物を提供する。
る群から選択され、R2は、H、CH3、Cl、およびFからなる群から選択され、R3は
、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、およびS
CH3からなる群から選択される]を含む組成物を提供する。
、CH=CHCOOH、CH2−テトラゾール、CH2−CH2−テトラゾール、CH2CO
OCH3、CH3、CH2CONH2、CH2CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、
およびCH2NH2からなる群から選択され、R2は、H、Cl、CH2CH3、OCH3、N
H2、NHCH3、CF3、CH2NH2、CH2OH、CH2Cl、CH(CH3)2、および
OCH2CH3からなる群から選択され、R3は、H、CH=CH2、CCH、C(CH3)3
、CF3、OH、OCH3、OCH2CH3、NH2、NHCH3、CN、NHCOCH3、
からなる群から選択され、R4は、H、Cl、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2、OC
H3、OCHCH3、NH2、およびNHCH3からなる群から選択される]を含む組成物を
提供する。
ときIC50がスリンダクよりも小さいこと、およびCOX−2に結合させたときIC50が
スリンダクよりも大きいことからなる群から選択された少なくとも一方の特性を示す組成
物を提供する。
−フルオロフェニル)−2−メチルプロパン酸、6−フルオロ−2−メチル−2,3−ジ
ヒドロインデン−1−オン;エチル2−(6−フルオロ−2−メチル−3H−インデン−
1−イル)アセテート;(Z)−2−(3−(4−(メチルチオ)ベンジリデン)−6−
フルオロ−2−メチル−3H−インデン−1−イル)酢酸;(Z)−2−(3−(4−メ
チルベンジリデン)−6−フルオロ−2−メチル−3H−インデン−1−イル)酢酸;(
Z)−2−(3−(4−エチルベンジリデン)−6−フルオロ−2−メチル−3H−イン
デン−1−イル)酢酸;(Z)−2−(3−(4−イソ−プロピルベンジリデン)−6−
フルオロ−2−メチル−3H−インデン−1−イル)酢酸;エチル2−(6−フルオロ−
3H−インデン−1−イル)アセテート;(E)−2−(3−(4−(メチルチオ)ベン
ジリデン)−6−フルオロ−3H−インデン−1−イル)酢酸;スピロ(ジヒドロ−2(
3H)フラノン−5−1’(2’H)(3’H)−6−フルオロ−インダン;メチル3−
(6−フルオロ−3H−インデン−1−イル)プロパノエート;(E)−メチル3−(3
−(4−(メチルチオ)ベンジリデン)−6−フルオロ−3H−インデン−1−イル)プ
ロパノエート;K−80003類似体第1号;K−80003類似体第2号;K−800
03類似体第3号;K−80003類似体第4号;K−80003類似体第5号;K−8
0003類似体第6号;K−80003類似体第7号;K−80003類似体第8号;K
−80003類似体第9号;K−80003類似体第10号;K−80003類似体第1
1号;K−80003類似体第12号;K−80003類似体第13号;K−80003
類似体第14号;K−80003類似体第15号;K−80003類似体第16号;K−
80003類似体第17号;K−80003類似体第18号;K−80003類似体第1
9号;K−80003類似体第20号;K−80003類似体第21号;K−80003
類似体第22号;K−80003類似体第23号;K−80003類似体第24号;K−
80003類似体第25号;K−80003類似体第26号;K−80003類似体第2
7号;K−80003類似体第28号;K−80003類似体第29号;K−80003
類似体第30号;K−80003類似体第31号;K−80003類似体第32号;K−
80003類似体第33号;およびK−80003類似体第34号からなる群から選択さ
れた化合物を含む組成物を提供する。
する組成物および方法を対象とする。この経路を本明細書に記載のとおりに操作して、が
んを治療し、またはがんになるリスクを低減することができる。
用し、AKTを活性化し、足場非依存的な細胞の増殖をもたらす。これらの知見から、が
ん細胞におけるtRXRαを媒介とする生存経路が明かになり、RXRαおよびそのリガ
ンドのがんにおける役割の新たな見通しが示されている。RXRαのタンパク質プロセシ
ングによるこのようなPI3K/AKT生存経路の活性化は、切断型Bid(tBid)
によるアポトーシス経路の活性化および切断型Notchタンパク質によるNotch経
路の活性化に類似している。興味深いことに、BidおよびNotchの切断も、RXR
α切断での影響と同様に、その細胞内局在を変化させる。RXRαがスリンダク作用の細
胞内ターゲットとして働くという発見は、本明細書に記載の、AKT活性を抑制するRX
Rα選択的なスリンダク誘導体を設計する刺激となった。たとえば、本明細書では、RX
Rαに対する親和性がより高く、AKTの阻害において効力が強化されているが、COX
阻害活性は欠如している、スリンダクから導いたRXRαリガンドのK−80003の設
計および合成を示す。加えて、本明細書に記載するように、内因性TNFαの上向き調節
および/または外因性TNFαの導入は、反応性を得るためのがん細胞の予備刺激におい
て有用となり得る。
よび0、1または2個のR4で置換されていてもよい。一部の実施形態では、Bは、アリ
ールまたはヘテロアリールであり、0、1または2個のR4によって任意に置換されてい
てもよい。一部の実施形態では、R1は、(CR5R6)nCOOHである。一部の実施形態
では、R2は、H、C1〜10アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキ
ルアルキル、ハロアルキル、アルキルO、アルキルS、ハロアルキルO、NH2、および
アルキルNからなる群から選択される。一部の実施形態では、R3およびR4は、H、C1
〜10アルキル、ハロアルキル、ハロ、CN、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキ
ル、ヘテロアリールアルキル、アルキルO、アルキルS、(CR4R6)nCONR7R8、
OH、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルO、およびアルコキシ
アルキルからなる群から独立に選択される。一部の実施形態では、R5およびR6は、H、
C1〜7アルキル、OH、アルコキシ、およびシクロアルキルからなる群から独立に選択さ
れ、または、一緒になってシクロアルキル基もしくはヘテロシクリル基を形成する。一部
の実施形態では、nは、0、1、2および3からなる群から選択される。
選択される。一部の実施形態では、R2は、CH3およびHからなる群から選択される。一
部の実施形態では、R3は、4−SCH3、4−CH3、4−CH2CH3、および4−CH
(CH3)2からなる群から選択される。
Clからなる群から選択される。一部の実施形態では、R2は、H、CH3、Cl、および
Fからなる群から選択される。一部の実施形態では、R3は、CH3、CH2CH3、CH(
CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、およびSCH3からなる群から選択され
る。一部の実施形態では、Bおよび/またはDは、ヘテロ環である(たとえば、ヘテロ原
子に限定される)。
ば、一部の実施形態では、組成物は、式IVを有するコア構造を含む。
Clからなる群から選択される。一部の実施形態では、R2は、H、CH3、Cl、および
Fからなる群から選択される。一部の実施形態では、R3は、CH3、CH2CH3、CH(
CH3)2、C(CH3)3、CH2Cl、OCH3、およびSCH3からなる群から選択され
る。一部の実施形態では、Bおよび/またはDは、ヘテロ環である(たとえば、ヘテロ原
子に限定される)。
CH2−テトラゾール、CH2−CH2−テトラゾール、CH2COOCH3、CH3、CH2
CONH2、CH2CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、およびCH2NH2からな
る群から選択される。一部の実施形態では、R2は、H、Cl、CH2CH3、OCH3、N
H2、NHCH3、CF3、CH2NH2、CH2OH、CH2Cl、CH(CH3)2、および
OCH2CH3からなる群から選択される。一部の実施形態では、R3は、H、CH=CH2
、CCH、C(CH3)3、CF3、OH、OCH3、OCH2CH3、NH2、NHCH3、C
N、NHCOCH3、
からなる群から選択される。
3、OCHCH3、NH2、およびNHCH3からなる群から選択される。さらに、R1〜R4
は、当業者に知られている任意の他の適切な基であってもよい。
H2−CH2−テトラゾール、CH2COOCH3、CH3、CH2CONH2、CH2CONH
CH3、CH2OH、CH2CH2OH、およびCH2NH2からなる群から選択される。
OH、CH2Cl、CH(CH3)2、およびOCH2CH3からなる群から選択される。
、NH2、NHCH3、CN、NHCOCH3、
からなる群から選択される。
、およびNHCH3からなる群から選択される。
する化合物の類似体および誘導体を含めて、式I〜IXのいずれかのコア構造を有する、
化合物の類似体をさらに提供する。既知の方法を使用して、本明細書に記載の化合物に様
々な変更を加えて、類似体を生成してもよいことが理解される。さらに、種々のコア構造
のR基は、様々に変えてよいことも理解される。また、本明細書で開示する化合物の類似
体は、既知の化学合成法を使用し、構造活性相関(SAR)研究を実施して、当業者が容
易に調製できることも理解される。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の方法を使
用して、様々な類似体の活性を容易に判定することができる。
のスリンダクのIC50の約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35
%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、90%、95%、または99%である。
ときのスリンダクのIC50より約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35
%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、90%、95%、または100%大きい。一部の実施形態では、COX−1に結合し
た類似体のIC50は、COX−1に結合したときのスリンダクのIC50の約1.5倍、2
倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10
倍、50倍、100倍、250倍、500倍、または1000倍である。
ときのスリンダクのIC50より約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35
%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、90%、95%、または100%大きい。一部の実施形態では、COX−2に結合し
た類似体のIC50は、COX−2に結合したときのスリンダクのIC50の約1.5倍、2
倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10
倍、50倍、100倍、250倍、500倍、または1000倍である。
を例示および規定するために記載する。
キル基を指す。
で置換されているアルキル基を指す。
飽和炭化水素から誘導された基を指す。
ル基である二環式縮合環系を指す。二環式縮合環系は、4〜6員の芳香環または非芳香族
炭素環に縮合したフェニル基からなる。本開示のアリール基は、その基の任意の置換可能
な炭素原子を介して親分子部分に結合することができる。アリール基の典型例として、そ
れに限らないが、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、およびテトラヒドロナ
フチルが挙げられる。
換されているアルキル基を指す。
原子を有する単環式または二環式の飽和炭化水素環系を指す。シクロアルキル基の典型例
として、それに限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、およびシクロペンチルが挙
げられる。
ルキル基で置換されているアルキル基を指す。
で置換されているアルキル基を指す。
た1個、2個、または3個のヘテロ原子を含む5員、6員、または7員環を指す。5員環
は、0個〜2個の二重結合を有し、6員環および7員環は、0個〜3個の二重結合を有す
る。用語「ヘテロシクリル」は、ヘテロシクリル環が、4〜6員の芳香環もしくは非芳香
族炭素環または別の単環式ヘテロシクリル基に縮合している二環式の基も包含する。本開
示のヘテロシクリル基は、その基の炭素原子または窒素原子を介して親分子部分に結合す
ることができる。ヘテロシクリル基の例として、それらに限らないが、ベンゾチエニル、
フリル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル
、モルホリニル、オキサゾリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピリジニル
、ピロリジニル、ピロロピリジニル、ピロリル、チアゾリル、チエニル、およびチオモル
ホリニルが挙げられる。
性の有効性の妨げとならず、宿主または患者に対する毒性が最小限に抑えられている賦形剤
媒質を指す。
であるが、原子が異なって集まっている化学化合物を指す。すなわち、特定の同一の化学
的部分が、空間において異なる配向をとっており、したがって、純粋であるとき、偏光面
を回転させる能力を有する。しかし、一部の純粋な立体異性体は、旋光が、本計装では検
出不可能なほどかすかである場合がある。本明細書に記載の化合物は、1個または複数の
不斉炭素原子を有し、したがって種々の立体異性体を含むことがある。すべての立体異性
体が本発明の範囲内に含まれる。
たは他のいずれかの低減を指す。たとえば、AKTの活性を抑制することとして、AKT
の基礎レベルを低下させ、またはAKT活性化を阻害することが挙げられる。
き、所望の生物学的成果を引き出すのに十分な組成物の量を指す。その成果は、疾患の徴
候、症状、原因の予防、緩和、もしくは寛解、または所望される他のいずれかの生体系の
変化でよい。たとえば、成果には、がん性細胞増殖の減少および/または逆転を含めるこ
とができる。
これらの用語は両方とも、特定の酵素活性を低下させ、または前記酵素の基質の活性もし
くは機能と競合する能力を有する組成物を規定する。
殖を指す。
卵巣がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の皮膚がん、肺がん、肝臓がん、急性骨髄性白血
病、膀胱がん、子宮頚がん、胆管がん、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、胃肉腫、神経
膠腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、膵臓がん、胃がん、または局部の腫瘍
(手術不能の腫瘍、または腫瘍の局所治療が有益となる腫瘍、および固形腫瘍を含める)
を始めとする、当業者に知られている任意の悪性腫瘍の予防および治療に使用することが
できる。
剤およびその製剤によりけりであり、投与量および製剤を所与の患者のために最適化する
ことは、十分に当業者の技量の範囲内である。したがって、たとえば、そのような薬剤は
、標準の製剤方法を使用して、経口、皮下、非経口、粘膜下、静脈内、または他の適切な
経路による投与用に製剤することができる。化合物の有効量および投与方法は、患者の性
別、年齢、体重、および疾患段階、投与が治療的であるか予防的であるか、ならびに当業
者には明白な他の要素に基づき様々となる。
判断に応じて、患者の詳細な状況およびニーズに合わせるべく、適切な投与量および投与
スケジュールを導き出すであろう。通常、患者に投与する組成物の用量範囲は、患者の体
重1kgあたり約0.5〜1000mgとし得る。投与量は、患者の必要に応じて、単回
のものでも、または1日またはそれ以上の日程で投与する2回以上の連続したものでもよ
い。一部の実施形態では、本発明は、類似物について確立されたヒト投与量と同じ投与量
、またはその約0.1%〜500%の間、より好ましくは約25%〜250%の間にある
投与量を使用する。適切なヒト投与量は、たとえば、動物における毒性および効力研究に
よって適格とされるような、ED50値もしくはID50値、またはインビトロ(in vi
tro)もしくはインビボ(in vivo)研究から導かれた他の適切な値から推測す
ることもできる。
して多少の一般化を行うことができる。成人患者のための日用投与計画は、たとえば、0
.1mg〜500mgの間、好ましくは約1mg〜約250mgの間、たとえば約150
mg〜約200mgの経口用量でよい。一部の実施形態では、経口投与剤形は、約5mg
、10mg、25mg、50mg、100mg、125mg、150mg、175mg、
200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450m
g、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、または1000m
gである。化合物は、継続的な治療の期間、たとえば、1週間以上、または数ヶ月もしく
は数年間投与することができる。
を維持するのに十分である、活性部分の血漿レベル、すなわち最小有効濃度(MEC)を
得るために、個々に調節することができる。MECは、各化合物で様々となるが、インビ
トロ(in vitro)データから推定することができる。MECを実現する投与量は
、個体の特徴および投与経路によりけりである。しかし、HPLCアッセイまたは生物検
定を使用して、血漿濃度を求めることができる。
のできる包装品または分注装置の体裁にすることができる。包装品または分注装置には、
投与の説明書を添付することができる。包装品または分注装置には、医薬品の製造、使用
、または販売を取り締まる政府機関によって定められた形で容器に添えられた、薬物の形
態がヒトまたは動物への投与についてその機関に認可されていることを反映する公告を添
付する場合もある。そのような公告は、たとえば、米国食品医薬局によって処方薬用に認
可されたラベル、または認可された製品挿入物でよい。本発明の化合物を含む組成物を、
適合性のある医薬賦形剤中に製剤化したものを、適応症である状態の治療用に調製し、適切
な容器に入れ、ラベルを貼ることもできる。
、Nur77、またはRARβに結合するスリンダクのHPLC分析(図1B)を行った
。RXRα LBDタンパク質を、スリンダクまたは未標識9−シス−RAの存在下また
は非存在下で[3H]9−シス−RAと共にインキュベートした。結合した[3H]9−シ
ス−RAを、液体シンチレーション計数によって定量化した(図1A)。C末端側TAP
タグに融合したRXRαを安定して発現するHEK293T細胞(Stratagene
、カリフォルニア州La Jolla)を、100μMのスリンダク硫化物で、またはこ
れなしで3時間処理した。処理後、細胞を精製し、スリンダク硫化物の存在についてHP
LCで分析した。スリンダク硫化物の標準溶液を使用して検量線を得た。特徴的なピーク
スペクトルおよび保持時間を同定に使用し、定量化に使用する最大のピーク面積を算出し
た(図1Bおよび図10)。スリンダク硫化物はRXRαに結合し、IC50は、アポトー
シスを誘発する濃度範囲にある80μMであった(図1A)。HPLC分析では、スリン
ダクはRXRαに直接結合するが、RARやNur77などの、細胞中の他の核内受容体
には結合しないことが示された(図1Bおよび図10)。
たは非存在下で、[3H]全トランス型RAと共にインキュベートした。結合した[3H]
全トランス型RAを、液体シンチレーション計数によって定量化した。スリンダクは、図
1Bで示した細胞ベースの実験と一致して、RARγに結合しなかった(図9A)。
)用のTREpal2−tk−CAT、および、RXRα/PPARγヘテロ二量体(図
9C)用のDR1 tk−CAT)を、CV−1細胞に一過性に形質移入した。スリンダ
クの存在下または非存在下で、細胞をリガンド(シグリタゾン、10-6M;T3、10-7
M)で処理し、またはそれなしで処理した。CAT活性を求めた。スリンダクは、RXR
α/PPARγヘテロ二量体のトランス活性化を阻害したが、RXR/TRヘテロ二量体
の方は阻害しなかった(図9B、C)。
リプシン(ug/ml)に対する感受性の変更(図1C)、および10μMのRXRα
LBDまたはNur77タンパク質の非存在下および存在下でのスリンダク(100μM
)の19F NMRスペクトルを比較する、示差走査熱量測定(DSC)走査データ(図1
D)も明らかにした。RXRαへの結合は、スリンダクによる、RXRαのキモトリプシ
ン消化に対する感受性の変更(図1C)および示差走査熱量測定(DSC)(図1D)に
よって確認した。加えて、SR11237(10-6M)によって活性化されたRXRαト
ランス活性化の、スリンダクによる阻害も測定した(図1F、実施例2参照)。
ダクの存在下または非存在下において、細胞をRXR選択的アゴニストであるSR112
37(10-6M)で処理し、またはこれなしで処理した。(TREpal)2−tk−C
AT(Zhangら、Nature 358、587〜591(1992a)))(図1
E)およびβRARE−tk−CAT(Zhangら、Nature 355、441〜
446(1992b))(図1F)CAT活性を明らかにした。レポーターアッセイにお
いて、スリンダク結合は、RXRαホモ二量体およびヘテロ二量体トランス活性化を阻害
し(図1E、F、および図10)、スリンダクがRXRα転写アンタゴニストであること
が示された。
9細胞およびRXRα欠如F9細胞(F9−RXRα−/−)におけるスリンダクの細胞
死効果を調べた。
ルムアルデヒドで固定し、DAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)(
1mg/ml)で染色して、核を蛍光顕微鏡で可視化した。核の断片化および/またはク
ロマチンの凝縮を伴う少なくとも300個のGFP陽性細胞をカウントすることにより、
アポトーシス細胞のパーセンテージを求めた。DNA断片化の判定には、Cell De
ath Detection ELISAPLUS(Roche Applied Scie
nce、ドイツ国バイエルン州Penzberg)を使用した。
2)、RARγ siRNA siGENOME SMARpool(M−003439
−01)、およびsiRNA非特異的対照IX(D−001206−09−05)をDH
ARMACON(コロラド州Lafayette)から購入した。Oligofecta
mine試薬(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)を製造者の勧
めに従って使用することにより、1ウェルあたり分割量2.5μlの20mM siRN
Aを、12ウェルプレートで増殖させた細胞に形質移入した。形質移入してから2日後、
ウエスタンブロット法用に細胞を回収した。
M)で24時間処理し、DAPI染色(図2A)、ポリ(ADP−リボース)ポリメラー
ゼ(PARP)切断(図2B)、およびDNA断片化(図2C)によって分析した。H4
60肺がん細胞に対照またはRXRα siRNAを形質移入し、スリンダク(75μM
)で24時間処理し、アポトーシスについてDAPI染色で分析した(図2Dおよび2E
)。
316E(図2G)を形質移入し、スリンダク(75μM)で24時間処理し、DAPI
染色によって分析した。GFP−RXRαを形質移入した細胞では、広範な核の断片化お
よび凝縮が起こった(図2F)。受容体を形質移入した細胞において、アポトーシスを記
録した(図2Gおよび11)。RXRαリガンド結合ポケットの崩壊によって、そのホモ
二量体トランス活性化が弱められた(図11Aおよび11B)。RXRαリガンド結合ポ
ケットの崩壊によって、さらに、そのヘテロ二量体トランス活性化も弱められた(図11
C、11D)。RXRα(20ng)、RXRα/F313S/R316E(20ng)
、β−ガラクトシダーゼ(100ng)、および/またはNur77(100ng)発現
ベクターを、(TREpal)2−tk−CAT(100ng)(図11A、11B)ま
たはβRARE−tk−CAT(100ng)(図11C、D)と共に、CV−1細胞に
一過性に形質移入した。漸増濃度のスリンダク(10、37.5 75、150 300
μM)の存在下または非存在下において、細胞をSR11237(10-6M)で処理し、
またはこれなしで処理した。CAT活性を求めた。
/−細胞においてはほとんど効果を示さなかった(図2A〜2C)。スリンダクのアポト
ーシス効果は、RXRα siRNAを形質移入した細胞においても低下したが(図2E
)、RXRαの形質移入によって、その細胞死効果は強化された(図2F、G)。RXR
α/F313S/R316Eは、リガンドが誘発するホモ二量体またはヘテロ二量体トラ
ンス活性化に反応せず(図11)、スリンダクに対するアポトーシス反応の低下を示した
(図2G)。したがって、RXRαは、スリンダクが誘発するアポトーシスに関与するこ
とがわかった。
(75μM)で、またはこれなしで24時間処理した。アポトーシスをPARP切断(図
2H)およびDAPI染色(図2I)によって明らかにした。RXRα siRNAもし
くは対照siRNAを48時間かけて形質移入し、またはこれなしで形質移入したHCT
116細胞を、スリンダクで6時間処理し、Baxオリゴマー化(図2J)について、ま
たBax/Δ21、Bax/6A7、または抗Hsp60抗体を使用する免疫染色/共焦
点顕微鏡観察によるBax立体構造変化およびミトコンドリア標的化(図2K)について
分析した。約60%の細胞が、BAX立体構造変化を示した。
ポトーシス(図2I)を誘発したが、Bax欠如HCT116細胞(Bax−/−)では
誘発しなかった。HCT116細胞は、COX−2を欠損しているという事実により、ス
リンダクが誘発するアポトーシスが、COX−2非依存的であり得ることが示された。免
疫ブロット法アッセイによって、Baxは、ミトコンドリア上で広範なオリゴマー化を経
たが、RXRα siRNAによって抑止されたことが示された(図2J)。加えて、抗
Bax抗体(Bax/Δ21)およびBax立体構造に感受性のある抗体Bax/6A7
(Nechushtanら、Biochem Biophys Res Commun
254、388〜394(1999))を使用した免疫染色によって、スリンダクが誘発
するBax立体構造変化およびミトコンドリア標的化が、RXRα siRNAによって
弱められたことが実証された(図2K)。総合して、これらの結果は、RXRαが、スリ
ンダクのアポトーシス効果を媒介する細胞内ターゲットとして働く可能性があることを示
している。
ト(LBP)の機能の完全性の維持に不可欠なアミノ酸(Bourguet,W.ら、M
ol Cell 5(2)、289〜298(2000))を変えた、RXRα突然変異
体(RXRα/F313S/R316E)を構築した。
よび逆方向プライマー5’-acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’を使用するポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)によって構築した。PCR産物をEcoRIおよびSalIで消化し
、pCMV−Flagベクターにクローン化した。RXRα突然変異体は、QUIKCH
ANGE(登録商標)突然変異誘発キット(Stratagene、カリフォルニア州L
a Jolla)を使用し、次のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて構築した
。RXRα/F313S/R316E、5’-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCAT
AGCTGTGAAAGA
GCAGCTCGTTCC(逆方向−配列番号2);RXRα/Δ80、5’-CCGGAATTCGGaccacacccac
cctgggc-3’(順方向−配列番号3)および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’(逆
方向−配列番号4);RXRα/Δ100、5’-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3’(
順方向−配列番号5);および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’(逆方向−配列
番号6)。PCR産物をEcoRIおよびXhoIで消化し、pCMV−Mycベクター
に連結した。
トシダーゼ(100ng)、および/またはNur77(100ng)発現ベクターを、
(TREpal)2−tk−CAT(100ng)(図11A)またはβRARE−tk
−CAT(100ng)(図11B)と共に、CV−1細胞に一過性に形質移入した。細
胞をSR11237(10-6M)で、またはこれなしで処理した。CAT活性を求めた。
に対する反応の低下を示した(図2G)(実施例2参照)。
査した。
R−75−1、およびHaCat細胞を一晩栄養欠乏させ、スリンダク(100μM)で
1時間処理し、AKT活性化について免疫ブロット法で分析した(図3A)。HepG2
細胞にはまた、RXRα siRNAを48時間かけて形質移入し、スリンダク(100
μM)で1時間処理し、AKT活性化およびRXRα発現について免疫ブロット法で分析
した(図3B)。
F(100ng/ml)で15分間刺激した。AKT活性化を免疫ブロット法によって分
析した(図12A)。MEFおよびCaco−2細胞を一晩栄養欠乏させ、スリンダクで
30分間前処理した後、全トランス型レチノイン酸(ATRA)(10-7M)に30分間
曝し、AKT活性化について分析した(図12B)。RXRα siRNAを48時間か
けて形質移入した後、9−シス−RA(10-7M)に30分間曝したZR−75−1乳が
ん細胞におけるAKT活性化も、免疫ブロット法によって分析した(図13C)。RXR
αまたは対照siRNAを形質移入したA549肺がん細胞(図3C)、ならびに、ZR
−75−1およびPC3細胞(図3D)を、スリンダク(100μM)で1時間前処理し
た後、TNFα(10ng/ml)に30分間曝し、AKT活性化およびRXRα発現に
ついて免疫ブロット法で分析した。
びHCT116結腸がん細胞を始めとする種々のがん細胞系で観察され(図3A)、CO
X−2非依存的な機序が示された。スリンダクは、EGFによるAKT活性化を阻害しな
かったが、レチノイン酸によるAKT活性化を強力に阻害した。RXRα siRNAを
形質移入すると、スリンダクの効果と同様に、構成性のAKT活性化が有意に低下した(
図3B)。細胞を全トランス型RA(ATRA)で30分間処理すると、AKT活性化が
強力に誘発されたが、スリンダクによって用量依存的に(図12B)、またRXRα s
iRNAによって(図12C)阻害された。スリンダクは、上皮増殖因子が誘発するAK
T活性化を阻害しなかったが(図12A)、レチノイン酸が誘発するAKT活性化を、R
XRα依存的な形で強力に阻害した(図12B、C)。したがって、スリンダクは、RA
が誘発する急速なRXRα依存的AKT活性化を妨げることができる。
549肺がん細胞においてAKTを強力に活性化したが、スリンダクおよびRXRα s
iRNAによって強力に阻害され(図3C)、TNFαによるAKTの活性化がRXRα
依存的であることが示唆された。TNFαは、基礎AKT活性化の高い細胞(ZR−75
−1細胞やPC3細胞など)においてAKTを活性化せず、またスリンダクは、これら細
胞においてAKT活性化に対する阻害効果をほとんど示さなかったが、スリンダクをTN
Fαと組み合わせると、相乗的に、またほぼ完全に、AKT活性化が阻害された(図3D
)。したがって、TNFαは、スリンダクによるAKT阻害に対するがん細胞の感受性を
高めることができ、TNFαは、可能性としてはAKT活性化をRXRα非依存的な形か
らRXRα依存的な形へと変換することにより、がん細胞のスリンダクに対する反応性を
予備刺激し得ることが示唆される。
ー腎臓(BHK)細胞を、D20またはΔN197抗RXRα抗体を使用する免疫共沈降
によって、RXRα−p85α相互作用について分析した(図12D)。9−シス−RA
および/またはスリンダク(100μM)で30分間処理したH292肺がん細胞を、Δ
N197抗体を使用する免疫共沈降によって、RXRα−p85α相互作用について分析
した(図12E)。スリンダクは、EGFによるAKT活性化を阻害しなかったが、レチ
ノイン酸によるAKT活性化を強力に阻害した。さらに、9−シス−レチノイン酸は、t
RXRαのp85αとの相互作用を、ΔN197抗RXRα抗体を使用したときには促進
したが、D20抗RXRα抗体を使用したときには促進しなかった。
Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ)を免疫共沈降(Co−
IP)およびウエスタンブロット法(WB)アッセイで使用した。BHK細胞をATRA
(10-7M)で30分間処理した。可溶化液を調製し、D20抗RXRα抗体またはΔN
197抗RXRα抗体を使用してRXRα−p85α相互作用について分析した(図12
D)。
体(D20)を使用した最初の試みでは、抗体がRXRαタンパク質を有効に免疫沈降さ
せたものの、明確な相互作用が検出されなかった。しかし、RXRαのCOOH末端側の
リガンド結合ドメイン(LBD)に対する別の抗RXRα抗体(ΔN197)を使用した
とき、p85αが、TNFα(図3E)またはRA(図12D、E)に依存的な形で容易
に免疫共沈降した。D20抗RXRα抗体は、N末端側のA/Bドメインのアミノ酸2〜
21を認識し、ΔN197抗RXRα抗体は、C末端側のE/Fドメインを認識するもの
であった(図3E)。ΔN197抗RXRα抗体によるp85αの免疫共沈降には、D2
0 RXRα抗体によって検出されなかった切断型RXRα(tRXRα)の免疫沈降が
伴い、切断型RXRαがN末端側の配列を欠いていることが示された(図12D)。ΔN
197抗RXRα抗体を使用すると、p85αのtRXRαおよび/またはRXRαとの
相互作用は、TNFαによって強化され、スリンダクによって阻害された(図3E)。T
NFα存在下でのp85αのtRXRαとの相互作用も、スリンダクによって阻害された
(図12E)。これらの結果は、tRXRαがp85αに結合し、AKTを活性化するこ
とを示唆するものである。
である
れなしで30分間処理し、可溶化液を、ΔN197 RXRα抗体を使用する免疫ブロッ
ト法によって分析した(図3F)。免疫ブロットにより、RXRαは、異なる細胞内状況
および生物学的過程で、そのアミノ末端において切断される場合が多いことが実証された
(図3F)。
Nu)および細胞質(Cyt)画分を、D20またはΔN197抗RXRα抗体を使用す
る免疫ブロット法によって分析した。調製物の純度を保証するために、画分は、Hsp6
0(細胞質特異的)およびPARP(核特異的)タンパク質の存在に対しても免疫ブロッ
トした(図13)。MEFにおける内因性RXRαの細胞内局在を、抗RXRα(ΔN1
97)を使用した免疫染色後の共焦点顕微鏡観察によって可視化した。細胞をDAPIで
染色して、核も可視化した(図4B)。
上で点状構造を示した(図4A、下部パネル)。MEFにおける44kDaのtRXRα
の産生は、細胞密度によっても調節された(図4A)。低密度で培養した細胞で観察され
た44kDaのtRXRαのレベルは、細胞を高密度で増殖させたとき低下し、より小さ
いRXRα断片の出現を伴った。興味深いことに、44kDaのtRXRαタンパク質の
レベルは、AKT活性化と相関しており(図4A)、RXRαの細胞密度依存的なタンパ
ク質切断が、AKT活性化を調節する重要な機序であるかもしれないことが示唆された。
tRXRαの細胞質局在(図13)と一致して、MEF細胞をΔN197抗RXRα抗体
によって免疫染色したとき、RXRαは主として細胞質中に見られた(図4B)。したが
って、RXRαの極めてN末端側の末端配列が欠失すると、その細胞内局在が変更され、
p85αと相互作用するその能力が付与され得ることになる。本明細書に記載するように
、p85αがtRXRαと免疫共沈降したという知見は、tRXRαがp85αに結合し
、tRXRα依存的なAKT活性化をもたらす可能性があることを示唆するものである。
ロット法で分析した。可溶化液は、ΔN197抗RXRα抗体を使用する免疫ブロット法
によっても調べた(図4A)。マウス胚性線維芽細胞(MEF)におけるtRXRαのレ
ベルは、細胞密度依存的な形でAKT活性化と相関した(図4A)。tRXRαの細胞質
局在と矛盾せず、MEFは、多くの場合、RXRαの形質膜局在を示した(図4B)。
、そのN末端側の80個のアミノ酸(RXRα/Δ80)を欠いているRXRα突然変異
体を構築し、これによって、内因性tRXRαと類似した分子量のRXRα突然変異体タ
ンパク質が産生された。Mycタグ付きRXRα/Δ80をFlag−p85αと共に細
胞に同時形質移入したとき、これらは強力に相互作用し、相互作用は、TNFαによって
さらに強化された(図5A)。対照的に、全長RXRαまたは100個のN末端側アミノ
酸を欠いているRXRα突然変異体(RXRα/Δ100)は、同じ条件下でFlag−
p85αと相互作用しなかった。したがって、RXRαのアミノ酸80から100は、p
85αへの結合にとって極めて重要である。これを裏付けて、そのLBD(RXRα/2
24〜462)でなく、RXRα N末端側A/Bドメイン(RXRα/1〜134)が
、p85αと相互作用した(図5B)。tRXRαの細胞質局在(図13)と一致して、
RXRα/Δ80は、多くが細胞質に存在し、拡散した、時には点状の形質膜局在を示し
た(図5D)。RXRα/Δ100でなくRXRα/Δ80を形質移入すると、種々の細
胞タイプにおいてAKTも強力に活性化された(図5C)。
て調べた。Mycタグ付きRXRα/Δ80およびp85αをA549細胞に同時形質移
入し、Myc−RXRα/Δ80を含有する複合体を抗Myc抗体によって免疫沈降させ
、PI3K活性について検定した。細胞から調製した特異的なMyc−RXRα/Δ80
免疫沈降物は、TNFα依存的な形で強力なPI3K活性を示し(図5Eおよび15)、
p85αと相互作用するその能力(図5A)およびAKTの活性化(図5C)と十分に相
関した。したがって、TNFαが誘発するtRXRα/p85α相互作用は、PI3K/
AKTシグナル伝達を活性化することがわかった。
され、得られる安定なクローンSW480/RXRα/Δ80およびHCT116/RX
Rα/Δ80は、AKT活性化の上昇およびその下流ターゲットであるc−Mycおよび
サイクリンD1の誘導を示した(図5F)。クローン原性生存アッセイを使用して、SW
480/RXRα/Δ80およびHCT116/RXRα/Δ80の増殖を評価した。安
定なクローンは、対照細胞よりはるかに多くのコロニーを形成した(図5G)。RXRα
/Δ80ががん細胞の増殖に及ぼす影響を動物において調べた。このために、同じ数のR
XRα/Δ80発現細胞または対照細胞を、同じヌードマウスの異なる側腹部に注射し、
その増殖を明らかにした。動物において、SW480/RXRα/Δ80およびHCT1
16/RXRα/Δ80によって形成された腫瘍は、対照細胞によって形成された腫瘍よ
りもはるかに速く成長した(図5H〜I)。総合して、これらの結果は、N末端切断型R
XRαがインビボ(in vivo)でのがん細胞増殖の強力なプロモーターであること
を実証するものである。
p85α結合モチーフがRXRαでは遮蔽されることが示唆された。したがって、RXR
αのN末端側A/Bドメインは、全長RXRαと相互作用することがあり(補足図8a)
、分子内相互作用が明らかになった。
細胞に形質移入した。相互作用を、抗Myc抗体を使用するCo−IPによって分析した
(補足図8a)。そのN末端においてGFPと融合させた全長RXRαまたはRXRα/
1〜134、およびそのC末端においてMycエピトープでタグ付けした全長RXRαを
HEK293T細胞に同時形質移入した。36時間後、細胞可溶化液を、IPおよび抗M
yc抗体でのWBによって分析した。
断片の発現は、RXRα切断を誘発した(補足図8b)。RXRα/1〜134を全長R
XRαと共に形質移入すると、おそらくは競合により分子内相互作用が崩壊する結果とし
てRXRα N末端にあるタンパク質分解部位が露出するために、tRXRαのレベルが
高まった(補足図8b)。
ルを高めることができた(図14)。内因性tRXRαの役割を研究するために、RXR
α/1〜134をHeLa細胞において安定して発現させ、RXRα/1〜134を安定
して発現させる細胞では、tRXRαタンパク質が有意に増加し、これに伴って内因性全
長RXRαタンパク質は減少した(図4C)。親HeLa細胞と比べて、HeLa/RX
Rα/1〜134安定クローンは、より高いAKT活性化を伴い(図4C)、軟寒天にお
いて急速に増殖し(図4D)、AKT活性化における内因性tRXRαの役割および細胞
形質転換活性が示唆された。コロニー形成アッセイでは、スリンダクは、安定クローンが
形成したコロニーを強力に阻害した(図4E)。tRXRαの臨床的関連性は、乳がん患
者からの腫瘍組織中にはtRXRαが存在するが、対応する腫瘍周辺組織および正常組織
中には存在しないことによって例証された(図4F)。同様の結果が肝臓がん患者でも得
られた。ヒト肝臓がん検体におけるRXRαの免疫組織化学分析では、腫瘍組織において
強い細胞質RXRα染色が明らかになったが、対応する腫瘍周辺組織においては明らかに
ならなかった(図4G)。まとめると、これらの結果は、tRXRαが、AKTを活性化
することによりがん細胞の増殖および生存の一因となり得ること、ならびにtRXRαに
よって媒介される活性は、スリンダクによって負に調節できることを実証するものである
。
を抑制するためのRXRα選択的なスリンダク誘導体を特定する機会をもたらした。スリ
ンダクのRXRαおよびCOX−2への結合(図7A、18B)を比較して、RXRα結
合には好都合であるが、COX結合には不都合であるスリンダク類似体を設計した。スリ
ンダク硫化物とインドメタシンとの二次元構造を比較した(図18A)。COX−2の活
性部位において結合したスリンダクとインドメタシンのオーバーレイ画像を作成した(図
18B)。スリンダクは、インドメタシンと同様にCOX−2に結合するように直感的に
モデルが作られたものである。
使用して、置換インダノン誘導体(4)を調製した。パーキン反応において、誘導体(1
)を適切な無水物で処理して誘導体(2)を得、次いでこれを接触水素化によって還元し
て誘導体(3)を得た。ポリリン酸(PPA)を触媒とする分子内のフリーデル−クラフ
ツアシル化によって5員環を閉環して、1−インダノン誘導体(4)を得た。誘導体(4
)を、酢酸エチルとリチウムヘキサメチルジシリルアミド(LHMDS)とから発生させ
たエノレートで処理した後、酸性条件下で脱水すると、所望のアセテート(5)が得られ
た。生成したインデン−3−アセテート(5)を置換ベンズアルデヒドと反応させて(ク
ライゼン−シュミット反応)、酸性化した後、スリンダク類似体(Z−6)を得た。スリ
ンダク類似体(9)の合成の一工程は、1−インダノン誘導体(4)のアクリル酸メチル
との、二ヨウ化サマリウム(SmI2)を介した還元カップリングであり、これによって
スピロラクトン(7)が得られた。(7)のメタノール溶液を触媒量のpara−トルエ
ンスルホン酸(p−TsOH)で処理すると、脱水生成物(8)が得られ、これをクライ
ゼン−シュミット反応にかけ、酸性化して、スリンダク類似体(9)を得た。注目すべき
は、化合物(5/8)のクライゼン−シュミット反応において、R2=CH3であるとき、
化合物(6/9)のシス(Z)異性体が主に生成し、一方R2=Hである場合、化合物(
6/9)のトランス(E)異性体が主に生成した。
て、RXRα結合活性からそのCOX阻害を切り離すための、スリンダクの構造を改変す
る戦略を割り出した。スリンダクのRXRαへのドッキングを図7Aに示す。ドッキング
したスリンダクの配向および位置を、9−シス−RA、DHA、およびBMS649の結
晶構造と比較した(図7B)。スリンダクは、RXRα LBPにあるArg316と相
互作用しながら、そのカルボキシレート基が、調べたすべてのRXRαリガンドで見られ
るカルボキシレート基と一直線に並んだ方式で結合した(図7B)。スリンダクのベンジ
ルメチルスルフィド部分は、9−シス−RAのa−イオノン環と一部重なりながら、RX
Rα LBPの疎水性領域に結合した。この結合方式では、4位にある−SCH3基(図
7C)のRXRαタンパク質とのファンデルワールス相互作用は最適でなく、RXRαへ
の結合を改善するための改変の余地があった。RXRα選択的類似体の設計に4位を使用
する発想は、スリンダクプロドラッグ、スリンダクスルホキシド、および代謝産物のスリ
ンダクスルホンがCOX阻害活性を示さない一方で、代謝産物のスリンダク硫化物(本明
細書で使用するもの)が強力なCOX阻害剤である(Haanen、2001)という事
実によって十分に裏付けられた。図7Aに示すように、スリンダクのカルボキシレート基
は、RXRαリガンドのDHA、BMS649、および9−シス−RAにおける同等の基
と比べて、Arg316から離れた位置にあった。D位にある−CH2COOHを、−C
H2CH2COOHなどのより嵩のある基で置き換えれば、カルボキシレート基をArg
316により近づけて配置して、RXRαで、9−シス−RAで観察されたような良好な
電荷−電荷相互作用を実現する助けになることになる。
X結合化合物を特定した。これらの検討に基づき、5種の類似体を設計し、合成した(図
7Cおよび図19)。それらを評価すると、すべての類似体がRXRα結合活性を保持し
ていたことが示され、K−80003が、おそらくは4位にあるそのイソプロピル(i−
Pr)基においてRXRαのヘリックス7上の疎水性残基との相互作用が改善されている
ために、最も強力であった(スリンダクの約34倍)。意義深いことに、K−80003
およびK−80005は、COX活性の検出可能な阻害を伴わず(図7C)、構成性の、
TNFα(図7D)またはIL−1β(示さない)によって誘発されるプロスタグランジ
ンE2(PGE2)産生を阻害しなかった。K−80003のRXRαへの結合は、19
F NMR結合アッセイによっても確認された(図7E)。したがって、スリンダクのR
XRα結合は、そのCOX結合から切り離すことができる。
を播いた。一晩培養した後、血清を含まないDMEM培地において細胞を10ng/ml
のIL−1βで24時間刺激した。細胞を、表示する濃度のスリンダクまたは類似体で1
0分間前処理した後、10μMのアラキドン酸、およびスリンダクまたはその類似体で、
37℃にて30分間同時に処理した。培地を集め、直ちにアッセイにかけた。PGE2産
生を、Prostaglandin E2 EIA Kit−Monoclonalを用
い、製造者の説明書に従って測定した(Cayman Chemical、ミシガン州A
nn Arbor)。PGE2産生(%)は、化合物の存在下で産生されたPGE2の、
媒体のみでのPGE2に対する比として示す。
、K−80003が、おそらくは4位にあるイソプロピル(i−Pr)基においてRXR
αのヘリックス7上の疎水性残基との相互作用が改善されているために、最も強力であっ
た(スリンダクの約34倍)(図7C)。K−80003およびK−80005は、CO
X活性の検出可能な阻害を伴わず(図7C)、構成性の、またはTNFα(図7D)もし
くはIL−1β(示さない)によって誘発されるプロスタグランジンE2(PGE2)産
生を阻害しなかった。K−80003(100μM)の19F NMRスペクトルを、10
μMのRXRα LBDの非存在下と存在下とで比較した(図7E)。
30分間処理し、次いで全トランス型RA(10-7M)で15分間刺激した。AKT活性
化を免疫ブロット法によって分析した。RXRαまたはRARγ siRNAを形質移入
したPC3細胞を、K−80003(50μM)で1時間前処理した後、TNFα(10
ng/ml)に30分間曝した(pRXRα:リン酸化RXRα)。A549細胞にFl
ag−p85αおよびMyc−RXRα/Δ80を形質移入し、スリンダク(50μM)
またはK−80003(50μM)で1時間処理し、TNFαに30分間曝し、抗Fla
g抗体を使用する免疫共沈降によって分析した。K−80003(50μM)は、ATR
Aが誘発するAKT活性化(図20)およびTNFαが誘発するAKT活性化(図8A)
、HeLa/RXRα/1〜134安定クローンのコロニー形成(図8B)、ならびにp
85αのRXRα/Δ80との相互作用(図8C)の阻害において、スリンダク(50μ
M)よりもはるかに有効であった。siRNAによってRXRα発現を減少させることで
、PC3細胞におけるAKT活性化に対するK−80003の阻害効果は、大幅に弱まっ
た。比較において、RARα発現がRARα siRNAによって減少すると、そのよう
な効果は示されなかった。したがって、AKT活性化のK−80003による阻害も、R
XRα発現に依存的であった(図8B)。
のp85αとの相互作用が、K−80003によって、スリンダクの効果と比べて強力に
阻害されたことが実証された(図8C)。
0003(50μM)で6時間処理し、免疫ブロット法によって分析した。K−8000
3は、ZR−75−1細胞においてTNFαと共に使用したとき、PARP切断の誘発で
もスリンダクより有効であった(図8D)。スリンダクと同様に、TNFαと組み合わせ
たK−80003は、HepG2およびPC3細胞において、PARP切断およびカスパ
ーゼ8活性化を相乗的に誘発した(図8E)。
RXRα/Δ80安定クローンのコロニー形成が、K−80003によってほぼ完全に抑
制され、K−80003の細胞増殖阻害能が明らかになった(図8F)。K−80003
がAKT活性化に与える阻害効果は、RXRα siRNAによって消失したが、RAR
γ siRNAでは消失せず(図8F)、K−80003の効果の媒介におけるRXRα
の役割が示唆された。
003(60mg/kg)で2週間腹腔内処置した。腫瘍を取り出し、測定した。意義深
いことに、K−80003は、動物におけるRXRα/Δ80腫瘍の成長に対してスリン
ダクよりはるかに強力な阻害効果を示した(図8G)。まとめると、RXRα選択的なス
リンダク類似体K−80003は、RXRαを媒介とするPI3K/AKTシグナル伝達
およびがん細胞増殖の強力な阻害剤である。
る化合物をスクリーニングする。各候補化合物をマウスに導入し、分析して、候補化合物
が、細胞においてAKTの活性化を抑制し、カスパーゼ8を活性化し、BAXを活性化し
、cFLIPを阻害し、かつ/またはBidを分解し得るかどうかを判定した。スクリー
ニングの際に特定された化合物は、本明細書で開示するさらなるスクリーニングアッセイ
または治療方法に使用することができる。
無関係に機能することがわかっている化合物を投与する。化合物を投与した結果としてが
んが安定化または改善するかについて患者をモニターする。化合物を投与した後の患者に
おいて抗腫瘍性効果が認められる。
80003を含有する150mgの錠剤を1日2回服用するように指示する。患者はモニ
ターされ、化合物投与後にがんにならない。
時間、次いでTNFα(10ng/ml)および/またはスリンダク(75μM)で4時
間処理し、免疫ブロット法によって分析した。対照またはRXRα siRNAを形質移
入したHepG2細胞をTNFαおよび/またはスリンダクで処理し、免疫ブロット法に
よって分析した。
リンダクおよびTNFαで処理すると、PARP切断およびカスパーゼ8活性化(カスパ
ーゼ8切断産物であるp43/p41を指標とする)が有効に誘発されたが、これらの細
胞をスリンダクまたはTNFαのどちらか単独で処理すると、効果がほとんどなかった。
スリンダク/TNFαの組合せのアポトーシス効果は、RXRα選択的リガンドのSR1
1237(図6A)またはRXRα siRNAの形質移入(図6B)によって部分的に
抑制され、RXRαの役割が重ねて実証された。
M)で1時間前処理したHepG2細胞を、TNFαおよびスリンダクで処理し、免疫ブ
ロット法によって分析した。スリンダク/TNFαが誘発するPARP切断の完全な抑制
(図6Cおよび16B〜C)。細胞にカスパーゼ8 siRNAを形質移入した場合も同
様の結果が得られた(図6Dおよび16D)。したがって、スリンダク/TNFαが誘発
するアポトーシスは、外因性のアポトーシス経路を媒介とする。
で処理したHepG2細胞をBax/6A7抗体で免疫染色した。スリンダク処理細胞で
は約15%、スリンダク/TNFα処理細胞では約60%が、Bax染色を示した。Ba
x活性化をもたらした、外因性アポトーシス経路のスリンダクによる潜在的な活性化も調
べた。TNFαもしくはスリンダク単独で、または合わせて処理したHepG2細胞を、
立体構造に感受性のあるBax/6A7抗体を使用する免疫染色によって、Bax活性化
について調べた。細胞をTNFαとスリンダク両方で処理した場合にだけ、有意なBax
染色が観察された(図6E)。外因性アポトーシス経路と内因性アポトーシス経路のクロ
ストークは、Bidの切断および活性化によって結び付けることができる(Liら、Ce
ll 94(4)、491〜501(1998))。実際に、Bidは、TNFαおよび
スリンダクで処理した細胞で有意に分解され(図6A)、スリンダク/TNFαが誘発す
るBax活性化に、Bid活性化が介在している可能性があることが示唆された。
はスリンダクで処理し、免疫ブロット法によって分析した(図6F)。カスパーゼ8(図
6G)およびBax(図6H)のスリンダクおよびTNFαによる活性化。CA−AKT
を形質移入したHepG2細胞をTNFαおよびスリンダクで処理し、抗切断型カスパー
ゼ8またはBax/6A7抗体で免疫染色した。約80%の非形質移入細胞および15%
のCA−AKT形質移入細胞がカスパーゼ8染色を示した。約60%の非形質移入細胞お
よび約13%のCA−AKT形質移入細胞がBax染色を示した。スリンダク/TNFα
が誘発するPARP切断は、構成的活性型AKT(CA−AKT)の形質移入によって阻
害されたが、ドミナントネガティブAKT(DN−AKT)(図6F)の形質移入によっ
て強化された。スリンダク/TNFαの組合せによるアポトーシスの誘発(図17B)な
らびにカスパーゼ8(図6G)およびBax(図6H)の活性化は、一貫して、CA−A
KTによって阻害された。
分析した(図6I)。カスパーゼ8活性化を阻害することにより外因性アポトーシス経路
の強力な阻害剤として働く、AKTシグナル伝達の下流ターゲット遺伝子であるc−FL
IPの発現を調べた。HepG2、A549、およびSW480細胞をTNFαで処理す
ると、短鎖型(c−FLIPS)と長鎖型(c−FLIPL)との両方のc−FLIPが
強力に誘導されたが、スリンダクによって阻害された(図6I)。したがって、スリンダ
クは、TNFαがc−FLIP発現に与える誘導効果を抑制することにより、アポトーシ
スを誘発し得る。
長阻害効果を調査した。K−80003をNaHCO3に溶解させた(pH8.0)。M
CF−7乳房腫瘍組織を有するマウスに、15mg/kgのK−80003、30mg/
kgのK−80003、60mg/kgのK−80003、または対照を、総体積100
ulにして、1日1回胃管栄養法によって投与した。20日間にわたり測定した腫瘍体積
から、経口K−80003で処置したマウスは、対照で処置したマウスと比べて、腫瘍体
積の用量依存的な縮小を見せたことが示された(図21A)。
を行った。K−80003は、毒性が非常に低く(図22A)、静脈内製剤と比べて経口
での生物学的利用能が高くなっており(図22B)、PKプロファイルは望ましかった(
図22C)。
3−(4−フルオロフェニル)−2−メチルアクリル酸(2a)
0mL、242mmol)を加えた。5分間撹拌してよく混合した後、p−フルオロベン
ズアルデヒド(1a)(13.0mL、120mmol)を加えた。混合物を160℃で
12時間加熱した。氷浴で冷却した後、反応混合物に水を加えた。得られた黄色の沈殿を
濾過し、EtOAcで洗浄して、未精製の酸2aを得、これをそのまま次の工程で使用し
た。既知のアクリル酸2a(40)の分析用サンプルを、MeOHから再結晶させて取得
した。2a:淡黄色の結晶。融点155-158℃ (MeOH). IR (KBr): νmax = 3429, 3076, 2
972, 1665, 1596, 1508,1425, 1313, 1298, 1224 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2
.09 (s, 3H, CCH3), 7.22-7.11 (m, 2H, Ph-H), 7.52-7.43 (m, 1H, Ph-H), 7.69 (s, 1H
, CH=CCH3) ppm; 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 12.7, 114.8, 115.1, 131.4, 131.5, 1
32.1, 132.2, 137.5, 161.3, 163.75, 170.4 ppm; MS (ESI) m/z 179 (M-H+).
35g)をメタノール(190mL)に混ぜた混合物を、20気圧の水素中で10時間水
素化した。触媒を濾別し、濾液を濃縮して未精製の3aを得、これをそのまま次の工程で
使用した。化合物3a(40)の分析用サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムク
ロマトグラフィー(酢酸エチル:PE、1:2)によって取得した。3a:無色の油状物
。IR (フィルム): νmax = 3406, 2972, 2933, 1701, 1560, 1509, 1460, 1406, 1223 cm
-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:1.17 (d, J = 6.82 Hz, 3H, CHCH3), 2.77-2.61 (m, 2
H, CH2CH), 3.02 (dd, J = 13.18, 6.35 Hz, 1H, CH2CH), 7.00-6.93 (m, 2H, Ph-H), 7.
16-7.11 (m, 2H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 16.4, 38.4, 41.4, 115.1,
115.1, 130.3, 130.4, 134.5, 134.6, 160.4, 162.8, 182.6 ppm; MS (ESI) m/z 181 (M
-H+).
80℃で4時間加熱した。得られる混合物を氷水中に注ぎ、EtOAcで抽出した。抽出
物を合わせてNaHCO3飽和水溶液で洗浄して、出発材料の酸を除去し、次いでブライ
ンで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュ
カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:PE、1:30)によって精製して、化合物4
a(40)を淡黄色の油状物(1.44g、50%)として得た。NaHCO3層を濃H
Clで酸性化し、EtOAc(3×30mL)で抽出した。抽出物を合わせてブラインで
洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、回収された出発材料3
a(34%)を得た。4aについてのデータ:IR (フィルム) νmax = 3064, 2968, 2932
, 2873, 1716, 1611, 1509, 1486, 1444, 1264, 1158 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)
δ: 1.32 (d, J = 7.37 Hz, 3H, CHCH3), 2.82-2.65 (m, 2H, CH2CH), 3.37 (dd, J = 16
.71, 7.55 Hz, 1H, CH2CH), 7.33-7.26 (m, 1H, Ph-H), 7.44-7.36 (m, 2H, Ph-H) ppm;
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 16.2, 34.4, 42.9, 76.3, 109.7, 109.9, 122.2, 122.5,
127.8, 127.9, 138.1, 148.8, 149.6, 161.1, 163.6, 208.5 ppm; MS (ESI) m/z 187 (M
+Na+).
)
た0℃の溶液に、n−BuLi(2.5Mのn−ヘキサン溶液、17.0mL、42.8
mmol)を滴下した。約30分間撹拌した後、混合物を−78℃に冷却し、EtOAc
(4.20mL、42.8mmol)を加えた。混合物を−78℃でもう30分間撹拌し
た。得られる混合物に、インデノン4aの無水THF溶液(40mL)を滴下した。混合
物を−78℃でもう4時間撹拌し、次いでNH4Cl飽和水溶液で失活させた。混合物を
EtOAc(3×20mL)で抽出した。有機層を合わせて無水Na2SO4で乾燥させ、
濾過し、減圧下で濃縮した。残渣にHOAc/H2SO4(10/1、55mL)を加えた
。室温で5時間撹拌した後、混合物をCH2Cl2(3×15mL)で抽出した。抽出物を
合わせて水、飽和NaHCO3、およびブラインで続けて洗浄し、Na2SO4で乾燥させ
、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフ
ィー(酢酸エチル:PE、1:30)によって精製して、化合物5a(40)を無色の油
状物(3.26g、70%)として得た。IR (フィルム) νmax =2981, 2911, 1736, 161
4, 1590, 1473, 1368, 1329, 1308, 1256, 1154, 1034 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)
δ: 1.25 (t, J = 7.13 Hz, 3H, COOCH2CH3), 2.12 (s, 3H, CCH3), 3.29 (s, 2H, PhCH2
C), 3.48 (s, 2H, PhCCH2), 4.14 (q, J = 7.13 Hz, 2H, COOCH2CH3), 6.79 (ddd, J = 9
.62, 8.12, 2.41 Hz, 1H, Ph-H), 6.96 (dd, J = 9.33, 2.40 Hz, 1H, Ph-H), 7.25 (dd,
J = 8.17, 4.93 Hz, 1H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:14.1, 14.3, 31.5,
42.1, 60.9, 105.6, 105.9, 110.2, 110.4, 123.6, 123.7, 129.6, 129.6, 137.2, 137.
2, 144.6, 147.8, 147.9, 161.2, 163.6, 170.7 ppm; MS (ESI) m/z 257 (M+Na+).
3H−インデン−1−イル)酢酸
(スリンダク硫化物)(6a)
N NaOMe(4.6mL、9mmol)を加えて、橙色の混合物を得た。20分間撹
拌した後、混合物にp−(メチルチオ)ベンズアルデヒド(0.8mL、7.5mmol
)を加えた。得られる混合物を80℃で3.5時間還流させた。減圧下で濃縮した後、残
渣を1N HCl溶液中に注いだ。室温でもう10時間撹拌した後、混合物をEtOAc
(3×15mL)で抽出した。有機層を合わせて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減
圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル:PE、1:2.5
)によって精製して、主としてシス(Z)異性体の6a(スリンダク硫化物)(40)を
黄色の固体(868mg、85%)として得た。トランス(E)異性体は、約2%得られ
た。融点182-185℃ (EtOAc) (文献(40) 融点180-184℃). IR (KBr) νmax = 3445, 3012
, 2914, 2850, 1702, 1602, 1589, 1465, 1410, 1320, 1240, 1171, 1085 cm-1; 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.15 (s, 3H, C=CCH3), 2.54 (s, 3H, SCH3), 3.57 (s, 2H, CH
2COO), 6.77-6.71 (m, 1H, ビニル H), 7.01 (dd, J = 9.31, 2.25 Hz, 1H, ビニル H),
7.25-7.46 (m, 5H, Ph-H), 12.40 (s, 1H, COOH) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 1
0.7, 14.7, 31.5, 106.1, 106.4, 110.6, 110.8, 123.4, 123.5, 125.8, 130.0, 130.3,
131.0, 132.1, 132.6, 138.5, 139.5, 139.5, 139.5, 147.2, 147.3, 161.5, 161.6, 172
.1 ppm; MS (ESI) m/z 331 (M+Na+).
アルデヒドと縮合させることにより、化合物K−80001〜K−80003をそれぞれ
合成した。
ンデン−1−イル)酢酸(6b)
(K−80001)
5, 1733, 1717, 1655, 1599, 1512, 1470, 1408, 1381, 1214, 1172 cm-1; 1H NMR (400
MHz, CDCl3) δ: 2.19 (s, 3H, C=CCH3), 2.41 (s, 3H, Ph-CH3), 3.58 (s, 2H, CH2CO2H
), 6.59-6.53 (m, 1H, ビニル H), 6.87 (dd, J = 8.98, 2.40 Hz, 1H, ビニル H), 7.44
-7.16 (m, 6H, Ph-H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 10.61, 21.43, 29.73, 31.44
, 105.54, 105.77, 110.48, 110.71, 123.73, 123.83, 129.21, 129.32, 129.78, 129.80
, 129.84, 129.87, 131.00, 131.02, 133.48, 138.29, 138.95, 139.76, 146.13, 146.22
, 161.84, 164.29, 176.68 ppm; MS (ESI) m/z 363 (M+Na+). 元素分析:C20H17FO2の計
算値: C, 77.90; H, 5.56. 実測値: C, 77.88; H, 5.99.
ンデン−1−イル)酢酸(6c)
(K−80002)
23, 1705, 1604, 1473, 1465, 1413, 1312, 1229, 1168 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)
δ: 1.29 (t, J = 7.61 Hz, 3H, CH2CH3), 2.20 (s, 3H, C=CCH3), 2.71 (q, J = 7.60
Hz, 2H, CH2CH3), 3.59 (s, 2H, CH2COO), 6.60-6.54 (m, 1H, 芳香族ビニル H), 6.88 (
dd, J = 8.97, 2.39 Hz, 1H, 芳香族ビニル H), 7.19-7.44 (m, 5H, Ph-H) ppm; 13C NMR
(100 MHz, CDCl3) δ: 10.6, 15.4, 28.7, 31.4, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7,
123.8, 128.0, 129.4, 129.7, 129.9, 131.0, 133.7, 138.9, 139.7, 144.6, 161.8, 16
4.2, 176.4 ppm; MS (ESI) m/z 345 (M+Na+). 元素分析:C21H19FO2の計算値: C, 78.24;
H, 5.94. 実測値: C, 78.21; H, 5.55.
3H−インデン−1−イル)酢酸(6d)
(K−80003)
, 1629, 1603, 1507, 1464, 1412, 1315, 1293, 1171, 1134 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CD
Cl3) δ:1.31 (d, J = 6.95 Hz, 6H, CH(CH3)2), 2.20 (s, 3H, C=CCH3), 2.97 (td, J =
13.81, 6.91 Hz, 1H, CH(CH3)2), 3.59 (s, 2H, CH2COO), 6.61-6.88 (m, 2H, 芳香族ビ
ニル H), 7.19-7.46 (m, 6H, Ph-H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:10.6, 23.9, 31.3,
34.0, 76.7, 105.5, 105.7, 110.5, 110.7, 123.7, 123.8, 126.5, 129.4, 129.7, 129.8
, 131.0, 133.7, 139.0, 139.6, 146.1, 146.2, 149.3, 161.8, 164.2, 176.1 ppm; MS (
ESI) m/z 359 (M+Na+). 元素分析:C22H21FO2の計算値: C, 78.55; H, 6.29. 実測値: C
, 78.13; H, 6.02.
0℃の溶液に、n−BuLi(2.5Mのn−ヘキサン溶液、0.8mL、2mmol)
を滴下した。約30分間撹拌した後、混合物を−78℃に冷却し、EtOAc(0.2m
L、2mmol)を加えた。−78℃でもう30分間撹拌した後、インデノン4b(15
0mg、1mmol)を含有する無水THF(0.7mL)を滴下した。混合物を−78
℃でもう2時間撹拌し、次いで飽和NH4Clで失活させた。混合物をEtOAc(3×
5mL)で抽出した。有機層を合わせて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣をAcOH/H2SO4(10/1、3mL)で溶かした。室温で3時間撹拌
した後、混合物をCH2Cl2(3×5mL)で抽出した。抽出物を合わせて水、飽和Na
HCO3、およびブラインで続けて洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過
し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー(
酢酸エチル:PE、1:30)によって精製して、5bを無色の油状物(99mg、49
%)として得た。IR (フィルム) νmax = 3054, 2982, 2931, 1704, 1636, 1486, 1446,
1369, 1345, 1288, 1276 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.28 (t, J = 7.15 Hz, 3
H, CH2CH3), 3.35 (s, 2H, CH2CO2Et), 3.56 (dd, J = 2.93, 1.51 Hz, 2H, CH2CH), 4.1
9 (q, J = 7.15 Hz, 2H, CH3CH2), 6.52 (s, 1H, C=CH), 6.93-7.36 (m, 3H, Ph-H) ppm;
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 14.2, 34.1, 37.4, 61.0, 106.4, 106.7, 111.4, 111.6
, 124.3, 124.4, 134.1, 136.3, 136.4, 139.2, 139.3, 146.3, 146.4, 161.1, 163.5, 1
70.72 ppm. 元素分析:C13H=FO=の計算値: C, 70.90; H, 5.95. 実測値: C, 71.30; H,
6.23.
ン−1−イル)酢酸(6e)
(K−80004)
室温で2N NaOMe(4mL、4mmol)を加えた。20分間撹拌した後、得られ
る混合物に、p−(メチルチオ)ベンズアルデヒド(0.65mL、2.50mmol)
を加えた。混合物を80℃で3.5時間還流させた。得られる溶液を減圧下で濃縮し、次
いで1N HCl中に注いだ。室温で10時間撹拌した後、混合物をEtOAc(3×1
0mL)で抽出した。有機層を合わせて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:PE
、1:2.5)によって精製して、トランス(E)異性体の6e(K−80004)を黄
色の固体(429mg、48%)として得た。融点180-182℃ (EtOAc). 1H NMR (400 MH
z, CDCl3) δ: 2.54 (s, 3H, SCH3), 3.69 (s, 2H, CH2COO), 7.09-7.84 (m, 9H, Ph-H),
12.52 (s, 1H, COOH) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 13.6, 115.5, 115.7, 127.3
, 131.7, 131.8, 139.9, 161.5, 163.9, 174.0 ppm. 元素分析:C19H15FO2Sの計算値: C,
69.92; H, 4.63; F, 5.82; O, 9.80; S, 9.82. 実測値: C, 70.16; H, 4.92.
−インダン(7a)
ノール(0.190mL、2.50mmol)、およびアクリル酸メチル(0.45mL
、5mmol)をTHF(10mL)に溶かした溶液を、アルゴンで20分間パージし、
0℃に冷却した。Sml2(1.50mmol)のTHF(15mL)溶液を、トランス
ファーニードルで加えた。5分後、飽和K2CO3(2mL)で反応を失活させた。得られ
る混合物をEtOAc(3×3mL)で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し、
無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、EtOAc−PE(1
:6)を溶離液とするシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製
して、化合物7a(74.5mg、0.37mmol、73%)を無色の油状物として得
た。IR (フィルム) νmax: 3058, 2945, 2856, 1766, 1603, 1494, 1155 cm-1; 1H NMR (
400 MHz, CDCl3) δ: 2.28-2.52 (m, 4H, ArCCH2), 2.77 (dt, J = 8.0, 1.2 Hz, 2H, Ar
CCH2CH2CO), 2.81-2.90 (m, 1H, ArCH2), 3.00-3.09 (m, 1H, ArCH2), 6.96-7.03 (m, 2H
, Ar-H), 7.18-7.23 (m, 1H, Ar-H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 28.7, 29.5, 33.3,
39.4, 94.1, 109.7 (d, JC-F = 22.4 Hz) 116.6 (d, JC-F = 22.5 Hz), 126.2 (d, JC-F
= 8.3 Hz), 138.8, 144.7 (d, JC-F = 7.4 Hz), 162.2 (d, JC-F = 233.5 Hz), 176.0 p
pm; 元素分析:C12H11FO2の計算値: C, 69.89; H, 5.38. 実測値: C, 69.97; H, 5.62.
ロ−インダン7a(61mg、3mmol)のCH3OH(1.5mL)溶液に、p−T
sOH(6mg)を加えた。混合物を2時間還流させた。NaHCO3の飽和水溶液(2
.0mL)で反応を失活させた。得られる混合物をEtOAc(3×2mL)で抽出した
。有機相を合わせてブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮した。残渣を、EtOAc−PE(1:300)を溶離液とするシリカゲルでのフラッ
シュカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物8a(61mg、0.28mm
ol、94%)を淡黄色の油状物として得た。IR (フィルム) νmax: 2959, 2901, 1739,
1585, 1606, 1473, 1254, 1162 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.68-2.73 (m, 2H
, CH2COO), 2.82-2.88 (m, 2H, ArCCH2), 3.28-3.31 (m, 2H, ArCH2), 3.71 (s, 3H, COO
CH3), 6.30 (t, 1H, J = 1.6 Hz, ArC=CH), 6.83-6.91 (m, 1H, Ar-H), 7.02-7.06 (m, 1
H, Ar-H), 7.33-7.38 (m, 1H, Ar-H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 22.9, 32.4, 37.3
, 51.7, 106.0 (d, JC-F = 23.1 Hz), 111.4 (d, JC-F = 22.8 Hz), 124.4 (d, JC-F = 8
.9 Hz), 130.3, 139.5, 142.4 (d, JC-F = 3.0 Hz), 146.9 (d, JC-F = 8.5 Hz), 162.4
(d, JC-F = 240.6 Hz), 173.4 ppm; 元素分析:C13H13FO2の計算値: C, 70.90; H, 5.95.
実測値: C, 70.50; H, 5.97.
インデン−1−イル)プロパノエート(9a)
(K−80005)
mg、0.5mmol)のCH3OH(1mL)溶液を、窒素で10分間パージし、0℃
に冷却した。新たに調製したCH3ONa(0.75mmol)含有CH3OH(1mL)
を滴下した。30分間撹拌した後、4−(メチルチオ)ベンズアルデヒド(63μL、0
.6mmol)を滴下した。混合物を2時間還流させた。冷却した後、水(3mL)で反
応を失活させ、室温で10分間撹拌した。混合物を1M HClで酸性化してpH=4と
した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をEtOAc(3×5mL)で抽出した。有機層を合
わせてブライン(2mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮
した。残渣を、EtOAc−PE(1:4)を溶離液とするシリカゲルでのフラッシュカ
ラムクロマトグラフィーによって精製して、トランス(E)異性体の9a(112mg、
66%)を黄色の固体として得た。融点:182-184℃ (EtOAc); IR (KBr) νmax: 3055, 29
88, 2925, 1711, 1640, 1488, 1445, 1656, 1290, 1277 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3)
δ: 2.53 (s, 3H, SCH3 ), 2.68 (t, 2H, J = 7.6 Hz, CH2COO), 2.84 (t, 2H, J = 7.6
Hz, ArCCH2), 6.96-7.84 (m, 9H, Ar-H), 12.21 (s, COOH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)
δ: 14.3, 22.6, 32.0, 106.1 (d, JC-F = 23.4 Hz), 111.5 (d, JC-F = 23.0 Hz), 120
.5 (d, JC-F = 9.2 Hz), 122.6, 125.8 (2C), 127.3, 130.4 (2C), 132.8, 134.1, 136.4
, 139.4, 143.2 (d, JC-F = 8.8 Hz), 146.3, 162.2 (d, JC-F = 240.5 Hz), 173.8 ppm;
元素分析:C20H17FO2Sの計算値: C, 70.57; H, 5.03; S, 9.42. 実測値: C, 70.20; H,
4.62; S, 9.01.
である。)
である)。
プラスミド
,S.K.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 102(7)、2
525〜2530(2005);Cao,X.ら、Retinoid X recept
or regulates Nur77/TR3−dependent apoptos
is [corrected] by modulating its nuclear
export and mitochondrial targeting.Mol
Cell Biol 24(22)、9705〜9725(2004);Masia,S
.ら、Rapid, nongenomic actions of retinoic
acid on phosphatidylinositol−3−kinase s
ignaling pathway mediated by the retinoi
c acid receptor.Mol Endocrinol 21(10)、23
91〜2402(2007);Ohashi,E.ら、Cancer Res 69(8
)、3443〜3450(2009);Balkwill,F.、Nat Rev Ca
ncer 9(5)、361〜371(2009);Han,Y.H.ら、Oncoge
ne 25(21)、2974〜2986(2006))。Flag−p85αは、順方
向プライマー5’-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3’および逆方向プライマー5’-acgcg
tcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’を使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって構
築した。PCR産物をEcoRIおよびSalIで消化し、pCMV−Flagベクター
にクローン化した。RXRα突然変異体は、QUIKCHANGE(登録商標)突然変異
誘発キット(Stratagene、カリフォルニア州La Jolla)を使用し、次
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて構築した。RXRα/F313S/R3
16E、5’-GGAACGAGCTGCTGATCGCCTCCTCCTCCCACGAGTCCATAGCTGTGAAAGATGGG(順方向−配
列番号1)および5’-CCCATCTTTCACAGCTATGGACTCGTGGGAGGAGGAGGCGATCAGCAGCTCGTTCC(逆
方向−配列番号2);RXRα/Δ80、5’-CCGGAATTCGGaccacacccaccctgggc-3’(順
方向−配列番号3)および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’(逆方向−配列番号
4);RXRα/Δ100、5’-CCGGAATTCGGgtcagcagcagcgaggac-3’(順方向−配列番
号5)および5’-CCGCTCGAGctaagtcatttggtgcggcg-3’(逆方向−配列番号6)。PCR
産物をEcoRIおよびXhoIで消化し、pCMV−Mycベクターに連結した。
がん細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したRPMI1640で培養した。H
epG2肝臓がんおよびMCF−7ヒトがん細胞は、10%FBSを含有するMEMで維
持した。HEK293Tヒト胚性腎細胞、CV−1ミドリザル腎臓細胞、MEF細胞、A
549ヒト肺がん細胞、HaCatヒトケラチノサイト細胞、BHKベビーハムスター腎
臓細胞、Caco2ヒト結腸がん癌腫細胞、SW480ヒト結腸腺癌細胞、およびHCT
116ヒト結腸細胞は、10%FBSを補充したDMEMで維持した。F9ネズミ胎児性
癌細胞系は、両方の対立遺伝子がRXRα崩壊型であった(Clifford,J.ら、
Embo J 15(16)、4142〜4155(1996))。細胞培養物は、5%
CO2加湿雰囲気中にて37℃で維持した。
ジー(マサチューセッツ州ダンヴァーズ)からのものであった。抗β−アクチン抗体(A
1978)および抗Flag抗体(M2、F3165)は、シグマ−アルドリッチ(ミズ
ーリ州セントルイス)から入手した。抗p85α(#06〜195)抗体は、ミリポア(
マサチューセッツ州ビルリカ)から購入した。Akt1(C−20)sc−1618、G
FP(B−2)sc−9996、HSP60(N−20)sc−1052、c−Myc(
9E10)sc−40PI3、RARγ(C−19)sc−550、RXRα(D20)
sc−553、RXRα(ΔN197)sc−774、PARP(H−250)sc−7
150の抗体は、サンタクルーズバイオテクノロジー(カリフォルニア州サンタクルーズ
)からのものであった。ECL、抗ウサギおよび抗マウスIgG、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合種特異的抗体は、GE ヘルスケア(英国バッキンガムシア州リトルチャルフ
ォント)からのものであった。アレクサ フルオル(登録商標)594ヤギ抗ウサギIg
G(A−11012)およびアレクサ フルオル(登録商標)488ヤギ抗マウスIgG
(A−10667)は、インビトロジェン(カリフォルニア州カールズバッド)から購入
した。プロテイン A/G プラス−アガロース(sc−2003)は、サンタクルーズ
バイオテクノロジー(カリフォルニア州サンタクルーズ)からのものであった。リコンビ
ナントヒトTNFα(210−TA)は、R&D システムズ(ミネソタ州ミネアポリス
)からのものであった。プロテアーゼインヒビターカクテルタブレッツは、ロッシュ(ス
イス国バーゼル)からのものであった。9−シス−レチノイン酸(9−シス−RA)(R
4643)。スリンダク硫化物およびその類似体は、ジメチルスルホキシド(DMSO)
に溶解させて100mMの保存液とした。全トランス型レチノイン酸(ATRA)(R2
625)およびキモトリプシンは、Sigma−Aldrich(ミズーリ州セントルイ
ス)からのものであった。SR11237は、マルシア I.ドーソン(Marcia
I.Dawson)博士(バーナムインスティテュート)の厚意により提供を受けた。
23〜462)を、リガンド結合アッセイ緩衝液中にて、様々な濃度の未標識9−シス−
RAまたはスリンダク硫化物の存在下または非存在下で[3H]−9−シス−RA(アマ
シャムバイオサイエンス、英国アマシャム)と共にインキュベートした。RXRα LB
Dタンパク質を、ニッケルコーティングされたビーズによって捕捉した。結合された放射
標識9−シス−RAを、記載されているとおりにシンチレーションカウンターで定量した
(Kolluri,S.K.ら、Proc Natl Acad Sci U S A
102(7)、2525〜2530(2005))。
体を含む発現ベクターを、FuGene 6形質移入試薬(ロッシュ、スイス国バーゼル
)を使用して、HEK293細胞に形質移入した。10%の仔ウシ血清(SCS、ユタ州
ハイクロンローガン)、2mMのグルタミン、ペニシリン(100U/ml)、およびス
トレプトマイシン(100μg/ml)を補充した完全培地DMEM(メディアテックI
nc.、バージニア州ハーンドン)において、細胞を指数増殖で維持した。形質移入後2
日目に、細胞を、400mg/mlのG418を含有する培地に入れ替えて、形質移入後
20日目に達したとき、薬物耐性コロニーについてシャーレの記録をつけた。RXRα融
合タンパク質の発現を、免疫ブロット法によって明らかにした。細胞を4枚の150mm
プレートにおいて集密に増殖させ、引き続いて100mMのスリンダク硫化物で、または
これなしで3時間処理した。処理後、細胞を50mlの冷PBSで2回洗浄し、ストレプ
トアビジンベースの精製を、ストレプトアビジンビーズを、提供されたストレプトアビジ
ン結合緩衝液で最初に洗浄するまでは、インタープレイ(商標)ママリアンTAPシステ
ム(ストラトジーン、カリフォルニア州ラホーヤ)マニュアルに記載のとおりに実施した
。次いで0.1ml分の希硫酸溶液(pH2)を加えた後、1.0mlのアセトニトリル
を加えた。次いで、サンプルをボルテックスミキサーで30秒間ボルテックス撹拌し、引
き続いて遠心分離した(1000g×5分)。次いで液体サンプルを第2の試験管に移し
、窒素流中で蒸発乾燥させた。残渣を0.12mlのクロマトグラフィー用移動相に溶解
し直し、0.1ml分をHPLCに注入した。HPLC分析は、ミクロソーブ−mv 1
00〜3 C18 100×4.6カラム(バリアン、カリフォルニア州パロアルト)を
使用して実施した。移動相は、1.0ml/分の流量でポンプ注入される4%v/v酢酸
水溶液とアセトニトリル(30:70)からなるものとした。スリンダク硫化物の検出は
、フォトアレイ検出装置(Waters model 2996、ウォーターズ社、マサ
チューセッツ州ミルフォード)を使用して実施し、これにより200〜450nMの間の
スペクトルを収集した。スリンダク硫化物の標準液を使用して検量線を得た。同定には特
徴的なピークスペクトルおよび保持時間を使用し、定量化に使用する4maxのピーク面
積を、ミレニアムクロマトグラフィマネージャーソフトウェア(ウォーターズ社、マサチ
ューセッツ州ミルフォード)を使用して算出した。同様の3通りの実験の1つを示した。
用するインビボ(in vitro)転写−翻訳によって、以前に記載されているとおり
にRXRα LBDを合成した(Kolluri,S.K.ら、Proc Natl A
cad Sci U S A 102(7)、2525〜2530(2005);Zha
ng,X.K.ら、Nature 355(6359)、441〜446(1992);
Zhang,X.−K.ら、Nature.358(6387)、587〜591(19
92))。インビトロ(in vitro)翻訳された35[S]メチオニン標識RXRα
−LBDを、溶媒(1%DMSO)、スリンダク(100μM)、または9−シス−RA
(10-7M)と共に30分間プレインキュベートし、次いで示した濃度のキモトリプシン
で消化した。消化された断片をPAGEによって分離した。
ウム沈殿手順を使用して、記載されているとおりに一過性に形質移入した(Kollur
i,S.K.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 102(7)、
2525〜2530(2005);Cao,X.,ら、Mol Cell Biol 2
4(22)、9705〜9725(2004))。
ルムアルデヒドで固定し、DAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)(
1mg/ml)で染色して、核を蛍光顕微鏡で可視化した(Masia,S.ら、Rap
id, nongenomic actions of retinoic acid
on phosphatidylinositol−3−kinase signali
ng pathway mediated by the retinoic acid
receptor.Mol Endocrinol 21(10)、2391〜240
2(2007);Ohashi,E.ら、Cancer Res 69(8)、3443
〜3450(2009);Balkwill,F.、Nat Rev Cancer 9
(5)、361〜371(2009))。核の断片化および/またはクロマチンの凝縮を
伴う少なくとも300個のGFP陽性細胞をカウントすることにより、アポトーシス細胞
のパーセンテージを求めた。DNA断片化の判定には、セルデスディテクションELIS
APLUS(ロシュアプライドサイエンス、ドイツ国バイエルン州ペンツブルク)を使用した
。同様の3通りの実験の1つを示した。
2)、RARγ siRNA siGENOME SMARpool(M−003439
〜01)、およびsiRNA非特異的対照IX(D−001206〜09−05)をダル
マコロン(コロラド州ラファイエット)から購入した。オリゴフェクトアミン試薬(イン
ビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド)を製造者の勧めに従って使用すること
により、1ウェルあたり分割量2.5μlの20mM siRNAを、12ウェルプレー
トで増殖させた細胞に形質移入した。形質移入してから2日後、ウエスタンブロット法用
に細胞を回収した。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移した。移した
後、抗体を含む5%乳含有TBST(10mMのTris−HCl、pH.8.0、15
0mMのNaCl、0.05%のTween20)で膜をブロックした。次いで膜をTB
STで3回洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗免疫グロブリンを含む5
%乳含有TBST中にて室温で1時間インキュベートした。
、溶解緩衝液(50mMのTris−HCI、pH7.4;150mMのNaCl;20
mMのEDTA;1%のNP−40;1mMのPMSF;50mg/mlのロイペプチン
;20mg/mlのアプロチニン;0.1mMのNa3VO4;および1mMのDTT)に
懸濁させた。プロテイン A/G プラス アガロース ビーズ(サンタクルーズバイオ
テクノロジー、カリフォルニア州サンタクルーズ)と共にインキュベートして細胞抽出物
を清澄にし、次いで適切な抗体および30mlのプロテイン AまたはG プラス アガ
ロース ビーズと共に4℃で一晩インキュベートした。次いでレムリゲル添加液において
ビーズを洗浄および煮沸した後、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用してS
DS−PAGE/免疫ブロット法を実施した。強化型化学発光系(ECL(商標))(ア
マシャムバイオサイエンス、英国アマシャム)を用い、化学発光によって免疫反応産物を
検出した。
ォルニア州ラホーヤ)にクローン化した。得られるpNTAP−RXRα/1〜134を
HeLa細胞に形質移入した。形質移入から48時間後、細胞を400mg/mlのG4
18で2週間かけて選択した。単一クローンを取り出し、免疫ブロット法によって調べた
。HeLa RXR/α1〜134安定クローン、および対照pNTAPベクターを形質
移入したHeLa細胞を、10%FBSおよび0.35%アガロースを0.5%床寒天と
共に補充したDMEMに5×103細胞/ウェル(6ウェルプレート)で播いた。37℃
で12日間インキュベートした後、コロニーを0.005%クリスタルバイオレットで1
時間染色し、カウントした。
レートに350細胞/ウェルで播いた。5日後、細胞を、0.5%血清培地中のスリンダ
ク(50μM)およびK−80003(25μM)で3日間処理した。PBSで洗浄した
後、細胞をPBS中4%パラホルムアルデヒドで20分間かけて固定した。コロニーを0
.1%クリスタルバイオレットで30分間染色し、写真を撮り、コロニーをカウントした
。
って取得した。組織学的正常検体は、腫瘍小結節から少なくとも約3〜5cm離れたもの
としたが、対応する患者から取得した。当研究は、生物医学研究倫理委員会に対してシア
メンユニバーシティインスティテュートが認可しており、患者は全員、説明を受けた上で
同意した。
n=6)患者からの組織を集めた。免疫ブロット法アッセイに向けて、腫瘍およびその周
囲組織を別個に調製し、変更型RIPA緩衝液に溶解させた。可溶化液を8%SDS−P
AGEゲル上で電気泳動にかけ、PVDF膜に移した。膜は、引き続いて、ΔN197抗
RXRα抗体(1:1000)と共に4℃で一晩、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウ
サギIgG抗体(1:5000)と共に室温で1時間インキュベートし、強化型化学発光
(ECL(商標))(アマシャムバイオサイエンス、英国アマシャム)によって検出した
。はがしたブロットを、負荷対照についてモノクローナル抗GAPDH抗体(1:200
0)で探索し直した。免疫組織化学分析については、組織切片をΔN197抗RXRα抗
体(1:500)と共に4℃で一晩インキュベートし、ヤギ抗ウサギ特異的免疫グロブリ
ン(1:100)を用いて室温で30分間検出した。スライドをヘマトキシリンで対比染
色した。
を、一晩チャンバースライドに播いておいた。細胞を、3.7%パラホルムアルデヒドを
含有するPBSで10分間固定し、PBSで2回洗浄した。次いで細胞を、PBS中0.
1%のTritonX−100で5分間透過処理した。固定された細胞を、5%BSAを
含有するPBS中にて室温で30分間プレインキュベートした。細胞を、ポリクローナル
抗Myc抗体(1:500希釈)および抗Flag抗体(1:500希釈)に続いて、C
y3結合抗ウサギIgG(1:1000、シグマ−アルドリッチ、ミズーリ州セントルイ
ス)またはFITC標識抗マウスIgG(1:500、シグマ−アルドリッチ、ミズーリ
州セントルイス)で染色した。原稿において示す共焦点顕微鏡観察データは、少なくとも
3通りの同様の実験を代表するものである。
,ら、Mol Cell Biol 24(22)、9705〜9725(2004);
Ohashi,E.ら、Cancer Res 69(8)、3443〜3450(20
09))。
EPES−KOH、pH7.4、10mMのKCl、10mMのMgCl2、0.5mM
のEGTA、1.5mMのEDTA、pH8.0、および1mMのDTT)にプロテイナ
ーゼ阻害剤と共に懸濁させた細胞(1×107細胞)をホモジナイズし、細胞抽出物を8
00×gで10分間遠心分離した。核を含むペレットを、200μlの1.6Mスクロー
スを含有するプロテアーゼ阻害剤を加えた低張性緩衝液に再懸濁し、2.0Mのスクロー
スを含有する同じ緩衝液1mlをかけ、次いで4℃で90分間150,000×gで遠心
分離して、核画分を得た。上清を4℃で30分間10,000×gで遠心分離して、細胞
質画分を得た。核画分および細胞質画分を100μlの溶解緩衝液(10mMのTris
、pH7.4、150mMのNaCl、1%のTritonX−100、5mMのEDT
A、pH8.0)にプロテイナーゼ阻害剤カクテルと共に再懸濁して、免疫ブロット法分
析に備えた。
COX 蛍光活性(Fluorescent Activity)アッセイキット(7
00200)、COX 蛍光阻害(Fluorescent Inhibitor)スク
リーニングアッセイキット(700100)、およびプロスタグランジンE2エンザイム
イムノアッセイ(EIA)キット(514010)を、ケイマンケミカル(ミシガン州ア
ナーバー)から入手した。COX−1およびCOX−2活性アッセイは、製造者のプロト
コールに従って実施した。
1H NMRおよび13C NMRスペクトルは、ブルカーAV 400分光計(ドイツ
国ブレーメン州)で記録した。1H NMRスペクトルは、示した溶媒中で記録したもの
であり、化学シフトは、内部Me4Siを基準とした百万分率(δ)で表示する。IRス
ペクトルは、ニコレットアベーター(Nicolet Avatar)360 FT−I
R分光光度計(サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサ
ム)で記録した。質量スペクトルは、ブルカーダルトンエスクワイア3000プラス(E
SI直接注入)(ドイツ国ブレーメン州)で記録した。元素分析は、Vario RL分
析装置を使用して行った。融点は、X−4 マイクロメルティングポイント装置で決定し
、補正はしていない。この研究で使用した6−フルオロ−1−インダノン4bは、市販さ
れている。テトラヒドロフランは、使用前にナトリウムベンゾフェノンケチルから蒸留し
た。ジクロロメタンは、五酸化リンから蒸留した。メタノールは、マグネシウム旋削くず
およびヨウ素から蒸留した。ヤンタイシリカゲル工場(中国)のシリカゲル(zhifu
、300〜400メッシュ)を、(別段記載しない限り)酢酸エチル/石油エーテル(P
E)(60〜90℃)混合物またはジクロロメタン/メタノールを溶離液とするカラムク
ロマトグラフィーに使用した。
であれば、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および細部に様々な変更を施し
てよいことを理解するであろう。本明細書で言及するすべての図、表、特許、特許出願、
および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
Claims (9)
- 以下の構造を有する式(I)の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル:
Aは、フェニルであり、Aは、R3、および0または1個のR4によって置換されており、
Bは、縮合したフェニルであり、Bは、フルオロによって置換されており、
R1は、−(CR5R6)nCOOHであり、
R2は、CH3であり、
R3およびR4は、C2〜3アルキル、n−ブチル、iso−ブチル、sec−ブチル、−CF3、C3〜C4シクロアルキルおよびC4〜C5シクロアルキルアルキルからなる群から独立に選択され、
R5およびR6は、Hであり、
nは、1または2である]。 - 以下の構造を有する式(II)の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル:
R1は、CH2COOHおよびCH2CH2COOHからなる群から選択され、
R2は、CH3であり、
R3は、4−CH2CH3および4−CH(CH3)2からなる群から選択される]。 - 前記化合物が、
- 前記化合物が、
- 前記化合物が、
- 以下の構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステル:
- 請求項1に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
- 請求項2に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
- 請求項6に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩もしくはエステルと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
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