KR101881228B1 - 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법 - Google Patents

Abstract

금속 나노입자의 표면플라즈몬공명 현상을 이용하는 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 테스트하는 방법이 제공된다. 수용체가 결합된 상태에서 해당 센서의 금속 나노입자에 비특이 결합 방지 물질을 결합시킨 후 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 세기 변화 D값을 도출하는 단계와, D값을 이용하여 수용체의 결합 상태를 판단하는 단계를 포함한다. 이는 단백질 특이결합과 같은 바이오 센서의 제작 과정 또는 측정 과정에서 in-situ로 진행할 수 있고, 그에 따라 센서의 성능이나 적부 판단을 간편하게 할 수 있다.

Description

표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법{METHOD FOR TESTING SURFACE PLASMON RESONANCE SENSOR}

본 발명은 표면플라즈몬공명 센서 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 센서의 제작 과정 중에 in-situ로 테스트를 진행할 수 있는 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법에 관한 것이다.

표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance)은 입사된 광이 금 이나 은의 금속 박막 또는 나노 입자와 반응할 때 자유전자의 집단적 진동에 의해 발생하는 현상으로 특정 표시자 없이 생체물질 간의 반응을 실시간으로 측정할 수 있는 장점때문에 단백질 칩 분석 및 다양한 바이오 반응들을 측정할 수 있는 바이오센서에 응용되고 있다.

표면플라즈몬공명 센서를 이용하여 단백질 간 특이결합(specific binding) 등과 같은 바이오 측정을 수행할 때, 센서의 표면에는 수용체(ligand)를 흡착시키고 여기에 분석대상물(analytes)을 반응시키며 센서의 출력신호를 검출하게 된다. 이때 센서 표면에 흡착되는 수용체의 양이나 화학적 안정성 등은 분석대상물과의 반응에 중요한 영향을 미친다. 따라서 감도, 재현성, 안정성 등과 같은 분석대상물의 검출 특성을 분석하고 이를 통해 전반적인 센서의 성능을 평가하기 위해서는, 센서 표면에 흡착되는 수용체의 흡착 상황에 대한 적절한 관찰 및 대응, 그리고 분석이 센서의 제작 단계부터 진행될 필요가 있다.

현재 사용되고 있는 대부분의 센서에는 이러한 수용체의 흡착을 센서의 제작 및 준비 단계에서 파악할 수 있는 방법이 존재하지 않는다. 일반적으로 수용체의 흡착 여부는 적절한 표지자(labelling or marker)가 부착된 또 다른 수용체를, 분석대상물을 사이에 두고 이중으로 결합시킨 후 측정하는 방법(sandwich assay) 등을 통해 분석하게 된다. 그러나 이러한 방법은 수용체의 흡착을 분석하기 위해 별도의 센서를 제작하는 것이라 볼 수 있고 모든 처리가 끝난 후 표지자를 측정할 수 있는 별도의 분석 장비를 이용해야 한다.

센서를 제작하는 제작자의 입장에서도 센서의 성능 및 품질 관리라는 측면에서 수용체의 흡착 상황을 센서의 제조 단계에서 직접적으로(in-situ) 분석할 필요가 있으나 이에 대한 적절한 알려져 있는 방법은 존재하지 않는다.

한국특허출원 10-2002-0067661

따라서 본 발명은 표면플라즈몬공명 센서 장치를 제작하는 과정에 in-situ로 센서를 테스트하는 방법을 제공한다.

본 발명은 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 측정 또는 제작 과정에서 수용체의 결합 상태를 판단할 수 있는 테스트 방법을 제공한다.

본 발명은 금속 나노입자의 표면플라즈몬공명 현상을 이용하는 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법을 제공하며, 이는: 수용체가 결합된 상태에서 해당 센서의 금속 나노입자에 비특이 결합 방지 물질을 결합시킨 후 상기 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 세기 변화 D값을 도출하는 단계; 및 상기 D값을 이용하여 상기 수용체의 결합 상태를 판단하는 단계;를 포함한다.

상기 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 변화값에 대한 기준 범위를 미리 마련하고, 해당 센서의 D값을 상기 기준 범위와 비교하여 상기 수용체의 결합 상태를 판단할 수 있다.

상기 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 변화값 D는 상기 센서의 수용체가 결합된 금속 나노입자에 상기 비특이 결합 방지 물질을 결합 하기 전과 후에 각각 버퍼 용액 내에서 상기 금속 나노입자로부터의 반사광을 수신하여 얻어지는 센서의 출력 신호의 차이값이다.

상기 D값이 상기 기준 범위 이상의 값을 가질 경우, 결합된 수용체의 부족 또는 불안정에 따른 수용체의 부적합한 결합 상태로 판단할 수 있다.

본 발명에 따르면, 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 제작 과정 또는 측정 과정 중에 in-situ 센서의 금속 나노입자에 결합된 수용체의 상태 또는 상황을 분석할 수 있는 테스트 방법이 제공된다. 실제 단백질 간 특이결합 등을 측정할 수 있는 센서 장치 또는 시스템을 구성하는 과정에서 수용체의 결합 상태 또는 상황을 분석함으로써 센서의 성능 또는 적부 판단을 간단하게 수행할 수 있다. 이는 해당 센서의 보다 더 신뢰성 있는 측정 결과를 얻을 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법이 적용되는 광섬유 기반 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 제조 과정을 보여주는 도면과 사진이다.
도 2는 본 발명의 테스트 방법이 적용되는 표면플라즈몬공명 센서 장치의 예를 도시한 도면이다.
도 3은 도 2의 센서 장치에 포함된 광섬유 기반 표면플라즈몬공명 센서를 도시한 도면이다.
도 4와 5는 본 발명의 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법의 과정을 설명하기 위해 도시한 도면이다.

이하 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예를 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 수용체 결합 상태를 분석할 수 있는 테스트 방법을 제공한다. 이러한 테스트는 해당 센서를 포함하는 센서 장치의 제작 과정 중에 수행될 수 있다. 예를 들어 광섬유의 말단 코어에 금 나노입자가 흡착된 표면플라즈몬공명 센서를 포함하는 실제 단백질 간 특이결합 등을 측정할 수 있는 센서 장치 또는 시스템을 구성하는 과정에서 수용체의 결합 상태 또는 상황을 분석함으로써 센서의 성능 또는 적부 판단을 간단하게 수행할 수 있고, 그럼으로써 보다 더 신뢰성 있는 측정 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 다시 센서의 제조 과정에 피드백하여 센서의 품질 관리에 반영할 수 있다.

예를 들어 국소화 표면플라즈몬공명 센서를 이용한 단백질 간 특이결합(specific binding)과 같은 바이오 측정은 금속 나노입자에 수용체(ligand)를 결합시키고, 수용체에 분석대상물(analytes)을 반응시키면서 센서의 출력신호를 검출한다. 이러한 측정을 위해서는 센서 외에 측정에 필요한 용액을 제공하기 위한 용액 공급, 공급된 용액을 금속 나노입자에 접촉시키기 위한 요소, 광학측정부 등을 포함하는 하드웨어적인 배치를 구현한 후 검사에 필요한 수용체를 포함하는 용액을 금속 나노입자에 접촉하여 결합시키고, 분석대상물을 포함하는 용액을 접촉시켜서 특이결합을 분석한다.

도 1은 본 발명의 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법이 적용되는 광섬유 기반 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 제조 과정을 보여주는 도면과 사진이다. 도 2는 본 발명의 테스트 방법이 적용되는 표면플라즈몬공명 센서 장치의 예를 도시한 도면이다. 도 3은 도 2의 센서 장치에 포함된 광섬유 기반 표면플라즈몬공명 센서를 도시한 도면이다.

도면을 참조하여, 본 발명의 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법은 도 1 내지 3에 도시한 광섬유 기반 국소화 표면플라즈몬공명 센서에 적합하게 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

광섬유 기반 국소화 표면플라즈몬공명 센서는 도 1에 도시한 바와 같이 예를 들어 광섬유의 말단 코어 부위에 자기조립단원자층(self-assembled monolayer: SAM)을 이용하여 금이나 은과 같은 금속 나노입자를 결합하여 구현할 수 있다.

이러한 표면플라즈몬공명 센서를 도 2와 같은 측정을 수행하기 위한 센서 장치의 하드웨어적 배치를 마련하여 측정 과정을 진행한다. 센서의 하드웨어적 배치는 이를 테면 복수의 용액 주입구(21)와 용액 배출구(22)를 가지는 미세 채널을 포함하는 미세 채널 유닛(2), 용액 주입구(21)로 각각의 용액을 공급하는 용액 공급부(3), 미세 채널 유닛(2)에 장착된 표면플라즈몬공명 센서(1), 및 센서의 후단에 연결된 광학 측정부(4)를 포함할 수 있다. 이러한 센서 장치의 구성은 복수의 용액을 상호 혼합을 최소화하면서 순차로 흘리면서 측정 과정을 진행할 수 있다.

특정한 분석대상물에 대한 특이적 결합을 측정을 하기 위해서는 상술한 센서 장치에 장착된 센서의 금속 나노입자에 수용체(항체)가 결합된 상태에서 분석대상물을 흘려서 항체-항원 반응을 측정한다. 단백질 간 특이결합 등과 같은 측정의 과정은 일반적으로 센서그램(sensorgram)으로 표시한다. 센서그램은 센서의 출력 신호의 크기를 시간에 따라 연속적으로 표시한다.

전립선 암 표지자에 대한 측정을 예로 도시한 도 4와 5에서와 같이, 본 발명의 테스트 방법은 먼저 센서를 버퍼 용액에 담그고 이후 수용체 용액, 버퍼 용액, 비특이 결합(nonspecific binding)을 방지하기 위한 단백질 용액, 버퍼 용액, 항원 용액 등의 순서로 담그며 센서의 출력 신호를 시간에 따라 표시한다.

본 발명의 테스트 방법은 수용체가 구속된 금속 나노입자에 비특이 결합 방지 물질을 결합시키기 전과 후에 센서의 말단 부위(금속 나노입자가 있는 부위)를 버퍼 용액에 담근 상태에서 각각 센서의 출력 신호 세기를 측정한 후 그 차이값으로 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 출력 신호 세기의 변화 D값을 도출한다. 이러한 D값을 이용하여 수용체의 결합 상태를 판단할 수 있다.

여기에서 비특이 결합을 방지하기 위한 물질 또는 단백질은, 센서의 금속 나노입자의 표면 상에서 수용체가 흡착되어 있지 않은 곳에 흡착됨으로써 비특이 결합을 억제하는 역할을 한다. 따라서 수용체가 금속 나노입자 표면에 안정적으로 많이 흡착되어 있을수록 이러한 비특이 결합 방지 물질의 결합은 줄어들게 된다. 반대로 금속 나노입자의 표면 상에 수용체가 조금밖에 흡착되어 있지 않거나 불안정한 상태여서 쉽게 분리될 수 있다면 이러한 비특이 결합 방지를 위한 단백질은 더 많이 결합되게 될 것이다. 즉, 변화 D값이 클수록 센서의 금속 나노입자 표면에 결합된 수용체의 양이 적고 결합 상태도 불안정하다고 할 수 있고, 작을수록 결합된 수용체의 양이 많고 결합 상태도 안정적이라고 판단할 수 있다.

이러한 판단은 예를 들어 미리 기준범위 또는 기준값을 정한 후, 이와 비교하여 수용체의 결합 상태를 판단할 수 있다. 기준범위 또는 기준값은 누적된 측정결과에서 평균적으로 도출될 수 있을 것이다.

비특이 결합 방지용 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 세기 변화 D값은 별도의 처리 과정이나 측정 장비를 필요로 하는 것이 아니고, 검출 대상 특이 결합에 대한 센서 장치의 제작 과정 중에 측정되는 센서그램을 통해 간단하게 도출할 수 있다. 수용체를 결합시킨 후 버퍼 용액 내에서 센서 출력 신호 세기 B를 측정하고, 비특이 결합 방지 물질을 결합시키고 버퍼 용액 내에서 센서의 출력 신호 세기 C를 측정한 후 그 차이(C-B)를 구하면 된다.

실시예

도 1과 같이 금 나노 입자를 광섬유 단면에 흡착시켜 국소화 표면플라즈몬공명(localized surface plasmon resonance) 센서를 구현하였다. 이렇게 제조된 광섬유 기반 표면플라즈몬공명 센서(1), 미세 채널 유닛(2), 용액 공급부(3), 및 광학 측정부(4)를 포함하는 센서 장치의 하드웨어적인 배치를 구현하였다.

예를 들어 미세 채널 유닛(2)은 복수개의 주입구(21)와 배출구(22)를 포함하는 미세 유체 채널을 포함하고, 광섬유 기반의 표면플라즈몬공명 센서(1)이 삽입되는 센서 삽입홀(23)를 가진다. 센서 삽입홀(23)에 삽입된 센서(1)는 전단부가 채널로 노출되어 코어 표면에 구속된 금 나노입자가 채널 내의 유체에 접촉된다. 센서(1)의 후단 부위에는 광학 측정부(4)의 광원(41)과 검출기(42)가 커플러(43)를 통해 연결된다.

측정 대상으로 전립선 암 표지자의 항체-항원 반응을 측정하였다. 이때 항체는 수용체에 해당하고 항원은 분석대상물에 해당한다. 분석대상물인 항원을 측정하기 위한 센서는 도 3과 같이 금 나노입자 표면에 수용체인 항체를 흡착하고, 여기에 비특이 결합을 방지하기 위한 단백질이 흡착된 상태로 구성된다. 비특이 결합 방지용 물질로는 BSA(bovineserumalbumin)를 사용하였다.

구체적으로는, 먼저 용액 공급부(3)를 이용하여 각각 정해진 용액 주입구(21)를 통해 DI 수 또는 버퍼 용액(이하, 버퍼 용액), 수용체 용액, 버퍼 용액, 비특이 결합 방지용 물질을 포함하는 용액, 및 버퍼 용액을 순차로 공급하면서 센서의 출력신호 측정을 통한 센서그램으로 표시하였다. 최종적인 단백질 특이결합 등을 검출하기 위한 최종 측정값을 도출하기 위해 항원을 포함하는 용액을 공급하기 전에 본 발명의 테스트를 진행하였다.

센서의 제작과 분석대상물의 측정 과정 동안 금 나노입자 표면의 상태는 도 4와 같이 나타낼 수 있고, 또한 도 5와 같이 센서그램으로 표시될 수 있다.

도 4 및 도 5에서, 본 발명의 수용체의 결합 상태의 파악 또는 판단은 수용체가 결합된 금 나노입자에 비특이 결합 방지 물질인 BSA를 결합시키고 그러한 결합에 따른 센서의 출력 신호 세기의 변화 D를 도출함으로써 이루어진다. 이는 도 5에서 나타낸 바와 같이 BSA를 결합하기 전과 후에 버퍼 용액을 미세 채널 유닛(2)로 공급한 상태에서 센서의 출력 신호 C와 B의 차이값이다.

수용체의 흡착 상황은 비특이 결합 방지용 단백질의 흡착 정도로 분석이 가능하며 상술한 D값을 이용하여 알 수 있다. 즉 이 D값이 다른 값들이나, 미리 정해진 기준값 또는 기준범위에 비해 상당히 증가하는 것으로 나타난다면 이는 센서 표면 상에 수용체인 항체가 제대로 흡착되지 않고 있다는 것을 의미한다. 반면 D값이 크기가 다른 값들이나 기준범위 또는 기준값에 비해 작게 나타난다면 이는 수용체가 안정적으로 흡착되었음을 의미한다. 이러한 분석은 센서를 제작하고 측정하기 위한 일련의 과정을 표현하는 센서그램을 통해서 분석하게 되므로 별도의 공정이나 장비 없이 매우 간단하게 구현이 가능하다.

참고적으로, 단백질 특이결합을 검출하기 위한 최종적인 측정값은 도 5에서 F으로서, 항원이 항체에 결합되는 것에 의해 발생하는 센서 출력 신호 세기의 변화값 F이다. 이는 항원을 항체에 결합시키기 전과 후에 각각 버퍼 용액을 공급한 상태에서 센서의 금 나노입자로부터의 반사광을 수신하여 얻어진 E와 C의 차이값이다.

이상, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해서 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다 할 것이다.

1: 센서 2: 미세 채널 유닛
3: 용액 공급부 4: 광학 측정부
21: 용액 주입구 22: 용액 배출구
23 : 센서 삽입홀 41: 광원
42: 검출기 43: 커플러

Claims (4)

1. 광섬유의 말단 코어 부위에 자기조립단원자층(self-assembled monolayer: SAM)을 이용하여 금속 나노입자를 결합한 후 분석 대상물에 대한 수용체와 비특이 결합 방지 물질을 순차로 금속 나노 입자에 결합시켜서 제작되는, 금속 나노입자의 표면플라즈몬공명 현상을 이용하는 국소화 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법으로서:
   상기 센서에 대하여 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 변화값에 대한 기준 범위를 미리 마련하는 단계;
   상기 금속 나노입자에 수용체가 결합된 상태에서 해당 센서의 상기 수용체가 결합되지 않은 금속 나노입자에 비특이 결합 방지 물질을 결합시킨 후 상기 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 세기 변화 D값을 도출하는 단계; 및
   해당 센서의 D값을 상기 기준 범위와 비교하여 상기 수용체의 결합 상태를 판단하는 단계;를 포함하고,
   상기 비특이 결합 방지 물질의 결합에 따른 센서의 출력 신호 변화값 D는 상기 센서의 수용체가 결합된 금속 나노입자에 상기 비특이 결합 방지 물질을 결합 하기 전과 후에 각각 버퍼 용액 내에서 상기 금속 나노입자로부터의 반사광을 수신하여 얻어지는 센서의 출력 신호의 차이값인, 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 D값이 상기 기준 범위 이상의 값을 가질 경우, 결합된 수용체의 부족 또는 불안정에 따른 수용체의 부적합한 결합 상태로 판단하는 것인, 표면플라즈몬공명 센서의 테스트 방법.

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