KR101873025B1 - 한방 식물 복합 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 주름 방지 또는 개선, 피부 보습력 증가, 피부 탄력 개선, 피부 장벽 개선, 항산화 효과, 각종 산화독성 및 광독성 등의 노화인자로부터 피부를 보호하는 효과, 미백 효과 등을 나타낸다.

Description

한방 식물 복합 추출물을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING COMPLEX EXTRACT OF ORIENTAL PLANTS}

본 발명은 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화에는 내적요인 및 외적요인에 의한 노화가 있다. 상기 내적요인에 의한 노화는 특별한 환경적인 요인 없이 나이가 들면서 나타나는 자연스러운 현상이다. 반면, 상기 외적요인에 의한 노화는 자외선, 흡연, 스트레스, 화학물질, 공해 등을 포함하는 환경적인 요인에 의한 노화로서, 특히 자외선에 의한 노화가 주된 원인이다.

노화 과정에는 프리라디칼(free radical)에 해당하는 활성산소가 관여한다. 상기 활성산소는 병원균 또는 바이러스와 같은 체내 침입 물질을 제거하거나 억제하는 중요한 역할을 하는 반면, 활성산소종은 에너지가 크고 반응성이 매우 높기 때문에 과다 생성될 경우에는 피부의 효소적 및 비효소적 항산화 방어 시스템을 붕괴시켜 피부 노화를 가속시키는 것으로 알려져 있다(Yang et al., J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 34:275-286, 2008). 활성산소 및 자유라디칼은 피부가 자외선에 노출될 때 더욱 많이 생성되며, 이에 따라 광독성, 광과민증, 피부노화 및 각종 면역관련 질병 등을 유발한다고 보고되고 있다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989).

이와 같은 피부 노화 과정에서, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되며, 이에 따라 피부 세포 및 조직이 파괴된다. 특히, 단백질의 산화는 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알루론산과 같은 피부 결합조직을 손상시켜, 과다 염증반응 및 피부의 탄력을 저하시킨다. 나아가, 손상이 더 심해지게 되면, DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하 상태에까지 이르게 된다.

따라서, 노화된 피부를 빠르게 회복시키고 피부의 노화를 예방하기 위해서는, 신체의 대사 과정 및 자외선 조사에 의해 매개되는 활성산소를 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상된 세포에 대해서는 재생을 촉진시켜 세포를 증식시켜야 할 필요가 있다.

자유라디칼 및 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에는 대표적으로 O₂ ^- (superoxide anion radical), OH(hydroxyl radical), ¹O₂(singlet oxygen), H₂O₂(hydrogen peroxide) 등이 있다. 이러한 활성산소종에 의한 효소적 및 비효소적 산화를 억제함으로써 피부노화를 방지하기 위한 항산화제가 다양하게 개발되어오고 있으며, 합성 항산화제와 천연 항산화제로 크게 구분지을 수 있다.

상기 합성 항산화제의 대표적인 예에는 BHT(butylated hydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole) 등이 포함되는데, 이들은 항산화 효과는 우수하지만 발암성이 높아 인체에 악영향을 줄 수 있다는 문제점이 있으며, 또한 비효소적 항산화 효과에 비해 효소적 항산화 효과가 좋지 않다는 단점이 있는 것으로 알려져 있다.

최근에는 합성 항산화제의 문제점을 보완할 수 있는 천연 항산화제에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 예를 들어, 등록특허공보 제10-1773456호 (2017.08.31)에는 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 혼합하고 5종의 미생물을 이용하여 순서대로 발효시킨 생약복합발효추출물이 항산화, 피부주름개선 및 피부염증완화 효과가 있다고 개시되어 있다. 또한, 공개특허공보 제10-2017-0137536호 (2017.12.13)에는 갱미 추출물, 지모 추출물, 인삼 추출물 및 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 피부 미백, 주름개선, 탄력개선, 트러블개선 또는 항산화 효과가 있다고 개시되어 있다. 상기 천연 항산화제는 발암성과 같은 부작용이 합성 항산화제에 비해 덜하지만, 효소적 항산화 효과 및 비효소적 항산화 효과를 모두 충족시키는데 있어 여전히 한계점을 드러내고 있다.

한편, 노화에는 활성산소 외에도 MMP(Matrix metalloproteinase)라는 효소가 관여한다. 건강한 피부에서는 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성 및 분해가 생체 내에서 적절하게 조절되는 반면, 노화가 진행되면 콜라겐의 합성이 감소하면서 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 이때, MMP 효소는 콜라겐을 분해하는 작용을 나타내므로, 자외선 조사 등에 의해 MMP의 발현이 촉진되면 피부의 노화가 가속화된다.

피부 노화에 영향을 미치는 MMP의 발현을 효율적으로 억제하는 동시에 종래의 합성 항산화제가 나타내는 부작용이 없으면서도, 종래의 천연 항산화제가 달성하지 못한 효소적 항산화 효과 및 비효소적 항산화 효과 모두의 증가를 보여줄 수 있고, 미백 및 보습 효과를 함께 나타낼 수 있는 화장료 조성물에 대한 필요성은 여전히 당업계에 크게 존재한다.

등록특허공보 제10-1773456호 (2017.08.31) 공개특허공보 제10-2017-0137536호 (2017.12.13)

본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 인식하고 피부 노화, 피부 미백, 피부 보습 등과 관련되는 다양한 기전에 관여하여 우수한 효과를 나타낼 수 있는 천연 복합제제를 오랜 기간 동안 실험해온 결과, 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "감초"는 콩과에 속하는 다년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Glycyrrhiza uralensis이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "당귀"는 산형과에 속하는 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리를 건조시킨 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "천궁"은 산형과에 속하는 다년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Cnidium officinale MAKINO이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "작약"은 작약과에 속하는 다년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Paeonia lactiflora이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "자소엽"은 꿀풀과에 속하는 일년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Perilla frutescens이다. 이는 차조기라고도 지칭된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "어성초"는 삼백초과에 속하는 다년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Houttuynia cordata이다. 이는 약모밀이라고도 지칭된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "녹차"는 차나무과에 속하는 다년생 상록교목을 가리키며, 학명은 Camellia sinensis이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "복령"은 복령균(Poria cocos Wolf.)의 균핵을 말린 것이다. 이는 흰솔풍령이라고도 지칭된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "인삼"은 두릅나무과에 속하는 다년생 초본식물을 가리키며, 학명은 Panax ginseng이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상백피"는 뽕나무과에 속하는 뽕나무(Morus alba) 또는 동속 식물의 뿌리껍질로 만든 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 복합 추출물을 포함한다. 여기서, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피는 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 식물 부위 중에서 꽃, 잎, 종자, 열매, 뿌리 및/또는 줄기일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 적절한 추출용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하는데, 여기에는 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물, 또는 분획물이 포함되는 것으로 해석된다. 바람직하게는, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 복합물(예를 들어, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피가 건조 형태로 조합된 형태)을 추출함으로써, 본 발명에 따른 추출물을 수득할 수 있다.

상기 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피는 복합물의 전체 중량을 기준으로 각각 감초 1 - 91 중량%, 당귀 1 - 91 중량%, 천궁 1 - 91 중량%, 작약 1 - 91 중량%, 자소엽 1 - 91 중량%, 어성초 1 - 91 중량%, 녹차 1 - 91 중량%, 복령 1 - 91 중량%, 인삼 1 - 91 중량%, 상백피 1 - 91 중량%일 수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 고온가압 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 고온가압 추출 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가알코올; 클로로포름, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 페트롤륨에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합 형태가 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 물이 추출용매로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 화장료 조성물 중 추출물의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 제형의 종류, 투여 경로, 대상체의 피부 상태 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.0001 내지 20 중량%일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 화장료 조성물에 포함되는 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물은 2:1:1:1:1:1:2:1:1:2의 중량비인 것이 특히 유리하다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 주름 방지 또는 개선, 피부 보습력 증가, 피부 탄력 개선, 피부 장벽 개선, 미백, 항산화 효과, 각종 산화독성 및 광독성 등의 노화인자로부터 피부를 보호하는 효과 등을 우수하게 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 노화의 다양한 기전에 영향을 미침으로써 매우 우수한 항노화 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개선"은 피부 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상 또는 진행의 정도를 감소, 지연, 완화 또는 억제시키는 모든 행위 뿐만 아니라 역전시키는 행위도 포함시키는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 본 발명의 화장료 조성물은 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 화장료 제조방법이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 효능 증진을 위해 상기 추출물 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없다. 선택적으로, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 담체 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 화장품 기능을 부가하거나 증대시키기 위하여 전형적으로 사용되는 성분들이 또한 추가될 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 복합물에 용매를 첨가하는 단계; 추출 공정을 수행하는 단계; 추출물을 분리하여 여과하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

선택적으로, 상기에 따라 수득된 여과액을 동결건조 또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 포함되는 추출물은은 건조된 형태, 농축된 형태, 용액 형태 등일 수 있다.

본 발명에 따른 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피로 이루어진 복합물의 추출물은 개별 추출물에 비해 현저히 우수한 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 특정 조성비로 이루어진 복합 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 다른 조성비에 비해서도 유의적인 상승적 효과를 나타낸다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 페놀성 화합물과 플라보노이드와 같은 대표적인 항산화 성분의 함량이 매우 높다. 특히, 자유라디칼소거시험을 통해 우수한 비효소적 항산화 효과가 입증되었을 뿐만 아니라, 활성산소소거시험을 통해 우수한 효소적 항산화 효과가 입증되었다. 아울러, 본 발명에 따른 추출물은 그 구성성분이 모두 천연 물질로 이루어짐에 따라, 합성 항산화제가 나타내는 발암성과 같은 부작용을 발생시키지 않는다. 이와 같이 인체에 대한 부작용이 없으면서도 비효소적 항산화 효과와 효소적 항산화 효과가 모두 우수하다는 것은 종래의 합성 항산화제와 천연 항산화제가 갖는 문제점을 해결하였다는 점에서 유의적이다.

더욱이, 피부노화의 주된 원인 중 하나인 자외선이 조사되었을 때, 세포외기질과 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포생존율을 빠른 시간 내에 회복시켜주며, 자외선에 의한 세포독성을 완화시켜줄 수 있다.

또한, 콜라겐 분해 효소 MMP(Matrix metalloproteinase)는 자외선 조사에 의해 발현이 촉진되지만, 본 발명에 따른 추출물은 MMP의 발현을 유의적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라 콜라겐의 분해를 효과적으로 방지하여 피부 탄력을 개선하고 노화 진행을 억제할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 조성물은 대상체의 피부색을 밝게 변화시켜 가시적인 미백 효과를 나타내며, 주름의 깊이를 감소시키고, 피부장벽의 손상 회복율이 우수하고 경피수분의 손실을 최소화시켜 보습 효과가 뛰어나다는 것이 생체내(in vivo) 실험을 통해 직접적으로 입증되었다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 주름 방지 또는 개선, 피부 보습력 증가, 피부 탄력 개선, 피부 장벽 개선, 항산화 효과, 각종 산화독성 및 광독성 등의 노화인자로부터 피부를 보호하는 효과, 미백 효과 등이 있다. 이와 같이 다각적 작용을 통해 본 발명에 따른 조성물은 화장품, 피부외용제, 화장료 등으로서 매우 유용하다.

도 1은 각 시료가 나타내는 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)을 보여주는 그래프이다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기위해 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나, 하기의 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 1

건조된 복합 천연물 시료(감초 2 중량부, 당귀 1 중량부, 천궁 1 중량부, 작약 1 중량부, 자소엽 1 중량부, 어성초 1 중량부, 녹차 2 중량부, 복령 1 중량부, 인삼 1 중량부, 상백피 2 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 1"이라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 1

건조된 복합 천연물 시료(감초 1 중량부, 당귀 1 중량부, 천궁 1 중량부, 작약 1 중량부, 자소엽 1 중량부, 어성초 1 중량부, 녹차 1 중량부, 복령 1 중량부, 인삼 1 중량부, 상백피 1 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 2"라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 2

건조된 복합 천연물 시료(감초 2 중량부, 당귀 2 중량부, 천궁 2 중량부, 작약 1 중량부, 자소엽 1 중량부, 어성초 1 중량부, 녹차 1 중량부, 복령 1 중량부, 인삼 1 중량부, 상백피 1 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 3"이라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 3

건조된 복합 천연물 시료(감초 1 중량부, 당귀 1 중량부, 천궁 1 중량부, 작약 2 중량부, 자소엽 2 중량부, 어성초 2 중량부, 녹차 1 중량부, 복령 1 중량부, 인삼 1 중량부, 상백피 1 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 4"라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 4

건조된 복합 천연물 시료(감초 1 중량부, 당귀 1 중량부, 천궁 1 중량부, 작약 1 중량부, 자소엽 1 중량부, 어성초 1 중량부, 녹차 2 중량부, 복령 2 중량부, 인삼 2 중량부, 상백피 1 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 5"라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 5

건조된 복합 천연물 시료(감초 1 중량부, 당귀 1 중량부, 천궁 1 중량부, 작약 1 중량부, 자소엽 1 중량부, 어성초 1 중량부, 녹차 1 중량부, 복령 2 중량부, 인삼 2 중량부, 상백피 2 중량부) 130 g을 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 복합 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 "시료 6"이라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

비교예 6

각각의 건조된 천연물 시료(감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼, 상백피)를 130 g씩 각 반응기에 담아 물 870 g을 첨가하였다. 이어서, 침지된 시료를 가압하에 80℃에서 3시간 동안 추출을 하였다. 추출이 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건에서 20분간 원심분리하여, 천연물 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

그 결과 수득된 여과액을 각각 "시료 7", "시료 8", "시료 9", "시료 10", "시료 11", "시료 12", "시료 13", "시료 14", "시료 15", "시료 16"이라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 항산화 성분의 함유량

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 추출물에 대해, 항산화 성분의 함량을 확인하였다. 이를 위해, 항산화 효과를 나타내는 것으로 이미 당업계에 잘 알려져 있는 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함량을 각 시료에서 측정하였다.

먼저, 페놀성 화합물의 총 함량은 다음과 같이 측정하였다.

각각의 시료 1 mL에 증류수 10 mL를 첨가한 후, 2 mL의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시켰다. 여기에 20% 탄산나트륨을 2 mL 첨가하여 혼합하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표물질의 농도 별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 페놀성 화합물의 총 함량을 산출하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	총 페놀 함량 (mg/g 추출물)
시료 1	18.3
시료 2	14.4
시료 3	13.1
시료 4	13.8
시료 5	12.7
시료 6	13.1
시료 7	11.8
시료 8	9.3
시료 9	8.4
시료 10	10.6
시료 11	7.3
시료 12	7.8
시료 13	12.9
시료 14	5.3
시료 15	10.7
시료 16	6.8

다음으로, 플라보노이드의 총 함량은 다음과 같이 측정하였다.

각각의 시료 1.5 mL에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃·6H₂O를 혼합하고, 상온에서 10분간 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 367 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 카테킨(catechin, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표물질의 농도 별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 플라보노이드의 총 함량을 산출하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	총 플라보노이드 함량 (mg/g 추출물)
시료 1	17.4
시료 2	13.2
시료 3	12.8
시료 4	13.6
시료 5	13.1
시료 6	12.9
시료 7	10.7
시료 8	8.6
시료 9	7.9
시료 10	9.7
시료 11	6.9
시료 12	7.4
시료 13	12.7
시료 14	4.1
시료 15	6.8
시료 16	5.3

상기 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 시료 1의 복합 추출물에서 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함량이 가장 높다는 것이 확인되었다. 본 발명에 따른 추출물 내 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함량이 높다는 것은 본 발명에 따른 추출물의 항산화력이 크다는 것을 의미한다. 특히, 비교예에 해당하는 시료 2 내지 6은 실시예에 해당하는 시료 1과 마찬가지로 감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피를 모두 포함하지만, 각 구성성분의 중량비에 따라 페놀성 화합물과 플라보노이드의 함량에 차이가 있다는 것이 관찰되었다.

시험예 2. 항산화 효과

본 발명의 피부 노화 개선 효과를 검정하기 위하여, 각 시료의 항산화능을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 자유라디칼소거시험(비효소적 항산화 효과시험)과 활성산소소거시험(효소적 항산화 효과시험)을 실시하였다.

(1) 자유라디칼 소거 시험 (비효소적 항산화 효과 시험)

항산화 효과를 확인하기 위해 당업계에서 자주 사용되는 자유라디칼 소거 시험은 안정한 2,2-디페닐-1-피크릴-히드라질(DPPH)의 흡광도가 540 nm에서 최대값을 나타내는 원리에 기초한 것이다. 따라서, 자유라디칼 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록, 즉 자유라디칼 소거율이 증가될수록, 540 nm에서의 흡광도는 감소하게 된다.

먼저 0.1 mM DPPH(Sigma) 용액 1 mL에 상기 실시예에서 제조한 시료를 메탄올에 희석시킨 용액 1 mL를 혼합하였다. 이어서, 37℃에서 15분간 방치한 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 DPPH 1 ml 및 메탄올 1 ml를 넣어 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 메탄올 1 ml 및 시료 1 ml를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다. 하기 식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 산출하여 표 3에 나타내었다.

[식 1]

자유라디칼소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

	자유라디칼소거율(%)
시료 1	0.7
시료 2	1.4
시료 3	1.6
시료 4	1.7
시료 5	1.5
시료 6	1.9
시료 7	4.2
시료 8	5.3
시료 9	8.4
시료 10	5.9
시료 11	9.3
시료 12	8.4
시료 13	1.8
시료 14	10.4
시료 15	9.8
시료 16	8.6

상기 표 3에서, 자유라디칼소거율(%) 값이 작을수록 항산화 활성이 높다는 것을 의미한다. 시료 1의 자유라디칼소거율(%)은 다른 시료 2 내지 16 모두의 자유라디칼소거율(%)에 비해 유의적으로 더 작은 값을 나타내었으며, 이는 본 발명에 따른 추출물에 속하는 시료 1의 항산화 활성이 가장 높다는 것을 의미한다.

(2) 활성산소 소거 시험 (효소적 항산화 효과 시험)

활성산소 소거 시험은 잔틴/잔틴산화효소(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소 반응에 의해 활성산소가 발생되는 원리에 기초한 것이다. 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용하여 흡광도 변화를 측정함으로써, 활성산소의 소거능을 확인할 수 있다.

Na₂CO₃ 2.4 mL, 잔틴(Sigma) 0.1 mL, EDTA 0.1 mL, BSA(소혈청알부민, Sigma) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 시료 0.1 mL을 혼합하고, vortex mixer(Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 voltexing한 후 25℃에서 10분간 방치하였다. 이어서, 잔틴산화효소 0.1mL를 넣고 25℃에서 20분간 반응시켰다. 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 시료 용액 대신 3차 증류수를 넣어 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 잔틴산화효소 용액 대신 3차 증류수를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다. 하기 식 2를 이용하여 활성산소소거율(%)을 산출하여 표 4에 나타내었다.

[식 2]

활성산소소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

	활성산소소거율(%)
시료 1	0.8
시료 2	1.6
시료 3	1.8
시료 4	1.7
시료 5	1.6
시료 6	1.8
시료 7	6.4
시료 8	7.2
시료 9	9.9
시료 10	7.1
시료 11	11.8
시료 12	9.8
시료 13	2.1
시료 14	12.7
시료 15	10.7
시료 16	10.8

상기 표 4에서, 활성산소소거율(%) 값이 작을수록 항산화 활성이 높다는 것을 의미한다. 시료 1의 활성산소소거율(%)은 다른 시료 2 내지 16 모두의 활성산소소거율(%)에 비해 유의적으로 더 작은 값을 나타내었으며, 이는 본 발명에 따른 추출물에 속하는 시료 1의 항산화 활성이 가장 높다는 것을 의미한다.

시험예 3. 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

복합 천연 추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 플레이트에 1x10⁵개씩 분주한 후, 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 500 μL의 PBS를 첨가하였다. 그 후, 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UVB 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 섬유아세포에 자외선 10 mJ/cm²를 조사하였다. 이어서, PBS를 제거하고, 세포배양 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM) 1 mL를 첨가하였다.

여기에 앞서 생산된 각 시료를 농도 0.01% 기준으로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 μL와 MTT 용액(2.5 mg/mL) 60 μL를 첨가한 후, 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 μL씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고, 상등액 100 μL를 96-웰 시험 플레이트로 옮겼다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 565 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

하기 식 3에 의해 세포생존율(%)을 산출하였으며, 하기 식 4에 의해 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)을 산출하였다. 시료 처리농도 0.5%를 기준으로 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)을 하기 표 5에 나타내고, 또한 도 1에 그래프로 나타내었다.

[식 3]

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕x 100

· Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도

· Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도

· St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도

[식 4]

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕x 100

· Bo : 자외선을 조사하지 않고 시료도 처리하지 않은 웰의 세포생존율

· Bt : 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

· St : 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

세포독성 완화율(%)
시료 1	59
시료 2	21
시료 3	18
시료 4	20
시료 5	18
시료 6	18

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물은 자외선에 의해 야기되는 세포 독성을 효과적으로 방어하며, 높은 세포 생존율을 보인다는 것이 확인되었다.

시험예 4. 자외선조사 후 MMP-1 발현 억제 효과

앞서 언급된 바와 같이, 콜라겐을 분해하는 효소 MMP(Matrix metalloproteinase)는 자외선 조사에 의해 그 발현이 촉진될 수 있으며, 이 경우 콜라겐 분해가 활성화되고 이에 따라 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성되는 결과에 이르게 된다.

본 시험예에서는 피부 탄력 저하, 주름 형성, 노화와 관련되는 MMP-1의 UV 조사 및 시료 첨가 후 농도를 측정함으로써, 시료에 의한 MMP-1 발현 억제 효과를 확인하였다. 이를 위해 다음과 같이 효소면역분석법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/cm²의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량 및 배양 시간을 결정하기 위하여, 예비 실험을 통해 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확인하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA 환경에서 같은 시간 동안 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 상태 그대로이며, UVA를 조사한 후 시료가 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅하였다.

일차항체로서 MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2 (Ab-3) 단일클론항체를 처리하고, 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 동안 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/ml ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 음성 대조군으로서 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였으며, 양성 대조군으로서 MMP-1 발현 억제효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀을 사용하였다. 시료 처리농도 0.01%를 기준으로 MMP-1 발현 억제율(%)을 하기 표 6에 나타내었다.

MMP-1 발현 억제율 (%)
시료 1	35.1
시료 2	20.4
시료 3	19.8
시료 4	21.2
시료 5	20.6
시료 6	20.0
양성 대조군 - 레티놀	22.5

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 시료 1은 양성 대조군으로 사용된 레티놀의 MMP-1 발현 억제율 22.5%보다 훨씬 우수한 효과를 나타내었다. 이는 본 발명에 따른 추출물이 MMP 효소의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 효율적으로 막을 수 있으며, 이에 따라 피부 탄력 저하 및 주름 형성을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

시험예 6. 인비보(in-vivo) 효과

본 발명에 따른 조성물의 미백 효과, 주름개선 효과, 피부장벽 손상 개선 효과를 검정하기 위하여, 하기 표 7의 구성성분 및 함량에 따라 영양크림을 제조하였다.

번호	성 분	제형예 1	제형비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리소르베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히알루로네이트	3.0	3.0
16	시료 1	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

(1) 미백 효과 시험

미백 효과를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세 이상의 여성 20명을 대상으로 상기 표 7에 따라 제조된 제형예 1 및 제형비교예 1의 영양크림을 각각 12주간 사용하게 하였다. 그 후 Chromameter(CR-410, Minolta, Japan)를 이용하여 피부색의 밝기 변화(△L)를 측정하였다. 20명의 측정값의 평균을 하기 표 8에 나타내었다.

	피부색 밝기 변화(△L)
	제형예 1	제형비교예 1
영양크림 도포 12주 후	4.21	0.54

상기 표 8에서, 피부색 밝기 변화(△L) 값이 높을수록 미백 효과가 우수하다는 것을 의미한다. 제형예 1의 영양크림을 사용한 경우 제형비교예 1의 영양크림을 사용한 경우보다 피부색이 유의적으로 밝아졌으며, 본 발명에서 목적하는 미백 효과가 달성되었다.

(2) 주름개선 효과 시험

주름개선 효과를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 피부노화가 진행 중인 30대 이상의 여성 10명을 대상으로 상기 표 8에 따라 제조된 제형예 1 및 제형비교예 1의 영양크림을 각각 12주 동안 양쪽 눈가주름(crow feets) 부위에 사용하게 하였다. 4주째, 8주째, 12주째에 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이(μm)를 측정하였다. 10명의 측정값의 평균을 하기 표 9에 나타내었다.

	주름의 깊이 (μm)
	제형예 1	제형비교예 1
영양크림 도포 전	348 ± 12	338 ± 10
영양크림 도포 12주 후	288 ± 21	319 ± 11
주름깊이 감소율(%)	17.2	5.62

상기 표 9에서, 주름깊이 감소율(%) 값이 높을수록 주름개선 효과가 우수하다는 것을 의미한다. 제형예 1의 영양크림을 사용한 경우 제형비교예 1의 영양크림을 사용한 경우보다 주름깊이가 유의적으로 감소되었으며, 본 발명에서 목적하는 주름개선 효과가 달성되었다.

(3) 피부장벽 손상 개선 효과 시험

피부장벽 손상 개선 효과를 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 피부장벽을 손상시키기 위해 아세톤을 사용하였다. 8~12주령의 무모생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분손실량(TEWL; transepidermal water loss)이 4.0 g/m²/h에 도달하면, 상기 제형예 1 및 제형비교예 1의 영양크림을 각각 도포하였다. TEWL은 C+K사(Cologne, Germany)의 증발계 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과 후의 TEWL 측정값과 초기 TEWL 측정값의 차이를 통해 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써, 피부장벽기능이 회복되는 정도를 확인하였다. 피부장벽회복율은 하기 식 5에 따라 산출하였으며, 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다.

[식 5]

Br(Barrier Recovery) = (1-(B_t=6 - B_t=0)/(B_t=d - B_t=0)) x 100

· B_t=6 : 피부장벽 손상으로부터 6시간 경과 후의 TEWL 측정값

· B_t=0 : 피부장벽 손상 이전의 TEWL 측정값

· B_t=d : 피부장벽 손상 직후의 TEWL 측정값

	피부장벽회복율 (%)
	제형예 1	제형비교예 1
6시간 경과 후 (초기 TEWL 기준)	43	10

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물이 포함된 제형예 1의 영양크림은 본 발명에 속하지 않는 제형비교예 1의 영양크림에 비해 피부장벽의 손상 회복율이 우수하고 경피수분의 손실을 최소화시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 또다른 제형예들을 예시하지만, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

제형예 2. 화장수

번호	성 분	함량(%)
1	정제수	잔량
2	부틸렌글라이콜	5.00
3	시료 1	2.00
4	글리세린	4.00
5	디소듐 EDTA	0.02
6	카보머	0.10
7	베타인	0.50
8	히알루론산	0.01
9	에탄올	4.00
10	PEG-60 수소화 캐스터오일	0.30
11	메틸파라벤	0.10
12	페닐트리메치콘	0.05
13	착향료	미량
14	착색제	미량

제형예 3. 로션

번호	성 분	함량(%)
1	정제수	잔량
2	메틸파라벤	0.20
3	시료 1	5.00
4	글리세린	5.00
5	부틸렌글라이콜	7.00
6	카보머	0.10
7	잔탄검	0.05
8	세틸아릴알코올	3.00
9	글리세릴스테아레이트	0.50
10	프로필파라벤	0.10
11	미네랄 오일	3.00
12	식물성 스쿠알란	3.00
13	세틸에틸헥사노에이트	3.00
14	알지닌	0.10
15	착향제	미량

제형예 4. 크림

번호	성 분	함량(%)
1	정제수	잔량
2	메틸파라벤	0.20
3	시료 1	5.00
4	글리세린	5.00
5	부틸렌글라이콜	7.00
6	카보머	0.20
7	잔탄검	0.08
8	세테아릴알코올	3.00
9	글리세릴스테아레이트	0.50
10	베헤닐알코올	2.00
11	수첨 레시친	0.20
12	프로필파라벤	0.10
13	미네랄오일	3.00
14	식물성 스쿠알란	3.00
15	세틸에틸헥사노에이트	3.00
16	알지닌	0.20
17	착향제	미량

제형예 5. 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	정제수	잔량
2	메틸파라벤	0.20
3	시료 1	5.00
4	히알루론산	0.05
5	부틸렌글라이콜	2.00
6	카보머	0.08
7	잔탄검	0.04
8	세테아릴알코올	0.50
9	글리세릴스테아레이트	0.50
10	프로필파라벤	0.10
11	미네랄 오일	1.00
12	식물성 스쿠알란	2.00
13	세틸에틸헥사노에이트	1.00
14	알지닌	0.08
15	에탄올	4.00
16	PEG-60 수소화 캐스터오일	0.30
17	착향제	미량

제형예 6. 팩

번호	성 분	함량(%)
1	정제수	잔량
2	글리세린	10.00
3	시료 1	5.00
4	부틸렌글라이콜	5.00
5	카올린	4.00
6	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.00
7	사이클로메치콘	1.00
8	마그네슘알루미늄실리케이트	1.00
9	PEG-100 스테아레이트, 글리세릴스테아레이트	2.00
10	잔탄검	0.10
11	에탄올	3.00
12	메틸파라벤	0.20
13	클로페네신	0.10
14	티타늄디옥사이드	0.50
15	착향료	미량

Claims (3)

1. 주름 개선, 피부 보습력 증가, 피부 탄력 개선, 피부 장벽 개선, 피부 미백 및 항산화 효과를 나타내는 화장료 조성물로서,
   감초, 당귀, 천궁, 작약, 자소엽, 어성초, 녹차, 복령, 인삼 및 상백피의 추출물을 2:1:1:1:1:1:2:1:1:2의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 삭제

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