KR101854448B1

KR101854448B1 - O-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자

Info

Publication number: KR101854448B1
Application number: KR1020150045706A
Authority: KR
Inventors: 김하형; 김대경; 박병태
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2018-05-04
Also published as: KR20160117851A

Abstract

본 발명은 o-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(hGM-CSF)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 세포로부터 유래되며 특정 위치에서 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화 된 것을 특징으로 하는 hGM-CSF에 관한 것이다.
본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 폴리펩타이드의 특정 위치에 갈락토아라비난 형 o-글리칸이 o-당쇄화 되어있으며 이는 단백질의 안정성에 기여한다. 따라서 본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 안정성이 높아 대량 생산에 있어 큰 이점이 있으며, 생체 투여시에도 안정성과 관련된 장점을 지니기 때문에 재생불량성 빈혈, 선천성 및 특발성 호중구 감소증, 그리고 크론병과 같은 다양한 질병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

O-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자{o-glycosylated human granulocyte macrophage colony stimulating factor}

본 발명은 o-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(hGM-CSF)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 세포로부터 유래되며 특정 위치에서 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화 된 것을 특징으로 하는 hGM-CSF에 관한 것이다.

단백질의약품은 사람이나 다른 생물에서 유래된 것을 원료 또는 재료로 하여, 유전자조작 기술을 이용하여 제조되는 펩타이드 또는 단백질 등을 유효성분으로 하는 의약품으로 질병의 발생원인에 작용하고, 사람에 존재하는 단백질을 개발의 근간으로 삼아 합성의약품과 비교하여 상대적으로 부작용이 적다는 장점을 가지고 있다. 단백질의약품은 1970년대 유전자 재조합기술의 보편화와 함께 개발이 시작되어 고부가가치 의약품을 생산할 수 있는 첨단기술로서 의약품 산업에 크게 기여할 것으로 전망되어, 유전자 재조합 의약품 및 세포배양기술을 이용한 세포배양의약품 분야에서 활발한 연구개발이 이루어지고 있다. 단백질의약품의 종류로는 단클론 항체(monoclonal antibody) 와 항체 이외의 단백질의약품으로 성장인자(stimulating factor), 호르몬, 효소, 혈액제재, 백신, 사이토카인(cytokine) 등이 있다.단클론 항체는 1980년대 초반 미국 FDA 승인을 획득한 인슐린을 필두로 인체 성장호르몬, 인터페론, 콜로니 자극인자 및 다수의 단클론 항체 등이 제품화되어 각종 질병의 치료에 널리 사용되고 있다.

사람과 같은 진핵생물에서는 단백질의 기본단위인 폴리펩티드의 특정부위를 잘라내거나 당과 인산기를 덧붙이는 것과 같이 리보솜에서 번역된 단백질을 변형시키는 작용을 하는데, 이것을 post-translational modification (PTM) 이라 한다. 단백질의 PTM은 3차, 4차 구조를 결정하고 그 단백질의 활성과 기능도 조절한다. 이러한 이유로 단백질의 1차적인 구조만으로는 생물학적 기능이나 조절 기전을 설명하기에는 불충분하다. 따라서 재조합 단백질의 생산에는 단백질의 복잡한 서열과 PTM과 같은 복합적인 구성요소를 포함한 단백질을 생산해낼 수 있는 능력을 가진 세포주를 사용하는데, 가장 널리 사용되는 세포주는 Chinese hamster ovary(CHO) 세포주와 murine myeloma NS0(NS0) 세포주이다. CHO 세포주나 NS0과 같이 포유동물 유래 세포주에서 생산된 단백질은 사람에서 만들어진 단백질과 거의 동일한 서열을 가지며, PTM과정을 거치는 장점이 있으나, 세포주의 세포 증식속도가 느리고 배양이 까다로우며, 생산비용이 많이 드는 단점이 있다. 이에 따라 동물세포주를 대체할 수단으로 형질전환 동물이나 식물, 대장균이나 효모 등에 도입하여 배양하는 방법이 연구되고 있으며, 이미 임상실험이 진행중인 것들도 있다. 인체 유전자를 대장균이나 효모 등에 도입하여 발효조에서 배양하여 단백질 의약품을 생산하는 방법은 증식이 빠르고 대량배양이 용이하고 저렴하여 생체에서 추출하거나 동물세포주를 이용하는 방법보다 획기적으로 단가를 낮출 수 있는 장점이 있다. 그러나 대장균과 같은 세균은 원핵생물로서 사람과 같은 진핵생물과 달리 단백질을 더 이상 변형시키는 능력이 없으므로, 만들어진 단백질을 분리정제 후에 재차 인위적으로 변형을 시켜야하는 번거로움이 따를 수 있다. 효모 또한 경우에 따라 단백질 분해효소를 만들어 효모 내에서 만들어진 단백질 의약품을 분해하기도 한다.

CHO 세포나 NS0와 같은 동물세포 발현시스템의 대량생산의 어려움, 생산비용 문제, 병원체 감염과 같은 문제점들을 극복하기 위한 대안으로서 식물세포 배양 기술을 이용한 재조합 단백질 생산에 관한 많은 연구가 진행되었으며 효소, 인터류킨(interleukin), 호르몬, 싸이토카인 (cytokine), 단일클론항체 등을 담배(tobacco), 덩이줄기(tuber)를 포함한 식물세포에서 발현하고자 많은 연구가 이루어 지고 있다. 식물세포를 이용한 재조합 단백질 배양의 가장 큰 장점 중 하나는 동물세포와 마찬가지로 glycosylation을 포함한 PTM을 거친 복잡한 구조를 가지는 재조합 단백질을 생산할 수 있다는 것이며, 이와 함께 상대적으로 저렴한 생산비용, 바이러스나 병원체 감염과 같은 잠재적인 오염의 위험을 피할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

최근 단백질 분석과 관련하여 분석방법과 관련 기기들이 발전함에 따라 단백질의 PTM에 대한 연구가 활발히 진행중이며, PTM이 단백질에 끼치는 영향이 점차 밝혀짐에 따라 그 중요도가 부각되고 있다. PTM은 대부분 진핵생물의 단백질 활성조절에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 여러 중요한 PTM중의 하나로 당쇄화(glycosylation)가 있다. 당쇄화(glycosylation)는 올리고당 당쇄가 단백질에 공유결합하는 과정 혹은 그 결과이며, 단백질의 용해도, 항원성, 접합, 생물학적 활성 및 반감기뿐만 아니라 세포간의 인지와 신호체계에도 영향을 미치는 등 중요한 역할을 하는것으로 알려져 있다. 상기 당쇄화는 올리고당의 결합위치에 따라 크게 N-glycosylation과 O-glycosylation의 두 분류로 구분되지만, 실질적으로 상기 당쇄화에 의해 단백질에 부착되는 당쇄(당 사슬)들은 이를 구성하는 당조성이 매우 다양하다. 또한 당 조성에 따라 해당 당쇄가 단백질에 부여하는 특성이 다르며, 특정 당쇄가 존재함으로써 어떤 단백질에 부여된 특성이 다른 단백질 일반에도 해당 및 작용되지는 않기 때문에(즉, 유사한 당쇄라도 단백질마다 작용하는 기능이 다르기 때문에), 각 당쇄 및 이를 구성하는 구성 당(sugar)의 차이와 당단백질의 특성 간에 연관성을 찾아내는 것은 상당한 시간과 노력을 필요로 하고 있다.

동물 발현 시스템의 대안으로 대두되는 식물 발현 시스템을 사용하여 제조한 재조합 단백질의 glycosylation은 단백질의 구조나 기능에 있어서 차지하는 중요성에 비하여 잘 연구가 되어있지 않다. 특히, 식물세포로부터 발현된 재조합 단백질의 O-glycosylation과 이러한 단백질에 존재하는 O-glycosylation이 단백질에 미치는 영향과 관련된 연구는 많이 이루어지지 못한 상태이다.

한편, Human GM-CSF (hGM-CSF)는 T-lymphocyte 유래 싸이토카인(cytokine)으로, 골수성 전구세포 (myeloid progenitor cell)의 증식과 호중구 (neutrophil), 호산구 (eosinophil), 단핵구 (monocyte)의 기능을 증가시킨다. Mature hGM-CSF는 127개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 4개의 cysteine 잔기가 두 개의 disulfide bond로 결합되어 있다. 또한 Asn27과 Asn37 두 개의 잠재적인 N-glycosylation site가 있으며, N-말단 부위에 네 개의 잠재적인 O-glycosylation site가 있는 것으로 알려졌다(Kaushansky K et al., 1987; R.E. Donahue et al., 1986).

[비특허문헌 1] Kaushansky K, Hagen FS.: Role of carbohydrate in the function of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Biochemistry. 26, 4861-4867 (1987). [비특허문헌 2] R.E. Donahue and S.C. Clark: Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 685-692 (1986). [비특허문헌 3] Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970). [비특허문헌 4] J.T. Yang and H.M. Martinez: Calculation of protein conformation from circular dichroism. Methods in Enzymology. 130, 208-269 (1986). [비특허문헌 5] Prasanta K Ghosh: Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: The protein and its current & emerging applications. Indian journal of Biotechnology. 6, 435-448 (2007). [비특허문헌 6] Shin YJ and Kwon TH: Production of recombinant human granulocyte macrophage-colony stimulating factor in rice cell suspension culture with a human-like N-glycan structure. Plant Biotechnology Journal. 9, 1109-1119 (2011). [비특허문헌 7] Tan, L., Leykam, J.F. and Kieliszewski, M.J.: Glycosylation motifs that direct arabinogalactan addition to arabinogalactan proteins. Plant Physiology. 132, 1362-1369 (2003) [비특허문헌 8] Guilermina Forno: N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line. Europian Journal of Biochemistry. 271, 907-919 (2004). [비특허문헌 9] Yun-Ji Shin, Yun-Jo Chong, Kyu-Boem Han, Moon-Sik Yang, Tae-Ho Kwon: N-linked glycan analysis of glycoproteins secreted from rice cell suspension cultures under sugar starvation, Enzyme and Microbial Technology 47 (2010) 189-193. [비특허문헌 10] Chu CC, Wang CC, Sun CS, Hsu C, Yin KC, Chu CY, et al. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci Sin 1975;18:659-8.

이에, 본 발명자들은 형질전환 기법을 통해 벼 세포로부터 hGM-CSF 단백질을 발현시키고 일련의 공정을 통해 hGM-CSF를 수득하였고, 상기 과정을 통해 제조 및 수득된 hGM-CSF가 아미노산 서열의 특정 위치에서 갈락토아라비난 형 글리칸(galactoarabinan type glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation)되어 있으며 이것이 단백질의 구조 안정성에 기여하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하여 제조되는 hGM-CSF에 있어서, 상기 hGM-CSF가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 2의 2번째, 6번째 및 8번째 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 갈락토아라비난 형 당쇄구조를 가지는 hGM-CSF를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하여 제조되는 hGM-CSF에 있어서, 상기 hGM-CSF가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 2의 2번째, 6번째 및 8번째 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 갈락토아라비난 형 당쇄구조를 가지는 hGM-CSF를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 형질전환 벼세포 (transgenic rice cell)를 사용하여 생산한 재조합 사람 GM-CSF의 분자량 및 deglycosylation에 따른 2차구조 변화, 단당 및 올리고당 구조 분석, glycopeptide분석을 실시하여 단백질의 glycosylation 및 결합되어 있는 올리고당의 구조를 분석하였다.

구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 효소 및 화학적 방법을 사용하여 단백질에 결합되어 있는 올리고당을 분리하여 이를 SDS-PAGE, MALDI-TOF MS를 사용하여 확인하였고, 단백질의 분자량이 기존에 보고된 사람GM-CSF와 유사하며, glycosylation의 정도 (degree) 또한 유사한 것을 확인하였다. HPAEC-PAD를 사용하여 단당분석을 실시하여 구성당을 확인한 결과 식물 특이적인 당인 Ara, Xyl 등이 검출되었으며, Ara와 Gal의 함량 비율이 높게 나타난 것을 확인하였다. rrhGM-CSF를 효소 및 화학적 방법을 사용하여 N-결합, N-,O-결합 올리고당을 제거한 뒤 CD spectrum을 측정하여 deglycosylation에 따른 2차구조의 변화를 측정하였으며, rrhGM-CSF의 glycosylation은 주로 α-helix A에 결합되어 구조에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

또한 효소반응을 사용하여 분리한 N-결합 올리고당을 AB화 하여 HPLC 및 MALDI-TOF MS 분석을 실시한 결과 10개의 올리고당 구조를 확인하였으며, 이는 보고되어 있는 rrhGM-CSF N-결합 올리고당과 거의 일치하는 결과임을 확인하였다. 화학적 방법을 사용하여 분리한 rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당을 AB화 한 뒤 HPLC와 MALDI-TOF MS를 사용하여 분석한 결과 Ara와 Gal로 구성된 10개의 galactoarabinan-type 올리고당 구조를 밝혀냈다. 또한 프로나아제(pronase) 처리하여 얻은 glycopeptide를 분석한 결과, 표 8에 기재된 바와 같은 Pro/Hyp 전환된 O-glycopeptides를 확인하였다. 이로부터 본 발명에서 생산된 rrhGM-CSF는 서열번호 1로 표시되는 hGM-CSF의 폴리펩타이드 서열 중에서 2번째, 6번째 및 8번째 프롤린(Pro)이 하이드록시프롤린(Hyp)으로 치환되고, 상기 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 것을 확인하였다. 이는 기존에 식물단백질에서 O-glycopeptide의 경우 SP_n(n=2,4)서열이 존재할 때 Pro/Hyp 전환이 일어나고 아라비노갈락탄(arabinogalactan)이 결합하는 것으로 알려져 있는 것과 대비된다.

상기와 같이, 본 발명에서 제조한 벼세포 유래 rrhGM-CSF는 폴리펩타이드의 특정 위치에 갈락토아라비난 형 o-글리칸이 o-당쇄화 되어있으며 이는 단백질의 안정성에 기여한다. 따라서 본 발명은 hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하여 제조되는 hGM-CSF에 있어서,

상기 hGM-CSF가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 2의 2번째, 6번째 및 8번째 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 갈락토아라비난 형 당쇄구조를 가지는 hGM-CSF를 제공한다.

본 발명의 갈락토아라비난 형 당쇄구조를 가지는 hGM-CSF는, hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하여 제조되는 것으로서, 식물세포의 형질전환 및 이로부터 목적 단백질의 분리 수득방법은 공지의 방법에 의할 수 있다. 바람직하게 하기의 문헌을 참조로 할 수 있다; Yun-Ji Shin, Yun-Jo Chong, Kyu-Boem Han, Moon-Sik Yang, Tae-Ho Kwon: N-linked glycan analysis of glycoproteins secreted from rice cell suspension cultures under sugar starvation, Enzyme and Microbial Technology 47 (2010) 189193.

구체적으로 본 발명의 갈락토아라비난 형 당쇄구조를 가지는 hGM-CSF는,

(a) hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 세포를 N6 배지에서 배양하여 hGM-CSF를 발현 및 수득하는 단계; 및

(c) Con A-Sepharose 4B 컬럼, DEAE 컬럼, Phenyl Sepharose 컬럼 및 Sephacryl S-200 컬럼을 이용하여 순차적으로 분리하여 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것 일 수 있다.

상기 (a) 단계는 hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하는 단계이다.

본 발명에서 상기 hGM-CSF 코딩(cording, 암호화) 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 한 폴리펩타이드를 구성하는 염기의 조합은 특별히 제한되지 않는다.

상기 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)는 골수의 혈액세포와 혈소판의 생성과정에 관여하며, 또한 대식세포라 불리는 백혈구의 성장을 증진시킨다. 이와 같이 GM-CSF는 조혈작용의 조절인자일 뿐만 아니라 면역세포의 생성을 증가시키는 효능 때문에 백혈병 환자의 골수 이식 수술 후 투여되는 약물로 쓰이며, 그 외에 재생 불량성 빈혈 등의 혈구와 관련된 질환 등에 사용된다. 또한 최근에는 위장 관계의 만성 질환인 크론병 (Crohn's disease) 치료에도 이용되고 있다 (Dieckgraefe et al., Lancet 360(9344):1478-80(2002)).

상기 벼 세포는 공지의 벼 유래 세포를 의미하는 것 일 수 있으며, 바람직하게 Oryza sativa L. cv Dongjin 세포 주일 수 있다.

상기 용어‘형질전환(transformation)’은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

상기 용어‘도입’은 유전자 또는 유전자군을 인위적으로 표적하는 세포에 삽입하여 그 유전자군을 발현시키거나 또는 그 세포의 게놈(genome)에 다른 유전자(군)을 부가하는 조작을 의미한다. 이러한 유전자의 도입은 박테리오파아지에 의한 형질도입(세균), 토양세균인 Agrobacterium spp.을 매개로 한 간접적인 방법, 유전자 총(genegun), 전기자극(electrophoration), 현미주입법(microinjection) 등에 의한 방법으로 수행 될 수 있으며, 이 외에도 표적 세포 및 삽입 유전자의 특징에 따라 당업자가 공지된 유전자 도입 기술을 선택적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서 형질전환이란, hGM-CSF 코딩(cording, 암호화) 유전자를 식물 세포(특히, 벼 세포)에 도입하는 것을 의미하며, 공지의 식물세포 형질전환 방법에 의해 수행될 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 원하는 유전자를 벡터(vertor)에 삽입하여 재조합 벡터를 만들고, 상기 재조합 벡터를 Agrobacterium 속의 균주에 형질전환 시킨 다음, 상기 균주를 식물 세포에 감염시키는 방법일 수 있다. hGM-CSF 발현 벡터의 제작 및 벼 세포 형질전환은 ‘대한민국 등록특허 10-0640193’등의 문헌을 참조로 할 수 있다

상기 벡터는 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하는 것으로 바람직하게 발현 벡터이다. 상기 발현벡터(expression vector)는 선택된 폴리뉴클레오티드가 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 특히 상기 프로모터로는, 바람직하게 벼의 알파-아밀레이즈 3D 프로모터(RAmy3D promoter) 등을 포함하여 알파 아밀레이즈 프로모터(α-amylase promoter)가 사용될 수 있다.

상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience , 1987).

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 형질전환된 세포를 N6 배지에서 배양하여 hGM-CSF를 발현 및 수득하는 단계이다.

본 발명에서 상기 (a) 단계에서 형질전환된 세포는 공지의 식물배양용 배지에서 배양 될 수 있으나, N6 배지에서 배양되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 키네틴(kinetin)이 첨가된 공지의 N6 배지(Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)에서 배양되는 것 일 수 있다.

상기 N6 배지는 바람직하게 FeNaEDTA 35~38mg/L, H₃BO₃ 1~2mg/L, KI 0.5~1mg/L, MnSO₄·H₂O 3~4mg/L, ZnSO₄·7H₂O 1~2mg/L, CaCl₂ 125~126mg/L, KH₂PO₄ 390~410mg/L, KNO₃ 2820~2840mg/L, MgSO₄ 90~91mg/L, (NH₄)₂SO₄ 462~464mg/L, Glycine 1~2mg/L, Thiamine HCl 0.5~2mg/L, Pyrioxine HCl 0.3~0.7mg/L 및 Nicotinic acid 0.3~0.7mg/L으로 이루어지는 것 일 수 있다.

상기 2,4-디클로로페녹시아세트산은 N6 배지에 1~3 ㎎/ℓ로 첨가되는 것 일 수 있다. 상기 키네틴은 N6 배지에 0.001~0.1 mg/L 로 첨가되는 것 일 수 있다.

상기 본 발명에서 사용되는 배지는, 배지 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 10%(w/w), 바람직하게는 1 내지 5%(w/w)의 수크로오tm(sucrose)를 추가적으로 포함할 수 있다. 배양 초기에는 수크로오스를 배지 내에 포함시킬 수 있으나, 목적 단백질의 발현 및 분비 유도를 위해서는 배양 후기에 수크로오스가 결핍된 환경을 만드는 것이 바람직하다.

상기 배양 시 온도 조건은 바람직하게 25~32℃일 수 있으며, 보다 바람직하게 27~29℃일 수 있다. 4~10일간 수행하는 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 4.5~8일간 배양할 수 있고, 암처리하는 것이 바람직하다.

상기 (b) 단계에서는 식물세포 유래 단백질분해효소의 분비 억제 또는 상기 효소의 활성을 저해하는 임의의 처리를 추가적으로 수행 할 수 있다.

상기 (c) 단계는 본 발명에서 원하는 특성을 가지는 hGM-CSF를 선별하는 과정으로서 Con A-Sepharose 4B 컬럼, DEAE 컬럼, Phenyl Sepharose 컬럼 및 Sephacryl S-200 컬럼을 이용하여 순차적으로 분리하여 선별하는 것이 특징이다.

상기 원하는 특성이란, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 hGM-CSF 서열 중에서 2번째, 6번째 및 8번째 프롤린이 하이드록시프롤린((2S,4R)-4-Hydroxyproline 또는 L-hydroxyproline, IUPAC names: (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidine- 2-carboxylic acid)으로 치환되고 상기 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 것을 의미한다. 따라서 상기 (c)단계에서 수득되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 서열에 포함된 하이드록시프롤린 잔기(서열번호 2의 2번째, 6번째 및 8번째에 위치함)가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 되어있다.

본 명세서에서 용어‘o-글리칸’은 o-결합된 올리고당류 또는 O-당쇄화(O-glycosylation) 된 올리고당류를 의미한다. 상기 O-당쇄화란 serine (Ser), threonine (Thr) 혹은 hydroxyproline (Hyp)의 hydroxyl oxygen에 당이 결합하는 것을 의미한다. O-glycosylation은 N-glycosylation과는 달리, 단백질에 결합하는 올리고당의 구조나 구성 성분에 있어서 동물과 식물 사이에 큰 차이가 있다

동물 O-glycan의 예로는 Ser 또는 Thr에 결합하는 여덟 가지 glycan core 구조를 포함하는 mucin type O-glycan들이 대표적이며, 이러한 type의 glycosylation은 아미노산 잔기에 N-acetylgalactosamine (GalNAc)이 결합하는 것을 시작으로 다른 당들이 순차적으로 첨가되는 방식을 통해 일어난다.

식물에서는 O-glycosylation이 Ser, Thr이 아닌 Hyp의 hydroxyl group에서 일어나며, 동물에서의 O-glycosylation과는 구조적으로도 매우 다른데, 대표적인 식물 O-glycosylation으로는 solanaceous lectin-type, linear extensin-type 그리고 arabinogalactan-type O-glycosylation이 있다. 이 중 extensin-type과 arabinogalactan-type O-glycosylation은 대표적인 O-glycosylated 단백질인 extensin과 arabinogalactan protein (AGP)에 존재하는 형태이다.

식물 o-글리칸 및 o-당쇄화 관련하여, 전술한 바와 같이 일반적으로 알려진 것과는 다르게, 본 발명의 hGM-CSF 단백질은 갈락토아라비난 형 글리칸이 o-당쇄화 된 것이 특징이다.

본 발명에서 상기 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)은 바람직하게 Ara₄Gal_1,Ara₄Gal₂, Ara₄Gal₃, Ara₄Gal₄, Ara₄Gal₅, Ara₄Gal₆, Ara₄Gal₇, Ara₄Gal₈및 Ara₄Gal₉으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

가장 바람직하게는 본 발명의 명세서 표 8에 기재된 바와 같이 각 펩타이드 서열 및 해당 o-글리칸의 조합으로 결합되는 것일 수 있다.

상기 Con A-Sepharose 4B 컬럼, DEAE 컬럼, Phenyl Sepharose 컬럼 및 Sephacryl S-200 컬럼을 이용한 단백질 분리는, 상기 각각의 컬럼을 이용하는 공지의 단백질 크로마토그래피법에 의할 수 있다. 본 발명에서는 상기 각각의 컬럼을 사용한 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 본 발명에서 목적하는 단백질(rrhGM-CSF)을 수득한다.

본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 폴리펩타이드의 특정 위치에 갈락토아라비난 형 o-글리칸이 o-당쇄화 되어있으며 이는 단백질의 안정성에 기여한다. 따라서 본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 안정성이 높아 대량 생산에 있어 큰 이점이 있으며, 생체 투여시에도 안정성과 관련된 장점을 지니기 때문에 재생불량성 빈혈, 선천성 및 특발성 호중구 감소증, 그리고 크론병과 같은 다양한 질병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 A는 각각 intact rrhGM-CSF, N-deglycosylated rrhGM-CSF, N-및O-deglycosylated rrhGM-CSF에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다(Lane M: molecular weight marker, lane 1: intact rrhGM-CSF, lane 2: N-deglycosylated rrhGM-CSF, lane 3: N-,O-deglycosylated rrhGM-CS).
도 1의 B는 각각 intact rrhGM-CSF, N-deglycosylated rrhGM-CSF, N-및O-deglycosylated rrhGM-CSF에 대한 MALDI-TOF MS spectra를 나타낸다(1: intact rrhGM-CSF, 2: N-deglycosylated rrhGM-CSF, 3: N-,O-deglycosylated rrhGM-CS).
도 2의 A는 중성당 표준물질 6종류(Fuc, Ara, Gal, Glc, Man, Xyl)와 아미노당 표준물질 2종류(GalN, GlcN)에 대한 단당 크로마토그램을 나타낸다.
도 2의 B는 본 발명 rrhGM-CSF의 중성당 및 아미노당에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 3의 A는 중성당 표준물질 6종류(Fuc, Ara, Gal, Glc, Man, Xyl)와 아미노당 표준물질 2종류(GalN, GlcN)에 대한 단당 크로마토그램을 나타낸다.
도 3의 B는 본 발명 rrhGM-CSF로부터 분리된 N-결합 올리고당(N-linked oligosaccharides)의 중성당 및 아미노당에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 pH 7.0에서 측정한, intact rrhGM-CSF, N-deglycosylated rrhGM-CSF, N-및O-deglycosylated rrhGM-CSF 각각에 대한 원편광이색성 스펙트럼(Circular dichroism spectrum)을 나타낸다(●: intact rrhGM-CSF, ■: N-deglycosylated rrhGM-CSF, △: N-,O-deglycosylated rrhGM-CSF).
도 5의 A는 AB(2-aminobenzamide)-표지된 glucose homopolymer 표준물질의 크로마토그램을 나타낸다.
도 5의 B는 rrhGM-CSF로부터 분리되고 AB(2-aminobenzamide)-표지된 N-결합 올리고당들에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 rrhGM-CSF로부터 분리되고 AB(2-aminobenzamide)-표지된 N-결합 올리고당들에 대한 Positive MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.
도 7의 A는 β-elimination 방법에 의하여 rrhGM-CSF로부터 분리되고 AB(2-aminobenzamide)-표지된 O-결합 올리고당들에 대한 MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.
도 7의 B는 A는 β-elimination 방법에 의하여 rrhGM-CSF로부터 분리되고 AB(2-aminobenzamide)-표지된 O-결합 올리고당들에 대한 HPLC chromatogram을 나타낸다.
도 8은 프로나아제(pronase)에 의하여 분해된 rrhGM-CSF의 전체에 대한 MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.
도 9는 프로나아제(pronase)에 의하여 분해된 rrhGM-CSF 중 Asn27 잔기를 포함하는 N-glycopeptide에 대한 MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.
도 10은 프로나아제(pronase)에 의하여 분해된 rrhGM-CSF 중 Asn37 잔기를 포함하는 N-glycopeptide에 대한 MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.
도 11은 프로나아제(pronase)에 의하여 분해된 rrhGM-CSF 중 O-glycopeptide에 대한 MALDI-TOF MS spectrum을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

벼세포 유래 rrhGM-CSF의 제조, 상기 rrhGM-CSF의 당쇄 조성 및 단백질 구조 분석

<실험 준비>

1. 시약

1-1) 시료

Yun-Ji Shin et al., 2010를 참조하여 형질전환 벼세포 유래 사람 granulocyte macrophagy-colony stimulating factor(rrhGM-CSF)를 제조하였다. 간략하게, hGM-CSF를 발현하도록, Oryza sativa L.cv. Dongjin으로부터 개발된 rice-suspension culture 세포를 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2 mg/L), kinetin (0.02 mg/L), 3% sucrose가 포함된 N6 medium에 넣고, 110rpm으로 shaking incubation후 세포를 5배로 희석하여 배제에서 배양하였다. 약 7일후 배지를 회수하고, 15,000rpm, 30 분간 4 도씨에서 원심분리 후 동결건조하였다. 이렇게 얻은 총 단백질을 Con A-sepharose 4B column (GE Healthcare Bioscience, Piscataway, NJ, USA)로 분리하고, 0.2M methyl-d-glucopyranoside로 용출하였다. 용출된 단백질을 DEAE ion exchange chromatography (GE Healthcare Bioscience)로 NaCl 농도의 변화를 주어 분리 후 ammonium sulfate precipitation을 실시하였다. 계속해서, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow hydrophobic interaction chromatography로 분리 후, 최종적으로 Sephacryl S-200 gel permeation chromatography (GE Healthcare Bioscience)를 적용하여 최종 시료로 분리하였다.

1-2)효소

Glycoamidase A (E60116)는 Seikagaku Kogyo Co. (Japan), trypsin proteomics grade는 Sigma Chemical Co. (St. Louis), pronase는 Roche applied science (Germany)에서 각각 구입하였다.

1-3) 표준물질

단당 분석에 사용한 표준물질인 L-(-)-fucose (Fuc), D-(+)-galactose (Gal), D-(+)-glucose (Glc), D-(+)-mannose (Man), D-(+)-galactosamine (GalN), D-(+)-glucosamine (GlcN), D-(+)-xylose (Xyl), L-(+)-arabinose (Ara), N-acetylneuraminic acid (NeuAc), N-glycolyl neuraminic acid(NeuGc)는 모두 Sigma Chemical Co. (St. Louis)에서 구입하였다. 올리고당 분석에 사용한 표준물질인 AB labeled glucose homopolymer는 Ludger (United Kingdom)에서 구입하였다.

1-4) 그 외 시약

HPAEC-PAD eluent의 제조에 사용되는 sodium hydroxide는 Fisher(Rockville), sodium acetate anhydrous는 Sigma Chemical Co.(St. Louis)에서 구입하였다. O-결합 올리고당 분리를 위한 β-elimination에 사용된 β-elimination kit와 N-, O-결합 올리고당 제거를 위한 trifluoromethane sulfonic acid(TFMS)를 포함한 Glycoprofile^TMIVchemicaldeglycosylationkit는 Sigma Chemical Co. (St. Louis)에서 구입하였다. AB labeling에 사용한 2-aminobenzamide, dimethylsulfoxide (DMSO), acetic acid, sodium cyano-borohydride는 모두 Ludger (United Kingdom)에서 구입하였다. Diaminobenzidine과 MALDI-TOF 측정에 사용한 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA), 2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis)에서 구입하였다. 그리고 기타 시약 및 용매는 모두 일급 또는 특급시약을 사용하였다.

2. 기구 및 기기

단백질의 deglycosylation 및 분자량 확인을 위한 SDS-PAGE 는 PS-503 electrophoresis power supply (APELEX, France)와 electrophoresis kit (BIO RAD,)를 사용하였다. 단백질로부터 유리된 올리고당 정제를 위해 Extract-Clean SPE Carbo, 150mg/4ml (GRACE, Deerfield)를 사용하였다. 용액의 증발농축에는 centrifugal evaporator, Uni trap (EYELA, Japan)를 사용하였다. 당단백질의 단당 및 시알산 분석에는 high pH anion-exchange chromatography/pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD)이 적용된 ICS-3000 chromatography system (Dionex, Sunnyvale), CarboPac^TMPA1 Analytical, 4 * 250 mm (Dionex, Sunnyvale), AminoTrap^TMTrapColumn,4*50mm(Dionex,Sunnyvale)등을 사용하였다. 올리고당 분석에는 Waters 2690 HPLC(Waters, Milford Massachusetts), Shim-pack HRC-ODS column, 6.0 * 150 mm (Shimadzu, Japan), TSK Amide-80 column, 4.6 * 250 mm (Tosoh, Japan)등을 사용하였다. 올리고당의 mass측정에는 경기바이오센터의 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) Ultraflex Ⅲ (Bruker Daltonik, Germany) 등을 사용하였다.

3. rrhGM-CSF로부터 올리고당 분리

3-1) rrhGM-CSF로부터 N-결합 올리고당 분리

rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당의 단당분석 및 올리고당 구조분석을 위하여 N-결합 올리고당을 단백질로부터 분리하였다. Intact rrhGM-CSF 100 ㎍ 을 50 ㎕ 0.5 M citrate-phosphate buffer (pH 4.5)에 용해시킨 후 20 ㎍ glycoamidase A 효소를 가한 뒤 37℃에서 18 시간 반응시켜 N-결합 올리고당을 유리시켰다. 이후 Extract-Clean SPE Carbo, 150mg/4ml를 이용하여 올리고당만을 분리하였다. 이렇게 얻어진 올리고당을 모두 증발농축 시켰다.

3-2) rrhGM-CSF로부터 O-결합 올리고당 분리

rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당의 구조분석을 위하여 O-결합 올리고당을 단백질로부터 분리하였다. rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당 분리는 Sigma社의 β-elimination kit를 사용하여 제조자의 지시에 따라 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다. rrhGM-CSF 100 ㎍을 100 ㎕ 증류수에 용해시킨 뒤 60℃에서 30분간 denaturing시킨 후, 실온에서 식힌 다음 20 ㎕ β-elimination reagent를 가하고 4℃에서 18시간 반응시켜 O-결합 올리고당을 유리시킨 뒤 1 M HCl을 사용하여 용액을 중화시켰다. 유리된 올리고당과 단백질을 microcon (MWCO 10 kDa)을 사용하여 분리하였다. 분리한 올리고당을 증발농축 시켰다.

3) rrhGM-CSF의 N-, O-deglycosylation

rrhGM-CSF으로부터 N-결합 및 O-결합 올리고당을 모두 제거하기 위하여 TFMS를 사용한 deglycosylation을 실시하였다.

4℃로 차갑게 식힌 140 ㎕ TFMS와 15 ㎕ anisole을 빈 vial에 넣고 잘 섞은 뒤, 150 ㎕ TFMS-anisole 혼합용액을 centrifugal evaporator를 사용하여 증발건조 시킨 100 ㎍ intact rrhGM-CSF에 가한 뒤 시료가 모두 녹을 때 까지 가볍게 흔들어주고 4℃에서 3시간 반응시켰다. 반응이 완료된 시료에 0.2% bromphenol blue solution 4 ㎕를 가하여 지시약으로 하고, -15℃ methanol-dry ice bath에서 차갑게 식힌 60% pyridine solution을 색깔이 light blue가 될 때까지 가하여 반응을 종료시켰다. 분리된 단백질과 올리고당을 microcon (MWCO 10 kDa)을 사용하여 분리하였다.

4. SDS-PAGE, MALDI-TOF MS를 이용한 시료의 순도 확인 및 deglycosylation 확인

Intact rrhGM-CSF와 glycoamidase A 및 TFMS 처리를 통한 rrhGM-CSF의 순도 및 degylcosylation확인을 위하여 0.1% SDS가 포함된 polyacrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE를 실시하였으며, 이는 'Laemmli UK(1970)'의 방법에 준하였다. 15% gel을 사용하였으며, 100 V, 130 분 영동을 실시하였으며, 단백질 염색에는 coomasie brilliant blue를 사용하였다. 또한 각각의 시료를 MALDI-TOF MS를 사용하여 분석을 실시하였다. 경기바이오센터의 MALDI-TOF MS Ultraflex Ⅲ (Bruker Daltonics, Germany)를 이용하여 분자량을 측정하였으며 분석 프로그램은 FlexControl 3.0 software를 사용하였고 Reflactor voltage는 26.3 kV, repetition rate는 100 Hz이며 측정을 위한 matrix로는 sinnapnic acid 10 ㎎을 0.05% trifluoroacetic acid를 포함하는 50% acetonitrile 1 ml에 녹인 용액을 사용하였다.

5. CD spectrum을 이용한 rrhGM-CSF의 2차 구조 분석

Intact rrhGM-CSF, N-deglycosylated rrhGM-CSF, N-,O-deglycosylated rrhGM-CSF의 2차구조를 분석하기 위하여 CD spectrum분석을 실시하였다. J-715 spectrophotometer (Jasco)를 사용하여 측정조건을 far UV region (190-250 nm)에서 25℃, scan speed 50 nm/min, response time 4 sec 그리고 bandwidth를 1 nm로 하여 측정하였다. 시료는 0.15 M NaCl을 포함하는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 1.0 mg/ml 농도로 용해시켜 분석에 사용하였다.

6. High pH anion-exchange chromatography/pulsed amperometric detection를 이용한 중성당, 아미노당 표준물질의 정량성 검출

중성당 표준물질 7종류(Fuc, Ara, Gal, Rha, Glc, Man, Xyl)와 아미노당 표준물질 2종류(GalN, GlcN)를 증류수에 용해시킨 혼합용액을 1600 pmol에서 시작해 2배씩 최종 1.56 pmol까지 희석하여 HPAECPAD (ICS-3000 system, DIONEX, Sunnyvale)를 사용하여 분석하였다. 칼럼은 AminoTrap^TM을 연결한 CarboPac-PA1 (DIONEX, Sunnyvale)을 사용하여 27℃에서 분석하였다. 이동상으로는 200 mM sodium hydroxide 용액, 증류수를 사용하였다. 20 mM sodium hydroxide의 isocratic 조건으로 0.5 ml/min의 유속으로 분석하였다. 검출은 AgCl을 작용전극으로 하여 four-potential step (E₁=0.1V,E₂=-2.0V,E₃=0.6V,E₄=-0.1V)으로 구성된 intergrated amperometry quadruple 모드로 측정하였다. 각각의 중성당, 아미노당 표준물질의 피크 높이를 이용하여 검량선을 작성하였다.

7. rrhGM-CSF의 단당 조성 및 함량 분석

7-1) 산가수분해에 의한 중성당, 아미노당의 분리

시료로부터 중성당 및 아미노당을 분리하기 위하여 rrhGM-CSF 100 ㎍에 400 ㎕ 2 M trifluoroacetic acid 를 넣고 heating block을 사용하여 100 ℃에서 4시간 동안 산가수분해 반응시켰다. 반응 후 반응물의 용매를 증발농축기를 사용하여 제거한 후 400 ㎕ 증류수로 2회 세척하였다.

7-2) High pH anion-exchange chromatography/pulsed amperometric detection를 이용한 중성당 및 아미노당의 조성 및 함량 분석

시료의 단당조성 및 함량을 분석하기 위해 시료로부터 중성당, 아미노당 조건에 따른 산가수분해를 통해 분리한 각각의 중성당, 아미노당을 증류수에 용해시킨 뒤, 0.2 ㎛ PVDF syringe filter를 사용하여 여과한 후 AminoTrap^TM을 연결한 CarboPac-PA1 column을 장착한 HPAEC-PAD을 사용하여 분석하였다. 중성당 및 아미노당 분석에는 두 가지 이동상을 사용하였으며, 하나는 200 mM sodium hydroxide 용액, 다른 하나는 증류수를 사용하였다. 20 mM sodium hydroxide의 isocratic 조건으로 0.5 ml/min의 유속으로 분석하였다. 검출은 AgCl을 작용 전극으로 하여 four-potential step (E₁=0.1V, E₂=-0.2V, E₃=0.6V, E₄=-0.1V)로 구성된 integrated amperometry quadruple mode로 측정하였다.

8. rrhGM-CSF의 N-결합 및 O-결합 올리고당의 aminobenzamide labeling을 통한 구조분석

8-1) 올리고당의 aminobenzamide labeling

앞선 과정 3-1), 3-2) 에서 분리한 각각의 올리고당을 2-aminobenzamide과 sodium cyanoborohydride를 사용하여 aminobenzamide (AB)화 하였다. DMSO 350 ㎕와 acetic acid 150 ㎕를 혼합한 뒤, 100 ㎕ DMSO-acetic acid 혼합액을 2-aminobenzamide 5 mg을 취한 tube에 가하여 용해시킨 후 sodium cyanoborohydride 6 mg에 가하여 섞어 labeling agnet를 제조하였다. 5 ㎕ Labeling agent를 건조된 올리고당 시료에 각각 가하여 완전히 섞은 뒤, 65℃에서 3시간 동안 반응시켰다. AB화 된 올리고당을 cellulose column을 사용하여 미반응한 과잉의 시약을 제거하여 정제하였다. 정제된 올리고당을 증발농축 시켰다.

8-2) HPLC를 통한 aminobenzamide 표지된 올리고당의 분리 및 구조분석

올리고당의 구조분석을 위하여 AB화된 올리고당을 TSK-GEL Amide 80 column (4.6 * 250 mm, TOSOH, Japan)을 이용하여 분리하였고 형광 검출기로 각 올리고당을 검출하였다. Elution은 두 가지 이동상 A, B를 사용하여 30℃에서 분석을 실시하였다. 이동상 A는 50mM ammonium formate (pH 9.5)이며, formic acid와 ammonia 용액으로 pH를 조절한 후, 증류수를 이용하여 최종 농도로 희석하였다. 이동상 B는 99.9% acetonitrile 용액을 사용하였다. 초기 기울기 용리 조건은 20% A, 유속 0.4 ml/min 이며 A를 기준으로 0-132분 동안 20-53% A가 되도록 기울기 용리를 주고, 135분까지 53-100% A가 되도록 한다. 즉시, 2분 동안 유속을 1.0 ml/min으로 올려주고 100% A로 5분간 washing 한다. Washing 후 2분 동안 유속을 0.4 ml/min로 낮추고 그 뒤 15분 동안 100-20% A가 되도록 기울기 용리를 준다. 형광은 λ_ex=330 nm, λ_em=420nm에서 측정하였다. N-glycan의 elution position은 AB 표지된 glucose homopolymer와 비교하여 glucose unit (GU) 값을 구하였다. AB화 된 올리고당 중 일부를 취해 경기바이오센터의 MALDI-TOF MS Ultraflex Ⅲ (Bruker Daltonics, Germany)를 이용하여 올리고당의 분자량을 측정하였다. 분석 프로그램은 FlexControl 3.0 software를 사용하였고 Reflactor voltage는 26.3 kV, repetition rate는 100 Hz이며 올리고당 측정을 위한 matrix로는 DHB 10㎎을 0.1% trifluoroacetic acid를 포함하는 50% acetonitrile 1 ml에 녹인 용액을 사용하였다. 표준 올리고당의 Amide의 GU값과 올리고당의 분자량으로 작성한 database에 각 peak의 GU값과 분자량 값을 적용시켜 올리고당의 구조를 확인하였다.

9. rrhGM-CSF의 glycopeptide 분석

rrhGM-CSF를 효소처리하여 glycopeptide를 분석하기 위하여 시료를 효소처리 하기 전 disulfide bond를 제거하였다. 10 mM ethylenediaminetetra acetic acid와 8 M urea를 포함하는 1.5 M Tris-HCl (pH 8.5)buffer에 용해시킨 뒤, 100 mM dithiothreitol와 220 mM iodoacetamide를 사용하여 disulfide bond를 reduction and alkylation (RA)화 하여 제거하였다. RA화 하여 disulfide bond가 제거된 rrhGM-CSF (rrhGM-CSF-RA) 20 ㎍을 40 mM podassium phosphate buffer (pH 7.5)에 용해시킨 뒤 비특이적으로 아미노산을 절단하는 단백질 분해효소인 pronase를 20 ㎍ 가하여 기질과 효소의 비율을 1:1 (w/w) 비율로 한 뒤 37℃에서 18시간 반응시켜 짧은 glycopeptide 및 아미노산으로 분해하였다.

Pronase 처리한 rrhGM-CSF-RA는 zip-tip으로 정제하여 염을 제거한 뒤 10 mg CHCA를 1 ml 0.05% TFA를 포함하는 50% ACN용액을 matrix로 하여 1:1 (v:v) 비율로 혼합한 뒤 MALDI-TOF MS를 사용하여 분자량을 측정하였다. 경기바이오센터의 MALDI-TOF MS Ultraflex Ⅲ (Bruker Daltonics, Germany)를 사용하였으며, 분석 프로그램은 FlexControl 3.0 software를 사용하였고 Reflactor voltage는 26.3 kV, repetition rate는 100 Hz로 하였다.

<실험 결과>

1. rrhGM-CSF의 순도 및 deglycosylation 확인

rrhGM-CSF의 순도 및 deglycosylation을 확인하기 위하여 PNGase A 및 TFMS처리하여 각각 N-결합 올리고당 및 N-, O-결합 올리고당을 제거한 rrhGM-CSF의 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF MS 분석을 실시하였다. SDS-PAGE를 실시한 결과, 각각의 시료에 불순물이 거의 없고 순도가 95%이상임을 확인하였으며, intact rrhGM-CSF (20-25 kDa, 도 1의 A, lane 1)과 비교하여 N-deglycosylated rrhGM-CSF (16-20 kDa, Fig. 도 1의 A, lane2)와 N-, O-deglycosylated rrhGM-CSF(14-15kDa, 도 1의 A, lane3)가 각각 분자량이 감소하여 밴드가 아래쪽으로 이동하였으며, 이로부터 N-결합, N-,O-결합 당이 잘 제거되었음을 알 수 있다. 또한 MADI-TOF MS 측정결과 세 시료 모두 불순물 피크가 없었으며, N-deglycosylated rrhGM-CSF(m/z17,500-22,500,도 1의 B, 2)와 N-, O-deglycosylated rrhGM-CSF(m/z16,000-20,000,도 1의B, 3)의 분자량 감소가 SDS-PAGE 결과와 유사한 것으로 측정되었다.

SDS-PAGE에서 염색된 band와 MALDI-TOF MS에서의 peak가 넓게 나타나는 것은 상기 단백질에서 올리고당 제거 시 탈당쇄화의 정도(deglycosylation)차이에 의한 것이다. N-deglycosylated rrhGM-CSF의 제작을 위해 반응에 사용하는 효소인 glycoamidase A의 경우, peptide에 결합되어 있는 올리고당에 대한 활성이 더 높은 것으로 알려져 있는데, intact 상태의 시료를 효소반응시켰을 뿐만아니라 intact rrhGM-CSF에 존재하는 disulfide bond의 영향때문에 효소반응이 불완전했을 가능성이 있다. 또한 O-glycosylation heterogeneity 역시 분자량 범위가 넓게 나타난 것에 영향을 끼칠 수 있다. TFMS 처리한 rrhGM-CSF의 경우 MALDI-TOF MS 측정결과 분자량이 m/z 15,154.4 (도 1의 B, 3)으로, non-glycosylated rrhGM-CSF의 분자량(14.7 kDa)보다 454 Da 더 큰 것으로 확인되었는데, 이는 TFMS시약의 특성에 기인한 것으로서, TFMS 시약은 N-결합 올리고당의 Asn과 결합된 가장 안쪽의 GlcN 부분을 제외한 모든 당을 제거하기 때문에 단백질에 소량의 GlcN이 잔류한다. 따라서 이러한 사실을 고려하여, 도 1 B의 3번 실험 결과는 rrhGM-CSF의 N-결합 위치에 결합된 GlcN을 제외한 모든 당이 제거되었음을 나타낸 결과이다.

2. rrhGM-CSF의 중성당 및 아미노당 분석

1) HPAEC-PAD를 이용한 중성당, 아미노당, 시알산 표준물질의 정량성 검출

시료의 단당 분석을 위해 표준물질인 중성당, 아미노당의 검량선을 작성하고 그 정량성을 확인하였다. 중성당과 아미노당 표준물질로 Fuc, Rha, GalN, Ara, GlcN, Gal, Glc, Man. Xyl 혼합액을 1600 pmol부터 2배씩 희석하여 최종 2¹⁰배 까지 희석한 표준물질 혼합액을 각각 중성당 및 아미노당 산가수분해 조건에 따라 반응시킨 후 AminoTrap^TM을 연결한 CarboPac-PA1 컬럼을 사용하여 분석하였다. 중성당과 아미노당 9종류의 단당 표준물질은 모두 분리되었으며(도 2의 A, 도 3의 A), 이러한 분리능을 바탕으로 시료분석을 실시 할 수 있었다. 시료 분석과 동일한 조건으로 각각의 표준물질을 1600 pmol부터 2배씩 최종 2¹⁰배 까지 희석하여 분석을 실시하여, 각 표준물질의 농도별 피크 높이(height, nC)에 따라 검량선을 작성한 결과, 모든 표준물질에서 R²값이 0.99이상인 것을 확인하였으며(데이터 미도시), 분리된 표준물질 혼합액의 크로마토그램 결과 및 각각의 검량선을 단당 조성 및 정량분석에 적용하였다.

2) Intact rrhGM-CSF의 중성당 및 아미노당 분석

Intact rrhGM-CSF에 결합된 중성당, 아미노당 조성분석 및 함량을 정량하기 위하여 중성당 및 아미노당 분리 조건에 따라 산가수분해 반응을 실시하였다. 산가수분해를 실시한 시료의 중성당 및 아미노당의 분석조건에 따라 HPAEC-PAD를 사용하여 분석한 결과, Intact rrhGM-CSF의 중성당, 아미노당을 분석한 크로마토그램은 도 2의 B에 나타냈다. 표준물질을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 각각의 단당의 몰 수 및 상대적 함량비를 표시하였다(표 1). 그 결과, Intact rrhGM-CSF 에서는 Fuc 220.8± 1.5 pmol, Ara 773.6± 6.2 pmol, GlcN 148.4± 1.8 pmol, Gal 718.6± 6.1 pmol, Man 305.2± 5.8 pmol, Xyl 169.8± 6.2 pmol이 각각 검출되었다 (표 1). rrhGM-CSF는 식물 유래 당단백질에서 특징적으로 나타나는 Xyl와 Ara가 검출되었으며, 중성당, 아미노당 이외에 시알산(N-acetylnueraminic acid(NeuAc) 및 N-glycolylneuraminic acid(NeuGc))은 검출되지 않았다(데이터 미도시). 또한 중성당 중 Ara와 Gal의 함량 비율이 각각 33.1%, 30.8%에 달하여 두 중성당이 전체 단당 조성 중 함량비의 절반 이상을 차지하였다.

rrhGM-CSF 의 중성당 및 아미노당 함량

	Monosaccharides
	Fuc	GalN	Ara	GlcN	Gal	Man	Xyl	Total
hGM-CSF (pmol)	220.8± 1.5	0.0	773.6±6.2	148.4± 1.8	718.6± 6.1	305.2± 5.8	169.8± 6.2	2335.6± 20.6
Content (%)	9.4	0.0	33.1	6.3	30.8	13.1	7.3	100.0

3) rrGM-CSF N-결합 올리고당의 중성당 및 아미노당 분석

rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당의 중성당, 아미노당 조성분석 및 함량을 정량하기 위하여 단백질로부터 N-결합 올리고당만을 분리하여 중성당 및 아미노당 분리 조건에 따라 산가수분해 반응을 실시하였다. 산가수분해를 실시한 시료를 중성당 및 아미노당 분석조건에 따라 HPAEC-PAD를 사용하여 분석하였으며, 분석한 크로마토그램은 도 3의 B에 나타냈다. 표준물질을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 각각의 단당의 몰 수 및 상대적 함량비를 계산하였다(표 2). 그 결과 Fuc 24.3 pmol, Ara 4.3 pmol, GlcN 90.8 pmol, Gal 10.2 pmol, Man 54.5 pmol, Xyl 25.1 pmol이 각각 검출되었다(표 2). N-결합 올리고당만을 산가수분해하여 단당 조성을 확인한 결과 Ara와 Gal의 함량비가 각각 2.1%, 4.9%를 차지하는 것으로 나타났다. Intact rrhGM-CSF의 전체 단당분석 결과와 N-결합 올리고당의 단당분석 결과를 비교하였을 때, rrhGM-CSF에서 구성 당 중 Ara와 Gal의 함량 비율이 절반 이상을 차지할 정도로 높았던 것에 비하여 N-결합 올리고당에서는 Ara는 2.1%, Gal은 4.3% 함량으로 확인되어, rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당의 구성당의 대부분을 Ara와 Gal가 차지하고 있는 당으로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 이로부터 rrhGM-CSF 단백질에는 arabinogalactan-type 올리고당 또는 galactoarabinan type 올리고당이 결합되어 있음을 제시할 수 있다.

rrhGM-CSF로부터 분리된 N-결합 올리고당의 중성당 및 아미노당 함량

	Monosaccharides
	Fuc	GalN	Ara	GlcN	Gal	Man	Xyl	Total
hGM-CSF (pmol)	24.3	0.0	4.3	90.8	10.2	54.5	25.1	209.2
Content (%)	11.6	0.0	2.1	43.3	4.9	26.1	12.0	100.0

3. CD spectrum을 이용한 rrhGM-CSF의 2차 구조 분석

rrhGM-CSF, N-deglycosylated rrhGM-CSF 및 N-, O-deglycosylated rrhGM-CSF의 CD spectrum 분석 결과는 도 4에 나타냈으며, intact rrhGM-CSF는 208 nm에서 최저, 201 nm에서 최고 값을 나타냄을 확인하였다. Glycoamidase A 처리하여 N-deglycosylated rrhGM-CSF 및 TFMS 처리한 N-, O-deglycosylated rrhGM-CSF의 CD spectrum도 함께 측정하였으며, 2차 구조 분석은 Yang et al., 1986의 방법에 준하여 실시하였다. 각 시료의 2차 구조 구성요소의 함량은 표 3에 요약하여 나타냈다. α-Helix, β-sheets, β-turns, and random-coil 구조의 함량은 각각 다음과 같다. Intact rrhGM-CSF (28.4%, 33.5%, 3.0%, 35.1%), N-deglycosylated rrhGM-CSF(22.9%, 40.7%, 1.5%, 35.0%), N-,O-deglycosylated rrhGM-CSF(19.9%, 19.6%, 25.6%, 35.0%). 위의 결과를 토대로 rrhGM-CSF가 각각 N-결합 올리고당, N-,O-결합 올리고당이 제거됨에 따라 helix 구조와 sheet 구조, turn 구조에서 변화가 일어났음을 확인하여 deglycosylation이 시료의 2차구조에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

CD는 단백질의 2차 구조 분석을 위한 분광학적 기술로서 사용되어왔으며, reference spectra를 바탕으로한 2차 구조 분석방법이 정립되어 있다는 장점이 있다. P. K. Ghosh et al., 2007의 연구에 보고된 모식도에 의하면 human GM-CSF는 네 개의 α-helix (A (W₁₃-N₂₇),B(L₅₅-G₆₅),C(K₇₄-Q₈₆),D(F₁₀₃-V₁₁₆))와 두 개의 β-sheets (S1 (V₄₂-S₄₄),S2(Q₉₉-I₁₀₁)),두 개의 disulfide bond (C₅₄-C₉₆,C₈₈-C₁₂₁)가 있음을 나타내고 있다. α-Helix A의 말단부위에 한 개의 N-glycosylation site (N₂₇)를 포함하고 있으며, 다른 한 개의 N-glycosylation site (N₃₇)는 α-helix A근처의 random coil에 위치하고, O-glycosylation site역시 α-helix A에 위치하고 있다. 두 개의 disulfide bond의 경우 α-helix B-C와 α-helix C-D를 연결하고 있다. 따라서 human GM-CSF의 α-helix A 구조는 glycosylation의 영향을 받고 disulfide bond가 2차 구조에 큰 영향을 끼칠 것으로 예상된다. 본 발명의 rrhGM-CSF의 아미노산 서열, N-glycosylation site및 disulfide bond 위치는 human GM-CSF와 거의 동일하다(데이터 미도시). 그러므로 본 발명의 rrhGM-CSF 역시 disulfide bond보다는 약하지만, glycosylation(특히, o-glycosylation)이 2차 구조에 영향을 끼칠 것으로 예상되며, 2차 구조의 변화는 반감기 또는 생물학적 활성 변화에 영향을 끼칠 가능성이 있다.

rrhGM-CSF의 이차 구조

	structure	Fraction	Ratio
iGM	Helix	0	28.40%
	Beta	0	33.50%
	Turn	0	3.00%
	Random	0	35.10%
	Total	0.1	100.00%
	structure	Fraction	Ratio
iGM-glycoamidase A	Helix	0	22.90%
	Beta	0.1	40.70%
	Turn	0	1.50%
	Random	0.1	35.00%
	Total	0.2	100.00%
	structure	Fraction	Ratio
iGM-TFMS	Helix	0.1	19.90%
	Beta	0.1	19.60%
	Turn	0.1	25.60%
	Random	0.1	35.00%
	Total	0.3	100.00%

(iGM; intact rrhGM-CSF, iGM-glycoamidase A; intact rrhGM-CSF treatment with glycoamidase A, iGM-TFMS; intact rrhGM-CSF treatment with TFMS.

4. rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당 분석

Glycoamidase A를 사용하여 rrhGM-CSF로부터 분리한 N-결합 올리고당을 AB화 하여 amide column을 사용하여 분석하여 10개의 peak가 분리, 검출되었다 (도 5의 B). Amide column을 사용하여 AB화된 glucose homopolymer의 chromatogram (도 5의 A)으로부터 얻은 retention time 과 시료의 retention time으로부터 각 peak의 glucose unit (GU)값을 계산하였다. AB-labeled N-결합 올리고당을 MALDI-TOF MS를 사용하여 각각의 올리고당의 분자량을 측정하였고(도 6), GU값과 분자량 정보로부터 rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당 구조를 확인하였으며, 구조, GU값, 분자량 (m/z) 및 각 peak의 상대적 함량을 표 4에 정리하여 나타내었다. HPLC와 MALDI-TOF MS 분석을 통해 밝힌 rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당 구조는 기존에 보고된 MALDI-TOF MS분석만을 사용하여 밝힌 rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당 구조와 거의 일치함을 확인하였으며(Shin YJ et al., 2011), rrhGM-CSF의 N-결합 올리고당 구조는 대부분 식물 특이적인 중성당인 α1,3 Fuc와 β1,3 Xyl를 포함하는 구조를 가지고 있다.

Peaks of 도 5의 B

Mass values of [M+Na]⁺ions of each peak

Relative abundance of each glycan calculated according to peak area

5. rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당 분석

β-Elimination을 사용하여 rrhGM-CSF로부터 O-결합 올리고당을 분리하였다. 분리된 올리고당쇄는 당의 안정성을 위하여 AB화 하고 amide column을 사용하여 10개의 peak가 분리, 검출됨을 확인하였다 (도 7의 B). 또한 AB-labeled O-결합 올리고당을 MALDI-TOF MS를 사용하여 분자량을 측정하였고(도 7의 A) 두 결과를 토대로 O-결합 올리고당 구조를 분석하였다.

MALDI-TOF MS 측정 결과 4개의 pentose에 해당하는 구조에서부터 각 peak간에 hexose 1개씩 추가로 인한 162 Da spacing이 나타남을 확인하였으며, 단당분석 결과로부터 pentose는 Ara, 추가되는 hexose는 Gal임을 확인할 수 있다. 이 결과에 따라 확인된 rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당 구조는 다음과 같이 제시할 수 있다; Ara₄(m/z689.2),Ara₄Gal₁(m/z851.3),Ara₄Gal₂(m/z1013.4),Ara₄Gal₃(m/z1175.4),Ara₄Gal₄(m/z1337.5),Ara₄Gal₅(m/z1499.5),Ara₄Gal₆(m/z1661.6),Ara₄Gal₇(m/z1823.6),Ara₄Gal₈(m/z1985.7),Ara₄Gal₉(m/z2105.6)이며, 각 peak의 분자량은 각각 [M+Na]+ ion값에 해당한다. rrhGM-CSF의 O-결합 올리고당의 GU, m/z값, HPLC 분석에서의 peak들의 상대적 함량비 및 예상 올리고당 구성을 요약하여 표 5에 정리하여 나타냈다.

포유류의 O-결합 올리고당은 mucin-type 올리고당이 Ser 또는 Thr의 hydroxyl group에 결합한 형태로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 일례로 CHO cell 유래 재조합 human GM-CSF의 경우 Ser7, Ser9, Thr10에 mucin-type 올리고당 (NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc) 이 결합되어있다(Guilermina Forno, 2004). 식물의 경우 식물 특이적 type (solanaceous lectin-type, linear extension-type 및 arabinogalactan-type)의 올리고당이 Hyp에 결합한 형태로 존재하는 것으로 알려져있다. 이에 반해 형질전환 벼세포 유래인 rrhGM-CSF는 하기 표 5의 결과에 나타낸 것과 같이, 아라비난 백본(arabinan back bone)에 갈락탄 곁사슬(galactan side chain)을 가지는 구조로 되어있는 galctoarabinan-type 올리고당이 아라비난 부위에서 단백질(또는 펩타이드)에 결합되어 있음을 알 수 있다. 이는 기존에 식물 o-글라이칸에는 갈락탄 백본(galactan back bone)에 아라비난 곁사슬 (arabinan side chain)을 가지는 구조로 되어있는 arabinogalactan-type의 올리고당이 부착하는 것으로 알려진 것과 대비되는 결과이다.

rrhGM-CSF o-결합 올리고당의 GU, 질량(mass), 제안 구조(proposed structure) 및 상대 함량(relative abundance), 표 5에서 Ara_xGal_y는 Ara가 x개 Gal이 y개 연결되어 존재하는 것을 의미함

Peak^a	GU^b	Mass^c (m/z)	Proposed composition^d	Relative abundance^e(%)
1	3.38	689.2	Ara₄Gal₁	36.3
2	4.17, 4.24	851.3	Ara₄Gal₁	8.6, 6.6
3	4.96	1013.4	Ara₄Gal₂	17.9
4	5.64	1175.4	Ara₄Gal₃	14.8
5	6.39	1337.5	Ara₄Gal₄	7.7
6	7.14	1499.5	Ara₄Gal₅	2.6
7	7.91	1661.6	Ara₄Gal₆	2.4
8	8.67	1823.6	Ara₄Gal₇	1.8
9	9.46	1985.7	Ara₄Gal₈	0.9
10	10.22	2105.6	Ara₄Gal₉	0.3

^a, 도 7의 B에 대한 피크들(Peaks)

^b, Glucose unit of each peak calculated by glucose homopolymer ladder standard (Ludger)

^c, Mass values of [M+Na]⁺ions of each peak

^d, Expected compositions of each peak by combination of HPLC and MALDI-TOF MS analysis

^e, Relative abundance of each glycan calculated according to peak area

6. rrhGM-CSF의 glycopeptide 분석

Intact rrhGM-CSF에 존재하는 두 개의 disulfide bond를 RA반응을 통하여 제거한 후 pronase 효소를 처리한 뒤 zip tip을 사용하여 peptide를 정제한 뒤 MALDI-TOF MS 측정을 통하여 glycopeptide 분석을 실시하였다. 측정한 MALDI-TOF MS 전체 spectrum을 도 8에 나타내었다. 두 개의 N-glycosylation site (Asn27, Asn37) 중 Asn27 잔기를 포함하는 N-glycopeptides 도 9, Asn37 잔기를 포함하는 N-glycopeptides는 도 10에 각각 나타냈다. O-glycopeptidepeak는 도 11에 나타냈다. 도 9 내지 도 11에서 보는 바와 같이, Pronase 처리한 rrhGM-CSF 분석 spectrum으로부터 Asn27 포함 N-glycopeptide, Asn37 포함 N-glycopeptide, O-glycopeptide는 각각 19개, 18개, 20개씩 확인할 수 있었으며 glycopeptide의 sequence와 결합되어 있는 당구조 및 m/z값을 정리하여 표 6, 표 7, 표 8에 각각 나타냈다.

Asn27 잔기를 포함하는 N-glycopeptides의 경우 peptide에 결합된 올리고당 구조가 10개 확인되었으며, Asn37 잔기를 포함하는 N-glycopeptides의 경우 6개의 올리고당 구조가 확인되었다. 이는 Asn27은 fully glycosylation 되어 있으나, Asn37의 경우, fully glycosylation이 아닌 partial glycosylation 되었을 가능성이 있음을 알 수 있다. O-Glycopeptides의 경우 Pro의 Hyp로의 전환으로 분자량이 16 Da 증가하는 것을 포함하면서 Ara와 Gal로 구성된 올리고당과 peptide가 결합된 peak들을 확인하였으며, 확인된 O-glycopeptides는 다음과 같다; S₅O+Ara₄Gal₂,R₄SO+(Ara₄/Ara₄Gal₁/Ara₄Gal₄),S₅OS+(Ara₄Gal₂/Ara₄Gal₃),A₃RSO+(Ara₄/Ara₄Gal₃/Ara₄Gal₇),R₄SOS+(Ara₄Gal₂/Ara₄Gal₄/Ara₄Gal₇),(S₅OSP/S₅PSO/O₆SPS/P₆SOS)+(Ara₄/Ara₄Gal₁),(S₅OSO/O₅SOS)+Ara₄Gal₂,S₇OST+(Ara₄/Ara₄Gal₁Ara₄Gal₃/Ara₄Gal₅/Ara₄Gal₆),O₈STQ+Ara₄Gal₆[표 8 참조]. O-Glycopeptide의 peptide sequence 와 peptide에 결합된 올리고당, 분자량 (m/z)의 예측 값 및 실측 값을 표 8에 정리하여 나타냈다.

Pronase 효소는 단백질을 비특이적으로 분해하여 아미노산단위로 까지 분해하지만 당이 결합되어 있는 경우 단백질을 완전히 분해하지 못하고 당이 결합된 아미노산을 포함하여 약 3-6개 정도의 아미노산으로 이루어진 glycopeptide로 분해하게 된다. rrhGM-CSF의 경우 형질전환 벼세포 유래 당단백질이므로, 결합되어 있는 올리고당이 구성성분 및 구조에서 식물 특이적인 형태를 띠고 있는 특징이 있음을 알 수 있었다. 기존에 식물 단백질에서 O-glycopeptide의 경우 SP_n(n=2,4)서열이 존재할 때 Pro/Hyp 전환이 일어나고 arabinogalactan이 결합하는 것으로 알려져있는데(Tan, L et al., 2003), 이와는 다르게 본 발명에서 확인한 rrhGM-CSF에는 특이하게 표 8에 기재된 펩타이드 서열의 Hyp 위치에서 galactoarabinan이 결합된 것을 확인하였다.

Mass values of [M+Na]⁺ions of each peak

Abbribiation: R(Arg),L(Leu),N(Asn), S(Ser), D(Asp), T(Thr)

Mass qvalues of [M+Na]⁺ions of each peak

Abbribiation: A(Ala),E(Glu),M(Met),N(Asn),T(Thr),V(Val),I(Ile)

rrhGM-CSF에서 O-linked glycopeptides의 펩타이드 서열 및 글리칸 분석(하기 표8에서 peptide의 아래첨자로된 숫자는 해당 아미노산의 위치를 의미하는 것이고, glycan에서 아래첨자로된 숫자는 해당하는 당(sugar)의 개수를 의미)

Glycopeptide (O-linked)			m/z theoretical	m/z observed
No.	Peptide	Glycan	m/z theoretical	m/z observed
OGP1	S₅O	Ara₄Gal₂	1093.3	1094.4
OGP2	R₄SO	Ara₄Gal₁	925.2	924.4
OGP3		Ara₄Gal₂	1087.2	1086.6
OGP4		Ara₄Gal₄	1573.4	1572.6
OGP5	S₅OS	Ara₄Gal₂	1180.3	1179.5
OGP6	S₅OS	Ara₄Gal₃	1342.3	1342.7
OGP7	A₃RSO	Ara₄Gal₁	997.2	998.4
OGP8		Ara₄Gal₃	1483.3	1483.6
OGP9		Ara₄Gal₇	2131.5	2130.7
OGP10	R₄SOS	Ara₄Gal₂	1337.3	1336.6
OGP11		Ara₄Gal₄	1661.4	1660.6
OGP12		Ara₄Gal₇	2147.5	2146.7
OGP13	S₅OSP or S₅PSO/	Ara₄Gal₂	1115.2	1114.6
OGP13	O₆SPS or P₆SOS	Ara₄Gal₂	1115.2	1114.6
OGP14	S₅OSO/O₅SOS	Ara₄Gal₂	1293.3	1293.6
OGP15	S₇OST	Ara₄Gal₁	957.2	957.4
OGP16		Ara₄Gal₂	1119.2	1120.5
OGP17		Ara₄Gal₃	1443.3	1444.6
OGP18		Ara₄Gal₅	1767.4	1766.7
OGP19		Ara₄Gal₆	1929.5	1929.6
OGP20	O₈STQ	Ara₄Gal₆	1947.5	1948.7

Mass values of [M+Na]⁺ions of each peak

Abbribiation: O(Hyp, hydroxyproline), R(Arg), S(Ser), A(Ala), P(Pro), T(Thr), Q(Gln)

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 o-당쇄화 된 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(hGM-CSF)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 세포로부터 유래되며 특정 위치에서 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화 된 것을 특징으로 하는 hGM-CSF에 관한 것이다.

본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 폴리펩타이드의 특정 위치에 갈락토아라비난 형 o-글리칸이 o-당쇄화 되어있으며 이는 단백질의 안정성에 기여한다. 따라서 본 발명의 벼세포 유래 hGM-CSF는 안정성이 높아 대량 생산에 있어 큰 이점이 있으며, 생체 투여시에도 안정성과 관련된 장점을 지니기 때문에 재생불량성 빈혈, 선천성 및 특발성 호중구 감소증, 그리고 크론병과 같은 다양한 질병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> o-glycosylated human granulocyte macrophage colony stimulating factor <130> NP15-0026 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type hGM-CSF <400> 1 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> o-glycosylated hGM-CSF <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa is Hyp <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Hyp <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa is Hyp <400> 2 Ala Xaa Ala Arg Ser Xaa Ser Xaa Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125

Claims

hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하여 제조되는 hGM-CSF에 있어서,
(a) hGM-CSF(human Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 코딩 유전자를 포함하는 발현 벡터로 벼(Oryza sativa) 세포를 형질전환하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 세포를 N6 배지에서 배양하여 hGM-CSF를 발현 및 수득하는 단계; 및
(c) Con A-Sepharose 4B 컬럼, DEAE 컬럼, Phenyl Sepharose 컬럼 및 Sephacryl S-200 컬럼을 이용하여 순차적으로 분리하여 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며,
상기 hGM-CSF가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 서열번호 2의 2번째, 6번째 및 8번째 하이드록시프롤린 잔기가 갈락토아라비난 형 o-글리칸(galactoarabinan type o-glycan)으로 o-당쇄화(o-glycosylation) 된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 갈락토아라비난 형 당쇄 구조를 가지는 hGM-CSF.