KR101848200B1

KR101848200B1 - Ｄｎａ 라이게이션 시약

Info

Publication number: KR101848200B1
Application number: KR1020170025659A
Authority: KR
Inventors: 조용직; 김보선
Original assignee: 조용직
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2018-04-11

Abstract

본 발명은 DNA의 라이게이션에 사용되는 시약에 있어서, 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에서 299번째 아미노산인 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환시킨 치환 T4 DNA 라이게이션에, pH 5.5~8.0의 35~60 mM Tris-HCl, 5~20 mM MgCl₂, 0.1~5 mM ATP, 1~20 mM DTT(dithiothreitol), 1~15% PEG 6000(상품명) 및 1~10 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)가 함유되는, DNA 라이게이션 시약에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, T4 DNA 라이가제의 염기 서열을 부위 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로 바꾸게 됨으로써, 유전자 재조합 과정에서 인큐베이션 시간(incubation time)을 줄일 수 있고, 라이게이션 효율(ligation efficiency)을 높일 수 있으며, 라이게이션 버퍼(ligation buffer)에 새로운 시약을 첨가함으로써 라이게이션 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

ＤＮＡ 라이게이션 시약{DNA ligation reagent}

본 발명은 DNA 라이게이션 시약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 재조합 과정에서 인큐베이션 시간(incubation time)을 줄일 수 있고, 라이게이션 효율(ligation efficiency)을 높일 수 있는 DNA 라이게이션 시약에 관한 것이다.

일반적으로, 분자 생물학 및 생명 공학 급성장 분야에서 광범위한 연구와 개발로부터 일어나는 실험 작업과 상업적 생산에 사용할 수 있는 플라스미드(plasmid)에 각종 유전자를 라이게이션(ligation)함으로써 유전자 조작을 할 수 있도록 한다.

각종 질병 연구, 예를 들면, 지카바이러스, 메르스, 조류독감, 암, 기타 질병 등의 연구에서 유전자 조작을 위해 특정 유전자를 플라스미드에 라이게이션하는 것이 연구의 첫 단계에 해당한다. 이때 특정 유전자인 DNA를 플라스미드 라이게이션시 사용하는 것이 T4 DNA 리가제(Ligase)이다.

이와 같이, 특정 유전자인 DNA를 플라스미드에 라이게이션하는 "유전자 재조합 기술(recombinant DNA technology)"에서, DNA를 자르고 붙여서 새로운 DNA을 만들 때, 자르는 가위에 해당하는 것이 제한효소(restriction enzyme)이고, 접착제에 해당하는 것이 T4 DNA 리가제인 것이다.

T4 DNA 리가제는 이중나선(Duplex) DNA 혹은 RNA에서 나란히 놓인 5'-phosphate 말단과 3'말단 사이의 phosphodiester(인산기) 결합을 형성하는 효소이다. 보조인자로 ATP를 요구하고, 반응 중간물로 enzyme-ATP 컴플렉스(complex)가 만들어지며, 이것이 DNA에 작용한다. Blunt-end(평활말단) 및 sticky-end(돌출말단)를 연결해주는 활성과, duplex DNA, RNA 또는 DNA/RNA hybrid에서 단일 가닥 절단 부위인 nick을 연결시켜주는 활성을 가지고 있다.

T4 DNA 리가제는 비임상용 시약으로서, 모든 생물학, 의학, 약학, 농수산학 실험에서 꼭 필요한 시약 중의 하나이다. 이러한 T4 DNA 리가제는 플라스미드에 특정 유전자 즉, DNA 프레그먼트(fragment)를 라이게이션하는데 쓰이는데, 가장 기본적인 프로토콜(protocol)이 25 ℃에서 1시간 또는 16 ℃에서 16시간을 인큐베이션(incubation)해야 한다.

그러나, 최근의 새로운 경향은 위에서 열거한 표준 인큐베이션 시간보다 단축된 인큐베이션 시간과 향상된 라이게이션 효율을 요구하게 된다.

한국등록특허 제10-0673836호(2007년01월18일 등록) "스태필로써머스 마리너스 유래의 내열성 ＤＮＡ 연결효소"

상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 유전자 재조합 과정에서 인큐베이션 시간(incubation time)을 줄이고, 라이게이션 효율(ligation efficiency)을 높이도록 하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적들은 이하의 실시례에 대한 설명을 통해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일측면에 따르면, DNA의 라이게이션에 사용되는 시약에 있어서, 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에서 299번째 아미노산인 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환시킨 치환 T4 DNA 리가제에, pH 5.5~8.0의 35~60 mM Tris-HCl, 5~20 mM MgCl₂, 0.1~5 mM ATP, 1~20 mM DTT(dithiothreitol), 1~15% PEG 6000(상품명) 및 1~10 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)가 함유되는, DNA 라이게이션 시약이 제공된다.

상기 치환 T4 DNA 리가제는, 상기 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제의 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법에 의해 상기 라이신(Lysine; K)을 상기 류신(Leucine; L)으로 치환할 수 있다.

상기 특이적 변위 방법은, PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 실시될 수 있다.

상기 Tris-HCl은 pH 7.5의 50mM이고, 상기 MgCl₂는 10mM이고, 상기 ATP는 1mM이고, 상기 DTT는 10mM이고, 상기 PEG 6000(상품명)은 5%이고, 상기 NAD는 2.5 mM일 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 라이게이션 시약에 의하면, T4 DNA 라이가제의 염기 서열을 부위 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로 바꾸게 됨으로써, 유전자 재조합 과정에서 인큐베이션 시간(incubation time)을 줄일 수 있고, 라이게이션 효율(ligation efficiency)을 높일 수 있으며, 라이게이션 버퍼(ligation buffer)에 새로운 시약을 첨가함으로써 라이게이션 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시례에 따른 DNA 라이게이션 시약에서 와일드 타입 T4 DNA 리가제의 염기 서열의 전반부를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시례에 따른 DNA 라이게이션 시약에서 와일드 타입 T4 DNA 리가제의 염기 서열의 후반부를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시례에 따른 DNA 라이게이션 시약에 의한 라이게이션 효율을 조사하기 위하여, 사용한 플라스미드를 제한효소로 자른 후 아가로스 겔에서 확인한 이미지이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시례를 가질 수 있는 바, 특정 실시례들을 도면에 예시하고, 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니고, 본 발명의 기술 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 식으로 이해되어야 하고, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시례에 한정되는 것은 아니다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시례를 상세히 설명하며, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성요소에 대해서는 동일한 참조 번호를 부여하고, 이에 대해 중복되는 설명을 생략하기로 한다.

본 발명의 일 실시례에 따른 DNA 라이게이션 시약은 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에서 299번째 아미노산인 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환시킨 치환 T4 DNA 리가제에, pH 5.5~8.0의 35~60 mM Tris-HCl, 5~20 mM MgCl₂, 0.1~5 mM ATP, 1~20 mM DTT(dithiothreitol), 1~15% PEG 6000(상품명) 및 1~10 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)가 함유된다. 여기서, PEG 6000은 상품명으로서, 화학명은 Poly Ethylene Glycol 6000이고, 화학식은 (C₂H₆O₂)n;H(OCH₂CH₂)_nOH 이다.

치환 T4 DNA 리가제는 도 1의 전반부에 해당하는 염기 서열과 도 2의 후반부에 해당하는 염기 서열을 전체적인 염기 서열로서 가지는 공지된 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에 대한 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법에 의해 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환할 수 있는데, 여기서, 특이적 변위 방법은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 실시될 수 있다. 여기서, 라이신(Lysine; K)은 염기성을 띤 이마노산이고, 류신(Leucine; L)은 소수성(hydrophobic)이며, 비극성의 특성을 가지고 있다. 와일드 타입 T4 DNA 리가제에서 299번째 라이신을 류신으로 바꾸면, 단백질의 구조가 바뀌고, pI(isoelectric point)가 변하는데, 이는 T4 DNA 리가제의 라이게이션 효율을 향상시키게 된다.

치환 T4 DNA 리가제에 함유되는 Tris-HCl, MgCl₂, ATP 및 DDT는 DNA 리가제 버퍼(ligase buffer)에 해당하는데, DNA 리가제 버퍼는 치환 T4 DNA 리가제가 DNA를 연결시켜 주도록 하는 기능이 잘 작용하는 환경을 만들어주는 역할을 하게 된다. 여기서, Tris-HCl에서 Tris는 pH 유지를 위한 완충제로 사용되고, MgCl₂는 phophodiester bonding에서 T4 DNA 리가제의 보조인자(cofactor)로서 작용하며, ATP는 phosphodiester bond를 연결하는데 필요한 에너지원이고, DTT는 환원/산화 방지제로 사용된다.

또한, DNA 리가제 버퍼(ligase buffer)에 추가되는 PEG 6000(상품명)은 5'-phosphate 말단과 3'말단 사이의 phosphodiester(인산기) 결합을 촉진하는 역할을 하고, NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)는 PEG 6000(상품명)의 기능을 촉진시켜 준다.

1. 특이적 변위를 통한 wild type T4 DNA 리가제 염기 치환

T4 DNA 리가제의 라이게이션 효율을 높이기 위해, 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에서 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로 염기를 치환하였다. 와일드 타입 T4 DNA　리가제에서 299번째 아미노산은 AAA로 구성된 라이신(Lysine; K)인데, 이를 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로 CTA로 바꿈으로써 류신(Leucine; L)으로 변환시켰다(K299L: AAA → CTA).

와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제로부터 아미노산의 염기 치환을 위한 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법을 실시시, 사용한 와일드 타입 T4 DNA 리가제는 pET28a 플라스미드(plasmid)에 들어 있다. 또한 와일드 타입 T4 DNA 리가제의 299번째 아미노산 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)로 치환하는 특이적 변위 반응은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 실시하였다. 이를 위해, 총 부피를 50㎕로 실시했으며, 1ng의 pET28-T4 DNA 리가제와 0.5㎕ pfu 폴리머라제(polymerase)를 혼합하여 실행하였으며, PCR 런닝(running) 조건은 아래와 같다.

95℃ 30초, 25 cycles(95℃ 10초, 64℃ 30초, 72℃ 3분), 72℃ 5분

PCR이 끝난 후에 PCR 산출물(product)을 제한효소(restriction enzyme)인 DpnI으로 자른 후 형질 전환(transformation)을 실시하고, LB 플레이트에 뿌리고(spreading), 37℃ 인큐베이터(incubator)에 16시간을 놓아둔 다음, LB 플레이트에서 자란 콜로니(colony)를 검사했다.

2. DNA 리가제 버퍼로서 새로운 시약 첨가

치환 T4 DNA 리가제의 라이게이션 효율을 높이기 위해, 일례로 T4 DNA 리가제 버퍼로서, pH 7.5의 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM ATP 및 10mM DTT, 그리고, 5% PEG 6000(상품명)과 2.5 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 추가로 첨가하였다.

3. 본 발명의 DNA 라이게이션 시약에 대한 검사

상기한 바와 같은 방법으로 제작된 본 발명의 DNA 라이게이션 시약을 실시례로 하여 라이게이션 효율 검사를 하기 위해, 2가지의 플라스미드(pUC18과 pcDNA3)를 사용하였고, 2가지 종류의 인서트(sticky end와 blunt end)를 이용하였다.

라이게이션은 총 부피를 20 ㎕로 하고, 이 때 플라스미드와 인서트(insert)의 비율을 1:5로 하여 실시하였다. 라이게이션 온도는 25 ℃로 실시하였고, 인큐베이션(incubation) 시간은 10분, 30분, 60분, 즉 3가지로 실시하였다.

형질 전환(transformation)은 10 ㎕ 라이게이션 프로덕트(ligation product)를 100 ㎕ 컴피턴트 셀(competent cell)에 혼합하고, 얼음에서 45분 동안 인큐베이션하고, 형질 전환을 중지시키기 위해서 42℃에서 2분 동안 인큐베이션시키고, 400㎕ LB 배지를 혼합한 후 37 ℃ 쉐이커(shaker)에서 1시간 동안 쉐이킹(shaking)한 다음 LB 플레이트에 뿌리고(spreading), 37 ℃ 인큐베이터에 16시간을 놓아둔 다음, LB 플레이트에 있는 콜로니(colony) 수를 검사했다.

3-1. 라이게이션 효율 검사: sticky end - ligation

sticky end(돌출말단) - 라이게이션 시험에 사용한 2개 플라스미드(pUC18과 pcDNA3)는 2개의 제한 효소 BamHI과 EcoRI으로 잘라서 사용했다. 본 발명의 상기한 실시례와 KAPA社의 T4 DNA 리가제(비교례)를 비교하였다. 그 결과 표 1에서와 같이, 본 발명의 실시례가 비교례에 비하여 콜로니수가 월등히 많음을 알 수 있다.

콜로니수 비교

구분	25 ℃ (10분)		25 ℃ (30분)		25 ℃ (1시간)
구분	실시례 (본 발명)	비교례	실시례 (본 발명)	비교례	실시례 (본 발명)	비교례
pUC18	17	1	41	15	119	122
pcDNA3	9	4	29	9	131	117

3-2. RT- PCR : 라이게이션 효율 검사 : blunt end - ligation

blunt end(평활말단) - 라이게이션 시험에 사용한 2개 플라스미드(pUC18과 pcDNA3) 중에서 pUC18은 SmaI으로, pcDNA3은 EcoRV로 잘라서 사용했다. 본 발명의 상기한 실시례와 KAPA社의 T4 DNA 리가제(비교례)를 비교하였다. 그 결과 표 2에서와 같이, 본 발명의 실시례가 비교례에 비하여 콜로니수가 월등히 많음을 알 수 있다.

콜로니수 비교

구분	25 ℃ (10분)		25 ℃ (30분)		25 ℃(1시간)
구분	실시례 (본 발명)	비교례	실시례 (본 발명)	비교례	실시례 (본 발명)	비교례
pUC18	8	2	54	23	149	135
pcDNA3	14	7	67	31	154	129

3-3. 결과

T4 DNA 리가제의 라이게이션 효율을 높이기 위해서, 먼저, 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로, 와일드 타입의 T4 DNA 리가제에서 299번째 아미노산인 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환했고, DNA 리가제 버퍼로서, 상기한 바와 같은 새로운 시약들을 첨가하였다.

이에 대한 라이게이션 효율을 검사한 결과, blunt-end(평활말단)과 sticky-end(돌출말단) 2개 모두 우수한 라이게이션 효율을 나타내었다.

또한, 도 3에서와 같이, 본 발명에서의 T4 DNA 리가제의 DNA 사이즈가 정확함을 알 수 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 DNA 라이게이션 시약에 따르면, T4 DNA 라이가제의 염기 서열을 부위 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법으로 바꾸게 됨으로써, 유전자 재조합 과정에서 인큐베이션 시간(incubation time)을 줄일 수 있고, 라이게이션 효율(ligation efficiency)을 높일 수 있으며, 라이게이션 버퍼(ligation buffer)에 새로운 시약을 첨가함으로써 라이게이션 효율을 향상시킬 수 있다.

이와 같이 본 발명에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시례에 한정되어서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이러한 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims

DNA의 라이게이션에 사용되는 시약에 있어서,
와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제에서 299번째 아미노산인 라이신(Lysine; K)을 류신(Leucine; L)으로 치환시킨 치환 T4 DNA 리가제에, pH 5.5~8.0의 35~60 mM Tris-HCl, 5~20 mM MgCl₂, 0.1~5 mM ATP, 1~20 mM DTT(dithiothreitol), 1~15% PEG 6000(상품명) 및 1~10 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)가 함유되는, DNA 라이게이션 시약.
청구항 1에 있어서,
상기 치환 T4 DNA 리가제는,
상기 와일드 타입(wild type) T4 DNA 리가제의 특이적 변위(site-directed mutagenesis) 방법에 의해 상기 라이신(Lysine; K)을 상기 류신(Leucine; L)으로 치환하는, DNA 라이게이션 시약.
청구항 2에 있어서,
상기 특이적 변위 방법은,
PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 실시되는, DNA 라이게이션 시약.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Tris-HCl은 pH 7.5의 50mM이고, 상기 MgCl₂는 10mM이고, 상기 ATP는 1mM이고, 상기 DTT는 10mM이고, 상기 PEG 6000(상품명)은 5%이고, 상기 NAD는 2.5 mM인, DNA 라이게이션 시약.