KR101847757B1

KR101847757B1 - 퀴나졸린 유도체

Info

Publication number: KR101847757B1
Application number: KR1020167018546A
Authority: KR
Inventors: 헤솅 장; 광화이 쩡; 윙웨이 첸
Original assignee: 톈진 헤메이 파마슈티칼 사이-테크 캄파니 리미티드
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2018-05-28
Also published as: JP2016540020A; CA2933082C; CN104710407A; EP3081563A4; JP6342001B2; AU2014361633B2; KR20160096183A; US9840494B2; EP3081563A1; AU2014361633A1; CN109265441A; CN104710407B; WO2015085654A1; EP3081563B1; CA2933082A1; US20160311796A1

Abstract

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염이 개시된다.

Description

퀴나졸린 유도체{QUINAZOLINE DERIVATIVE}

본원은 약화학 분야에 관한 것이다.

관련 출원

본원은 2013년 12월 12일자로 중국 특허청에 제출된 "항종양 활성을 갖는 퀴나졸린 유도체, 이의 제조 및 적용"이라는 발명의 명칭의 중국 특허 출원 제 201310706058.3 호의 관련 이익 및 우선권을 주장하고, 이는 전체가 참조로서 본원에 혼입된다.

EGFR은 HER(인간 표피 성장 인자 수용체) 당단백질 계열의 일원이고, 상기 계열의 다른 일원은 ErbB2(HER-2), ErbB3(HER-3), ErbB4(HER-4)를 포함한다. 세포내 EGFR 티로신 키나아제는 다양한 기질 단백질의 인산화를 촉매화하고, 종양 세포의 신호 경로에서 중추적인 역할을 한다. EGFR은 세포외 신호의 자극하에 이의 세포내 티로신 키나아제를 활성화하고, 세포외 신호를 세포로 전달하고 신호를 증폭시킴으로써 세포의 성장 및 분화, 혈관형성 및 세포자멸의 억제를 조절할 수 있다. EGFR 과발현 또는 돌연변이에 의해 야기된 이상 신호 경로 전달은 악성 종양의 성장, 침습 및 전이와 밀접한 상관관계가 있다. EGFR 발현은 정상 조직, 전-암성 병변으로부터 암성 조직으로 점진적으로 증가하고, EGFR 발현 수준은 암 환자의 예후와 밀접하게 관련된다. 여러 합성 약물은 EGFR-매개된 신호 전달을 차단함으로써 종양 세포의 성장 및 주변 조직으로 종양 침습을 억제하고, 종양 세포의 세포자멸을 촉진할 수 있다. 따라서, EGFR-표적된 요법은 현재 가장 떠오르는 연구 중 하나이다. EGFR을 표적하는 분자 표적된 요법은 선택적인 집단에서 우수한 치료 효과를 갖는다.

현재, 약물 시장에서 EGFR을 표적하는 약물은 주로 2개의 카테고리로 나뉜다: EGFR의 세포외 도메인에서 작용하는 단클론 항체 및 세포내 EGFR 티로신 키나아제의 결합 도메인에서 작용하는 소분자 EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TKI). 더욱이, EGFR-TKI 약물은 상기 약물과 EGFR 티로신 키나아제 사이의 상이한 결합 방식으로 인해 2개의 카테고리(즉, 가역적 및 비가역적 억제제)로 분류된다. 비가역적 억제제는 단백질 티로신 키나아제에 비가역적이고 영구적으로 결합할 수 있고, 새로운 단백질 티로신 키나아제가 생성되지 않는 한 단백질 티로신 키나아제의 수준은 계속해서 감소할 수 있다. 비가역적 억제제는 오랫동안 약으로써 효과적인 시간을 갖는다. 그러나, FDA 신청 기록은, 현존하는 임상적으로 개발된 약물인 아파티닙(Afatinib)의 생체이용률이 단지 11.175%이고, A431 인간 표피 암종 누드 마우스를 사용하는 이종이식 모델에서, 10 mg/kg의 아파니팁의 투여가 약리 효과를 보이지 않음을 나타낸다. 그러나, 아파티닙의 MTD는 30 mg/kg이다(문헌[Li D, Ambrogio L, Shimamura T, et al. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhibitor highly effective in preclinical 폐암 models. Oncogene, 2008, 27(34): 4702-4711] 참조). 따라서, 아파티닙의 치료 기회가 매우 좁다는 것을 알 수 있다.

본원의 일 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이고, 여기서 상기 염을 형성하기 위해 사용된 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 메틸설폰산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄판산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레인산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 및 운데실렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이고, 여기서 상기 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이설페이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로브로마이드;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니트레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이포스페이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세테이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이페닐설포네이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이푸마레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레에이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니코티네이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이올레에이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이옥살레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이프로피오네이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이살리실레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(4-아미노살리실레이트);

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세틸살리실레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이타르트레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이(p-톨루엔설포네이트);

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이시트레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레이트;

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(나프탈렌-1,5-다이설포네이트);

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(데칸다이오에이트); 및

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(L-아스파르테이트).

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물과 반응시켜 화합물 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 수득하는 단계,

바람직하게는, 하기 화학식 I의 화합물을 활성화된 에스터, 아실 클로라이드, 아실화된 이미다졸 또는 혼합된 무수물로 전환한 후, 하기 화학식 II의 화합물과 반응시키는 단계,

더욱 바람직하게는, 촉매로서 3차 아민, 예컨대 트라이에틸아민, N-메틸모폴린, 트라이메틸아민, 피리딘 또는 치환된 피리딘을 첨가하고, 하기 화학식 I의 화합물을 아실 클로라이드로 전환하는 경우, 바람직하게는 염소화제로서 티온일 클로라이드, 인 트라이클로라이드, 인 펜타클로라이드, 인 옥시클로라이드, 옥살릴 클로라이드, 또는 시아누르 클로라이드를 사용하는 단계; 또는

바람직하게는, 하기 화학식 I의 화합물을 무수물로 전환한 후, 하기 화학식 II의 화합물과 반응시키는 단계,

더욱 바람직하게는, 촉매로서 피리딘, 치환된 피리딘, 예컨대 DMAP를 첨가하는 단계;

임의적으로, 화합물 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 이의 약학적으로 허용되는 산과 반응시켜 이의 상응하는 약학적으로 허용되는 염을 수득하는 단계:

[화학식 I]

[화학식 II]

.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 치료적 또는 예방적 효과량으로 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 단밸질 키나아제와 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 치료적 또는 예방적 효과량으로 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

본원의 추가 양상은 단백질 키나아제와 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

본원의 또 다른 양상은 단백질 키나아제와 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

하기 설명에서, 특정한 구체적인 세부사항은 다양하게 개시된 실시양태에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 포함된다. 그러나, 당업자는 실시양태가 하나 이상의 이러한 구체적인 세부사항 없이, 또는 다른 방법, 성분, 물질 등을 사용하여 실시될 수 있음을 인지할 것이다.

달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, "포함하다, 포함하는" 및 "함유하다, 함유하는"이라는 용어는 "비제한적으로 포함하다"로서 해석되어야 하는 열린 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 "일 실시양태", "또 다른 실시양태에서" 또는 "일부 실시양태에서"에 대한 언급은, 실시양태와 관련하여 기재된 특정하게 언급된 특성, 구조, 또는 특징이 최소한 하나의 실시양태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 나타낸 "일 실시양태에서", "실시양태에서", "또 다른 실시양태에서" 또는 "일부 실시양태에서"란 어구는 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 임의의 적합한 방식으로 하나 이상의 실시양태에서 조합될 수 있다.

정의

"약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 비제한적으로 임의의 어쥬번트, 담체, 부형제, 활주제, 감미료, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 강화제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등삼투압제, 용매, 또는 유화제 등을 포함하고, 이는 인간 또는 동물에서 사용하기 위해 허용되는 것으로 미국 식품 의약국에 의해 승인되었고 약학 조성물의 제조시 부작용이 없다.

"약학적으로 허용되는 염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 생물학적 효능 및 자유 염기의 특성을 보유하고, 무기산, 예컨대, 비제한적으로, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예컨대, 비제한적으로, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 메틸설폰산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄판산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레인산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산, 운데실렌산 등으로 형성된 염을 지칭한다.

"약학 조성물"은 본원의 화합물로부터 형성된 제형 및 생물학적으로 활성인 화합물을 포유동물, 예를 들면, 인간에게 전달하기 위해 당해 분야에서 일반적으로 허용되는 배지를 지칭한다. 상기 배지는 모두 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

"치료 효과량"은 본원의 화합물이 포유동물, 예컨대 인간에게 투여되는 경우, 하기 정의된 바와 같이, 상기 포유동물, 예컨대 인간에서 단백질 티로신 인산화 효소에 의해 매개되는 질병 또는 질환에 효과를 나타내기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다. "치료 효과량"을 이루는 본원의 화합물의 양은 화합물, 질병 또는 질환 및 이의 중증도, 및 치료될 포유동물의 연령에 따라 달라지지만, 당해 분야 및 본원과 관련한 지식을 갖는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.

본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 관심 질병 또는 장애를 갖는 포유동물, 예컨대 인간에서 관심 질병 또는 질환의 치료를 포괄하고, 하기를 포함한다:

(i) 포유동물에서 발생하는, 특히, 상기 포유동물이 질환에 취약하지만 상기 질환을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 경우, 질병 또는 질환을 예방함;

(ii) 상기 질병 또는 질환을 억제함, 즉, 이의 발달을 저지함; 또는

(iii) 상기 질병 또는 질환을 완화함, 즉, 상기 질병 또는 질환의 퇴행을 야기함.

본원에 사용된 용어 "질병" 및 "질환"은 상호교환적으로 사용될 수 있거나 특정한 병 또는 질환이 공지된 원인 인자를 갖질 수 없고(병인학이 아직 작동되지 않도록) 따라서 질병으로써 아직 인지되지 않지만 단지 바람직하지 않은 질병 또는 증상으로서 인지되고, 이때 더욱 특징적이거나 덜 특징적인 증상은 의사에 의해 확인되었다는 점에서 다를 수 있다.

구체적 실시양태

본원의 일 양상은 하기 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이고, 이때 상기 염을 형성하기 위해 사용된 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 메틸설폰산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄판산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레인산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 및 운데실렌산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원의 또 다른 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이고, 이때 상기 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

본원의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체의 예는 비제한적으로, 임의의 어쥬번트, 담체, 부형제, 활주제, 감미료, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 강화제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등삼투압제, 용매 또는 유화제 등을 포함하고, 이는 인간 또는 동물에서 사용하기 위해 허용되는 것으로 미국 식품 의약국에 의해 승인되었고 약학 조성물의 제조시 부작용이 없다.

일부 실시양태에서, 본원의 약학 조성물은 비경구, 경피, 점막, 비강, 구강, 설하 또는 경구 경로를 통해 투여된 정제, 용액, 과립, 패치, 연고, 캡슐, 에어로졸 또는 좌제로서 제형화될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 경구 투여, 구강 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 비강 드롭, 안구 드롭, 흡입, 직장 투여, 질 투여 또는 표피 투여에 의해 투여될 수 있다.

[화학식 I]

[화학식 II]

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일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 US 2002/077330 A1에 기재된 방법에 따라 제조된다.

일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 다음과 같이 제조된다:

2-브로모에틸메틸에터(1084.2 g, 7.8 mol), 4-피페리돈 일수화물 하이드로클로라이드(921.0 g, 6 mol), 무수 칼륨 카보네이트(3312.0 g, 24 mol) 및 N,N-다이메틸아세트아미드(3.75 L)를 반응 케틀(20 L)에 넣고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 케틀 중 반응 용액의 용량은 약 4.4 L이다. 반응 용액(2.2 L)을 따라 내고, 물(13 L) 및 다이클로로메탄(4 L)을 교반하에 10분 동안 케틀에 넣고, 생성된 혼합물을 액체 분리를 위해 방치한 후, 다이클로로메탄 층을 따라내었다. 수층을 다이클로로메탄(3 L x 3)으로 추출하였다. 상기 수층을 버렸다. 유기 층을 합하고, 무수 마그네슘 설페이트(1.3 kg)로 30분 동안 건조하고, 이어서 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 다이클로로메탄(1 L)으로 세척하였다. 필터 케익을 감압하에 여과 건조한 후 버렸다. 추가 반응 용액(2.2 L)을 상기와 같이 처리하였다. 여액을 합하고 회전 증발기로 농축하였다. 농축된 용액을 합하여 유성 물질을 수득하였다.

상기 유성 물질을 감압하에 증류하여 2 mmHg 하에 82 내지 88℃에서 분획을 수집하여, 무색 투명한 액체로서 1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-온(582.7 g)을 수득하였다.

나트륨 하이드라이드(174.1 g, 4.354 mol, 60% 함량) 및 다이클로로메탄(5.08 L)을 반응 케틀(20 L)에 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 0℃로 냉각하였다. 트라이메틸 포스포노아세테이트(660.4 g, 3.628 mol)를 천천히 적가하였다. 이를 적가하는 동안, 케틀의 온도를 0℃ 이하로 안정하게 유지하였다. 적가 동안, 다량의 가스가 생성되고, 반응 용액은 회색에서 백색으로 변하였다. 적가가 완료되면, 가스는 더 이상 방출되지 않고, 반응 용액은 백색 슬러리였다. 상기 반응 용액을 0℃ 이하의 저온에서 1 시간 동안 교반하면서 유지하였다. 1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-온(577.7 g, 3.628 mol)을 케틀에 천천히 적가하였다. 적가 동안 케틀의 온도를 2℃ 이하로 유지하였다. 적가가 완료된 후, 반응 용액을 15시간 동안 교반하에 0℃의 저온에서 유지하였다.

반응이 완료된 후, 물(1 L)을 첨가하여 반응을 종료하였다. 냉각을 중지하였다. 물(4.08 L)을 교반하에 10분 동안 첨가한 후, 액체 분리를 위해 반응 용액을 방치하였다. 다이클로로메탄 층을 따라 버리고, 수층을 다이클로로메탄(1.7 L)으로 추출하였다. 상기 수층을 버렸다. 유기 층을 합하고 물(5.08 L)로 1회 세척하고 1 N 염산(3.6 L + 1.5 L)으로 2회 추출하였다. 이어서, 다이클로로메탄 층을 버리고, 염산 층을 합하였다. 합한 염산 층을 약 0℃로 냉각하였다. 1 N 나트륨 하이드록사이드 용액을 교반하에 pH가 9에 도달할 때까지 이에 천천히 적가하였다. 냉각을 중지하고, 혼합물을 실온으로 가온하였다. 이어서, 추출을 위해 다이클로로메탄(5.08 L)을 첨가하였다. 수층을 버리고, 유기 층을 물(5.08 L)로 1회 및 나트륨 클로라이드 포화 용액(5.08 L)으로 1회 세척하였다. 유기 층을 무수 마그네슘 설페이트(500 g)로 30분 동안 건조하고 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 다이클로로메탄(0.5 L)으로 세척하였다. 여액을 회전 증발로 건조한 후 오일 펌프를 사용하여 감압하에 건조하여 연황색 유성 물질을 수득하였다.

메틸 2-[1-(2-메톡시에틸)-피페리딘-4-일리덴] 아세테이트(621.0 g, 2.915 mol) 및 에탄올(2.915 L)을 반응 케틀(20 L)에 첨가하고, 교반하고 0℃에서 냉각하였다. 나트륨 하이드록사이드(291.5 g, 7.289 mol)를 물(0.729 L)에 용해한 후, 10℃로 냉각하였다. 생성된 용액을 저온에서 유지하고 케틀에 천천히 적가하였다. 나트륨 하이드록사이드의 첨가가 완료된 후, 반응 용액을 25℃ 이하로 가온하고, 7시간 동안 계속 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 0℃로 냉각하고 밤새 교반하였다.

상기 반응 용액에, 농축 염산을 pH가 2에 도달할 때까지 천천히 첨가하면서 온도를 약 0℃로 유지하였다. 냉각을 중단하고, 30분 동안 실온에서 계속 교반하였다. 반응 용액을 진공에서 여과하였다. 필터 케익을 무수 에탄올(500 ml)로 세척한 후, 감압하에 건조 여과하고 보존하였다. 여액을, 액체가 증발되지 않을 때까지 수욕에서 50℃로 회전 건조함으로써 농축하여, 황색 유성 물질을 수득하고, 다수의 백색 결정을 침전시켰다. 이어서, 무수 에탄올(1.46 L)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 교반하고, 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 무수 에탄올(500 ml)로 세척한 후 감압하에 건조 여과하고 보존하였다. 여액을 액체가 증발되지 않을 때까지 50℃에서 회전 증발함으로써 농축하여 담황색의 걸쭉한 포리지-유사 물질을 수득하였다.

포리지-유사 물질에 이소프로필 알코올(1.46 L)에 첨가하여 재결정하였다. 생성된 혼합물을 정화하기 위해 수욕에서 85℃로 교반하고, 재환류하고 용해하였다. 감압하에 고온 여과를 수행하여 소량의 불용성 잔사를 제거하였다. 여액을 3 L 3목 플라스크로 옮기고 85℃ 수욕에 부었다. 가열을 중단하고, 반응 용액을 자연적으로 냉각하고 밤새 교반하였다.

반응 용액을 빙욕에서 2시간 동안 계속 교반하고 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 이소프로판올(100 ml x 5)로 세척한다. 이어서, 필터 케익을 실온에서 공기 중에 2시간 동안 건조한 후 45℃에서 진공에서 건조하여 2-[1-(2-메톡시에틸)-피페리딘-4-일리덴]아세트산 하이드로클로라이드(254.5 g)를 수득하였다.

일부 실시양태에서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 산과 반응시켜 이의 상응하는 약학적으로 허용되는 염을 수득하였다.

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드의 약학적으로 허용되는 염을 제조하기 위해 본원에서 사용될 수 있는 산의 예시적인 예는 비제한적으로, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 메틸설폰산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄판산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레인산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 및 운데실렌산을 포함한다.

본원의 추가 양상은 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 치료적 또는 예방적 효과량으로 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 단백질 키나아제과 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 질병은 암이다.

본원의 방법을 사용함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 암의 예시적인 예는 비제한적으로, 유방암, 두경부암, 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암을 포함함), 대장암, 췌장암, 식도암, 위암 및 전립선암을 포함한다.

일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 0.1 mg 내지 1000 mg이고, 이는 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 1 mg 내지 1000 mg이고, 이는 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 10 mg 내지 500 mg이고, 이는 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

일부 실시양태에서, 생리적 이상은 EGFR 또는 Her-2의 과발현에 의해 야기된다.

일부 실시양태에서, 생리적 이상은 암이다.

본원의 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 암의 예시적인 예는 비제한적으로, 유방암, 두경부암, 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암을 포함함), 대장암, 췌장암, 식도암, 위암 및 전립선암을 포함한다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 0.1 mg 내지 1000 mg이고, 이는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 1 mg 내지 1000 mg이고, 이는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

일부 실시양태에서, 유효 성분으로서 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 단위 투여량은 10 mg 내지 500 mg이고, 이는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 또는 예방적 효과량으로서 사용된다.

본원의 또 다른 양상은 단백질 키나아제와 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 포유동물에서 EGFR 및/또는 Her-2의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료 또는 예방에 사용된다. 일부 실시양태에서, 생리적 이상은 특히 EGFR의 과발현에 의해 야기된다.

일부 실시양태에서, 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상, 및 단백질 티로신 인산화 효소의 활성을 억제하는 방법이 효과적인 질병은, 암이다.

본원의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 암의 예시적인 예는 비제한적으로, 유방암, 두경부암, 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암을 포함함), 대장암, 췌장암, 식도암, 위암, 피부암, 대장암, 신장암, 방광암, 난소암, 구강암, 후두암, 자궁경부암, 간암 및 전립선암을 포함한다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg의 단위 투여량의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위해 투여된다. 특이적 징후가 없는 경우, 본원에 기재된 모든 단위 용법 투여량은 환자에게 투여될 수 있는 단위를 지칭하고 작동 및 포장이 용이한 단위, 즉, 단일 용량이다.

일부 실시양태에서, 약 1 mg 내지 약 1000 mg의 단위 투여량의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위해 투여된다.

일부 실시양태에서, 약 10 mg 내지 약 500 mg의 단위 투여량의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상을 치료하거나 예방하기 위해 투여된다.

본원의 또 다른 양상은 단백질 키나아제와 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 활성의 억제용 약제의 제조에 있어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본원의 또 다른 양상은 단백질 키나아제와 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료용 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약학 조성물은 포유동물에서 EGFR 및/또는 Her-2의 과발현에 의해 야기된 생리적 이상의 치료 또는 예방에 사용된다. 일부 실시양태에서, 생리적 이상은 특히 EGFR의 과발현에 의해 야기된다.

본원의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약학 조성물을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 암의 예시적인 예는 비제한적으로, 유방암, 두경부암, 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암을 포함함), 대장암, 췌장암, 식도암, 위암, 피부암, 대장암, 신장암, 방광암, 난소암, 구강암, 후두암, 자궁경부암, 간암 및 전립선암을 포함한다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

일부 실시양태에서, 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 활성을 억제하기 위해 단위 투여량으로서 투여된다.

일부 실시양태에서, 약 1 mg 내지 약 1000 mg의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 활성을 억제하기 위해 단위 투여량으로서 투여된다.

일부 실시양태에서, 약 10 mg 내지 약 500 mg의 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물은 단백질 키나아제와 관련된 질병을 치료하거나 예방하기 위해, 바람직하게는 포유동물에서 단백질 티로신 인산화 효소의 활성을 억제하기 위해 단위 투여량으로서 투여된다.

이하에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 다양한 양상 및 이의 장점의 더 나은 이해를 제공하기 위해 하기 언급된 실시예를 통해 상세하게 기재될 것이다. 그러나, 하기 언급된 실시예는 제한하는 것이 아니고 단지 본 개시내용의 일부 실시양태를 예시하기 위해 사용됨이 이해되어야 한다.

실시예

실시예 1

N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4- 일리덴 ] 아세트아미드

반응 케틀(20 L)을 아르곤 가스로 환기하였다. 2-[1-(2-메톡시에틸)-피페리딘-4-일리덴]아세트산 하이드로클로라이드(250.0 g, 1.062 mol), 재증류된 테트라하이드로푸란(1.46 L) 및 크로마토그래피로 순수한 N,N-다이메틸포름아미드(1.46 ml)를 상기 반응 케틀에 첨가하고, 교반하고 0℃로 냉각하였다. 옥살릴 클로라이드(128.1 g, 1.009 mol, 86.7 ml)를 천천히 적가하고, 케틀의 온도를 적가 동안 0℃ 이하로 유지하였다. 적가를 완료한 후, 생각을 중지하고, 아르곤 가스를 이용한 환기를 또한 중지하였다. 생성된 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하여 테트라하이드로푸란 중 2-[1-(2-메톡시에틸)-피페리딘-4-일리덴]아세틸 클로라이드 하이드로클로라이드의 용액을 수득하였다.

테트라하이드로푸란 중 2-[1-(2-메톡시에틸)-피페리딘-4-일리덴]아세틸 클로라이드 하이드로클로라이드의 용액을 함유하는 반응 케틀을 아르곤 가스로 환기하고, 교반하고 0℃ 미만으로 냉각하였다. N⁴-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4,6-다이아민(256.7 g, 0.708 mol)을 N-메틸피롤리돈(1.46 L)에 용해하였다. 상기 용액을 케틀에 천천히 적가하고, 케틀의 온도를 0℃ 이하로 안정하게 유지하였다. 적가를 완료한 후, 1시간 동안 계속 교반하였다. 냉각을 중지하고, 반응 용액을 자연적으로 25℃ 이하로 가온하고 밤새 교반하였다.

반응이 완료되었는지를 TLC로 모니터하였다. 반응을 완료한 후, 반응 용액을 약 0℃로 냉각하고, 이에 물(2.9 L)을 천천히 적가하였다. 케틸 중 반응 용액은 투명하였다. 반응 용액을 감압하에 여과하여 잔사를 제거한 후 기계적 교반하에 40℃ 수욕 중 10 L 환저 플라스크로 옮겼다. 5 N 나트륨 하이드록사이드 용액을 pH가 약 10에 도달할 때까지 적가하고, 곧 고체를 빠르게 침천시켰다. 반응 시스템이 정상적으로 교반하도록 적절한 양의 물을 첨가하였다. 수욕을 제거하고, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 적가된 액체의 pH가 약 7에 도달할 때까지 증류수로 세척한 후 건조하여 담분홍색 고체로서 조질 생성물인 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 수득하였다.

조질 생성물 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시 에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드(20 g) 및 이소프로판올(250 ml)을 케틀(1 L)에 첨가하고 기계적 교반하에 혼합하였다. 혼합물을 88℃에서 3시간 동안 환류 가열한 후 가열을 중단하고, 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 감압하에 여과하였다. 필터 케익을 이소프로판올(250 ml x 4)로 세척하고, 감압하에 건조 여과하고 공기 중에 건조하여 생성물인 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 수득하였다.

질량 분석(MS)(기계 모델: 6410B LC-MS; 아질런트(Agilent))은 544.2([M+H]⁺피크)의 분자 이온 피크를 나타내었다.

수소 핵 자기 공명 분광법(¹H-NMR)(기계 모델: 바리안 이노바(Varian Inova) 500 MHz; 측정 조건: 용매 DMSO)을 나타내고, 하기 결과를 수득하였다:

탄소 핵 자기 공명 분광법(¹³C-NMR)(기계 모델: 바리안 이노바 500 MHz; 측정 조건: 용매 DMSO)을 나타내고, 하기 결과를 수득하였다:

실시예 2

N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드(290.0 g) 및 이소프로판올(4.5 L)을 반응 케틀(20 L)에 첨가하고, 가열하고 40℃에서 교반하였다.

증류수(135 ml) 및 메틸설폰산(128.1 g)의 혼합된 용액을 케틀에 천천히 적가하였고, 케틀 중 반응 용액은 투명하였다. 적가를 완료한 후, 추가 5분 동안 계속 교반한 후 중지하고, 반응 용액을 빼내고 여과하였다. 케틀을 물:이소프로판올 = 3:100(부피 비)의 혼합된 용액(150 ml)으로 세척하고, 세척한 용액을 반응 용액에 혼합하였다. 생성된 용액을 감압하에 여과하여 잔사를 제거하고, 여액을 10 L 환저 플라스크로 옮겼다. 이어서, 필터 케익을 물:이소프로판올 = 3:100(부피 비)의 혼합된 용액(150 ml)으로 세척하고, 세척된 용액을 환저 플라스크에 재혼입하고 실온에서 밤새 교반하였다. 고체를 침전시켰다. 진공에서 여과를 수행하였다. 필터 케익을 이소프로판올(250 ml x 4)로 세척하고, 감압하에 건조 여과하고 진공에서 35℃로 24 시간 동안 건조하여 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트(356.1g)를 수득하였다. 수율: 90.7%.

질량 분석(MS) 검출(기계 모델: 6410B LC-MS; 아질런트), MS: 544.1에서 [M+H]⁺피크.

수소 핵 자기 공명 분광법(¹H-NMR)(기계 모델: 바리안 이노바 500 MHz; 측정 조건: 용매 D₂O)을 나타내고 하기 결과를 수득하였다:

탄소 핵 자기 공명 분광법(¹³C-NMR)(기계 모델: 바리안 이노바 500 MHz; 측정 조건: 용매 D₂O)을 나타내고 하기 결과를 수득하였다:

실시예 3

N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이설페이트

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드(10 g) 및 이소프로판올(155 mL)을 유리병(500 mL)에 첨가하고, 가열하고 40℃에서 교반하였다.

증류수(5 ml) 및 농축 황산(3.3 ml)의 혼합물을 유리병에 천천히 적가하였다. 유리병 내의 반응 용액은 투명하였다. 적가를 완료한 후, 추가 5분 동안 계속 교반한 후 중단하였다. 반응 용액을 빼내고 여과하였다. 유리병을 물:이소프로판올 = 3:100(부피 비)의 혼합된 용액(5 ml)으로 세척하고, 세척된 용액을 반응 용액에 혼합하였다. 생성된 용액을 감압하에 여과하여 잔사를 제거하고, 여액을 500 mL 환저 플라스크로 옮겼다. 이어서, 필터 케익을 물:이소프로판올 = 3:100(부피 비)의 혼합된 용액(5 ml)으로 세척하고, 세척된 용액을 환저 플라스크로 혼입하고 실온에서 밤새 교반하였다. 고체를 침전시켰다. 진공에서 여과를 수행하였다. 필터 케익을 이소프로판올(155 ml x 4)로 세척하고, 감압하에 건조 여과하고 진공에서 35℃로 24시간 동안 건조하여 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이설페이트를 수득하였다.

질량 분석(MS) 검출(기계 모델: 6410B LC-MS; 아질런트), MS: 544에서 [M+H-196]⁺ 피크.

실시예 4 내지 24

다른 산을 갖는 N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡시 )퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2- 메톡시에틸 )피페리딘-4- 일리덴 ] 아세트아미드의 염

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 실시예 2의 제조 방법에 따라 염산, 브롬화수소산, 질산, 인산, 아세트산, 벤젠설폰산, 푸마르산, 말레산, 니코틴산, 올레산, 옥살산, 프로피온산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 시트르산, 말산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 세박산, L-아스파르트산과 개별적으로 반응시켜 하기 생성물을 수득하였다:

하기 화합물 4 내지 화합물 25의 ¹H NMR 데이타를 브루커(Bruker) AV400 및 용매로서 D₂O에 의해 수득하였다:

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드

2.50(s, 1H), 2.52(s, 1H), 2.61(d, 1H), 2.94(t, 1H), 3.02(t, 1H), 3.30(s, 2H), 3.32(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.59(s, 1H), 3.61(s, 1H), 3.66(s, 1H), 3.69(d, 2H), 3.81(s, 2H), 4.18(s, 2H), 5.98(s, 1H), 6.84(s, 1H), 6.95(t, 1H), 7.20(t, 1H), 7.45(t, 1H), 8.27(s, 1H), 8.34(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로브로마이드

2.48(s, 1H), 2.53(s, 1H), 2.63(d, 1H), 2.90(t, 1H), 3.00(t, 1H), 3.31(s, 2H), 3.35(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.55(s, 1H), 3.62(s, 1H), 3.64(s, 1H), 3.67(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.15(s, 2H), 5.94(s, 1H), 6.80(s, 1H), 6.97(t, 1H), 7.25(t, 1H), 7.49(t, 1H), 8.31(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니트레이트

2.49(s, 1H), 2.54(s, 1H), 2.62(d, 1H), 2.93(t, 1H), 3.03(t, 1H), 3.33(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.38(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.70(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.16(s, 2H), 5.97(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.96(t, 1H), 7.23(t, 1H), 7.46(t, 1H), 8.33(s, 1H), 8.36(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이포스페이트

2.52(s, 1H), 2.56(s, 1H), 2.66(d, 1H), 2.95(t, 1H), 3.02(t, 1H), 3.35(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.65(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.72(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.16(s, 2H), 5.98(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.91(t, 1H), 7.23(t, 1H), 7.48(t, 1H), 8.30(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세테이트

2.08(s, 6H), 2.54(s, 1H), 2.56(s, 1H), 2.69(d, 1H), 2.95(t, 1H), 3.07(t, 1H), 3.35(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.62(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.74(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.16(s, 2H), 5.99(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.91(t, 1H), 7.26(t, 1H), 7.44(t, 1H), 8.30(s, 1H), 8.39(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이페닐설포네이트

2.51(s, 1H), 2.56(s, 1H), 2.60(d, 1H), 2.94(t, 1H), 3.07(t, 1H), 3.32(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.62(s, 1H), 3.70(s, 1H), 3.74(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.16(s, 2H), 6.01(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.93(t, 1H), 7.27(t, 1H), 7.31-7.42(m, 2H), 7.46(t, 1H), 7.54-7.93(m, 8H), 8.32(s, 1H), 8.35(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이푸마레이트

2.53(s, 1H), 2.55(s, 1H), 2.60(d, 1H), 2.95(t, 1H), 3.07(t, 1H), 3.33(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.71(s, 1H), 3.74(d, 2H), 3.86(s, 2H), 4.18(s, 2H), 6.03(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.95(t, 1H), 6.96(s, 2H), 7.04(s, 2H), 7.28(t, 1H), 7.47(t, 1H), 8.32(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레에이트

2.50(s, 1H), 2.57(s, 1H), 2.61(d, 1H), 2.97(t, 1H), 3.08(t, 1H), 3.34(s, 2H), 3.37(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.66(s, 1H), 3.71(s, 1H), 3.77(d, 2H), 3.86(s, 2H), 4.18(s, 2H), 6.02(s, 1H), 6.28(s, 2H), 6.30(s, 2H), 6.84(s, 1H), 6.95(t, 1H), 7.26(t, 1H), 7.44(t, 1H), 8.33(s, 1H), 8.39(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니코티네이트

2.47(s, 1H), 2.52(s, 1H), 2.62(d, 1H), 2.94(t, 1H), 3.06(t, 1H), 3.38(s, 2H), 3.39(s, 3H), 3.40(s, 3H), 3.56(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.68(s, 1H), 3.70(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.16(s, 2H), 5.94(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.95(t, 1H), 7.23(t, 1H), 7.43(t, 1H), 7.50(m, 2H), 8.17(m, 2H), 8.32(s, 1H), 8.38(s, 1H), 8.79(m, 2H), 9.04(m, 2H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이올레에이트

0.96(t, 6H), 1.27-1.31(m, 28H), 1.33-1.35(m, 12H), 1.53-1.58(m, 4H), 1.94-1.98(m, 8H), 2.23(t, 4H), 2.49(s, 1H), 2.53(s, 1H), 2.61(d, 1H), 2.93(t, 1H), 3.01(t, 1H), 3.34(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.55(s, 1H), 3.65(s, 1H), 3.68(s, 1H), 3.71(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.17(s, 2H), 5.41(s, 2H), 5.45(s, 2H), 5.98(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.95(t, 1H), 7.23(t, 1H), 7.45(t, 1H), 8.32(s, 1H), 8.37(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이옥살레이트

2.48(s, 1H), 2.52(s, 1H), 2.62(d, 1H), 2.95(t, 1H), 3.03(t, 1H), 3.35(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.56(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.72(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.16(s, 2H), 5.99(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.93(t, 1H), 7.24(t, 1H), 7.46(t, 1H), 8.30(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이프로피오네이트

1.09(t, 6H), 2.27(q, 4H), 2.45(s, 1H), 2.57(s, 1H), 2.65(d, 1H), 2.95(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.32(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.56(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.70(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.16(s, 2H), 6.01(s, 1H), 6.84(s, 1H), 6.93(t, 1H), 7.25(t, 1H), 7.46(t, 1H), 8.31(s, 1H), 8.37(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이살리실레이트

2.47(s, 1H), 2.59(s, 1H), 2.65(d, 1H), 2.94(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.31(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.55(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.68(s, 1H), 3.72(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.16(s, 2H), 6.03(s, 1H), 6.84(s, 1H), 6.97(t, 1H), 6.95-7.04(m, 4H), 7.23(t, 1H), 7.46(t, 1H), 7.48-7.96(m, 4H), 8.30(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(4-아미노살리실레이트)

2.50(s, 1H), 2.61(s, 1H), 2.66(d, 1H), 2.93(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.32(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.58(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.75(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.16(s, 2H), 6.05(s, 1H), 6.11-6.24(m, 4H), 6.88(s, 1H), 6.98(t, 1H), 7.25(t, 1H), 7.47(t, 1H), 7.68-7.74(m, 2H), 8.34(s, 1H), 8.36(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세틸살리실레이트

2.11(s, 6H), 2.49(s, 1H), 2.51(s, 1H), 2.65(d, 1H), 2.92(t, 1H), 3.03(t, 1H), 3.31(s, 2H), 3.34(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.57(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.68(s, 1H), 3.75(d, 2H), 3.89(s, 2H), 4.17(s, 2H), 6.03(s, 1H), 6.82(s, 1H), 6.98(t, 1H), 7.27(t, 1H), 7.21-7.30(m, 4H), 7.42(t, 1H), 7.78-8.09(m, 4H), 8.31(s, 1H), 8.36(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이타르트레이트

2.53(s, 1H), 2.56(s, 1H), 2.61(d, 1H), 2.97(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.33(s, 2H), 3.37(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.71(s, 1H), 3.75(d, 2H), 3.91(s, 2H), 4.18(s, 2H), 4.51(s, 4H), 5.99(s, 1H), 6.82(s, 1H), 6.98(t, 1H), 7.23(t, 1H), 7.48(t, 1H), 8.31(s, 1H), 8.38(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이(p-톨루엔설포네이트)

2.33(s, 6H), 2.50(s, 1H), 2.52(s, 1H), 2.61(d, 1H), 2.91(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.30(s, 2H), 3.31(s, 3H), 3.35(s, 3H), 3.57(s, 1H), 3.63(s, 1H), 3.71(s, 1H), 3.74(d, 2H), 3.86(s, 2H), 4.16(s, 2H), 6.05(s, 1H), 6.84(s, 1H), 6.91(t, 1H), 7.25(t, 1H), 7.31-7.42(m, 4H), 7.45(t, 1H), 7.74-7.93(m, 4H), 8.31(s, 1H), 8.37(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이시트레이트

2.47(s, 1H), 2.50(s, 1H), 2.60(d, 1H), 2.64(s, 8H), 2.92(t, 1H), 3.05(t, 1H), 3.31(s, 2H), 3.35(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.59(s, 1H), 3.62(s, 1H), 3.75(s, 1H), 3.78(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.11(s, 2H), 6.02(s, 1H), 6.85(s, 1H), 6.90(t, 1H), 7.24(t, 1H), 7.45(t, 1H), 8.31(s, 1H), 8.41(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레이트

2.47(s, 1H), 2.53(q, 2H), 2.56(s, 1H), 2.63(d, 1H), 2.78(q, 2H), 2.95(t, 1H), 3.04(t, 1H), 3.35(s, 2H), 3.38(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.53(s, 1H), 3.69(s, 1H), 3.71(s, 1H), 3.73(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.12(s, 2H), 4.42(q, 2H), 5.92(s, 1H), 6.85(s, 1H), 6.92(t, 1H), 7.22(t, 1H), 7.47(t, 1H), 8.33(s, 1H), 8.43(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(나프탈렌-1,5-다이설포네이트)

2.48(s, 1H), 2.58(s, 1H), 2.62(d, 1H), 2.97(t, 1H), 3.00(t, 1H), 3.33(s, 2H), 3.37(s, 3H), 3.38(s, 3H), 3.54(s, 1H), 3.66(s, 1H), 3.77(s, 1H), 3.79(d, 2H), 3.88(s, 2H), 4.10 (s, 2H), 5.95(s, 1H), 6.80(s, 1H), 6.93(t, 1H), 7.24(t, 1H), 7.48(t, 1H), 7.63-7.98(m, 12H), 8.30(s, 1H), 8.40(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(데칸다이오에이트)

1.27-1.31(m, 16H), 1.54-1.58(m, 8H), 2.23(t, 8H), 2.54(s, 1H), 2.61(s, 1H), 2.65(d, 1H), 2.94(t, 1H), 3.02(t, 1H), 3.32(s, 2H), 3.36(s, 3H), 3.39(s, 3H), 3.53(s, 1H), 3.67(s, 1H), 3.78(s, 1H), 3.81(d, 2H), 3.85(s, 2H), 4.13(s, 2H), 5.97(s, 1H), 6.83(s, 1H), 6.93(t, 1H), 7.22(t, 1H), 7.46(t, 1H), 8.32(s, 1H), 8.42(s, 1H).

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(L-아스파르테이트)

2. 50(s, 1H), 2.60(q, 2H), 2.58(s, 1H), 2.67(d, 1H), 2.85(q, 2H), 2.97(t, 1H), 3.04(t, 1H), 3.32(s, 2H), 3.35(s, 3H), 3.37(s, 3H), 3.55(s, 1H), 3.68(s, 1H), 3.75(s, 1H), 3.73(d, 2H), 3.82(q, 2H), 3.87(s, 2H), 4.14(s, 2H), 5.97(s, 1H), 6.88(s, 1H), 6.91(t, 1H), 7.2 (t, 1H), 7.48(t, 1H), 8.34(s, 1H), 8.47(s, 1H).

하기 실험 과정에 사용된 화합물 및 이의 약어:

화합물 1: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드;

화합물 2: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드;

화합물 3: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트;

화합물 4: 하기 구조식을 갖는 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드:

;

화합물 5: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이설페이트;

화합물 6: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니트레이트;

화합물 7: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이포스페이트;

화합물 8: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이페닐설포네이트;

화합물 9: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이푸마레이트;

화합물 10: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레에이트;

화합물 11: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이(p-톨루엔설포네이트);

화합물 12: 하기 구조식을 갖는 N-[4-(3-에틴일페닐아미노-7-(2-에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-메틸피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드:

.

생물학적 실시예

생물학적 실시예 1

래트에서의 생체이용률 분석

실험 I. 래트에서 N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡 시) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2- 메톡시에틸 )피페리딘-4- 일리덴 ] 아세트아미드 다이하이드로클로라이드에 대한 생체이용률 분석

1. 실험 동물

12 마리 위스타 래트(수컷, 체중 200 내지 220 g)를 베이징 바이탈 리버 래보래토리 애니멀 테크놀로지 캄파니 리미티드(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.; 허가 번호: SCXK(베이징) 2007-0001)로부터 구입하였다.

2. 시험용 약물의 제조

2.1. N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드(30 mg)를 칭량하고, 초순수(6 ml)를 이에 첨가하여 정맥내 투여에 사용하기 위한 샘플 용액(5 mg/㎖)을 제조하였다.

2.2. N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드(30 mg)를 칭량하고, 초순수(12 ml)를 이에 첨가하여 위내 투여에 사용하기 위한 샘플 용액(2.5 mg/㎖)을 제조하였다.

3. 실험 설계

4. 분석 방법

4.1. HPLC/MS 조건

4.1.1. HPLC 조건: 크로마토그래피 컬럼: 충전제로서 옥타데실-결합된 실리카 겔(4.6 mm x 50 mm, 1.8 ㎛), 아질런트; 이동상: 메탄올:5 mM 암모늄 아세테이트(pH 4.0)(60:40); 유속: 1 ml/분; 컬럼 온도: 40℃.

4.1.2. MS 조건

공급원 파라미터:

MRM 모드 검출

이온: 544.3→457.1(N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드)

559.3→440.3(내부 표준, 아토르바스타틴 헤미-칼슘 염)

체류 시간: 80; 단편 전압: 180; 충돌 에너지: 25;

4.2. 표준 곡선의 수립

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드(1 mg)를 칭량하고 메탄올(1 mg/㎖) 중 용액으로 제형화하였다. 이어서, 용액을 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖의 표준 용액으로 단계적으로 희석하였다. 표준 용액(10 ㎕)을 별도로 원심분리관(1.5 ml)으로 피펫팅하였다. 내부 표준(메탄올 중 1 ㎍/㎖ 복용 용액; 10 ㎕)을 이에 첨가하였다. 혼합물을 볼텍싱하였다. 이어서, 아세토니트릴(200 ㎕)을 첨가하여 단백질을 침전시킨 후, 1분 동안 볼텍싱하고 16000 r/분으로 8분 동안 원심분리하였다. 측정을 위해 상청액(10 ㎕)을 직접 주사하였다.

4.3. 생물 샘플의 처리

12 마리 래트를 무작위로 2개 군(즉, 1개의 군당 래트 6 마리씩)으로 나눴다. 이러한 래트를 투여 전 12시간 동안 단식시키고 임의의 물을 허락하였다. 각각의 래트의 블랭크 혈액(약 0.5 ml)을 채취하고, 이어서, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드(20 mg/kg)를 각각 위내 위관영양법 및 꼬리 정맥내 주사를 통해 투여하였다. 투여 후 상이한 시점에서 안와 정맥 채혈로부터 혈액(약 0.5 ml)을 채혈하였다(꼬리 정맥내 투여에 대한 혈액 수집 시점은 5분, 15분, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간이었고; 위내 투여에 대한 혈액 수집 시점은 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간이었다). 혈액을 헤파린 첨가된 원심분리관에 넣고 8000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 혈장(100 ㎕)을 원심분리관(1.5 ml)에 피펫팅하고, 내부 표준(메탄올 중 1 ㎍/㎖ 아토르바스타틴 헤미-칼슘 염 용액; 10 ㎕)을 이에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 볼텍싱하였다. 이어서, 아세토니트릴(200 ㎕)을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 1분 동안 볼텍싱하고, 1600 r/분으로 8분 동안 원심분리하였다. 상청액을 회수하고, 상청액(10 ㎕)을 검출을 위해 직접 주사하였다.

5. 결과

5.1. 가로축으로서 샘플 농도의 자연 로그 및 세로축으로서 내부 표준에 대한 샘플의 피크 면적 비의 자연 로그를 갖는 표준 곡선을 다음과 같이 규명하였다:

y = 1.008x - 4.149(R2 = 0.998).

5.2. 각 시점에서 혈장 약물 농도(ng/㎖)를 하기 표에 나타내었다.

5.2.1. 정맥내 투여 결과

5.2.2. 위내 투여 결과

5.2.3. 결론

생체이용률의 계산 방법:

F = (AUCig x Div)/(AUCiv x Dig) x 100%

여기서, D는 투여량이고; AUC는 혈장 약물 농도-시간 곡선하 면적이고; ig는 위내 투여를 나타내고; iv는 정맥내 주사 투여를 나타낸다.

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드는 56.87%의 생체이용률을 갖고, 우수한 약동학 특성을 갖는다.

실험 II . 래트에서 N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 ) -7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2- 메톡시에틸 )피페리딘-4- 일리덴 ] 아세트아미드 다이하이드로브로마이드에 대한 생체이용률 분석

1. 실험 동물

12 마리 위스타 래트(6 마리는 수컷이고 나머지 6 마리는 암컷이다, 체중 160 내지 190 g)를 베이징 바이탈 리버 래보래토리 애니멀 테크놀로지 캄파니 리미티드(허가 번호: SCXK(베이징) 2007-0001)로부터 구입하였다.

2. 투여 설계

3. 분석 방법

3.1. 투여 양생법 및 혈액 샘플 운용

12 마리 래트를 투여 전 12 시간 동안 금식시키고 임의의 물을 허락하였다. 이들을 무작위로 2개의 군(즉 1개의 군당 래트 6 마리 씩)으로 나누고, 투여 설계에 따라 시험 용품을 투여하였다. 투여 전 안와 정맥 채혈로부터 및 투여 후 5분, 15분, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 24시간, 30시간에 혈액(약 0.5 ml)을 채취하고, 헤파린 첨가된 관에 넣고 8000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 혈장(100 ㎕)을 회수하고, 내부 표준(메탄올 중 1 ㎍/ml 아토르바스타틴 헤미-칼슘 염 용액; 10 ㎕)을 이에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 볼텍싱하였다. 이어서, 아세토니트릴(200 ㎕)을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 2분 동안 볼텍싱하고 13000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수득하고, 상청액(20 ㎕)을 측정을 위해 직접 주사하였다.

3.2. 표준 곡선의 수립

상이한 농도(50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 250 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖)를 갖는 메탄올 중 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로브로마이드 용액(10 ㎕)을 개별적으로 원심분리관(1.5 ml)에 피펫팅하였다. 래트 블랭크 혈장(100 ㎕)을 이에 첨가하고 볼텍싱하였다. 내부 표준(메탄올 중 1 ㎍/ml 아토르바스타틴 헤미-칼슘 염 용액; 10 ㎕)을 첨가하였다. 이어서, 아세토니트릴(200 ㎕)을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 2분 동안 볼텍싱하고 13000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수득하고, 상청액(20 ㎕)을 측정을 위해 주사하였다. 가로축으로서 내부 표준에 대한 샘플의 혈장 약물의 농도 비 및 세로축으로서 내부 표준에 대한 피크 면적 비를 사용하여 표준 곡선을 수립하였다.

3.3. HPLC/MS 조건은 실험 1에서의 조건과 동일하였다.

4. 결과

주요 약동학 파라미터 및 경구 생체이용률 결과를 DAS2.0(통계적 모멘트)을 사용하여 계산하였다.

5. 결론

생체이용률의 계산 방법:

F = (AUCig x Div)/(AUCiv x Dig) x 100%

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로브로마이드는 42.76%의 생체이용률을 갖고, 우수한 약동학 특성을 갖는다.

실험 III. N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 )-7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드에 대한 생체이용률 분석

1. 실험 동물

8 마리 위스타 래트(수컷, 체중 160 내지 190 g)를 래보래토리 애니멀 센터 차이니즈 피엘에이 아카데미 오브 밀리터리 메디칼 사이언시스(Laboratory Animal Center, Chinese PLA Academy of Military Medical Sciences; 허가 번호: SCXK(Army) 2012-0004; 인증 번호: 0037074)로부터 구입하였다.

2. 투여 설계

예비-제형의 제조:

1) 화합물을 10 ml 유리관에 정확히 칭량하였다.

2) DMSO의 부피는 총 부피의 2%이고, DMSO를 피펫팅하였다. 피펫의 끝을 원심분리관의 내벽에 밀어붙이면서 천천히 회전하고, DMSO를 수회 피펫팅하여 원심분리관의 벽에 흡착된 화합물을 용해하였다. 모든 화합물을 원심분리관의 바닥 부분으로 옮긴 후, 화합물을 볼텍싱하여 용해하고 이어서 수욕에서 80℃로 방치하였다.

3) 총 부피의 6%인 폴리옥실에틸렌 35-피마자유를 첨가하고 볼텍싱하였다.

4) 총 부피의 92%인 주사용(0.9%) 나트륨 클로라이드 용액을 첨가하고 볼텍싱하여 투명한 용액을 수득하고, 이는 60분 이내에 사용될 것이다.

(주의: 총 부피는 제조의 완료시 수득된 용액의 부피를 지칭한다.)

3. 분석 방법

3.1. 투여 양생법 및 혈액 샘플 운용

8 마리 래트를 투여 12시간 전에 금식시키고 임의의 물을 허락하였다. 이들을 무작위로 2개의 군(즉, 하나의 군당 래트 4 마리씩)으로 나누고, 투여 설계에 따라 약물을 투여하였다. 투여 전 안와 정맥 채혈로부터 및 투여 후 5분, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 및 8시간에 혈액(약 0.5 ml)을 채취하고, 헤파린 첨가된 원심분리관에 넣고 8000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 혈장(100 ㎕)을 회수하고, 메탄올 중 0.2% 아세트산(200 ㎕)(내부 표준(이르베사르탄, 20 ng/㎖)을 함유함)을 이에 첨가하여 단백질을 침전시키고, 2분 동안 볼텍싱하고 13000 r/분으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수득하고, 상청액(20 ㎕)을 검출을 위해 주사하였다.

3.2. LC-MS 검출 조건

(1) 크로마토그래피 조건

크로마토그래피 컬럼: 페노메넥스 시너지 폴라(Phenomenex Synergi Polar)-RP(150 x 4.6 mm, 2.5 ㎛)

유속: 1 ㎖/분; 컬럼 온도: 40℃

이동상: A 상: 암모늄 포름에이트의 5 mM 수용액; B 상: 메탄올, 및 구배는 다음과 같다:

(2) MS 조건

API3000 LC-MS/MS; ESI 공급원; MRM 양이온 스캔 모드; 및 파라미터는 다음과 같다:

4. 결과

5. 결론

생체이용률의 계산 방법:

F = (AUCig x Div)/(AUCiv x Dig) x 100%

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드는 23.9%의 생체이용률을 갖고, 우수한 약동학 특성을 갖는다.

실험 IV . 래트에서 N-[4-(3- 클로로 -4- 플루오로페닐아미노 ) -7-(2- 메톡시에톡시 ) 퀴나졸린 -6-일]-2-[1-(2- 메톡시에틸 )피페리딘-4- 일리덴 ] 아세트아미드 다이메틸설포네이트에 대한 생체이용률 분석

1. 실험 동물

12 마리 SD 래트(6 마리는 수컷이고 나머지 6 마리는 암컷이다, 7 내지 10 주령, 체중 200 내지 350 g)를 베이징 바이탈 리버 래보래토리 애니멀 테크놀로지 캄파니 리미티드로부터 구입하고, 애니멀 하우스 지엘피 센터(Animal House, GLP Center; 타이핑 로드 27 코트야드 소재)에서 사육하였다. 베이징 바이탈 리버 래보래토리 애니멀 테크놀로지 캄파니 리미티드의 제품 등록 번호는 SCXK(베이징) 2009-0002이다.

2. 투여 설계

3. 분석 방법

3.1. 투여 양생법 및 혈액 샘플 운용

투여 설계에 따라 동물의 각각의 군에 투여 1분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간 및 24시간 후에 안와 정맥 채혈로부터 유리 모세관을 사용하여 혈액(약 0.5 ml)을 채취하고, 헤파린 첨가된 원심분리관에 넣었다. 관을 위아래로 약하게 진탕하고, 이어서 3000 r/분으로 10분 동안 4℃로 원심분리하였다. 혈장을 분리하였다. 혈장(50 ㎕)을 원심분리관(5 ml)으로 피펫팅하고, 이어서 내부 표준으로서 50% 메탄올 수용액(50 ㎕) 및 티에노르핀-D4 동위원소(50 ㎕)를 이에 첨가하고 볼텍싱하였다. 메탄올:아세토니트릴 = 1:3(부피 비)의 용액을 첨가하고, 완전히 혼합하기 위해 30초 동안 볼텍싱하였다. 생성된 혼합물을 3000 r/분으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액(500 ㎕)을 제거하고, 일련의 희석을 위해 20% 메탄올 용액(500 ㎕)에 첨가하였다. 혼합물을 완전히 혼합하기 위해 30초 동안 볼텍싱하였다. 혼합물을 13000 r/분으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액(10 ㎕)을 LC/MS/MS 분석을 위해 주사하였다.

3.2. LC-MS 검출 조건

크로마토그래피 컬럼: 아젤라 베누실(Agela Venusil) AQ-C18, 5 ㎛ 2.1 x 50 mm; S/N: AQ-2105060029.

액체상 조건: A: 수용액(5 mmol/L 암모늄 아세테이트, 0.2% 포름산), B: 메탄올; 컬럼 온도 25℃; 주입 용량: 10 mL; 구배 용리. 구배 조건: A 상: 5 mM 암모늄 아세테이트(0.2% 포름산 함유); B 상: 메탄올; 0 내지 0.5분, A 상 0.21 ㎖/분, B 상 0.09 ㎖/분; 0.5 내지 1분, A 상의 유속은 0 ㎖/분으로 선형 감소하고, B 상의 유속은 0.3 ㎖/분으로 선형 증가하고; 1.01분, B 상의 유속은 0.5 ㎖/분으로 증가하고 1분 동안 유지하고; 2.01분, A 상의 유속은 0.21 ㎖/분으로 증가하고, B 상의 유속은 0.09 ㎖/분으로 감소하고, 비는 2분 동안 유지되고 초기 유속 비로 평형을 유지하였다.

MS 조건: 이온 공급원: 터보 이온스프레이(ESI+); 검출 모드: MRM; 5분기 파라미터: 화합물 1: m/z 544.2-457.1, CE(충돌 에너지): 36.5.

4. 결과

래트에서 5.0 mg/kg의 단일 정맥내 주사에 대한 통계적 모멘트(n=6)의 약동학 파라미터

래트에서 5.0 mg/kg의 단일 위내 투여에 대한 통계적 모멘트(n=6)의 약동학 파라미터

5. 결론

생체이용률의 계산 방법:

F = (AUCig x Div)/(AUCiv x Dig) x 100%

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트는 56.9%의 생체이용률을 갖고, 우수한 약동학 특성을 갖는다.

생물학적 실시예 2

마우스에 대한 단일 위내 위관영양법을 위한 MTD 분석

1. 실험 동물: ICR 수컷 마우스(체중 19 내지 22 g)를 베이징 바이탈 리버 래보래토리 애니멀 테크놀로지 캄파니 리미티드(동물 허가 번호 SCXK(베이징) 2007-0001)로부터 구입하였다.

2. 실험 설계: 21 마리 마우스를 9개의 군으로 나눴다. 군 I, IV 및 VI은 군당 1 마리 마우스를 나타내고, 군 II, V 및 IIX은 군당 4 마리 마우스를 나타내고, 군 III, VI 및 IX는 군당 2마리 마우스를 나타낸다. 화합물 4, 화합물 2 및 화합물 12를 주사용 물에 용해하였다. 군 I 내지 III에 각각 100 mg/kg, 150 mg/kg, 및 200 mg/kg 투여량으로 화합물 4(N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노) -7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드)를 꼬리 정맥내 투여하였다. 투여 후 동물 반응 및 체중 변화를 관찰하고, 이러한 동물을 해부학적 관측을 위해 14일 후 희생시켰다. 군 IV 내지 VI에 각각 100 mg/kg, 150 mg/kg, 및 200 mg/kg 투여량으로 화합물 2(N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드)를 꼬리 정맥내 투여하였다. 투여 후 동물 반응 및 체중 변화를 관찰하고, 이러한 동물을 해부학적 관측을 위해 14일 후 희생시켰다. 군 VII 내지 IX에 각각 100 mg/kg, 150 mg/kg, 및 200 mg/kg 투여량으로 화합물 12(N-[4-(3-에틴일페닐아미노-7-(2-에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-메틸피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드)를 꼬리 정맥내 투여하였다. 투여 후 동물 반응 및 체중 변화를 관찰하고, 이러한 동물을 해부학적 관측을 위해 14일 후 희생시켰다.

3. 실험 결과

화합물 4: 마우스의 사망 환경 및 해부학적 현상

화합물 2: 마우스의 사망 환경 및 해부학적 현상

화합물 12: 마우스의 사망 환경 및 해부학적 현상

예비 약동학 연구로부터 위장관에서 모아진 화합물 4 및 화합물 12, 및 이들의 경구 생체이용률이 매우 낮음이 밝혀졌다.

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-((2-메톡시에틸))피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드는 더욱 용인되고 독성이 적고, 따라서 더욱 바람직한 임상 약제 옵션이다.

생물학적 실시예 3

EGFR 의 티로신 키나아제 활성에 대한 억제 효과

1. 시약 및 재료

EGFR: 인비트로겐 캄파니(Invitrogen Company), 카탈로그 번호 PV3872

pGT(폴리(글루탐산-티로신)): 시그마-알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich Company), 카탈로그 번호 P0275

pY-20(마우스 항-포스포티로신 항체-HRP(서양고추냉이 과산화효소)): 인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 03-7720

TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, HRP 기질): 이바이오사이언스 캄파니(eBioscience Company), 카탈로그 번호 00-4201-56

96-웰 마이크로티터 플레이트: 눈크 캄파니(Nunc Company), 카탈로그 번호 442404

2. 기계 및 장치

마이크로플레이트 판독기: 바이오-라드 캄파니(Bio-Rad Company), 모델 680

96-웰 마이크로플레이트 세척기: 바이오-라드 캄파니, 모델 1575

3. 분석 방법

3.1. 일반적인 방법

분석 방법은 이러한 변형이 만들어지는 것에 기초하여 문헌[J. Moyer, E. Barbacci, K. Iwata, et al., Induction of apoptosis and cell cycle arrest by CP-358,774, an inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase Cancer Research 1997, 57:. 4838-4848]을 참조한다. 상기 분석 방법은 다음과 같이 요약된다.

3.1.1. 4℃에서, 96-웰 마이크로티터 플레이트를 밤새 PBS(포스페이트 완충액)에 용해된 0.2 mg/㎖ pGT(효소의 기질로서)로 코팅하였다. 비결합된 pGT를 세척 용액(PBS 중 0.05% 트윈-20)으로 세척하여 제거하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 공기 건조하였다.

3.1.2. 효소 반응을 50 mM HEPE(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-2-에탄설폰산)(pH 7.5), 0.01% BRIJ-35(폴리옥시에틸렌 라우릴 에터), 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA(에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에터)테트라아세트산)를 함유하는 반응 시스템(50 ㎕) 중에서 특정한 농도의 ATP(아데노신 트라이포스페이트) 및 키나아제와 함께 수행하고, 30분 동안 실온에서 진행하였다. ATP의 말단에서 포스페이트 기를 티로신 잔기를 인산화하기 위해 키나아제 촉매에 의해 pGT의 티로신 잔기로 옮길 수 있다.

3.1.3. 최종 농도의 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 인산화된 티로신 잔기를 pY-20을 사용하여 확인하였다. 항체 끝에서 HRP는 TMB가 색을 띨 수 있게 하였다. 이어서, 동량의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료하였다. OD 값(이는 pGT의 티로신 잔기의 인산화 정도와 긍정적으로 관련된다)을 450 nm에서 측정하였다.

3.2. 키나아제 및 기질 ATP의 농도를 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)에 의해 발간된 문헌[Optimization of a LanthaScreen Kinase assay for EGFR(ErbB1)](https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/EGFR_LanthaScreen_activity_Europium.pdf)을 참조하여 측정하였다. 최종 농도에 대한 선택 기준은 검출 시스템의 선형 범위 내의 생성물의 수율 및 ATP 접근 Km(미카엘리스 상수) 값의 농도를 가능하게 하는 키나아제의 농도이다.

3.3. 화합물의 활성을 측정하기 위한 분석

3.3.1. 적절한 양의 화합물을 DMSO(다이메틸설폭사이드)에 용해하여 2 mM 스톡 용액을 제조하였다. 이어서, 스톡 용액을 DMSO로 희석하여 가장 높은 시험 농도의 50-배의 작동 용액을 수득하고, 4-배 희석하여 총 7개 농도를 수득하였다.

3.3.2. 50-배 농도의 화합물 작동 용액(1 ㎕)을 반응 시스템(50 mM HEPES(pH 7.5), 0.01% BRIJ-35, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 40 ng/㎖ 최종 농도의 44.4 ng/㎖ EGFR을 함유함)(44 ㎕)에 첨가하고, 볼텍싱하였다. H₂O(EGFR 분석시 ATP의 농도는 100 ㎛이고, Her2 분석시 ATP의 농도는 400 ㎛이다)에 용해된 10-배 농도의 ATP(5 ㎕)를 첨가하여 효소 반응을 개시한 후 실온에서 30분 동안 반응시켰다.

3.3.3. 시험 화합물이 없는 양성 용매 대조군(PC) 및 ATP 및 시험 화합물이 없는 음성 용매 대조군(NC)을 동시에 준비하였다. 투여된 군의 OD 값과 용매 대조군의 OD 값을 비교하여 화합물의 억제율을 수득하고, 이를 다음과 같이 계산하였다: 억제율 = [1-(실험 값 - NC 평균 값)/(PC 평균 값 - NC 평균 값)] x 100%. 억제율 및 SD(표준 편차)의 평균 값을 중복 웰로 측정하였다. 가로축으로서 로그 분포인 화합물의 농도 및 세로축으로서 억제율의 평균 값을 갖는 곡선을 플롯팅하고 4-파라미터 로지스틱 함수를 이용하여 맞췄다. 50% 억제율에 상응하는 곡선 점에서 화합물의 농도는 IC₅₀ 값이다.

EGFR 분석 조건

4. 분석 결과

EGFR의 억제 활성(IC₅₀: nM)

생물학적 실시예 4

돌연변이체 EGFR ( L858R , L858R / T790M )의 티로신 키나아제 활성의 억제 작용

1. 주요 시약 및 재료

EGFR(L858R): 인비트로겐 코포레이션, 카탈로그 번호 PR7447A

EGFR(L858R/T790M): 인비트로겐 코포레이션, 카탈로그 번호 PR8911A

P22(폴리펩티드 기질): 지엘 바이오켐 리미티드(GL Biochem Ltd.), 카탈로그 번호 112393

96-웰 플레이트: 코닝 인코포레이티드(Corning Inc.), 카탈로그 번호 3365

384-웰 플레이트: 코닝 인코포레이티드, 카탈로그 번호 3573

2. 주요 기계 및 장치

칼리퍼 워크스테이션(Caliper workstation)

3. 분석 방법

3.1. 분석을 위한 일반적인 조건

3.2. 키나아제 완충액의 배합: 50 mM HEPES(pH 7.5), 0.0015% Brij-35, 10 mM MgCl₂, 및 2 mM DTT(다이티오트레이톨).

3.3. 종결 용액의 배합: 100 mM HEPES(pH 7.5), 0.015% Brij-35, 0.2% 코팅 시약 #3(칼리퍼 워크스테이션으로 제조됨), 및 50 mM EDTA(에틸렌 다이아민 테트라아세트산).

3.4. 화합물의 희석

3.4.1. 50-배 농도 화합물의 배합: 예를 들면, 분석을 위한 화합물의 최종 농도가 12.5 nM인 경우, 50-배 농도는 625 nM이다. 50-배 농도의 화합물 작동 용액을 96-웰 플레이트 중 DMSO로 4-배 희석하여 총 7개의 희석된 농도를 수득하였다.

3.4.2. 5-배 농도의 화합물을 반응 플레이트로 옮겼다. 용액(10 ㎕)을 상기 언급된 96-웰 플레이트의 각각의 웰로부터 또 다른 96-웰 플레이트로 옮기고, 이어서 키나아제 완충액(90 ㎕)을 첨가하였다. 용액(5 ㎕)을 상기 96-웰 플레이트로부터 384-웰 반응 플레이트로 옮겼다. 결과적으로, 10% DMSO에 용해된 5-배 농도의 화합물(5 ㎕)이 384-웰 반응 플레이트에 존재한다. 250 mM EDTA(5 ㎕)를 음성 대조군 웰에 첨가하였다.

3.5. 키나아제 반응

3.5.1. 키나아제 완충액을 사용하여 키나아제에 의해 2.5-배 농도의 효소 용액을 배합하였다.

3.5.2. 키나아제 완충액을 사용하여 폴리펩티드 및 ATP에 의해 2.5-배 농도의 기질 용액을 배합하였다.

3.5.3. 2.5-배 농도의 효소 용액(10 ㎕)을 384-웰 플레이트에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다.

3.5.4. 2.5-배 농도의 기질 용액(10 ㎕)을 384-웰 플레이트에 첨가하고, 28℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.

3.5.5. 종결 용액(25 ㎕)을 첨가하여 반응을 종결하였다.

3.6. 기질 전환율 데이타를 칼리퍼로 판독하였다.

3.7. 억제율 계산: 전환율을 억제율로 전환하였다.

억제율(%) = (max - 전환율)/(max - min) x 100%

여기서, max는 DMSO 대조군의 전환율을 지칭하고, min은 효소-부재 대조군의 전환을 지칭한다. 억제 곡선에 의해 IC₅₀ 값을 측정하였다.

돌연변이체 EGFR에 대한 억제 활성(IC₅₀: nM)

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 매우 선택적이고 비가역적인 티로신 키나아제 억제제이고, 특히 EGFR에 대하여 높은 억제 활성을 나타내고, 따라서 임상 약제에 대한 더욱 바람직한 옵션이다.

생물학적 실시예 5

인간 종양 세포에서 시험관내 억제 작용

1. 시험된 세포 및 주요 시약

인간 편평세포 암종 세포주 A431, 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827, 두경부암 세포주 Fadu 및 인간 췌장암 세포주 AsPC-1을 셀 뱅크 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스(Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)로부터 구입하였다.

RPMI-1640(배지의 종류; 깁코 인코포레이티드(Gibco Inc.), 카탈로그 번호 31800-022)은 건조 분말이다. 액체 배지를 설명서에 따라 배합하고, 세포 배양의 요건을 충족하기 위해 2 g/L NaHCO₃ 및 5.958 g/L HEPE를 이에 첨가하였다.

EMEM(얼의 염(Earle's salt)을 갖는 최소 필수 배지; 깁코 인코포레이티드, 카탈로그 번호 41500-034)은 건조 분말이다. 설명서에 따라 액체 배지를 배합하고, 세포 배양의 요건을 충족하기 위해 2.2 g/L NaHCO₃ 및 5.958 g/L HEPE를 이에 첨가하였다.

DMEM(듈베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium); 깁코 인코포레이티드, 카탈로그 번호 12800-017)은 건조 분말이다. 설명서에 따라 액체 배지를 배합하고, 세포 배양의 요건을 충족하기 위해 2.2 g/L NaHCO₃ 및 5.958 g/L HEPE를 이에 첨가하였다.

F-12K(영양 혼합물 F-12 햄 카이그의 변형; 시그마-알드리치 인코포레이티드, 카탈로그 번호 N3520)는 건조 분말이다. 설명서에 따라 액체 배지를 배합하고, 세포 배양의 요건을 충족하기 위해 1.5 g/L NaHCO₃ 및 2.383 g/L HEPE를 이에 첨가하였다.

F-12(햄 F-12 영양 혼합물; 깁코 인코포레이티드, 카탈로그 번호 21700-075)는 건조 분말이다. 설명서에 따라 액체 배지를 배합하고, 세포 배양의 요건을 충족하기 위해 1.76 g/L NaHCO₃ 및 2.383 g/L HEPE를 이에 첨가하였다.

FBS(소 태아 혈청), 하이클론 래보래토리즈 인코포레이티드(Hyclone Laboratories, Inc.), 카탈로그 번호 SV30087.

MTT(테트라졸륨 염), 시그마 코포레이션(Sigma Corporation), 카탈로그 번호 M5655. 5 mg/㎖ 스톡 용액을 포스페이트 완충액을 사용하여 제조하였다.

SRB(설포르호다민): 시그마-알드리치 인코포레이티드, 카탈로그 번호 S9012. 0.4%(w/v) 작동 용액을 1% 아세트산을 사용하여 제조하였다.

2. 주요 기계 및 장치

CO₂ 세포 인큐베이터(유형 311 및 371), 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc.).

층류 유동 후드(Laminar flow hood)(유형 DL-CJ-2N), 베이징 동리안 하르 인스트루먼트 메뉴펙쳐 캄파니 리미티드(Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co. Ltd.).

ELIASA(유형 680), 바이오-래드 래보래토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.).

96-웰 플레이트 세척기(유형 1575), 바이오-래드 래보래토리즈 인코포레이티드.

3. 분석 방법

3.1, 세포 배양 배지 배합(완전 배지)은 일반적으로 셀 뱅크 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 및 ATCC(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)에 의해 제공된 것을 따르고, 첨가제를 기본 배지 배합의 관점에서 조정하였다.

3.2. 세포 배양 방법: 세포를 대수 생장기(즉, 부착 세포가 실질적으로 완전한 합류에 도달함)까지 5% CO₂ 및 포화 습도하에 37℃에서 완전 배지 중에서 배양하고, 이어서 후속 분석을 위해 수집하였다. 부착 세포의 경우, 이들을 먼저 트립신/DETA로 소화시켜 분리하였다.

3.3. 특정한 수의 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트(이하, 96-웰 플레이트로 지칭됨)에 시딩하였다. 다양한 농도의 화합물을 첨가하고 일정 기간(통상적으로 3일) 동안 공-배양하였다. 최종적으로, 웰 중 총 세포 단백질을 SRB 분석을 사용하여 측정하거나, 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다.

3.3.1. 세포 시딩 농도를 화합물 억제 분석 과정을 완전히 모의하는 세포 성장 곡선 분석에 의해 측정하였다. 상이한 농도의 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였고, 적합한 농도는 화합물의 개입 없이 분석 시간에 걸쳐서 대수 생장기에서 세포를 유지하는 최대 시딩 농도이거나 이에 도달하여야 한다.

3.3.2. SRB 분석을 사용한 총 세포 단백질의 측정: 웰 중 배지를 회수하였다. 10% 트라이클로로아세트산을 첨가하여 1시간 초과 동안 세포를 고정한 후 제거하였다. 세포를 H₂O로 세척하고, 이어서 0.4% SRB로 15 내지 30분 동안 염색하였다. 과잉 SRB를 제거하고, 세포를 1% 아세트산으로 세척하였다. 10 mM 트리스(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 수용액(100 ㎕)을 첨가하여 단백질과 결합된 SRB를 용해하였다. 570 nm 파장에서 검출을 수행하였다.

3.3.3. MTT 분석을 사용한 세포 생존력의 측정: 웰 중 배지를 회수하였다. 0.5 mg/㎖ MTT를 함유하는 기저 배지(일반적으로 소 태아 혈성(FBS) 및 다른 첨가제가 없는 배지를 지칭함)(100 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 3 시간 동안 배양하였다. MTT를 함유하는 기저 배지를 회수하고, DMSO(100 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하여 포르마잔을 용해하였다. 490 nm 파장에서 측정을 수행하였다.

3.3.4. SRB 또는 MTT 분석의 선택: 인간 편평세포 암종 세포주 A431, 두경부암 세포주 Fadu 및 인간 췌장암 세포주 AsPC-1의 실험에서 MTT 분석을 사용하고, 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827의 실험에서 SRB 분석을 사용하였다.

3.4. 화합물의 희석 및 첨가: 세포에 내성이 있을 수 있는 DMSO의 농도를 DMSO 내성 분석에 의해 측정하고, 이로 인해 화합물의 희석 및 첨가 방법을 선택하였다. 세포 성장시 상이한 농도의 DMSO의 효과를 DMSO 내성 분석으로 측정하였다. 내성은, 세포 성장시 효과가 20%를 초과하지 않는 것으로 정의된다. 하기와 같은 두가지 방법을 최종적으로 측정하였다.

방법 I: 시험 화합물(1 내지 2 mg)을 칭량하고 DMSO에 용해하여 2 mM 스톡 용액을 형성하였다. 스톡 용액을 기저 매질을 사용하여 20 μM(또는 분석의 필요에 따라 조정됨)로 희석하고, 3-배 구배 희석(DMSO 농도는 희석 동안 1%로 변함없이 유지된다)을 이용하여 8개의 농도 군을 수득하였다. 분석 웰에 완전 배지(80 ㎕) 및 10-배 농도의 화합물 작동 용액(20 ㎕)을 첨가하였고, 웰당 최종 부피는 200 ㎕이었고 DMSO 농도는 0.1%이었다. 수반된 세포주는 HCC827이었다.

방법 II: 시험 화합물(1 내지 2 mg)을 칭량하고 DMSO에 용해하여 2 mM 스톡 용액을 형성하였다. 초기 농도를 분석의 필요에 따라 조정하고, DMSO로 3-배 구배 희석을 이용하여 총 8개 농도의 화합물의 용액을 수득하였다. 완전 배지(99 ㎕) 및 화합물의 용액(1 ㎕)을 각각의 분석 웰에 첨가하였고, 웰당 최종 부피는 200 ㎕이었고 DMSO 농도는 0.5%이었다. 수반된 세포주는 A431, Fadu 및 AsPC-1이었다.

3.5. 화합물의 억제 활성의 계산: 분석은 화합물 분석군, 화합물이 없는 양성 용매 대조군(PC) 및 세포 및 화합물이 없는 음성 용매 대조군(NC)을 포함한다. 억제율 = [1-(실험 값 - NC 평균 값)/(PC 평균 값 - NC 평균 값)] x 100%. 억제율 및 SD의 평균 값을 2회 분석 웰로 측정하였다. 가로축으로서 화합물의 농도 및 로그 분포를 갖고, 세포축으로서 억제율의 평균 값을 갖는 곡선을 플롯팅하고 4-파라미터 로지스틱 함수를 사용하여 맞췄다. 50% 억제율에 상응하는 곡선점에서 화합물의 농도는 IC₅₀ 값이다.

인간 종양 세포주의 배양 배지 배합 및 세포 시딩 농도

4. 분석 결과

4.1. 인간 편평세포 암종 세포주 A431에서 억제 작용

인간 표피암 세포주 A431에서 억제 활성(IC₅₀: μM)

4.2. 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827에서 억제 활성

인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827에서 억제 활성(IC₅₀: μM)

4.3. 인간 두경부암 세포주 Fadu에서 억제 활성

인간 두경부암 세포주 Fadu에서 억제 활성(IC₅₀: μM)

4.4. 인간 췌장암 세포주 AsPC-1에서 억제 활성

인간 췌장암 세포주 AsPC-1에서 억제 활성(IC₅₀: μM)

N-[4-((3-클로로-4-플루오로페닐아미노))-7-((2-메톡시에톡시))퀴나졸린-6-일]-2-[1-((2-메톡시에틸))피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 매우 선택적이고 비가역적인 티로신 키나아제 억제제이고, 특히 EGFR에서 높은 억제 활성을 나타낸다.

생물학적 실시예 6

A431 인간 표피 암종 이종이식 모델의 약역학 활성에 대한 평가

1. 분석 방법

세포 배양:

종양 세포를 10% 비활성화된 소 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 MEM 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 대수 생장기에서 종양 세포를 수집하고, 적절한 밀도로 조정하고, 누드 마우스에 피하 주사하였다(0.2 ml/마우스). 종양이 누드 마우스에서 형성된 후 이종이식 모델을 수립하고 3 세대 초과 동안 생체내 계대배양 하였다.

종양의 접종 및 분류:

상기 언급한 종양이 있는 마우스를 경추 탈골로 희생시켰다. 종양을 떼어내고 멸균 조건하에 작은 종양 조각(약 2 mm x 2 mm x 2 mm)으로 절단하였다. 작은 종양 조각을 투관침(trocar)을 사용하여 누드 마우스에 피하 접종하였다. 종양이 있는 누드 마우스에서 종양이 약 150±50 mm³(단위: 부피)까지 성장했을 때, 실험 동물을 다음 4개의 군으로 각각 8 마리씩 무작위로 나눴다: 용매 대조군, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트의 20, 40 및 80 mg/kg 투여군, 및 양성 대조군 약물 타르세바의 50 mg/kg 투여군. 각각의 군의 동물은 14 일간 연속해서 하루에 한번 위내 투여를 겪었다. 분류 일은 0일로 배정된다.

2. 분석 종점 및 데이타 처리

종양 부피를 다음과 같이 계산하였다: 부피 = 0.5 x 긴 지름 x 짧은 지름². 상대적인 종양 부피(RTV)를 RTV = V_t/V₀에 기초하여 계산하였고, 여기서 V₀은 투여될 동물을 분류할 때(즉, d0) 측정된 종양 부피이고, V_t는 각 측정이 이뤄진 때의 종양 부피이다. 상대적인 종양 증식률 T/C를 상대적인 종양 부피에 기초하여 계산하였고, 여기서, T는 처리군의 상대적인 종양 부피의 평균 값이고, C는 용매 대조군의 상대적인 종양 부피의 평균 값이다. T/C를 다음과 같이 계산하였다:

T/C = T_RTV/C_RTV x 100%(여기서, T_RTV는 처리군의 RTV이고, C_RTV는 용매 대조군의 RTV이다).

억제율(%) = (용매 대조군의 평균 종양 중량 - 처리군의 평균 종양 중량)/용매 대조군의 평균 종양 중량 x 100%.

체중 변화율(%) = W_n/W₀ x 100%(여기서, W_n은 n일에 각 군의 실험 동물의 평균 체중이고, W₀는 0일에 각 군의 실험 동물의 평균 체중이다).

3. 통계 분석

일 방향 아노바 시험을 SPSS13.0에서 수행하여, 군 사이의 통계 분석을 수행하였다.

4. 분석 결과

분석 종료시 각 군의 종양 부피, 상대적인 종양 부피 및 T/C

상기 종양 부피 파라미터 및 상대적인 종양 부피 파라미터에서, **p<0.01 및 ***p<0.001은 용매 대조군과 비교하였다.

각각의 군의 종양 중량 및 종양 억제율

"-"는 아무것도 없거나 유효 데이타가 없음을 나타내고; ***p<0.001은 용매 대조군과 비교하였다.

5. 분석 결론

화합물 3의 3개의 투여군은 모두 종양 성장을 억제할 수 있고, T/C는 각각 30.6%, 37.7% 및 19.1%이었고, 우수한 약물-효과 관계를 보인다. 양성 대조군의 T/C는 47.3%이었다.

A431 인간 편평세포 암종 이종이식 모델에서 화합물 3의 3개의 투여군의 종양 억제율은 각각 68.6%, 73.2% 및 85.6%이었고, 우수한 용량-효과 관계를 보인다. 양성 대조군의 종양 억제율은 62.0%이었다.

화합물 3의 3개의 투여군에서 실험 동물의 체중은 유의미하게 감소하지 않고, 유의미한 이상이 실험 동물에서 관찰되지 않고, 이는 모두 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트의 각각의 용량이 실험 동물에서 유의미한 독성을 생성하지 않을 수 있음을 나타낸다. 타르세바의 투여 용량은 MTD이었다.

N-[4-((3-클로로-4-플루오로페닐아미노))-7-((2-메톡시에톡시))퀴나졸린-6-일]-2-[1-((2-메톡시에틸))피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트는 우수한 항-종양 활성 및 넓은 치료 창을 갖고, 따라서 임상 약제에 대한 더욱 바람직한 옵션이다.

생물학적 실시예 7

FaDu 인간 두경부암 이종이식 모델의 약역학 활성에 대한 평가

1. 분석 방법

세포 배양:

종양 세포를 10% 비활성화된 소 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 MEM 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 대수 생장기에서 종양 세포를 수집하고, 적합한 밀도로 조정하고, 누드 마우스에 피하 주사하였다(0.2 ml/마우스). 종양이 누드 마우스에서 형성된 후 이종이식 모델을 수립하고 3 세대 초과 동안 생체내 계대배양 하였다.

종양 접종 및 분류:

상기 언급한 종양이 있는 마우스를 경추 탈골로 희생시켰다. 종양을 떼어내고 멸균 조건하에 작은 종양 조각(약 2 mm x 2 mm x 2 mm)으로 절단하였다. 작은 종양 조각을 투관침을 사용하여 누드 마우스의 우측 견갑골에 피하 접종하였다. 종양이 있는 누드 마우스에서 종양이 약 120±50 mm³(단위: 부피)까지 성장했을 때, 실험 동물을 다음 5개의 군으로 각각 8 마리씩 무작위로 나눴다: 용매 대조군, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트의 20, 40 및 80 mg/kg 투여군, 및 양성 대조군 약물 타르세바의 50 mg/kg 투여군. 각각의 군의 동물은 14 일간 연속해서 매일 위내 투여를 겪었다. 분류 일은 0일로 배정된다.

2. 분석 종점 및 데이타 처리

3. 통계 분석

4. 분석 결과

분석 종료시 각 군의 종양 부피, 상대적인 종양 부피 및 T/C

**p<0.01 및 ***p<0.001은 용매 대조군과 비교하였고; ##p<0.01은 양성 대조군과 비교하였다.

각각의 군의 종양 중량 및 종양 억제율

"-"는 아무것도 없거나 유효 데이타가 없음을 나타내고; **p<0.01 및 ***p<0.001은 용매 대조군과 비교하였고; ##p<0.01은 양성 대조군과 비교하였다.

5. 분석 결론

화합물 3의 각각의 투여군의 T/C는 각각 61.4%, 54.7% 및 31.6%이었다. 각각의 투여군은 FaDu 인간 두경부암 이종이식 모델에서 우수한 억제 활성을 갖는다.

화합물 3의 각각의 투여군의 종양 억제율은 각각 37.5%, 52.4% 및 76.2%이었다. 화합물 3의 각각의 투여군은 FaDu 인간 두경부암 이종이식 모델에서 우수한 억제 활성을 갖는다.

화합물 3의 각각의 투여군에서 실험 동물의 체중은 유의미하게 감소하지 않고, 유의미한 이상이 실험 동물에서 관찰되지 않고, 이들은 모두 화합물 3의 각각의 용량이 실험 동물에서 유의미한 독성을 생성하지 않음을 나타낸다. 타르세바의 투여 용량은 MTD이었다.

생물학적 실시예 8

HCC827 인간 비소세포 폐암 이종이식 모델의 약역학 활성에 대한 평가

1. 분석 방법

세포 배양:

접종 및 분류:

상기 언급한 종양이 있는 마우스를 경추 탈골로 희생시켰다. 종양을 떼어내고 멸균 조건하에 작은 종양 조각(약 2 mm x 2 mm x 2 mm)으로 절단하였다. 작은 종양 조각을 투관침을 사용하여 누드 마우스의 우측 견갑골에 피하 접종하였다. 종양이 있는 누드 마우스에서 종양이 약 150±50 mm³(단위: 부피)까지 성장했을 때, 실험 동물을 다음 5개의 군으로 각각 8 마리씩 무작위로 나눴다: 용매 대조군, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트의 20, 40 및 80 mg/kg 투여군, 및 양성 대조군 약물 타르세바의 50 mg/kg 투여군. 각각의 군의 동물은 14 일간 연속해서 매일 위내 투여를 겪었다. 분류 일은 0일로 배정된다.

2. 분석 종점 및 데이타 처리

3. 통계 분석

4. 분석 결과

분석 종료시 각 군의 종양 부피, 상대적인 종양 부피 및 T/C

***p<0.001은 용매 대조군과 비교하였다.

각각의 군의 종양 중량 및 종양 억제율

5. 분석 결론

화합물 3의 3개의 투여군의 T/C는 각각 0.5%, 1.8% 및 1.8%이었고, 우수한 용량-효과 관계를 보였다. 양성 대조군의 T/C는 5.0%이었다.

화합물 3의 3개의 투여군의 종양 억제율은 각각 91.7%, 95.2% 및 97.4%이었다.

화합물 3의 각각의 투여군에서 실험 동물의 체중은 유의미하게 감소하지 않고, 유의미한 이상이 실험 동물에서 관찰되지 않고, 이들 모두는 화합물 3의 각각의 용량이 실험 동물에서 유의미한 독성을 생성하지 않음을 나타낸다. 타르세바의 투여 용량은 MTD이었다.

생물학적 실시예 9

살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella Typhimurium )에 대한 돌연변이원성 분석

1. 재료 및 방법:

화합물 1: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드

화합물 3: N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트

직접 돌연변이원 1: 덱손(Dexon)(디마 테크놀로지 인코포레이티드(Dima Technology Inc.), 배치 번호: 456-2D)

직접 돌연변이원 2: 나트륨 아지드, SA(암레스코 인코포레이티드(Amresco Inc.), 배치 번호: 0580c509)

간접 돌연변이원: 2-아미노안트라센, 2-AA(시그마-알드리치 인코포레이티드; 배치 번호: STBB1901V)

균주: 살모넬라 타이피뮤리움 TA97, TA98, TA100, TA1535, 및 TA102의 히스티딘 영양요구성 돌연변이체(중국 의료 과학 아카데미의 실험 동물 과학 연구소)를 액체 질소에서 저온보존하였다.

비히클 1: 다이메틸 설폭사이드, DMSO(베이징 케미칼 웍스(Beijing Chemical Works), 배치 번호: 20111209)

비히클 2: 주사용 멸균수(톈진 파마슈티칼 자오쭤 캄파니 리미티드(Tianjin Pharmaceutical Jiaozuo Co., Ltd.), 배치 번호: 11080142)

2. 균주의 유전적 특징의 식별

자발적인 복구 돌연변이체 속도 시험, 히스티딘 요구 시험, 크리스탈 바이올렛 감수성 시험, UV 손상의 절제 수복 결핍 돌연변이에 대한 식별 시험, 암피실린 내성 시험 및 테트라사이클린 내성 시험을 포함하는 균주의 유전적 특징을 식별하고 공인하였다.

3. 균주의 증균 배양

액체 질소에 저온보존된 세균 현탁액을 37℃ 수욕에서 빠르게 해동시켰다. 세균 현탁액(100 ㎕)을 회수하여 20 mL 영양 브로쓰에 시딩하였다. 어두운 곳에서 37℃ 16시간 동안 정치 배양한 후, 돌연변이원성 분석을 위해 세균 현탁액을 취하였다.

4. 분석 방법

4.1. 분석군

4.2. 시험 샘플의 배합

화합물 1을 칭량하고 15 mg/㎖의 최종 농도로 DMSO에 용해하였다. 용액을 0.22 ㎛ 여과 막을 통해 여과하였다. 초기 여액(1.0 mL)을 여과 동안 버렸다. 이어서, 여과된 시험 샘플 용액(15 mg/㎖)을 DMSO를 사용하여 5, 1.5, 0.5 및 0.15 mg/㎖의 농도를 갖는 용액으로 구배적으로 희석하였다.

화합물 3을 칭량하고 15 mg/㎖의 최종 농도로 주사용 멸균수에 용해하였다. 용액을 0.22 ㎛ 여과 막을 통해 여과하였다. 초기 여액(1.0 mL)을 여과 동안 버렸다. 이어서, 여과된 시험 샘플 용액(15 mg/㎖)을 주사용 멸균수를 사용하여 5, 1.5, 0.5 및 0.15 mg/㎖의 농도를 갖는 용액으로 구배적으로 희석하였다.

4.3. 시험 샘플에 대한 농도 분석

여과 전에 15 mg/㎖ 시험 샘플 용액을 중복으로 유지하였다(각 부피당 0.5 mL). 배합 및 여과 후, 여과된 시험 샘플 용액의 각각의 농도를 중복으로 유지하고(각 부피당 0.5 mL) 실온에서 저장하였다. 농도의 정확도를 HPLC 방법으로 분석하였다.

HPLC 방법: 실리카 겔에 화학적으로 결합된 옥타데실 실란을 충전제(4.6 mm x 250 mm, 5 ㎛)로서 사용하였고; 이동상으로서 0.3% 아세트산 수용액(v/v, pH는 수성 암모니아를 사용하여 8.10±0.05로 조정하였다)-메탄올-아세토니트릴(1:7)=48:52(v/v); 유속은 1 ml/분이었고; 컬럼 온도는 40℃이었고; 검출 파장은 254 nm이었고; 실행 시간은 30분이었다.

4.4. 배합된 시험 샘플 용액의 저장 및 폐기

배합된 시험 샘플 용액을 투여 전에 실온에서 저장하였다. 남아있는 시험 샘플 용액을 투여가 끝난 후 의료 폐기물과 같이 폐기하였다.

4.5. 양성 대조군의 배합

덱손(Dexon): 적절한 양의 덱손을 칭량하고 주사용 멸균수에 용해하여 250 ㎍/㎖ 농도의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 0.22 ㎛ 멸균 여과 막을 통해 여과한 후 상기 용액을 사용하였다.

나트륨 아지드: 적절한 양의 나트륨 아지드를 칭량하고 주사용 멸균수에 용해하여 60 ㎍/㎖ 농도의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 0.22 ㎛ 멸균 여과 막을 통해 여과한 후 상기 용액을 사용하였다.

2-아미노안트라센: 적절한 양의 2-아미노안트라센을 칭량하고 DMSO에 용해하여 30 ㎍/㎖ 농도의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 0.22 ㎛ 멸균 여과 막을 통해 여과한 후 상기 용액을 사용하였다.

4.6. S9 혼합물의 제조 및 배합

이 분석에 사용된 스프래그-다우리 래트 간 S9 분획을 배치 번호 20120518을 사용하여 2012년 5월 18일에 제조하였다. 이를 액체 질소에 저장하였고, 단백질 농도는 20.477 mg/㎖이고, 이를 2014년 5월 17일 이전에 사용할 수 있다. 무균 시험 및 생물학적 활성 검출은 분석 요건을 충족하였다. S9 혼합물을 하기 표에 나타낸 조성에 기초하여 멸균 조건 하에 배합하였다.

사용 전에, S9 혼합물은 멸균 조건하에 배합하였다. 배합된 용량을 분석 요건에 따라 작동기로 측정하였다. 다른 용매를 센터의 표준 작동 과정에 따라 배합하였다. S9 혼합물의 배합은 하기 표를 따른다.

4.6. 분석 과정

상부 배지를 용융하도록 가열하고, 이어서 추가 사용을 위해 45℃ 수욕에서 균형을 유지하였다.

시험 제품 또는 대조군 약물 용액(0.1 mL), S9 혼합물 또는 PBS(pH 7.4)(0.5 mL), 및 상부 배지(약 0.05 mM 히스티딘, 약 0.05 mM 비오틴, 약 0.6% 아가, 및 약 0.5% NaCl 함유함)(2.0 mL) 및 마지막으로 세균 배양액(0.1 mL)의 순서로 10 mL 유리 시험관에 첨가하였다. 혼합물을 볼텍스 혼합기에서 신속하고 균일하게 혼합하고 하부 배지의 표면에 부었다. 상부 배지를 약간의 회전에 의해 기저 배지의 표면에 걸쳐 고르게 발랐다.

배지가 고형화가 될 때까지 플레이트를 수평 테이블에 놓았다. 이어서, 플레이트를 뒤집고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다(TA102 균주를 제외하고, 이를 72시간 동안 배양하였다). 플레이트를 철회하여 플레이트당 가시적인 복귀 돌연변이체 콜로니의 수를 카운팅하였다. 로딩하고 배양이 끝날 때 시험 샘플의 침전 현상을 관찰하였다. 3개의 플레이트를 각각 활성화 및 비활성화 조건하에 각각의 군에 대하여 시험하였다.

5. 결과 평가

상기 결과는 플레이트당 복귀 돌연변이체 콜로니의 수를 나타내고, 각각의 군의 복귀 돌연변이체 콜로니의 평균 수 및 표준 편차를 계산하였다. 결과가 하기 1 또는 2개의 기준을 충족하는 경우, 이는 긍정적으로 평가될 수 있다. 분석 결과의 생물학적 중요성이 우선적으로 고려되고, 통계 검정의 결과는 결과를 평가할 때 언급된다.

1) 하나 이상의 균주의 경우, 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수는 대사성 활성화가 있거나 없는 조건하에 약물-의존성 증가를 나타낸다.

2) 하나 이상의 투여군에서 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수는 대사성 활성화가 있거나 없는 조건하에 유의미한 증가를 나타내고, 이는 반복될 수 있다. 시험 제품이 균주에서 항균성 독성을 갖는지를 하기 기준에 따라 측정한다:

(1) 백그라운드 세균 깔개(bacterial lawn)가 얇게 되고, 이는 동시에 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수의 감소를 수반할 수 있다.

(2) 백그라운드 세균 깔개의 부재, 즉, 세균 성장이 완전히 억제된다.

(3) 침상 비-복귀 돌연변이체 돌연변이 작은 콜로니의 출현(통상적으로 백그라운드 세균 깔개의 부재가 수반된다).

6. 데이타 처리 방법

양측 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하고, 통계적 유의 수준은 P≤0.05로 설정하였다. 통계를 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니 수의 평균 값 및 표준 편차로 수행하였다.

데이타를 하기 과정에 따라 분석하였다: 먼저 데이타 동질성 시험을 위해 레벤(Levene) 검정을 수행하였다. 데이타가 동질한 경우(P>0.05), 분산 검정(아노바)의 단일-요소 분석을 수행할 수 있고; 분산 검정이 유의미한 경우(P≤0.05), 듀넷(Dunnett) 다중 비교를 수행할 수 있다. 레벤 검정 결과가 유의미한 경우(P≤0.05), 크루스칼-발리스 비모수(Kruskal-wallis nonparametric) 검정을 수행할 수 있다. 크루스칼-발리스 비모수 검정 결과가 유의미한 경우(P≤0.05), 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 짝 비교를 추가로 수행할 수 있다.

7. 결과

7.1. 시험 샘플의 분석 결과

화합물 1로 시험: 분석 결과는, 여과하기 전 가장 높은 농도 및 여과한 후 시험 샘플 용액의 각각의 농도가 101.77% 내지 104.31%의 이론적 농도임을 나타낸다. 여과 막은 90% 내지 110%의 허용 범위 내에서 용액의 농도에 유의미한 효과를 나타내지 않았다.

화합물 3으로 시험: 분석 결과는, 여과하기 전 가장 높은 농도 및 여과한 후 시험 샘플 용액의 각각의 농도의 정확도가 99.39% 내지 102.89%의 이론적 농도임을 나타낸다. 여과 막은 90% 내지 110%의 허용 범위 내에서 용액의 농도에 유의미한 효과를 나타내지 않았다.

7.2. 백그라운드 세균 깔개 및 콜로니에 대한 형태적 관찰

1500 ㎍/플레이트 용량의 TA97 균주는 대사성 활성화(S9 첨가함) 조건하에 항세균성 독성을 갖고, 이는 백그라운드 세균 깔개에서 침상 작은 콜로니의 출현 및 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수의 유의미한 감소(P≤0.05)를 나타내었다.

1500 ㎍/플레이트 및 500 ㎍/플레이트 용량의 TA102 균주는 대사성 또는 비-대사성 활성화(S9 첨가하지 않음) 조건하에 항세균성 활성을 갖고, 이는 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수에 있어서 유의미한 감소(P≤0.05)를 나타내었다.

유의미한 항세균성 활성은 대사성 또는 비-대사성 활성화 조건하에 각각의 용량으로 나머지 균주에서 발견되지 않았다.

7.3. 침전 현상에 대한 관찰

각각의 균주가 비-대사성 활성화 조건하에 150 내지 1500 ㎍/플레이트의 범위 이내 용량으로 및 대사성 활성화 조건하에 500 ㎍/플레이트 및 1500 ㎍/플레이트의 용량으로 존재하는 경우, 시스템은 시험 샘플 용액을 첨가한 후 백탁되었고, 500 ㎍/플레이트 및 1500 ㎍/플레이트의 용량으로 상부 층에 첨가한 후 유지하였다. 이는 침전이 상기 용량으로 배양 시스템에서 발생하고, 나머지 군에서 침전 현상이 발생하지 않았음을 나타낸다. 각각의 투여군에서 배양 종료시 침전 현상은 발생하지 않았다.

7.4. 콜로니 계수

상기 분석 결과는, 대사성 또는 비-대사성 조건하에 비히클 대조군에 관해서, 각각의 균주의 자발적인 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수가 본 발명의 정상적인 범위 내에 있고; 비-대사성 활성화 조건하에 덱손 및 나트륨 아지드 양성 대조군 및 대사성 활성화 조건하에 2-아미노안트라센 양성 대조군에 관해서, 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수가 분명하게 비히클 대조군에서 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수의 2배 이상보다 많이 유의미하게 증가하였음(P≤0.05)을 나타내고, 예상된 긍정적인 결과를 보인다.

15 ㎍/플레이트 내지 150 ㎍/플레이트 용량의 TA102 균주, 15 ㎍/플레이트 내지 500 ㎍/플레이트 용량의 TA97 균주, 및 15 ㎍/플레이트 내지 1500 ㎍/플레이트 용량의 나머지 균주는 시험 샘플과 관련된 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수에서 증가하지 않았다. 복귀 돌연변이체 돌연변이 콜로니의 수에 상응하는 범위 내의 용량으로 각각의 균주에서의 약간이지만 통계적으로 유의미한(P≤0.05) 변화는 정상 범위 내에서 정상 파동으로서 간주된다. 상기 분석 결과는, 150 ㎍/플레이트, 500 ㎍/플레이트 및 1500 ㎍/플레이트 이하의 용량의 시험 제품이 상응하는 TA102 균주, TA97 균주 및 나머지 균주에서 돌연변이원성을 갖지 않음을 나타낸다.

8. 결론

상기 분석 조건하에, 화합물 1 및 화합물 3은 150 ㎍/플레이트 이하의 용량으로 TA102 균주에서 돌연변이원성을 갖지 않고; 500 ㎍/플레이트 이하의 용량으로 TA97에서 돌연변이원성을 갖지 않고; 1500 ㎍/플레이트 이하의 용량으로 TA98, TA100 및 TA1535 균주에서 돌연변이원성을 갖지 않는다. 화합물 1 및 화합물 3은 항-세균 독성을 갖지 않는 용량으로 모든 균주에서 돌연변이원성을 갖지 않는다.

N-[4-((3-클로로-4-플루오로페닐아미노))-7-((2-메톡시에톡시))퀴나졸린-6-일]-2-[1-((2-메톡시에틸))피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 및 N-[4-((3-클로로-4-플루오로페닐아미노))-7-((2-메톡시에톡시))퀴나졸린-6-일]-2-[1-((2-메톡시에틸))피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트는 에임스(Ames) 독성이 없고, 임상 약제에 대한 더욱 바람직한 옵션이다.

전술한 바를 고려하여, 본원의 구체적 실시양태가 예시의 목적으로 기재되었지만, 당업자가 본원의 취지 및 범주에서 벗어나지 않고 다양한 변형 또는 개선을 만들 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 변형 또는 개선은 모두 본원의 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것이다.

Claims

N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
염을 형성하기 위해 사용되는 산이 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 메틸설폰산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄판산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레인산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 및 운데실렌산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
염이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로클로라이드;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이설페이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이하이드로브로마이드;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니트레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이포스페이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세테이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이메틸설포네이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이페닐설포네이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이푸마레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레에이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이니코티네이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이올레에이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이옥살레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이프로피오네이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이살리실레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(4-아미노살리실레이트);
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이아세틸살리실레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이타르트레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이(p-톨루엔설포네이트);
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이시트레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 다이말레이트;
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(나프탈렌-1,5-다이설포네이트);
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(데칸다이오에이트); 및
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 비스(L-아스파르테이트).
제 1 항에 따른 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 암이 유방암, 두경부암, 비소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함하는 폐암, 대장암, 췌장암, 식도암, 위암 및 전립선암으로부터 선택되는, 약학 조성물.
하기 화학식 I의 화합물을 하기 화학식 II의 화합물과 반응시켜 화합물 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드를 수득하는 단계,
를 포함하는, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법:
[화학식 I]

[화학식 II]

.
제 6 항에 있어서,
화학식 I의 화합물이 활성화된 에스터, 아실 클로라이드, 아실화된 이미다졸 또는 혼합된 무수물로 전환된 다음, 화학식 II의 화합물과 반응하는, 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
3차 아민이 촉매로서 추가되는, 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 3차 아민이 트라이에틸아민, N-메틸모폴린, 트라이메틸아민, 피리딘 또는 치환된 피리딘인, 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
화학식 I의 화합물을 아실 클로라이드로 전환하는 경우, 티온일 클로라이드, 인 트라이클로라이드, 인 펜타클로라이드, 인 옥시클로라이드, 옥살릴 클로라이드, 또는 시아누르 클로라이드가 염소화제로서 사용되는, 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
화학식 I의 화합물이 무수물로 전환된 다음, 화학식 II의 화합물과 반응하는, 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
피리딘 또는 치환된 피리딘이 촉매로서 사용되는, 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
치환된 피리딘이 DMAP인, 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드가 이의 약학적으로 허용 가능한 산과 반응하여, 이의 상응하는 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는, 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
대상체에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
제 15 항에 있어서,
상기 암이 유방암, 두경부암, 비소세포 폐암 및 소세포 폐암을 포함하는 폐암, 대장암, 췌장암, 식도암, 위암 및 전립선암으로부터 선택되는 군으로부터 선택되는, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
제 15 항에 있어서,
대상체가 포유 동물인, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
제 17 항에 있어서,
포유 동물이 인간인, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
제 15 항에 있어서,
화합물이 대상체에 0.1 mg 내지 1000 mg의 단위 투여량으로 투여되는, N-[4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-6-일]-2-[1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일리덴]아세트아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.