KR101844654B1 - LAMP primer set for diagnosing bean common mosaic necrosis virus and diagnostic kit comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콩모자이크괴저바이러스를 진단하기 위한 LAMP 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것으로서, 4개의 프라이머로 이루어진 LAMP 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트는 콩모자이크괴저바이러스로 알려진 모든 계통들과 반응하는 반면, 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않으므로 종 특이성이 높으며, 본 발명의 진단키트는 고가의 전문 장비 없이 유전자 증폭이 가능하므로 신속하고 간단하게 콩모자이크괴저바이러스를 진단할 수 있다. The present invention relates to a LAMP primer set for diagnosing soybean mosaic vesicular virus and a diagnostic kit comprising the LAMP primer set, and provides a set of LAMP primers consisting of four primers. The primer set of the present invention reacts with all strains known as soybean mosaic vesicular viruses, but does not react with viruses of other species and thus has high species specificity. The diagnostic kit of the present invention can amplify genes without expensive specialized equipments You can quickly and simply diagnose the soybean mosaic virus.
Description
본 발명은 콩모자이크괴저바이러스를 진단하기 위한 LAMP 프라이머 세트, 진단키트, 및 이를 이용한 콩모자이크괴저바이러스 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a LAMP primer set for diagnosing soybean mosaic gangrene virus, a diagnostic kit, and a method for diagnosing soybean mosaic gangrene virus using the same.
숙주세포를 감염시켜 증식하는 바이러스 중에서, 식물을 숙주로 하는 바이러스를 식물 바이러스라고 한다. 식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물과 화훼류의 생산량 및 품질저하와 품종퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다. 특히 최근에는 식량 및 각종 식물체 등의 국제 교역량이 증가되면서 국내에 존재하지 않던 외국의 병원성 식물 바이러스까지 유입되어 그로 인한 피해가 점차 심해지고 있는 추세이다. 이 때문에 재배식물에 대한 바이러스의 예방, 치료, 검역은 농업에서 중요한 과제이다.Of the viruses that propagate and propagate host cells, the virus that hosts the plant is called the plant virus. Plant viruses cause disease in many plants and cause severe economic damage throughout agricultural production, such as degradation of production and quality of various crops and flowers and degradation of varieties. In recent years, as international trade volume of food and various plants has increased, foreign plant viruses that have not existed in the country have been infiltrated and the damage caused by them has been increasing. Because of this, the prevention, treatment and quarantine of viruses on cultivated plants is an important task in agriculture.
바이러스를 진단할 수 있는 방법으로 종래에는 전자현미경 방법과 혈청학적 방법 (ELISA)이 주로 사용되었다. 하지만, 전자현미경 방법으로는 바이러스의 존재 자체는 확인할 수는 있지만 구체적으로 바이러스가 어떠한 종인지를 진단하기는 불가능하였으며, 혈청학적 방법인 ELISA는 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮고 항체와 검사시료의 비특이적 반응으로 진단의 신뢰성이 낮다는 문제점이 있었다. Electron microscopy and serologic methods (ELISA) have been mainly used as methods for diagnosing viruses. However, the presence of the virus can be confirmed by the electron microscopy method, but it is impossible to diagnose the species of the virus specifically. The serological method, ELISA, has a detection sensitivity about 1,000 times lower than the PCR method, There is a problem that the reliability of the diagnosis is low due to non-specific reaction of the sample.
최근에는, 이러한 문제점을 해결하고자 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 식물 바이러스 진단을 위하여 가장 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 대한민국(농림축산식품부 농림축산내부본부)의 등록특허 제10-1491810호는 RT-PCR 및 nested PCR의 결합 방법으로 콩모자이크괴저바이러스를 검출하는 방법을 제시하였다. 하지만, PCR은 반복적으로 온도를 변화시켜야 하므로 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되므로 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 또한, PCR 방법을 사용하더라도, 특이적 반응의 강도가 낮아서 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 경우를 대비하여, 병원체별 진단용 프라이머 은행을 구축하거나 PCR의 양성 반응과 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 마련하는 것이 요구된다. In recent years, RT-PCR methods with high detection sensitivity and convenience have been widely used for the diagnosis of plant viruses in order to solve these problems. For example, Korean Patent No. 10-1491810 (Ministry of Agriculture, Forestry and Livestock Foods, Ministry of Agriculture, Forestry and Livestock) discloses a method of detecting soybean mosaic vesicular virus by a combination of RT-PCR and nested PCR. However, since the PCR must repeatedly change the temperature, specialized equipment such as a thermocycler and a professional manpower to operate it are required. Since the series of processes require a long time to be performed, The ability to use in the field is not available. In addition, even in the case of using the PCR method, a primer bank for diagnosis of a pathogen or a positive reaction and a negative reaction of PCR may be constructed in preparation for the case that the intensity of the specific reaction is low so that discrimination is difficult or nonspecific reaction with other nucleic acids occurs It is necessary to establish a system that can do this.
이에 비하여, 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하지만, 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로, 항온수조와 같은 간단한 기구만 필요하며 1시간 이내에 검출을 할 수 있다는 장점이 있다. 등온증폭법을 위한 프라이머 세트는 각각 한 쌍의 내부 프라이머 및 외부 프라이머로 구성되며, 반응시 첨가되는 Bst. 중합효소 (polymerase) 또한 높은 활성을 가지고 있기 때문에 검출 방법으로 활용도가 높다.On the other hand, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is similar to the conventional PCR method, but since it does not require temperature changes during gene amplification, gene amplification can be easily performed at fixed temperature without specialized equipment Therefore, a simple apparatus such as a constant temperature water tank is required, and detection is possible within 1 hour. The primer set for the isothermal amplification method is composed of a pair of internal primer and external primer, and Bst. Polymerase also has high activity and is used as a detection method.
본 발명의 목적은, 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV) 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머 세트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a species-specific primer set capable of detecting all isolates present in soybean mosaic virus (BCMNV) species.
본 발명의 다른 목적은, 상기 콩모자이크괴저바이러스 종 특이적 프라이머 세트를 포함하는, 콩모자이크괴저바이러스 진단키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a soybean mosaic vesicle virus diagnostic kit comprising the soybean mosaic virus genome specific primer set.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 콩모자이크괴저바이러스 종 특이적 프라이머 세트를 이용하여, 콩모자이크괴저바이러스를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for diagnosing soybean mosaic virus using soybean mosaic virus species-specific primer sets.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
일실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는 콩모자이크괴저바이러스 (Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV) 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다. According to one embodiment, there is provided a primer set for the diagnosis of bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 4.
일실시예에 따르면, 서열번호 5 내지 8의 염기서열을 포함하는 콩모자이크괴저바이러스 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다.According to one embodiment, there is provided a primer set for the diagnosis of soybean mosaic necrosis virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8.
일실시예에 따르면, 서열번호 9 내지 12의 염기서열을 포함하는 콩모자이크괴저바이러스 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다.According to one embodiment, there is provided a primer set for the diagnosis of soybean mosaic necrosis virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 9 to 12.
일실시예에 따르면, 서열번호 13 내지 16의 염기서열을 포함하는 콩모자이크괴저바이러스 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다. According to one embodiment, there is provided a primer set for the diagnosis of soybean mosaic necrosis virus comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 13 to 16.
일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.According to one embodiment, there is provided a primer composition for isothermal amplification reaction comprising the primer set.
일측에 따르면, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.According to one aspect, the primer composition for isothermal amplification reaction may further comprise a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, a plurality of dNTPs and a reaction buffer.
일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 포함하는 콩모자이크괴저바이러스 검출을 위한 진단 키트를 제공한다.According to one embodiment, there is provided a diagnostic kit for detecting soybean mosaic vesicle virus comprising the primer set.
일측에 따르면, 상기 진단 키트는, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.According to one aspect, the diagnostic kit may further comprise a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, a plurality of dNTPs and a reaction buffer.
일측에 따르면, 상기 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV)는, 진뱅크 접근번호(GenBank accession number) NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, 및 HQ229993 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. According to one aspect, the soybean mosaic virus (BCMNV) may be at least one selected from the group consisting of GenBank accession numbers NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, and HQ229993.
일실시예에 따르면, 식물시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 콩모자이크괴저바이러스 진단방법을 제공한다. According to one embodiment, extracting RNA from a plant sample; Synthesizing cDNA from the RNA; Amplifying the target sequence by isothermal amplification (LAMP) at 60 ° C to 65 ° C using the cDNA as a template using the primer set; And detecting the amplified product. The present invention also provides a method for diagnosing soybean mosaic virus.
일측에 따르면, 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는, DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.According to one aspect, the step of detecting the amplified product can be performed by DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
본 발명의 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV) 진단을 위한 프라이머 세트는 콩모자이크괴저바이러스로 알려진 모든 계통들과 반응하는 반면, 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않으므로 종 특이성이 높으며, 기존의 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 바이러스를 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭법에서 사용되므로, 고가의 전문 장비 없이 유전자 증폭이 가능하며 높은 특이성으로 바이러스 검출이 가능하다. The primer set for the diagnosis of soybean mosaic virus (BCMNV) of the present invention reacts with all strains known as soybean mosaic vesicular virus, but does not react with viruses of other species and thus has a high species specificity. The virus can be diagnosed with a detection limit of 1,000 times or more. In addition, since the primer set of the present invention is used in the isothermal amplification method, gene amplification is possible without expensive professional equipment, and virus detection is possible with high specificity.
본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 진단키트를 이용하여 빠르고 간단하면서도 정확하게 콩모자이크괴저바이러스를 진단할 수 있으므로, 콩모자이크괴저바이러스로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있으며, 외국으로부터 수입되는 식물체 중에서 BCMNV에 감염된 식물체와 종자의 유입을 사전에 효과적으로 차단할 수 있다. The diagnostic kit comprising the primer set of the present invention can be used to diagnose the mosaic virus of the soybean mosaic virus quickly, simply and precisely. This makes it possible to prevent the economic loss of the farmhouse caused by the soybean mosaic virus, Can effectively prevent infestation of infected plants and seeds in advance.
도 1은, 콩모자이크괴저바이러스에 감염된 식물체의 증상을 나타낸 사진이다.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 2번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 4번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 5번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 6번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 중 외부 프라이머 증폭산물을 나타낸 것이다.
도 8은, 종래의 PCR로 증폭된 산물을 나타낸 것이다.Fig. 1 is a photograph showing symptoms of a plant infected with soybean mosaic virus.
FIG. 2 shows a result of performing LAMP using a primer set according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows the results of LAMP reaction using
4 shows the result of LAMP reaction using
FIG. 5 shows the result of LAMP reaction using
FIG. 6 shows the results of LAMP reaction using primer set No. 6 according to one embodiment of the present invention.
Figure 7 shows an external primer amplification product in a primer set according to one embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the products amplified by conventional PCR.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.In the following, embodiments will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Like reference symbols in the drawings denote like elements.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Various modifications may be made to the embodiments described below. It is to be understood that the embodiments described below are not intended to limit the embodiments, but include all modifications, equivalents, and alternatives to them.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used in the examples are used only to illustrate specific embodiments and are not intended to limit the embodiments. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, the terms "comprises" or "having" and the like refer to the presence of stated features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this embodiment belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries are to be interpreted as having a meaning consistent with the contextual meaning of the related art and are to be interpreted as either ideal or overly formal in the sense of the present application Do not.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In the following description of the present invention with reference to the accompanying drawings, the same components are denoted by the same reference numerals regardless of the reference numerals, and redundant explanations thereof will be omitted. In the following description of the embodiments, a detailed description of related arts will be omitted if it is determined that the gist of the embodiments may be unnecessarily blurred.
콩모자이크괴저바이러스 (Bean common mosaic necrosis virus: BCMNV)는 BCMV (Bean common mosaic virus)에서 분류되었으며 (Mink 등, 1994) 현재 분류학적으로 바이러스 Group IV (+) sense ssRNA viruses, Potyviridae과 Poyvirus속으로 분류된다. 콩모자이크괴저바이러스는 식물병원성 바이러스로서, 감염된 식물체에서는 괴사, 황백화, 모틀링 및 기형 증상이 일어나며, 이 때문에 아프리카, 유럽, 북아메리카 및 라틴아메리카 등에서 작물의 수확량이 감소 (35 내지 98%)한 적도 있다. Bean mosaic necrosis virus (Bean common mosaic necrosis virus: BCMNV ) were classified (Bean common mosaic virus) BCMV ( Mink et al., 1994) virus Group IV current taxonomic (+) sense ssRNA viruses, classified into Potyviridae and Poyvirus do. Soybean mosaic virus is a phytopathogenic virus that causes necrosis, yellowing, mottling and malformations in infected plants, which causes crop yields to decrease (35 to 98%) in Africa, Europe, North America and Latin America have.
도 1은, 콩모자이크괴저바이러스에 감염된 식물체의 증상을 나타낸 사진이다.Fig. 1 is a photograph showing symptoms of a plant infected with soybean mosaic virus.
콩모자이크괴저바이러스는 강낭콩 (Phaseolus vulgaris)을 주요 숙주로 하며, 숙마, 팥 및 녹두 등의 콩과 작물을 숙주로 하기도 한다. 콩모자이크괴저바이러스의 입자는 길이 720 내지 770 nm × 너비 12 내지 15 nm의 형태를 보인다. 입자는 단백질 95%와 핵산 5%로 이루어져 있으며, 외피 단백질에는 적어도 8가지의 단백질분해효소가 있어 기주를 공격하거나 기주에 대한 방어를 할 때 유용하게 사용 할 수 있다. 약 10 kb로 구성되어 있는 단일가닥 RNA에는 외피단백질을 코딩하는 유전자 (CP) 외에도 P1, HcPro, P3, 6K1, Cl, 6K2, VPg, Nla 및 Nlb 유전자가 포함되어 있다. 본 발명은 콩모자이크괴저바이러스의 complete genome을 사용하여 설계된 진단용 프라이머에 관한 것이다.Soybean mosaic virus is a major host of beans ( Phaseolus vulgaris ), and it hosts beans and crops such as anemia, red beans and mung beans. The particles of the soybean mosaic virus have a shape of 720 to 770 nm in length x 12 to 15 nm in width. Particles consist of 95% protein and 5% nucleic acid, and at least eight proteases in the coat protein are useful for attacking the host or defense against the host. Single-stranded RNA consisting of about 10 kb contains the P1, HcPro, P3, 6K1, Cl, 6K2, VPg, Nla and Nlb genes in addition to the gene encoding the coat protein (CP). The present invention relates to a diagnostic primer designed using the complete genome of soybean mosaic virus.
콩모자이크괴저바이러스 (Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV) 종 (species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통 (strain) 또는 분리주 (isolate)들이 존재한다. 따라서, 분리주에 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있으므로, 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 종에 특이적으로 작동하는 것이 중요하다. 따라서, 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV) 종으로 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여, 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통염기서열을 탐색하고, 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 선발된 종 특이적 서열을 전문장비 없이 빠른 시간 내에 효과적으로 검출할 수 있도록, 등온증폭법(loopmediated isothermal amplification, LAMP)에 사용되는 프라이머 세트를 상기 종 특이적 서열에 대하여 디자인하였다. (실시예 1 참조) There are strains or isolates in the bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) species that have slightly different sequences in the species. Therefore, when a primer specific to the isolate is used for diagnosis, there is a risk of failure in diagnosis. Therefore, it is important that the virus-detecting primer operates specifically on the virus species. Therefore, by collecting known nucleotide sequences from soybean mosaic virus (BCMNV) species, we search common sequences possessed by all strains and isolates of the species, Species specific sequences were selected by excluding the base sequence from the primer design subject. A primer set used for loopmediated isothermal amplification (LAMP) was designed for the species-specific sequence so that the selected species-specific sequence could be detected efficiently and quickly without professional equipment. (See Example 1)
등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이고, B3와 BIP는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.Unlike conventional polymerase chain reaction (PCR), the isothermal amplification method does not require temperature control to amplify the gene, so it can amplify the gene without specialized equipments and it is possible to amplify the gene at a high concentration in a short time. In order to use isothermal amplification, four primers (F3, B3, FIP, and BIP) should act as one set, and F3 and FIP are primers binding in the 5 ' ≪ / RTI > direction. In addition, FIP and BIP are primers that contain the nucleotide sequence of F2 (or B2) and F1c (or B1c).
일실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4, 서열번호 5 내지 8, 서열번호 9 내지 12, 또는 서열번호 13 내지 16으로 구성되는 LAMP 반응용 프라이머 세트가 제공된다. 이 중에서, 서열번호 5 내지 8, 서열번호 9 내지 12, 또는 서열번호 13 내지 16으로 구성되는 LAMP 반응용 프라이머 세트인 것이 보다 바람직하지만, 콩모자이크괴저바이러스를 진단할 수 있는 LAMP 반응용 프라이머 세트라면 이에 한정되지 않는다. According to one embodiment, there is provided a primer set for LAMP reaction consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, SEQ ID NOs: 5 to 8, SEQ ID NOs: 9 to 12, or SEQ ID NOs: 13 to 16. Among these, a primer set for LAMP reaction consisting of SEQ ID NOS: 5 to 8, SEQ ID NOS: 9 to 12, or SEQ ID NOS: 13 to 16 is more preferable. However, if a primer set for LAMP reaction capable of diagnosing soybean mosaic vesicle virus But is not limited thereto.
일측에 따르면, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있으며, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은 콩모자이크괴저바이러스 검출을 위한 진단 키트에 포함될 수 있다. According to one aspect of the present invention, the primer composition for isothermal amplification reaction may further comprise a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, a plurality of dNTPs and a reaction buffer, and the primer composition for isothermal amplification reaction may include a diagnostic for detecting soybean mosaic virus May be included in the kit.
일측에 따르면, 상기 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV)는, 진뱅크 접근번호(GenBank accession number) NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, 및 HQ229993로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는, 콩모자이크괴저바이러스로 알려진 염기서열을 분석한 후, 종 특이적인 서열에 대하여 작동하도록 디자인 되었는 바, 상기 진뱅크 접근번호에 개시된 염기서열을 갖는 콩모자이크괴저바이러스를 검출할 수 있다. According to one aspect, the soybean mosaic virus (BCMNV) may be at least one selected from the group consisting of GenBank accession numbers NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, and HQ229993. The primer set of the present invention is designed to operate on a species-specific sequence after analyzing the nucleotide sequence known as the soybean mosaic gangrene virus and detects the soybean mosaic gangrene virus having the nucleotide sequence disclosed in the above-mentioned Gene Bank accession number .
일실시예에 따르면, 식물시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 콩모자이크괴저바이러스 진단방법을 제공한다. 일측에 따르면, 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는, DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.According to one embodiment, extracting RNA from a plant sample; Synthesizing cDNA from the RNA; Amplifying the target sequence by isothermal amplification (LAMP) at 60 ° C to 65 ° C using the cDNA as a template using the primer set; And detecting the amplified product. The present invention also provides a method for diagnosing soybean mosaic virus. According to one aspect, the step of detecting the amplified product can be performed by DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
본 발명의 LAMP 프라이머는 종 특이적 염기서열로부터 디자인된 프라이머로서, 실제적인 RNA를 주형으로 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비 특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수하다. 또한, 본 발명의 LAMP 프라이머를 이용한 반응은, 반응의 조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 하여 검출의 효율을 높일 수 있도록 설계되었다.The LAMP primer of the present invention is designed as a primer designed from a species-specific base sequence. It synthesizes complementary DNA (cDNA) using an actual RNA as a template, and there is no nonspecific reaction with a nucleic acid other than the target virus. Excellent detection power. In addition, the reaction using the LAMP primer of the present invention is designed so that the reaction conditions can be the same in all viruses and primer combinations to increase detection efficiency.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following examples are provided for the purpose of illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1: 종 특이적 서열 탐색 및 프라이머 디자인>≪ Example 1: Species specific sequence search and primer design >
LAMP 검사법 개발 대상인 콩모자이크괴저바이러스(Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV)와 참고 바이러스 주(유사염기서열 및 동일 기주 감염 바이러스) 염기서열을 National Center for Biotechnology Information (U.S)로부터 BCMNV의 6가지 strain과 분류학적으로 유사한 9종의 염기서열을 확보하였다.The nucleotide sequences of the bean common mosaic necrosis virus ( BCMNV) and the reference virus strains (pseudomonas and identical host infectious viruses) , which are the targets of the LAMP test , were classified into six strains of BCMNV from the National Center for Biotechnology Information Nine kinds of nucleotide sequences similar to each other were obtained.
표 1은, 종 특이적 염기서열 탐색을 위해 사용한 바이러스 정보를 나타낸 것이다.Table 1 shows the virus information used for species-specific base sequence search.
다운로드한 15종의 염기서열은 'FASTA' format으로 정렬한 뒤, sequence alignment program인 BioEdit 버전 7.1.3을 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다. 정렬된 서열 중에서 프라이머 Tm 값은 50.6 내지 51.9℃(프라이머 별, 최고 1.3℃ 차이)를 조건으로, BCMNV의 종 특이적인 서열을 탐색하였고, 진단용 LAMP primer를 설계하였다. The 15 sequences that were downloaded were sorted in 'FASTA' format and multiple alignments were performed using the sequence alignment program BioEdit version 7.1.3. Species specific sequences of BCMNV were searched for primer Tm values ranging from 50.6 to 51.9 ℃ (difference of primer, maximum 1.3 ℃ difference) among the aligned sequences, and a diagnostic LAMP primer was designed.
표 2는, BCMNV 종 공통염기서열로부터 설계한 진단용 primer 정보를 나타낸 것이다.Table 2 shows diagnostic primer information designed from the BCMNV species common base sequence.
<실시예 2: 프라이머 세트 선발> ≪ Example 2: Selection of primer set >
상보적 DNA(cDNA)의 합성은 BCMNV 감염시료의 잎에서 추출한 총 RNA 2㎕를 주형으로, 반응 버퍼(Roche, 스위스) 4㎕, N25-프라이머(50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N; 서열번호 18)(N25-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법; 한국공개특허 10-2006-0121442) 3㎕, 2mM dNTP(Enzynomics, 한국) 2㎕, RNasin(Promega, 미국) 0.7㎕, M-MuLV 역전사효소(Roche, 스위스) 1.6㎕ 및 탈이온 증류수 6.7㎕를 넣어 총 볼륨을 20㎕로 하여 수행하였다. For the synthesis of complementary DNA (cDNA), 4 μl of reaction buffer (50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N) was used as a template and 2 μl of total RNA extracted from leaves of BCMNV infected samples was used as a template. , 3 μl of 2 mM dNTP (Enzynomics, Korea), 0.7 μl of RNasin (Promega, USA), 3 μl of M-MuLV 1.6 역 of reverse transcriptase (Roche, Switzerland) and 6.7 탈 of deionized distilled water were added to make a total volume of 20..
그 후, 합성된 cDNA 1.5㎕를 주형으로, LAMP 반응 버퍼 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, 외부 프라이머(F3 및 B3) 각각 0.6㎕, 내부 프라이머(FIP 및 BIP) 각각 1.4㎕ 및 Bst. polymerase 1.5㎕를 포함하여 총 볼륨 11㎕에 맞추어 LAMP 반응을 진행하였다.Then, the synthesized cDNA as a template 1.5㎕,
LAMP 반응은, 95℃에서 10분간 변성시키고, self annealing통하여 프라이머가 결합될 수 있도록 1분간 냉각시켜주었다. 그 후 각각의 튜브 안에 Bst. polymerase를 첨가하고 voltexing으로 잘 섞어준 후 스핀다운시키고, 62℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이때, 반응물의 조성은, DNA 1.5㎕, 반응버퍼 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, 10pM F3 및 10pM B3 0.6㎕, 10pM FIP 및 10pM BIP 1.4㎕ Bst. polymerase 1.5㎕를 포함하였다. The LAMP reaction was denatured at 95 ° C for 10 minutes and allowed to cool for 1 minute so that the primer could bind through self-annealing. Then, in each tube, Bst. Polymerase was added and mixed well by voltexing, then spun down and reacted at 62 ° C for 1 hour. At this time, the composition of the reaction product was 1.5 μl of DNA, 2 μl of reaction buffer, 2 μl of 10 mM dNTP, 0.6 μl of 10 μM F3 and 10 μM B3, 1.4 μl of 10 μM FIP and 10 μM BIP . polymerase.
BCMNV에 특이적인지 확인하기 위하여 염기서열이 유사하거나 숙주를 동일하게 갖는 9가지의 바이러스 (BPMV, CPMMV, CMV, SBMV, TNV, TRV, TSV, TBRV 및 TSWV)에 대하여, 각각의 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 수행하였다. For each of the nine viruses (BPMV, CPMMV, CMV, SBMV, TNV, TRV, TSV, TBRV and TSWV) having similar nucleotide sequences or having the same nucleotide sequence, LAMP was performed.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 수행한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 2 shows a result of performing LAMP using a primer set according to an embodiment of the present invention.
도 2를 참고하면, 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV)를 포함하는 총 10가지의 바이러스에 대하여, 실시예 1에서 디자인된 6개의 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 각각 수행하였으며, 마지막 한 세트는 Negative control 이다(61~66). 대조군 TSV에서 비 특이적 증폭이 일어난 1번 LAMP 프라이머 세트와, 대조군 BPMV, SBMV, TSV 및 TSWV에서 비특이적 증폭이 일어난 3번 LAMP 프라이머 세트를 제외하고 2번, 4번, 5번, 및 6번 프라이머 세트를 선발하였다. Referring to FIG. 2, for all 10 viruses including soybean mosaic virus (BCMNV), LAMP was performed using the six primer sets designed in Example 1, and the last set was a negative control (61-66). 4, 5, and 6 primers except for the non-specific LAMP primer set 1 in which the non-specific amplification occurred in the control TSV and the LAMP primer set 3 in which the nonspecific amplification occurred in the control BPMV, SBMV, TSV and TSWV The set was selected.
표 3은, 선발된 프라이머 세트와 각각의 프라이머 서열번호를 나타낸 것이다.Table 3 shows the selected primer sets and the respective primer sequence numbers.
<실시예 3: 민감도 테스트> ≪ Example 3: Sensitivity test >
실시예 2에서 합성된 cDNA 1.5㎕를 주형으로, LAMP 반응 버퍼 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, 외부 프라이머(F3 및 B3) 각각 0.6㎕, 내부 프라이머(FIP 및 BIP) 각각 1.4㎕ 및 Bst. polymerase 1.5㎕를 포함하여 총 볼륨 11㎕에 맞추어 LAMP 반응을 진행하였다. 상기 실시예 2에서 선정된 프라이머 세트 2, 4, 5, 및 6를 이용하여, 합성된 cDNA를 10-9까지 9단계로 희석한 후 LAMP 반응을 진행하였다.Example 2 The synthesis of cDNA as a template in 1.5㎕,
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 2번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이며, 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 4번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이고, 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 5번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이며, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 6번을 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.FIG. 3 shows a result of a LAMP reaction using primer set 2 according to an embodiment of the present invention. FIG. 4 shows a result of a LAMP reaction using primer set 4 according to an embodiment of the present invention. 6 shows a result of a LAMP reaction using a primer set No. 6 according to an embodiment of the present invention.
도 3 내지 6을 분석한 결과, 프라이머 세트 4번에서는 10-3까지 LAMP 증폭산물이 형성된 것을 확인하였고(도 4), 프라이머 세트 2번, 5번 및 6번에서는 10-4까지 증폭산물이 형성된 것을 확인하였다(도 3, 도 5 및 도 6).3 to 6, it was confirmed that LAMP amplification products were formed up to 10 -3 in the primer set 4 (FIG. 4), and amplification products were formed in the primer sets 2, 5, and 6 up to 10 -4 (Figs. 3, 5 and 6).
<실시예 4: 증폭 산물 검정> ≪ Example 4: Amplification product assay >
LAMP로 증폭된 산물을 검정하기 위하여, 외부 프라이머만을 이용하여 증폭시킨 산물을 각각에 해당하는 제한효소로 절단하여 확인하였다. In order to test the product amplified by LAMP, amplified product using only the external primer was cleaved with each corresponding restriction enzyme.
외부 프라이머를 사용한 PCR은, 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 합성된 cDNA 1㎕를 주형으로 수행되었다. PCR 반응은, 최초 95℃에서 10분의 변성 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하였다. 모든 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에서 Midori Green Nucleic Acid Staning Solution(Nippon genetics, 일본) 0.4㎕를 Loading dye 대신 시료와 섞어 30분간 전기영동 하였으며, UV하에서 형성된 특이밴드를 확인하였다.The PCR using the external primer was carried out using 1 μl of the cDNA synthesized in the same manner as in Example 2 above as a template. After the denaturation at 95 ° C for 10 minutes, the PCR reaction was repeated 35 times at 95 ° C for 45 seconds, at 55 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 1 minute, and finally at 72 ° C for 5 minutes. All of the products were electrophoresed on a 1.5% agarose gel with 0.4 μl of Midori Green Nucleic Acid Staning Solution (Nippon genetics, Japan) instead of loading dye for 30 min. The specific band formed under UV was confirmed.
LAMP 프라이머 세트 2에서 증폭된 산물이 제한효소로 절단되지 않아 제외하였고, LAMP 프라이머 세트 4번, 5번 및 6번을 검정하였다. The products amplified in LAMP primer set 2 were excluded because they were not digested with restriction enzymes, and LAMP primer sets 4, 5 and 6 were assayed.
도 7은, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 중 외부 프라이머 증폭산물을 나타낸 것이다. Figure 7 shows an external primer amplification product in a primer set according to one embodiment of the present invention.
도 7을 참고하면, 프라이머 세트 4번의 외부 프라이머(F3 및 B3)의 증폭산물은 MseI 제한효소를 사용하여 303 및 136bp로 절단되었고(도 7의 1번 열), 프라이머 세트 5번의 외부 프라이머의 증폭산물은 MseI 제한효소를 사용하여 202 및 92bp로 절단되었고(도 7의 2번 열), 프라이머 세트 6번의 외부 프라이머의 증폭산물은 DraI 제한효소를 사용하여 159 및 117bp로 절단되었는바(도 7의 3번 열), LAMP 증폭산물을 다시 한 번 검정하였다.7, the amplification products of external primers F3 and B3 of primer set 4 were cleaved at 303 and 136 bp using MseI restriction enzyme (
<실시예 5: 민감도 테스트> ≪ Example 5: Sensitivity test >
종래의 PCR 방법과 본 발명의 LAMP 방법의 민감도를 비교하기 위하여, 등록특허 제10-1491810호 (콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머 세트)에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 보다 구체적으로는, 합성된 cDNA를 10-9까지 9단계로 희석하고 상기 등록특허 중에서 조합번호 16에 해당하는 2번 세트(서열번호 1 및 13)로 1차 PCR 후 Nested 세트 2번(서열번호 2 및 14)으로 2차 PCR하였다.In order to compare the sensitivity of the conventional PCR method and the LAMP method of the present invention, PCR was carried out using the primer set disclosed in Patent No. 10-1491810 (primer set for soybean mosaic vesicular virus detection). More specifically, the synthesized cDNA was diluted to 9-steps up to 10 -9 , and after the first PCR with 2 sets (SEQ ID NOS: 1 and 13) corresponding to the
도 8은, 종래의 PCR로 증폭된 산물을 나타낸 것이다. Figure 8 shows the products amplified by conventional PCR.
도 8을 참조하면, 종래의 PCR 방법으로는 10-2까지 Nested PCR 증폭산물이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 LAMP를 이용한 BCMNV 진단법에 사용된 4번 프라이머 세트보다 10배 민감성이 떨어지는 결과이며, 5번 및 6번 프라이머 세트의 결과와 비교했을 때는 100배 민감성이 떨어지는 결과이다. (실시예 3 및 도 3 내지 도 6 참조)Referring to FIG. 8, it was confirmed that the conventional PCR method produced Nested PCR amplification products up to 10 -2 . This result is 10 times less sensitive than the 4 primer set used in the BCMNV diagnosis method using the LAMP of the present invention and 100 times less sensitive than the results of the 5 and 6 primer sets. (See Example 3 and Figs. 3 to 6)
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. For example, if the techniques described are performed in a different order than the described methods, and / or if the described components are combined or combined in other ways than the described methods, or are replaced or substituted by other components or equivalents Appropriate results can be achieved.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents to the claims are also within the scope of the following claims.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, DANKOOK UNIVERSITY <120> LAMP primer set for diagnosing bean common mosaic necrosis virus and diagnostic kit comprising the same <130> APC-2016-0212 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-2 (F3 primer) <400> 1 ctgcaaaagt ggcaaaca 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-2 (B3 primer) <400> 2 gcaaaaccac tagtcatcac 20 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-2 (FIP primer) <400> 3 ggcaagcctg ttgattttcc taactctgtc aacttcaacg g 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-2 (BIP primer) <400> 4 gttagcaagc agcttggaag ccgaatctat tgagtcctct c 41 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-4 (F3 primer) <400> 5 gaaactcaag ttcagggac 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-4 (B3 primer) <400> 6 gctgttcatg cacaacaa 18 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-4 (FIP primer) <400> 7 caaacgtgtg ttccatggtg tacttttgat agaaaggtgg cc 42 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-4 (BIP primer) <400> 8 gattgcaagc atacttcctt ggggtgttag atccaccttc aaa 43 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-5 (F3 primer) <400> 9 attttgggtg cactggata 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-5 (B3 primer) <400> 10 tccaaacaga tctgtcacc 19 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-5 (FIP primer) <400> 11 ttccgactat gtatccgtcg taactcaaga tggtgactgt g 41 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-5 (BIP primer) <400> 12 cttggaacaa acattggctt tggcactctt gggttgatca tct 43 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-6 (F3 primer) <400> 13 agggctggac ttatgatg 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-6 (B3 primer) <400> 14 ctttgcttcg atcccattc 19 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-6 (FIP primer) <400> 15 gctgagtgtg ttatataacc acacaggcta gttttcttcg cca 43 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMNV_LAMP-6 (BIP primer) <400> 16 gctatggttt atgtcacatc aagcatttct tgctcaagct ttgg 44 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, DANKOOK UNIVERSITY <120> LAMP primer set for diagnosing bean common mosaic necrosis virus and diagnostic kit comprising the same <130> APC-2016-0212 <160> 16 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-2 (F3 primer) <400> 1 ctgcaaaagt ggcaaaca 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-2 (B3 primer) <400> 2 gcaaaaccac tagtcatcac 20 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-2 (FIP primer) <400> 3 ggcaagcctg ttgattttcc taactctgtc aacttcaacg g 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-2 (BIP primer) <400> 4 gttagcaagc agcttggaag ccgaatctat tgagtcctct c 41 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-4 (F3 primer) <400> 5 gaaactcaag ttcagggac 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-4 (B3 primer) <400> 6 gctgttcatg cacaacaa 18 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-4 (FIP primer) <400> 7 caaacgtgtg ttccatggtg tacttttgat agaaaggtgg cc 42 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-4 (BIP primer) <400> 8 gattgcaagc atacttcctt ggggtgttag atccaccttc aaa 43 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-5 (F3 primer) <400> 9 attttgggtg cactggata 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-5 (B3 primer) <400> 10 tccaaacaga tctgtcacc 19 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-5 (FIP primer) <400> 11 ttccgactat gtatccgtcg taactcaaga tggtgactgt g 41 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-5 (BIP primer) <400> 12 cttggaacaa acattggctt tggcactctt gggttgatca tct 43 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-6 (F3 primer) <400> 13 agggctggac ttatgatg 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-6 (B3 primer) <400> 14 ctttgcttcg atcccattc 19 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCMNV_LAMP-6 (FIP primer) <400> 15 gctgagtgtg ttatataacc acacaggcta gttttcttcg cca 43 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > BCMNV_LAMP-6 (BIP primer) <400> 16 gctatggttt atgtcacatc aagcatttct tgctcaagct ttgg 44
Claims (11)
상기 프라이머 세트는 진뱅크 접근번호(GenBank accession number) NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, 및 HQ229993의 콩모자이크괴저바이러스에 특이적으로 결합하는,
콩모자이크괴저바이러스(Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV) 진단을 위한 등온증폭(LAMP) 반응용 프라이머 세트.
A primer set comprising the respective primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 9 to 12,
Wherein the primer set specifically binds to the soybean mosaic virus of the GenBank accession numbers NC_004047, AY282577, AY138897, AY864314, HQ229995, and HQ229993.
A primer set for isothermal amplification (LAMP) reaction for diagnosis of bean mosaic virus (BCMNV).
등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
11. A method of screening for < RTI ID = 0.0 >
A primer composition for isothermal amplification reaction.
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함하는,
등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
6. The method of claim 5,
A DNA polymerase for isothermal amplification reaction, a plurality of dNTPs and a reaction buffer,
A primer composition for isothermal amplification reaction.
콩모자이크괴저바이러스 검출을 위한 진단 키트.
11. A method of screening for < RTI ID = 0.0 >
A diagnostic kit for detecting soybean mosaic virus.
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함하는,
콩모자이크괴저바이러스 검출을 위한 진단 키트.
8. The method of claim 7,
A DNA polymerase for isothermal amplification reaction, a plurality of dNTPs and a reaction buffer,
A diagnostic kit for detecting soybean mosaic virus.
상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
콩모자이크괴저바이러스 진단방법.
Extracting RNA from the plant sample;
Synthesizing cDNA from the RNA;
Amplifying the target sequence by isothermal amplification (LAMP) at 60 ° C to 65 ° C using the cDNA as a template using the primer set of claim 3; And
And detecting the amplified product.
A method for diagnosing a bean mosaic vesicular virus.
상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는,
DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는,
콩모자이크괴저바이러스 진단방법.11. The method of claim 10,
Wherein the step of detecting the amplified product comprises:
DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactive measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
A method for diagnosing a bean mosaic vesicular virus.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101501414B1 (en) * | 2014-06-30 | 2015-03-17 | 중앙대학교 산학협력단 | Loop-mediated isothermal amplification reaction (LAMP) for detection of norovirus and their primer set |
-
2016
- 2016-06-01 KR KR1020160068285A patent/KR101844654B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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