KR101840113B1 - Mll1에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머, 이를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 진단용 조성물, MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물 및 상기 압타머를 이용한 MLL1 매개 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 압타머는 MLL1에 특이적으로 결합하며, 이에 따라 MLL1 단백질의 활성을 매우 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 상기 압타머를 포함하는 조성물은 백혈병을 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방, 치료 용도 및 진단 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 {Aptamers that specifically bind to MLL1 and the use thereof}

본 발명은 MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머, 이를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 진단용 조성물, MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물 및 상기 압타머를 이용한 MLL1 매개 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

MLL1 (Myeloid/lymphoid, or Mixed lineage leukemia 1)은 조혈 (hematopoiesis) 및 발생 단계에서 Hox 유전자 발현 유지에 필요한 전사 보조 활성자 (transcription co-activator)이다. MLL1은 여러 종류의 단백질과 결합하여 다수의 단백질 복합체를 형성하며, 각 복합체는 고유의 표적에 대해 H3K4 메틸화 활성을 조절한다. 특히, MLL1 단백질의 SET 도메인은 H3K4 위치에서 모노-, 다이- 또는 트리메틸화를 촉매하고, 상기 각각의 메틸화는 고유의 특이적인 역할을 갖는다.

한편, 상기 메틸화는 크로마틴 전사 활성 및 다양한 종류의 암과 밀접하게 관련되어 있는데, MLL1의 기능성 또는 비기능성 변이체는 엄격한 조절 하에 효소 활성을 유지한다. 예컨대, MLL1은 다양한 종류의 급성 림프구성 또는 골수성 백혈병에 관련된 매우 중요한 단백질 중 하나로 알려져 있다. MLL과 60 파트너 유전자 중 하나와의 융합은 HOX 유전자를 상향조절하는 키메라성 종양 유전자를 형성하여 궁극적으로 급성 백혈병을 야기하는 혈구 분화의 봉쇄를 초래한다 (Eguchi et al., Int J Hematol, 2003, 78(5): 390-401). MLL 전좌를 갖는 백혈병 환자는 매우 좋지 못한 예후 (35 % 5 년 생존)를 가지며 이들 백혈병을 치료하기 위해 신규한 치료 전략이 필요하다 (Slany, Hematol OncoI, 2005, 23(1): 1-9). 또한, 최근에는 MLL1이 에스트로겐 수용체 알파 표적 유전자의 호르몬 의존성 발현 및 MCF-7 세포의 성장에 필요하다고 보고된 바 있다. 또한, 본 발명자들의 선행 연구결과 (Jeong et al., Nucleic Acids Res, 2014, 42: 2245-2256; Jeong et al., Nat Struct Mol Biol, 2011, 18: 1358-1365; Won Jeong et al., Mol Endocrinol, 2012, 26: 955-966)에서 MLL1에 대한 몇 가지 중요한 사실로서 1) MLL1이 암세포 특이적인 유전자 발현을 조절한다는 사실과 2) siRNA를 이용한 세포 내 MLL1 레벨의 감소 시 유방암 세포주의 성장이 억제된다는 사실로서 MLL1이 암 치료 표적 분자로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인한 바 있다. 나아가, 상기 연구결과를 뒷받침하는 자료로 Kl Ansari 등이 발표한 연구 결과 (Ansari et al., Oncogene, 2013, 32: 3359-3370)에서도 siRNA를 이용한 세포 내 MLL1 레벨의 감소 시, 유방암 세포주 뿐 아니라 대장암, 위암, 자궁경부암 등 다양한 암 세포의 성장이 억제된다는 사실이 보고된 바 있다.

SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술은 Ellington, A.D 등에 의해 개발되었으며, 고선택성 및 고민감성을 가지면서 특정 리간드에 결합하는 ssRNA/ssDNA 분자 (압타머라 명명)를 순환 공정을 통해 농축시키는 시험관 내 (in vitro) 선별 방법이다. 이를 통해 선별된 압타머는 SELEX의 가격이 저렴하고, 기능 손실 없이 화학적 변형이 쉽고, 항체에 비해 고정이 용이하여 여러 가지 장점을 가지므로, 항체의 좋은 대체제로 여겨진다 (Nieuwlandt D, Curr Issues Mol Biol, 2000. 2: 9-16).

이에, 본 발명자들은 MLL1 매개 질환의 치료를 위해 MLL1 활성을 억제할 수 있는 압타머를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 선별하였으며, 상기 압타머가 MLL1의 활성을 효과적으로 억제하는 것 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 압타머를 포함하는 조성물은 MLL1 매개 질환의 치료, 진단 및 MLL1 매개 질환 부위의 영상화 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 목적은 MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 분리된 생물학적 시료에 상기 압타머를 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 압타머의 결합 정도를 측정하여, 상기 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 MLL1 매개 질환인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, MLL1 매개 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 총 10 종의 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 개발하였다. 상기 압타머는 MLL1 단백질에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하므로, MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머이다.

본 발명에서 용어 "MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)"은 KMT2A 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2A (histone-lysine N-methyltransferase 2A) 등으로도 명명된다. MLL1은 히스톤 메틸트랜스퍼라제로 광범위하게 유전자 전사를 조절하며, 전사촉진 (transactivation) 도메인 9aaTAD를 포함하는 히스톤-변형 단백질 그룹에 속하는 단백질이다.

MLL1은 전사 보조활성자 (transcriptional coactivator)로서 초기 발달 및 조혈 단계에서 유전자 발현을 조절하는데 핵심적인 역할을 한다. 특히 MLL1의 SET 도메인은 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) 메틸트랜스퍼라제 활성을 가져 후성적 전사 활성과 관련하여 크로마틴 변형을 매개한다. MLL1의 염색체 전좌 (chromosomal translocation)는 급성 림프구성 및 급성 골수성 백혈병을 야기하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "압타머 (aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 직쇄상 또는 환상의 형태의 핵산일 수 있으며, 구체적으로는 단일가닥 DNA (ssDNA) 또는 단일가닥 RNA (ssRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 압타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적인 압타머는 크기가 10 - 15 kDa (30 - 45 개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하 (sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합할 수 있다. 압타머는 결합 상호작용 (예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배지 (steric exclusion)) 또는 항체-항원 복합체에서의 특이성을 통하여 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 압타머는 구체적으로 서열번호 10 내지 서열번호 12에 기재된 염기 서열, 및 이와 상보적인 염기 서열 중 어느 하나의 염기 서열을 가지는 것일 수 있고, 또는 상기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 더욱 구체적으로는 90 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서, 실질적으로 MLL1에 대한 결합 활성을 가지는 압타머라면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

또한, 상기 상동성을 가지는 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 가지는 압타머가 실질적으로 서열번호 10 내지 12 또는 이와 상보적인 염기 서열의 압타머와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 발명에서는, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수 (score), 동일성 (identity) 및 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.

본 발명에서는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 공정을 이용하여 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 개발하고자 하였다. 상기 "SELEX"는 Ellington, A.D 등에 의해 개발되었으며, 고선택성 및 고민감성을 가지면서 특정 리간드에 결합하는 ssRNA/ssDNA 분자 (압타머)를 순환 과정을 통해 농축시키는 시험관 내 (in vitro) 선별 방법이다. 상기 압타머는 SELEX의 가격이 저렴하고, 기능 손실 없이 화학적 변형이 쉬우며, 또한 항체 고정과 비교하여 고정이 쉬워 항체에 비해 여러 가지 장점을 가지므로, 항체의 좋은 대체제로 여겨진다.

본 발명에서 SELEX에 적용된 방법은 i) MLL1 단백질에 RNA 라이브러리를 결합, ii) 비결합 RNA 서열의 제거, iii) 결합된 RNA-MLL1 복합체를 RT-PCR을 수행하여 이중 나선 DNA (dsDNA)를 수득, iv) 결합된 DNA 라이브러리를 이용하여 역전사하여 RNA 라이브러리를 제조, 및 v) PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 방법을 이용하여 RNA 라이브러리를 정제하는 과정을 포함한다. 상기 정제된 RNA는 다음 SELEX 순환에 다시 사용되었다.

본 발명에서 최초의 SELEX 순환에 사용된 RNA 라이브러리는 S0 라이브러리로 명명하였고, SELEX 순환 회차가 증가함에 따라 S1, S2, S3과 같이 명명하였다. 상기 S0 라이브러리는 25 뉴클레오티드의 중심 랜덤화 영역 서열 (central randomized region sequence)을 포함하는 RNA 압타머 라이브러리로서, T7 프로모터 및 프라이머 영역을 포함하는 플랭킹 영역 (flanking region)과 XhoI 및 HindIII 제한효소 위치를 가진다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 S0 라이브러리로브터 SELEX를 이용한 양성 선별을 총 16 회 수행하여 S16 라이브러리를 제조하였다 (도 1).

한편, SELEX 기술의 한 가지 단점은 수 회의 정제 및 증폭 과정을 통해 오직 표적 위치에 대해 가장 높은 친화성을 가지는 RNA를 얻는다는 점이며, 이에 RNA 결합 단백질의 RNA-서열 선호도의 범위 및 상대적 친화도를 완전히 특정 지을 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 상대적으로 저렴하고, 고처리량 시퀀싱 (high-throuput sequencing) 방법인 HT-SELEX를 사용하여 선별된 압타머를 추가적으로 분석하였다. 이 방법은 SELEX 공정에 비해 더욱 정량적이고 종합적인 방법이다. 이 방법은 소수의 선별 회차 (대부분 1 내지 3회)로 수행되며, 수 백만 개의 RNA 올리고 서열을 분석한다. 상기 방법은 RNA 결합 단백질 서열-결합 선호도를 더욱 정량적으로 확립하는데 도움이 될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 HT-SELEX를 사용하여 S1, S3 및 S16 라이브러리 서열을 분석하여, 이로부터 가장 비율이 높은 MLL1에 특이적으로 결합하는 10 종의 압타머 (APT1 내지 APT10, 서열번호 10 내지 19)를 선별하였다 (표 1 및 도 2).

본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 RNA 구조 예측 프로그램을 이용하여 상기 선별된 압타머의 구조를 예측하였고 (도 3 및 도 4), 상기 압타머 서열이 37 % 상호작용 경향 (interaction propensity) 및 85 % 식별력 (discriminative power)을 가지며, 약 100 %의 상호작용력 (interaction strength)을 가지는 것을 확인하였다 (도 5).

또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 FAM (Fluorescein Amidite) 변형 ssRNA 압타머가 MLL1에 대한 강력한 형광 강도를 보이는 것을 확인하였고 (도 7), 결합 해리 상수를 측정하였으며 (도 8), qRT-PCR (도 9) 및 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)를 수행 (도 10)하여, 본 발명에서 선별된 압타머가 MLL1에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

나아가, 상기 선별된 압타머를 이용하여 화학발광 (chemiluminescence) 시험을 수행하여 MLL1 단백질의 활성을 공지된 MLL1 억제제인 GS-13041과 유사한 수준으로 억제시키는 것을 확인하였다 (도 9).

이러한 결과를 종합하면, 본 발명의 압타머는 MLL1에 특이적으로 결합하며 단백질 활성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

한편, 상기 압타머를 이용하는 경우 압타머 잔기의 화학적 변형을 통해 안정성 및 물성을 변화시킬 수 있으며, 이러한 방식은 당업계에서 통상적으로 수행되는 것으로, 이 역시 본 발명의 범위에 포함되는 것은 자명하다. 구체적으로, 상기 압타머는 서열번호 10 내지 서열번호 19 (또는 그의 상보적인 서열)에서 적어도 1 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 유사체 (analog)일 수 있고, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기에 의해 치환된 것일 수 있다. 또한 상기 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 각각 PEG (polyethylene glycol), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업자는 공지된 압타머 잔기의 변형 방식을 적절하게 선택하여 본 발명에 적용할 수 있다. 예를 들어 상기 압타머의 변형에 대해 기술하고 있는 Acta Naturae, 2011, 3(4): 12-29; 및 http://www.genelink.com/Literature/ps/Aptamer_PG_Ver3.2.pdf에 기재된 내용은 모두 본 발명의 범주에 해당될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.

본 발명의 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머는 MLL1 단백질에 대해 저해 활성을 나타내어, MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 “MLL1 매개 질환”은 MLL1 단백질이 활성화되어 발병하는 질환을 총칭하며, 구체적으로 MLL1을 코딩하는 유전자의 전사활성 증가에 따른 발현 증가, 또는 MLL1 단백질의 번역 후 변형 (post-translational modification) 또는 유전자 변이 등에 의한 MLL1 단백질의 활성 증가로 인해 야기되는 모든 질환을 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 MLL1 매개 질환은 예컨대 백혈병일 수 있고, 구체적으로 급성 림프구성, 급성 골수성, 만성 림프구성 또는 만성 골수성 백혈병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 MLL1 매개 질환은 유방암, 대장암, 위암 및 자궁 경부암 등 MLL1에 의해 매개될 수 있는 모든 종류의 암을 포함할 수 있으며, 본 발명의 압타머를 이용하여 MLL1 단백질의 활성을 감소시킴으로써 상기 MLL1 매개 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, “예방”은 상기 조성물의 투여에 의해 MLL1 매개 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, “치료”는 상기 조성물의 투여에 의해 MLL1 매개 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 약학적 조성물에서 본 발명의 압타머의 유효 함량은 특별히 제한되지 않으며, 상기 약학적 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 중량 % 내지 99.99 중량 %로 포함되거나 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 압타머를 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은, 상기 담체와 함께 제제화되어 활용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 담체는 자연적 담체 및 비자연적 담체를 포함한다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제 들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.

상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(Dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (Magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (Calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (Sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (Polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.

나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.

상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 구강용 스프레이제, 구강용 세정제, 치약제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 보다 구체적으로 상기 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물을 연고, 크림 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나 구체적으로는 비경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있으며, 보다 구체적으로는 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 “약학적으로 유효한 양”이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 mg/kg, 보다 구체적으로는 1 내지 10 mg/kg으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1 일 1 회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 압타머, 약학적 조성물 및 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 MLL1 매개 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “개체”란 MLL1 매개 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, MLL1 매개 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물의 적합한 1 일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

특정 동물에 대한 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 진단용 조성물이다.

상기 압타머 및 MLL1 매개 질환은 상기 설명한 바와 같다.

MLL1은 백혈병, 유방암, 대장암, 위암 및 자궁경부암 등 MLL1 매개 질환을 가진 환자에게서 과발현될 수 있으므로, 본 발명의 압타머는 상기 MLL1 매개 질환의 진단용 조성물로 사용 가능하다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 분리된 생물학적 시료에 상기 MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 압타머의 결합 정도를 측정하여, 상기 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 MLL1 매개 질환인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, MLL1 매개 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이다.

상기 압타머 및 MLL1 매개 질환은 상기 설명한 바와 같다.

상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 타액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생물학적 시료에서의 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 압타머 말단에 형광 또는 방사선 물질을 표지하거나 비오틴을 결합시켜 형광 또는 방사선 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출가능한 표지는 형광 물질 또는 방사성 물질 표지 (또는 형광 물질 또는 방사성 물질과 반응 가능한 물질 결합)일 수 있고, 예를 들어, 발색효소 (예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S), 크로모포어 (chromophore), FITC, RITC, 형광단백질 (GFP (Green Fluorescent Protein); EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein); DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP (Cyan Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이와 같이, 본 발명의 압타머를 사용하여 시료 내 MLL1의 존재 여부 또는 과발현 여부를 확인하는 경우, 기존의 항체 또는 펩타이드를 이용한 검출 보다 현저하게 우수한 민감도를 보인다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, MLL1에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물이다.

MLL1 매개 질환의 영상화 및 진단은, 이에 제한되는 것은 아니나, MLL1 매개 질환의 초진 목적 뿐만 아니라, 진행 경과, 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포함할 수 있다. 상기 압타머는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위해, 검출가능한 표지에 링크 (예컨대 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다.

구체적으로, MLL1 매개 질환 부위 영상화를 위한 상기 검출가능한 표지는, 방사선 동위원소, 플루오로포어, 양자점 (quantum dot), 또는 자성입자, 예를 들어 상자성입자 (super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자 (ultrasuper paramagnetic particles) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물을 포함하는 나노입자 조영제이다.

본 발명의 압타머는 나노입자에 결합하여 MLL1 매개 질환 부위의 영상화를 위한 나노입자 조영제 형태로 제공될 수 있다. 이때, 본 발명의 압타머는 MLL1과 특이적으로 결합하여 MLL1 매개 질환 부위를 표적화하기 위한 표적지향 리간드 (target ligand) 역할을 하여, 능동적 표적 지향 방법에 의해 보다 빠르고 정확하게 MLL1 매개 질환 부위를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조영제"란 기관, 진단을 목적으로 하여 혈관이나 조직 등이 보다 잘 보이도록 인위적으로 대조도의 차를 만들어 영상으로 나타내기 위해서 사용되는 제제를 말한다. 조영제는 연구 대상 표면의 가시도 및 대조도를 증가시킴으로써, 질환 또는 손상의 존재 여부 및 그 정도를 결정할 수 있다.

조영제로 사용되기 위해서는 생체 내에서 생체적합성 및 생분해성이 우수해야 하고, 생체 내의 안정성이 우수하여 혈액 내에서의 생체분포도가 높아서 충분한 시간 동안 암 조직에 계속적으로 축적되는 특성이 필요하다. 본 발명의 압타머가 결합된 나노입자 조영제는 암 조직 축척 효율이 매우 높으며, 생체에 독성이 없고 이상 소견을 나타내지 않는 안전한 물질임을 확인되었으므로, 조영제로 사용하기에 적합하다.

본 발명의 조영제가 적용될 수 있는 구현예로, 자기공명영상 (magnetic resonance imaging, MRI), X-선 영상화 기술, 및 PET (positron emission tomography)를 비롯한 핵 영상화 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

자기공명영상(MRI)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 영상 진단 기술을 말한다. 본 발명을 MRI를 위한 나노입자 조영제에 적용하는 경우, 당업계에서 널리 사용되는 상자성 나노입자 또는 초상자성 나노입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상자성 입자의 경우 Gd, Fe, Mn 등의 전이금속이온을 사용할 수 있고, 초상자성 입자로는 초상자성 산화철 (superparamagnetic iron oxide) 나노입자 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 압타머는 MLL1에 특이적으로 결합하며, 이에 따라 MLL1 단백질의 활성을 매우 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 상기 압타머를 포함하는 조성물은 백혈병을 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 및 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 MLL1에 대한 S16 라이브러리의 특이성을 측정한 것이다. (a) 동량 (10 ng)의 RNA 라이브러리 S0 및 S16을 MLL1 단백질 1 ㎍에 적용한 다음, qRT-PCR을 이용하여 결합한 올리고뉴클레오티드에 대한 Ct 값을 측정하고, 이를 표준 곡선에 대입하여 양을 계산하였다. 결합 친화도는 결합된 형태의 비율로 나타내었다 (MLL-결합 RNA/총 RNA x 100). 각 값은 평균 ± SEM으로 나타내었다. *P < 0.001은 최초 라이브러리 대조군에 대한 값이다. (b) 다양한 양의 RNA (S0, S3 및 S16)를 MLL1 단백질 1 ㎍에 적용하고, RNA 양 (ng)의 로그 값에 대해 qRT-PCR로 확인된 1/Ct 값을 나타내었다.
도 2는 라이브러리에서 높은 비중을 차지하는 MLL1 결합 압타머를 나타낸 것이다.
도 3은 압타머의 KineFold 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 선별된 압타머의 이차 구조를 나타낸 것이다Mfold 공식 웹 서버를 이용하여 선별된 RNA-압타머의 예상되는 이차 구조를 나타내었다.
도 5는 웹 서버 catRAPID 그래픽 및 catRAPID 강도를 이용하여 MLL1에 대한 압타머의 결합 경향을 예측한 것이다. 식별력 (Discriminative Power, DP)은 0 % (예측 불가) 내지 100 % (예측 가능) 범위로 나타내었다. 50 % 이상의 DP 값은 상호작용이 거의 일어난다는 것을 의미하고, 75 % 이상의 DP 값은 고신뢰 예측 (high-confidence prediction)을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 MEME (Multiple EM Motif Elicitation) 및 GLAMS (Gapped Local Alignment of Motifs)으로 50 압타머의 모티프를 예측한 것이다. 가장 높은 한계 점수 (marginal score)를 가지는 상위 5 개 압타머를 나타내었다.
도 7은 형광 현미경을 이용하여 압타머의 MLL1 특이성을 확인한 것이다. FAM 표지된 가장 많이 농축된 세 개의 ssRNA 압타머 (APT1, APT2 및 APT3는 각각 A, B 및 C) 및 대조군 (D)에 대하여 이들의 MLL1에 대한 친화성 및 특이성을 시험하였다. E 및 F는 각각 아가로스 비드 및 TNFα와 결합한 FAM-APT1을 나타낸다.
도 8은 FLAA (Fluorescence Linked Aptamer Assay)로 확인한 Kd 값을 나타낸 것이다.
도 9는 qRT-PCR 분석으로 MLL1 단백질에 대한 라이브러리 및 선별된 압타머의 결합 친화성을 비교한 것이다.
도 10은 변형되지 않은 APT1 및 MLL1을 이용하여 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 APT1 결합에 대한 pH 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 APT1-MLL1 복합체 결합에서 온도 내성을 나타낸 것이다.
도 13은 압타머-MLL1 복합체의 3D 구조를 나타낸 것이다. (A)는 APT1의 3D 구조, (B)는 MLL1 및 APT1 사이의 다킹 (docking) 모델, (C)는 MLL1 SET 도메인 및 APT1 뉴클레오티드의 삼차원 상호작용을 두 시점에서 관찰한 결과이다.
도 14a 및 14b는 MLL1 복합체의 화학발광 분석을 나타낸 것이다. (a) APT1, APT2 및 APT3의 MLL1 활성에 대한 효과를 시험한 것이다. NEG: 음성 대조군 (효소 없이), DMSO: DMSO-처리, S0: SELEX 최초 라이브러리. ***p < 0.001은 DMSO 그룹에 대한 값이다. (b) APT1의 MLL1 활성에 대한 효과를 시험한 것이다. NEG: 음성 대조군 (효소 없이), DMSO: DMSO-처리, S0: SELEX 최초 라이브러리, GS-13041: MLL1 억제제. ***p < 0.001 값은 DMSO 그룹에 대한 값이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이브러리 제조

T7 프로모터 및 프라이머 영역을 포함하는 플랭킹 영역 (flanking region)과 함께 XhoI 및 HindIII 제한효소 위치를 가지는 최초 ssDNA 라이브러리는 25 뉴클레오티드의 중심 랜덤화 영역 서열 (central randomized region sequence)을 포함한다.

구체적으로, 최초 ssDNA 라이브러리 서열은 5'-CGACTCACTATA GGCTCGAGG-N(25)-GGAAGCTTACGGTACCTAGC-3'이다. SELEX 선별 과정에서 전사, 선별, 역전사 및 PCR 증폭을 위해 정방향 프라이머 5'-GCTAATACGACTCACTATAGGCTCGAGG-3' (서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-GCTAGGTACCGTAAGCTTCC-3' (서열번호 2)을 사용하였다. RNA 압타머 라이브러리는 변성 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 정제하고 NTEN 완충용액 (20mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 % NP-40)에 용해시켰다.

실시예 2: MLL1 단백질의 제조 및 정제

MLL1 (SET) 발현 플라스미드는 Yali Dou (University of Michigan)로부터 제공받았다. His-태깅된 MLL1(SET) 단백질 (a.a. 3762~3970)을 E. coli BL21(DE3) 균주에서 발현시키고 Ni-NTA 아가로스 비드와 함께 인큐베이션하여 정제하였다. 결합된 단백질은 25 mM 이미다졸을 함유하는 PBS (phosphate-buffered saline) 완충액으로 세척하고, 250 mM 이미다졸을 함유하는 PBS로 2 회 용출시켰다. 분리된 단백질의 농도는 Bradford 분석으로 확인하였다.

실시예 3: SELEX 선별 과정

먼저, RNA 압타머 라이브러리를 아가로스 비드에 3 회 노출시켜 비드에 비특이적으로 결합한 압타머를 제거하였다. 그 다음 10 ㎍의 RNA 라이브러리를 NTEN 완충용액 (20mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 % NP-40)에 현탁된 1 ㎍의 MLL1이 고정된 Ni-NTA 비드와 혼합하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합하지 않은 RNA를 NTEN 완충용액 (20mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 % NP-40)으로 3 회 세척하여 제거한 뒤, RNA-단백질 복합체를 이용해 직접 Ni-아가로스 비드로 역전사 과정을 수행하여 다음 PCR 반응에 사용될 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 수득한 DNA 라이브러리는 시험관 내 전사 (in vitro transcription, IVT) 과정을 통해 다음 단계의 RNA 생성에 이용하였다.

최초 5 회의 SELEX 후, RNA 라이브러리의 양은 절반 (5 ㎍)으로 감소하였다. 그 다음 매 3 회의 선별 후, 가장 강력하게 결합한 종을 포획하기 위해 선별 압력을 증가시켰으며, 표적의 양이 절반으로 감소되었다. 본 발명자들은 16 회의 선별을 수행하였다.

실시예 4: qRT - PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)

최초 라이브러리 (S0) 및 16 회 선별 후의 라이브러리 (S16)는 제조사 지침에 따라 IVT 키트 (Invitrogen)를 이용하여 cDNA 합성의 주형으로 사용하였다. 결합 전 RNA 라이브러리 (S0)를 다양한 RNA 함량 (0 ng, 1 ng, 10 ng 및 100 ng)으로 qRT-PCR을 수행하여 수득한 결과를 기반으로 표준 곡선을 작성하였다. cDNA 반응 혼합물의 부분 표본 (1/100)을 제조사의 지침에 따라 Stratagene Mx3005P (Agillent biotechnology)에서 qRT-PCR로 분석하였다.

실시예 5: 고처리량 시퀀싱 (high-throughput sequencing) 기술

S1, S3 및 S16 라이브러리를 아가로스 겔로 정제한 다음, 각각의 정제된 라이브러리 10 ng을 illumina 맞춤 아답터 서열 (custom adaptor sequence), 정방향 5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3` (서열번호 3) 및 역방향 5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (서열번호 4) -(index)- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3` (서열번호 5)과 연결하는데 이용하였다. 상기 역방향 아답터 서열은 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열이 S1, S3 또는 S16 라이브러리를 구별할 수 있는 특정 인덱스 (index) 서열에 연결된 것으로, 시퀀싱 후 인덱스 서열을 통해 라이브러리를 구별할 수 있다. 각각의 라이브러리를 확인하기 위해 illumina TruSeq® Targeted RNA Expression의 다양한 지표 (R702, R704 및 R707)를 각 라이브러리에 대해 사용하였다. 아답터에 연결된 DNA 라이브러리 서열에 대해 PCR을 수행하고 150-200 bp 범위의 크기를 갖는 절편을 3 % 아가로스 겔 카세트 및 소프트웨어 V. 6.00을 이용하여 gel extraction Pippin pre (Sage Science)를 통해 분리하였다. 라이브러리의 질은 Agilent bioanalyzer 2011 (일련번호 72901419)로 측정하고, SynergyH1 hybrid reader (biotek)을 이용하여 Pico-green method (Quant-iT^TM Picogreen^®)로 농도를 정량화하였다. 제조사의 지침에 따라 MiSeq^TM illumina^®로 각 라이브러리 7 pM을 이용하여 시퀀싱하였다.

실시예 6: 시퀀싱 분석

MLL1 특이적 압타머의 정확한 집단을 확인하기 위해 상기 시퀀싱으로 수득한 데이터를 이용하였다. 먼저, 아답터 서열 및 플랭킹 영역을 포함하지 않는 서열은 제거하였다. 그 다음, 정확한 서열을 알기 위해 아답터 서열 및 플랭킹 영역을 필터링하였다. 필터링 과정 후, Perl Script 소프트웨어를 이용하여 상기 데이터를 분석하였다.

실시예 7: 압타머의 컴퓨터 분석

7-1. 이차 구조 확인

슈도낫 (pseudo knots) 및 얽힌 나선 (entangled helix)을 포함하는 RNA 폴딩을 예측하기 위한 KineFold 웹 서버 (http://kinefold.curie.fr/cgi-bin/form.pl), 및 Mfold 공식 서버 (http://mfold.rna.albany.edu)로부터 상위 다섯 개 압타머의 이차 구조를 얻었다. Mfold에서, 모든 압타머에 대한 파라미터 조정은, 준최적수 퍼센트 (percent suboptimality number) = 5, 계산된 폴딩 수 상한 (the upper bound on the number on computed folding) = 4, 최대 내부 벌지/고리 크기 (maximum interior bulg/loop size) = 30으로 동일하게 하였다. 폴딩 온도 및 염도는 미리 고정시켰으며, 변경하지 않았다.

7-2. QGRS ( Quadruplex forming G-Rich Sequences)

추정상의 QGRS를 확인하기 위해 선별된 압타머의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. Quadruplex 구조의 존재 여부는 공식 웹 서버인 http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php를 사용하였다.

7-3. catRAPID 그래픽 및 catRAPID 강도

catRAPID 그래픽 모듈 (http://service.tartaglialab.com/update_submission/)은 단백질-RNA 쌍의 상호작용 성향을 예측하며, 대응하는 트레이닝 세트 (training set)와 함께 상호작용 강도의 척도인 식별력 (discriminative power), 및 상호작용 점수를 분석할 수 있다. carRAPID 강도 모듈 (http://service.tartaglialab.com/update_submission/)은 참조 세트 (reference set)에 대응하여 단백질-RNA 쌍의 상호작용 강도를 계산한다. 참조 서열은 관심있는 단백질-RNA 쌍과 동일한 길이를 가진다.

7-4. RNA 압타머의 공통 모티프 (consensus motif)

RNA 압타머의 공통 모티프브는 GLAMS2 (Gapped Local Alignment of Motifs, http://meme.nbcr.net/meme/tools/glam2) 및 MEME (Multiple Em for Motif Elicitation, http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme) 웹 서버를 이용하여 확인하였다.

실시예 8: 형광 현미경 검사

FAM (Fluorescein Amidite) 변형 ssRNA 압타머 서열은 바이오니어 (daejeon, Korea)에서 합성하였다. 상기 압타머 및 FAM 표지 대조군 RNA를 90 ℃에서 10 분 동안 결합 완충용액에서 가열하고, 0 ℃ 얼음에서 빠르게 식힌 다음, 상온에서 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 단백질 1 ㎍을 상기 FAM 표지 압타머 또는 대조군과 함께 30 분 동안 인큐베이션하였다. 결합 반응 후, 상등액을 제거하고, FAM-RNA 및 단백질 복합체를 결합 완충용액으로 3 회 세척하여 결합되지 않은 압타머를 제거하였다. 결합 완충용액 100 ㎕를 각 튜브에 첨가하고 상기 복합체를 현미경 슬라이드에 두었다. Nikon Eclipse Ti U 현미경을 이용하여 압타머의 사진을 찍었다.

실시예 9: 해리상수 ( Kd ) 결정

qRT-PCT 및 형광 방법을 사용하여 해리상수 (Kd)를 결정하였다.

9-1. qRT - PCR을 이용한 해리상수 ( Kd ) 결정

다양한 농도의 최초 라이브러리 및 S16 각각을 분리된 튜브에 담긴 결합 완충용액 (NTEN)에서 MLL1 단백질 1 ㎍ (Ni-아가로스 비드와 함께)에 결합시키고, 30 분 동안 인큐베이션하였다. 단백질-압타머 복합체를 결합 완충용액으로 3 회 세척하고 상기 복합체를 cDNA 합성의 표적으로 사용하였다. 각 튜브로부터 1/100 분할 표본을 제조하고 단백질에 결합한 압타머의 양을 제조사의 지침에 따라 Stratagene Mx3005P (Agillent biotechnology)에서 qRT-PCR로 정량화하였다.

9-2. 형광을 이용한 해리상수 측정

FAM 표지 ssRNA 압타머는 바이오니어에서 합성하였다; APT1 - 5`FAM-CGAGGAACGUACAGAGGGUGGAGAGUGGGU-3' (서열번호 6), APT2 - 5`FAM-CGAGGACGUAACAGAGGGAGGCGAGUGGG-3' (서열번호 7), APT3 - 5`FAM-CGAGGACCGAAGUCGAGGGGGACGUGAGGG-3' (서열번호 8) 및 대조군 RNA - 5`FAM-AUCGAAGUUAAUUGAGUCAUUUCAGUCUGA-3' (서열번호 9). 상기 압타머 및 대조군 RNA를 90 ℃에서 5 분 동안 결합 완충용액에서 가열하고, 0 ℃ 얼음에서 빠르게 식힌 다음, 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 1 ㎍을 상기 FAM 표지 압타머 또는 대조군과 30 분 동안 인큐베이션하였다. 결합 반응 후, 상등액을 제거하고 FAM-RNA 및 단백질 복합체를 NTEN 완충용액 (20 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % NP-40)으로 3 회 세척하였다. 그 다음 결합된 압타머를 10 분 동안 95 ℃로 가열하여 용출시켰다. 결합된 압타머 양은 Synergy H1 hybrid reader (Biotek)를 이용하여 형광을 정량화하여 측정하였고, prism graph pad 소프트웨어 6.0을 이용하여 비선형회귀 (non-linear regression) 방법으로 해리 상수를 계산하였다.

실시예 10: 온도 및 pH 내성 시험

10-1. 온도 내성 시험

FAM 표지 ssRNA APT1의 온도 내성에 대해 시험하였다. FAM-APT1을 10 분 동안 95 ℃에서 가열하고, 얼음에서 5 분 동안 빠르게 식힌 뒤, 상온에서 인큐베이션하였다. 총 25 ㎕ 부피로 결합 완충 용액에서 RNA-APT1 2000 nM을 MLL1 단백질이 결합된 NiTA 비드 1 ㎍과 함께 인큐베이션 하였다. 30 분 후 결합하지 않은 압타머를 포함한 모든 상등액을 제거하고, APT-MLL1 복합체를 결합 완충용액 200 ㎕로 3 회 세척하였다. 마지막으로, 결합 완충용액 200 ㎕를 복합체에 첨가하고 상온에서 가라앉도록 두었다. MLL1-APT1 복합체에서 결합된 APT가 떨어지는 온도를 측정하기 위해, 복합체를 각기 다른 온도에서 인큐베이션 하였는데, 즉 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃, 65 ℃, 75 ℃, 85 ℃ 및 95 ℃에서 인큐베이션하였다. 상기 복합체를 특정 온도에서 10 분 동안 인큐베이션하고, 분석을 위해 상등액 100 ㎕를 취한 다음 총 부피를 200 ㎕로 유지하기 위해 혼합물에 완충용액 100 ㎕를 첨가하였다. 제거된 상등액으로 형광 강도를 측정하였다.

10-2. pH 내성 시험

HCl 및 NaOH 용액을 이용하여 결합 완충용액의 pH 값을 다양하게 조정하고 (2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 11.5 및 12.5), 다양한 pH 조건 하에서 독립적으로 FAM-APT1 200 nM 및 MLL1이 결합된 NiTA 비드 1 ㎍ 사이의 결합 반응을 확인하였다. 결합 30 분 후, 결합하지 않은 압타머와 함께 상등액을 제거하고, 대응하는 pH 값의 결합 완충용액을 이용하여 상기 복합체를 3 회 세척하였다. 그 다음 결합된 압타머를 10 분 동안 95 ℃로 가열하여 용출시켰다. 결합된 압타머 양은 Synergy H1 hybrid reader (Biotek)를 이용해 형광을 정량화하여 측정하였다.

실시예 11: 2 성분 (binary) 복합체에 대한 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay) 분석

용액 내에서 MLL1 단백질 표적에 대한 APT1의 결합을 EMSA로 분석하였다. 모든 용액에서 압타머는 변성을 위해 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하고, 바로 얼음 위에 올려 5 분 동안 식힌 뒤, 상온에서 인큐베이션하였다. 총 부피는 25 ㎕로 하고, 각 압타머 용액은 상온에서 30 분 동안 MLL1 단백질의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. 상기 복합체를 1X TBE 완충용액 (Tris-HCl 89 mM, Borate 89 mM, EDTA 2 mM)에 담긴 10 % 비변성 폴리아크릴아마이드 겔 (native PAGE gel)에 로딩하였다. 겔 상의 압타머는 RNA-압타머와 결합하는 gel green (Biotium)으로 염색하였다. 상기 겔은 Bio Rad gel Doc^® EZ imager로 시각화하였다.

실시예 12: MLL1 - APT1 복합체의 3D 구조 예측

APT RNA의 이차 구조는 최소 자유 에너지만을 예측하기 위해 RNAfold 웹 서버 (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)를 통해 dot-bracket 표기로 작성하였다. 상기 파일 형식은 RNA composer 웹 서버 (httpL//rnacomposer.ibch.poznan.pl/)로 APT1의 Pdb 형식을 접고 그리기 위해 필요하다. MLL1 SET 도메인의 3D 구조는 단백질 데이터 은행 (PDB code: 2W5Y)으로부터 얻었고 APT1은 iFoldRNA Ver 2.0 (http://troll.med.unc.edu/ifoldrna.v2/index.php)으로 그렸다. APT1-MLL1 (SET 도메인) 다킹 (docking)은 에너지 기반 점수부여 기능, Statistical Potential, Shape Complementarily and Electrostatics를 이용하여 각각의 구조를 평가하는 ZDOCK 서버 Ver 3.0.2 (http://zdock.umassmed.edu/)를 이용하여 수행하였다. 또한, 구조적 상동성은 Swiss-PdbViewer 4.1.0으로 수행하였다.

실시예 13: MLL1 복합체 화학발광 분석

압타머 존재 하에 MLL1의 활성을 제조사의 지침에 따라 화학발광 분석 (BPS Bioscience)으로 정량화하였다. 구체적으로, MLL1 250 ng을 각각의 압타머 (APT1, APT2 및 APT3), S0 대조군 라이브러리 또는 양성 대조군 (억제제 불포함)이 각각 3 μM씩 포함된 반응 혼합 용액 (4x HMT 분석 완충용액 1, 20 μM S-아데노실메티오닌 (S-adenosylmethionine) 및 억제 완충용액)과 혼합하고 H₂O를 첨가하여 최종 부피를 50 ㎕로 맞춘 혼합액을 상온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 혼합액을 96 웰 플레이트에 올려 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 각 웰을 1X TBST 완충용액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 및 0.05 % Tween20) 200 ㎕로 세척하고, 페이퍼 타월로 건조시킨 뒤 블록킹 완충용액 10 ㎕와 함께 10 분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 800 배 일차 항체 2 (블록킹 완충용액에 희석) 100 ㎕를 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 다음, 블록킹 완충용액으로 웰을 3 회 세척하고 건조시킨 뒤 HRP (horseradish peroxidase) 표지된 이차 항체 1 (블록킹 완충용액으로 1,000 배 희석)을 각 웰에 첨가하였다. 상온에서 천천히 교반하며 30 분 동안 인큐베이션한 뒤, 각 웰을 1X TBST 완충용액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 및 0.05% Tween20) 200 ㎕로 세척하고, 페이퍼타올로 건조시킨 다음 블록킹 완충용액 100 ㎕와 함께 10 분 동안 인큐베이션하였다. 동량의 분획 (HRP 화학발광 기질 A 50 ㎕ 및 HRP 화학발광 기질 B 50 ㎕) 100 ㎕를 얼음 위에서 혼합하고 각 웰에 첨가하였다. 화학발광은 Bio-Tek 형광 마이크로플레이트 리더 (fluorescent microplate reader)를 이용하여 즉시 측정하였다.

실험예 1: SELEX 공정

MLL1에 결합하는 RNA 압타머를 분리하기 위해, 고친화성 및 고특이성 압타머를 얻는데 최적화된 SELEX를 16 회 수행하였다. 실제 SELEX 공정에 앞서, 비특이적 결합을 제거하기 위해 Ni-NTA-비드를 이용하여 5 회의 음성 선별 (Negative SELEX)을 수행하였다. MLL1에 대한 압타머를 농축시키기 위해, 양성 선별 각 회차에서 RNA 대비 단백질 비율 (1 : 1/2)을 낮추고, 인큐베이션 시간을 증가시키고, 세척 단계 및 세척 부피를 증가시켜 SELEX를 더 엄격하게 수행하였다. PCR을 16 사이클 수행하여 인위적 결과를 줄이고 비정상적 복제 서열로부터 라이브러리를 유지하였다. 각 결합 단계 전, RNA 라이브러리를 90 ℃로 가열한 뒤 얼음 위에서 빠르게 식히고 상온에서 표준화하여 RNA 라이브러리에서 잘못된 이차 구조가 발생하는 것을 감소시켰다.

실험예 2: MLL1에 대한 RNA 라이브러리의 결합 친화성

각 SELEX 사이클로부터 MLL1-결합 RNA의 농축을 확인하기 위해, qRT-PCR 기술을 이용하여 올리고뉴클레오티드 양을 측정하였다. 미리 결합된 순수한 SO RNA 라이브러리 (0 ng, 1 ng, 10 ng 및 100 ng)로 표준 곡선을 그렸다. 최초 RNA 라이브러리 (S0) 또는 16 회 선별 후 라이브러리 (S16) 각각 10 ng을 MLL1 1 ㎍에 결합시켰다. 표준 RNA 곡선과 함께 상기 두 복합체의 Ct 값을 비교한 결과, S0의 경우 0.7 ng (10 ng의 7 %)이 MLL1과 결합하였고, S16의 경우 6.8 ng (10 ng의 68 %)이 결합한 것을 확인하였다 (도 1의 A). S16은 S0에 비해 MLL1에 대한 약 10 배 높은 친화성을 보였으며, 이는 SELEX 공정을 수 회 수행하여 라이브러리 선택성이 증가했음을 보여주는 것이다.

나아가, S0, S3 및 S16 RNA 라이브러리의 다양한 농도에서 1/Ct 값을 확인한 결과 MLL1에 대해 예상되는 결합 강도가 S16 > S3 > S0인 것을 알 수 있었는데, 이는 SELEX 공정이 정확하게 수행되었음을 의미한다 (도 1의 B).

실험예 3: RNA 라이브러리의 고처리량 시퀀싱 (high throughput sequencing)을 통한 압타머 선별

고처리량 시퀀싱 SELEX (high throughput sequencing SELEX, HT-SELEX)는 수 회의 선별, 클로닝 및 최적화 단계와 관련해 통상적인 SELEX와 비교하여 더욱 효율적이고, 안정적이고, 유연하며, 단지 2 - 3 회의 양성 선별만 필요한 것으로 보고된 바 있다. 따라서 NGS (Next Generation Sequencing)를 수행하여 S1, S3 및 S16 라이브러리의 서열을 분석하였다.

각 선별 회차에서 약 1.5 x 10⁶ 개의 서열을 수득하였으며 Perl Script를 이용하여 데이터를 분석하였다. 라이브러리의 시퀀싱 데이터 분석으로 두 압타머 (APT1 및 APT2)의 비율이 S3 및 S16 라이브러리에서 상당히 증가하였음을 확인하였다 (표 1 및 도 2). SELEX 선별 회차가 증가하면서, 상기 두 압타머 서열은 현저히 증가하였다.

압타머	서열	집단 ( % )			농축 (배)
	5'-GGCUCGAGG-N(25)-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3'	S16	S3	S1	S3/S1
APT1	5'-GGCUCGAGG-AACGUACAGAGGGUGGAGAGUGGGU-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 10)	30.49	12.70	3×10-2	464
APT2	5'-GGCUCGAGG-ACGUAACAGAGGGAGGCGAGUGGGU-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 11)	25.95	12.24	3×10-2	384
APT3	5'-GGCUCGAGG-ACCGAAGUCGAGGGGGACGUGAGGG-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 12)	0.78	0.43	1×10-3	534
APT4	5'-GGCUCGAGG-ACCUAAGUGGGAAGGUGAGCGGGUG-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 13)	0.27	0.28	6×10-3	303
APT5	5'-GGCUCGAGG-AACGUACAGAGGGCGGAGAGUGGGU-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 14)	0.25	0.18	6×10-4	376
APT6	5'-GGCUCGAGG-AAAUGCAAGGAGGUCGGAGGUCGGA-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 15)	0.22	0.14	6.8×10-5	164
APT7	5'-GGCUCGAGG-ACCGACGACGAGGGGGACGUGAGGG-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 16)	0.20	0.12	6.8×10-5	197
APT8	5'-GGCUCGAGG-AUAAGCAUGGGGGUCGAGAGGGGAC-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 17)	0.20	0.11	6.8×10-5	294
APT9	5'-GGCUCGAGG-AACGUACAGAGGGAGGCGAGUGGGU-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 18)	0.17	0.10	6.8×10-5	273
APT10	5'-GGCUCGAGG-AACGUACAGAGGGUGGAGAGUGGGU-GGAAGCUUACGGUACCUAGC-3' (서열번호 19)	0.17	0.10	2×10-3	268

또한, 농축비 (S3/S1 선별 회차 사이의 카피수 비율)를 분석한 결과, APT1 및 APT2에 비해 APT3가 더 높은 비율로 농축됨을 확인하였다 (표 1).

상기 데이터는 다른 연구자들에 의해 보고된 것처럼 높은 카피수를 가지는 압타머가 반드시 높은 농축비를 보이는 것은 아니라는 것을 보여준다. S16/S3 농축비는 APT1, APT2 및 APT3 사이에 현저한 차이를 보이지 않았다 (각각 2.4, 2 및 2 배). 상기 결과는 HT-SELEX 기술이 SELEX의 사이클을 최소화하는데 효과적인 방법이라는 것을 의미한다.

실험예 4: 압타머의 구조 예측

본 발명자들은 상기 선별된 압타머의 구조를 분석하기 위해 다양한 생물정보학 도구를 적용하였다. 먼저, 압타머의 이차 구조를 슈도낫 (pseudo knot) 및 얽힌 나선 (entangled helices)에 대한 예측 알고리즘을 포괄하는 RNA 이차 구조 예측 프로그램 kineFold (http://kinefold.curie.fr/cgi-bin/form.pl)로 확인하였다. 분석을 위해 가장 낮은 자유 에너지를 가지는 구조를 선별한 결과, 다른 구조와 비교하여 APT3 및 APT5가 가장 낮은 에너지를 가지는 것을 확인하였다 (도 3).

또한, Mfold 공식 서버 (http://mfold.rna.albany.edu)에서 압타머 구조를 분석하였다. 가장 낮은 에너지를 가지는 압타머 구조를 선별하였고, KineFold 웹 서버에서와 같이 에너지 및 안정성에서 거의 유사한 패턴을 보이는 것을 확인하였다 (도 4). Mfold로 그린 압타머 구조는 상위 세 개의 압타머 (APT1, APT2 및 APT3) 모두 두 개의 헤어핀 고리 (hairpin loop) 및 하나의 말단 개방 가지 (terminal open branch)로 둘러싸인 하나의 중심 다가지 고리 (central multibranch loop)를 가지는 거의 유사한 구조를 가지는 것을 보여준다. APT3는 나머지 압타머와 비교하여 가장 낮은 자유 에너지를 가지는 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 압타머 구조의 안정성이 압타머의 결합 친화성에 필연적으로 상관관계를 가지는 것은 아니라고 결론 내었다.

한편, 시퀀싱을 통해 수득한 압타머는 5' 말단에 다수의 구아닌 염기 (Gs)를 가지므로, 상기 Gs는 G-quadruplex 구조를 형성할 것으로 생각되었다. 이에, 공식 웹 서버 (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php)를 이용하여 추정상의 QGRS (Quadruplex forming G-Rich Sequences)에 대하여 상위 다섯 개의 압타머를 분석하였다. 그 결과, 실질적으로 상기 quadruplex 형태를 가지는 압타머는 없다는 것을 확인하였다.

실험예 5: MLL1 - 압타머 쌍의 상호작용 경향 및 식별력 예측

catRAPID 그래픽 웹 서버를 사용하여 (http://service.tartaglialab.com/grant_submission/catrapid_graphic), 식별력 (discriminative power, DP)으로 나타나는 단백질-RNA 쌍의 상호작용 경향을 예측하였다. 상기 상호작용 경향은 단백질 및 RNA 사이의 상호작용 가능성을 측정하여 얻었다. 상기 측정은 예측에 사용될 수 있는 물리-화학적 프로필의 구체적인 특성을 나타내기 위해 리보핵산 단백질 복합체 구성요소의 관찰된 성향을 기반으로 한다. 상기 식별력은 상호작용 경향이 대응하는 catRAPID 트레이닝 (training)에 대해 평가되는 통계적 값이다. 이는 예측의 신뢰성을 나타낸다.

APT1, APT2 및 APT3의 결합 경향, 식별력 및 RNA 단백질 강도를 분석한 결과, 참조 세트 (reference set)에 대하여, 선별된 압타머는 표적 MLL1과 적당한 수준으로 결합하는 능력을 가지는 것으로 예측되었다. 추가적인 분석을 위해 선별된 모든 압타머 서열은 37 % 상호작용 경향 및 85 % 식별력을 가지며, 약 100 %의 상호작용력 (interaction strength)을 가지는 것을 확인하였다 (도 5).

실험예 6: 공통 모티프 (motif) 분석

다음으로, MLL1에 결합하는 라이브러리의 실제 모티프 (motif)를 얻기 위해, MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) 및 GLAMS2 (Gapped Local Alignment of Motifs) 웹 서버를 이용하여 S3 라이브러리의 상위 50 개 압타머에 대한 공통 모티프를 확인하였다 (도 6의 A). 뉴클레오티드 서열 (서열에서 도출되는 표본)에서 신규하고, 갭이 없는 (ungapped) 모티프 (반복되는 고정된 길이의 패턴)를 발견할 수 있기 때문에 MEME를 선택하였다. MEME는 다양한 길이의 패턴을 둘 또는 그 이상의 모티프로 분리한다. 반면에, GLAM2는 DNA 또는 단백질 서열 (서열에서 도출되는 표본)에서 신규하고, 갭이 있는 모티프 (반복되는 다양한 길이의 패턴)를 찾는다.

MEME에서, 본 발명자들은 모티프 발견을 위해 표준 발견 모드 (normal discovery mode)를 선택하였고, 서열 당 0 내지 1의 발생의 위치 분포를 선택하고, 총 모티프 수를 3 개의 서열로 설정하였다. MEME로 수득한 가장 공통적인 모티프 (도 6의 A에서 Motif No. 1)는 S16에서 APT1과 72 % 서열 상동성, 그리고 APT2와 60 %의 서열 상동성을 가졌다. 또한 APT1 및 APT2 (전체 서열 대비 각각 31 % 및 26 %로 발생)는 서로 76 % 서열 상동성을 가졌다. 상기 결과는 수 회의 선별 후 오직 실제로 결합하는 압타머만 남는다는 것을 증명하는 것이다.

GLAM2에서, 상기 분절 (segment)을 포함하는 정렬 (alignment) 점수에서 상기 분절을 제외한 정렬 점수를 뺀 값을 한계 점수 (marginal score)로 나타내었다. 상기 한계 점수는 각 분절이 다른 분절과 얼마나 일치하는지를 반영한다. 그 결과, APT1, APT2 및 APT5가 가장 높은 한계 점수를 가지는 것으로 나타났다 (각각 24.9, 24.4 및 24.9) (도 6의 B).

실험예 7: 형광 현미경 관찰

MLL1 단백질과 선별된 압타머의 특이적 상호작용을 더 확인하기 위해, FAM (Fluorescein Amidite) 변형 ssRNA 압타머 (APT1, APT2, APT3 및 대조군 RNA)와 함께 Ni-NTA-MLL1, Ni-NTA 아가로스 비드 및 Ni-NTA-TNFα를 대상으로 하여 실험을 수행하였다. 상기 세 개의 압타머 모두 Ni-NTA-MLL1에 대해 강력한 형광 강도를 보였다 (도 7). 상기 선별된 압타머들은 TNFα가 결합된 Ni-NTA 아가로스 비드 또는 Ni-NTA 아가로스 비드에서는 형광이 관찰되지 않았다. 상기 데이터는 모든 선별된 압타머들이 MLL1에 특이적으로 결합하고, 위양성 (false positive)으로 선별된 것이 아니라는 것을 보여준다.

실험예 8: FLAA (Fluorescence linked Aptamer Assay)에 의한 해리 상수 (Kd) 측정

MLL1-압타머 상호작용의 특이성을 확인하기 위해, 형광 염료인 FAM이 태깅된 APT1, APT2 및 APT3에 대해 FLAA를 수행하여 평형 해리 상수 및 결합 특이성을 측정하였다. 상기 상위 3 개의 서열, APT1, APT2 및 APT3에 대해 측정된 Kd 값은 각각 8.28 nM, 98 nM 및 36.61 nM로 나타났다 (도 8). APT1이 MLL1에 대해 가장 낮은 Kd 값을 가지는 것으로 확인되었고, 이는 가장 많이 농축된 압타머, 즉 APT1이 가장 강한 친화성을 가지는 것을 의미한다.

실험예 9: 압타머의 결합 친화성 평가

상기 시퀀싱 결과 및 해리 상수는 APT1이 MLL1에 대한 가장 강력한 결합 압타머임을 증명하는 것이다. 상기 결과를 더 확인하기 위해, MLL1 단백질에 대한 3 개의 압타머의 친화성을 측정하였다.

이를 위해, qRT-PCR 분석으로 APT1이 MLL1 단백질에 대해 최대 결합을 하는 것을 확인하였다 (APT1, APT 및 APT3는 각각 281 ng, 177 ng 및 79 ng). 또한 SELEX의 사이클이 증가됨에 따라 RNA 풀에 대한 친화성이 증가하는 것을 확인하였다 (S1, S3, S7, S11 및 S16은 각각 0.63 ng, 11.2 ng, 4 ng, 141 ng 및 125 ng) (도 9). 상기 결과는 APT1이 MLL1에 대해 가장 강력하게 결합하는 압타머 서열임을 명확하게 증명하는 것이고, APT1은 APT2 및 APT3 보다 더 우수한 결합 능력을 가지는 것을 알 수 있었다.

실험예 10: MLL1 - APT1 복합체에 대한 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay)

APT1 및 MLL1의 복합체 형태를 EMSA 분석을 통해 더 확인하였다 (도 10). MLL1의 농도 증가에 따라, APT-MLL 복합체가 나타나고 APT1 밴드가 약해지는 것을 확인하였다. 상기 데이터는 MLL1-APT1 복합체가 형성된다는 것을 추가적으로 입증하는 것이다.

실험예 11: MLL1 - APT1 결합 안정성

MLL1-APT1 복합체 형성의 특징을 설명하기 위해, 다양한 pH 및 온도 스트레스 조건에서 결합 강도 및 결합 안정성을 평가하였다. 그 결과, 다양한 pH 조건 하에 단백질의 이차 및 삼차 구조가 변화하기 때문에, APT1-MLL1 복합체는 pH 7.5에서 잘 결합하고 pH 값의 변화는 이들의 해리를 촉진하는 것을 확인하였다 (도 11).

또한, 온도가 상승하면서 상호작용이 약해지는 것을 확인하였다 (도 12). 이러한 결과는 APT1 및 MLL1 사이의 상호작용의 특이성이 수소 결합, 이온성 결합 및 소수성 상호작용과 같은 다양한 약한 상호작용에 기여한다는 것을 의미한다.

실험예 12: MLL1 - APT1 복합체의 3D 구조

APT1의 3D 구조를 예측하기 위해, iFoldRNA를 이용하였다. 다킹 (docking)을 위해, 가장 나선형이고, 에너지가 낮으며 단단한 구조를 선택했다. 이러한 구조가 MLL1-단백질 인식에서 매우 중요하다는 것으로 나타났다. 따라서, ZDOCK 서버를 이용하여 APT1 및 MLL1 단백질 사이의 고분자 다킹 (macromolecular docking)을 수행하였다 (도 13). 예측된 구조는 rA15, rC16, rA17, rG18, rA19, rG20, rG21, rG22 및 rU23이 효소 활성 위치 S-아데노실-호모시스테인 (S-adenosyl-homocysteine, AdoHcy) 및 그 주변 아미노산과 가까이 접하고 있는 것을 보여준다. 히스톤 H3의 라이신 4는 AdoHcy 결합 위치의 말단에서 채널에 삽입되었다. 아마도, 상기와 같은 구조는 MLL1 SET 도메인에 의해 효소활성을 억제하는 역할을 하는 것으로 보인다.

실험예 13: 압타머의 MLL1 활성 억제 확인

MLL1 활성에 대한 압타머의 효과를 확인하기 위해, APT1, APT2 및 APT3에 대한 화학발광 시험을 수행하였다. 대조군 (DMSO)과 비교하여, APT1 및 APT2는 MLL1 활성을 약 70 % 감소시켰다 (p < 0.005) (도 9A). 대조적으로, 대조군 라이브러리 (S0) 및 APT3는 효소 활성을 유의적인 수준으로 억제하지 못했다. 특히, APT1 (10 μM)의 억제 활성은 공지된 MLL1 억제제인 GS-13041과 유사한 수준이었다 (도 9B). 상기 데이터는 APT1 및 APT2가 MLL1에 특이적으로 상호작용을 하여 이를 효과적으로 억제하는 것을 보여주는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> Aptamers that specifically bind to MLL1 and the use thereof <130> KPA151172-KR <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX primer-F <400> 1 gctaatacga ctcactatag gctcgagg 28 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX primer-R <400> 2 gctaggtacc gtaagcttcc 20 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> custom adaptor sequence-F <400> 3 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> custom adaptor sequence-R-5' <400> 4 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> custom adaptor sequence-R-3' <400> 5 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34 <210> 6 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM APT1 <400> 6 cgaggaacgu acagagggug gagagugggu 30 <210> 7 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM APT2 <400> 7 cgaggacgua acagagggag gcgaguggg 29 <210> 8 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM APT3 <400> 8 cgaggaccga agucgagggg gacgugaggg 30 <210> 9 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM control <400> 9 aucgaaguua auugagucau uucagucuga 30 <210> 10 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT1 <400> 10 ggcucgagga acguacagag gguggagagu ggguggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 11 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT2 <400> 11 ggcucgagga cguaacagag ggaggcgagu ggguggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 12 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT3 <400> 12 ggcucgagga ccgaagucga gggggacgug agggggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 13 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT4 <400> 13 ggcucgagga ccuaaguggg aaggugagcg ggugggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 14 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT5 <400> 14 ggcucgagga acguacagag ggcggagagu ggguggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 15 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT6 <400> 15 ggcucgagga aaugcaagga ggucggaggu cggaggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 16 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT7 <400> 16 ggcucgagga ccgacgacga gggggacgug agggggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 17 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT8 <400> 17 ggcucgagga uaagcauggg ggucgagagg ggacggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 18 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT9 <400> 18 ggcucgagga acguacagag ggaggcgagu ggguggaagc uuacgguacc uagc 54 <210> 19 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APT10 <400> 19 ggcucgagga acguacagag gguggagagu ggguggaagc uuacgguacc uagc 54

Claims (11)

1. 서열번호 10에 기재된 염기 서열, 또는 이와 상보적인 염기 서열을 가지는, MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA인, 압타머.
   
3. 서열번호 10에 기재된 염기 서열, 또는 이와 상보적인 염기 서열을 가지는 압타머에서 적어도 1 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 유사체 (analog)를 포함하는, MLL1 (Mixed Lineage Leukemia 1)에 특이적으로 결합하는 압타머.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기에 의해 치환된 것인, 압타머.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 각각 PEG (polyethylene glycol), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상이 결합되어 변형된 것인, 압타머.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 MLL1 매개 질환은 백혈병, 유방암, 대장암, 위암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환의 진단용 조성물로서,
   상기 MLL1 매개 질환은 백혈병, 유방암, 대장암, 위암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 진단용 조성물.
   
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는 MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물로서,
   상기 MLL1 매개 질환은 백혈병, 유방암, 대장암, 위암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 영상화용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 방사선 동위원소, 플루오로포어, 양자점 (quantum dot), 상자성입자 (super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자 (ultrasuper paramagnetic particles)를 추가적으로 포함하는 것인, 영상화용 조성물.
   
10. 제8항의 MLL1 매개 질환 부위의 영상화용 조성물을 포함하는 나노입자 조영제.
    
11. (a) 분리된 생물학적 시료에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 압타머를 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 시료에서 압타머의 결합 정도를 측정하여, 상기 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 MLL1 매개 질환인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, MLL1 매개 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 MLL1 매개 질환은 백혈병, 유방암, 대장암, 위암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.

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