KR101839688B1

KR101839688B1 - 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 의약적 용도

Info

Publication number: KR101839688B1
Application number: KR1020160102357A
Authority: KR
Inventors: 민경훈; 권아라; 송지호
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2016-08-11
Publication date: 2018-03-19
Also published as: KR20170023387A

Abstract

본 발명은 NF-κB 활성을 억제하는 신규한 이미다조티아졸 화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체는 염증 환경에서 Nuclear factor kappa B (NF-κB)의 유전자 발현 및 활성을 억제함으로써 염증성 사이토카인 전구물질인 IL-6 및 TNF-α의 생성을 억제하였으며, NO 생산을 저해시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 안질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

Description

이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 의약적 용도{Imidazothiazole Derivatives or Its Pharmaceutically Acceptable Salts and Pharmaceutical Use Thereof}

본 발명은 NF-κB 활성을 억제하는 신규한 이미다조티아졸 화합물 및 이의 의약적 용도에 관한 것이다.

분자 핵 인자 카파 B(Nuclear factor kappa B, NF-κB)는 B 세포에 존재하는 κB 경쇄 발현의 조절자이며 또한 면역체계에서 중요한 역할을 하는 유도성 전사 인자로, 염증 조절, 세포 주기, 세포 사멸과 같이 면역체계에 관련된 유전자의 발현을 조절할 뿐만 아니라 세포의 생존, 분화, 증식에 관련된 유전자 발현에도 폭넓은 영향을 미친다. 이러한 다면적인 NF-κB의 역할 때문에 NF-κB 신호전달 경로의 조절 이상은 암을 포함한 염증성 질환, 자가 면역성 질환, 대사성 질환, 심혈관계 질환, 신경 퇴행성 질환 등 수많은 질병과 연관되어 있다. 그에 따라, NF-κB에 의해 조절되는 전사 시스템은 면역체계의 유지와 발전에 필수적이다.

NF-κB의 신호전달 경로는 전형적인 전 염증 신호전달 경로로서 인터루킨 1(interleukin 1, IL-1), 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α, TNF-α)와 같은 염증 유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)에 의해 활성화되고, 활성화된 NF-κB는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 및 접합 분자와 같은 또 다른 전 염증 유전자를 발현한다. 또한, NF-κB는 수많은 질병과 관련된 신호전달 경로에서 단계적으로 참여하고 있기 때문에 많은 연구자들과 제약사들이 NF-κB 활성에 대하여 효과적이고 특이적인 저해제를 찾기 위해 노력하고 있다.

NF-κB를 표적으로 하는 많은 저해제들은 천연물, 화학 물질, 금속, 대사 물질, 합성된 화합물, 펩타이드, 단백질 (세포성, 바이러스성, 박테리아성, 세균성)등이 포함되며, 이러한 저해제들은 IκB 인산화효소(IκB kinase, IKK)의 상위 전달 경로에 작용할 수 있으며, 또는 직접적으로 IKK 복합체의 인산화를 억제하거나 IκB의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 관련 분해를 억제할 수 있다. 또한, NF-κB 이합체가 핵으로 이동하는 것을 방지하거나 핵 내에서 NF-κB와 DNA간의 결합을 방해하거나 유전자와의 전이활성(transactivation)을 억제함으로써 NF-κB 신호전달 경로의 활성을 억제할 수 있다.

약물의 표적으로서 NF-κB에 대한 초기의 관심이 NF-κB의 활성을 조절하기 위해 상위 전달 경로에 집중됨에 따라, 펩타이트 붕소 산(Peptide boronic acid) 또는 디펩티딜 붕산염으로 이루어진 세린 프로테아제(serine protease) 저해제인 PS-262, PS-273, PS-341, PS-402 등이 개발되었고, 이중 가장 효과적인 PS-341 (Bortezomib or Velcade)은 다발성 골수종(multiple myeloma) 뿐만 아니라 다른 혈액암이나 고형암에 대해 상당한 효능을 나타내었다.

특히, 그 중 Bortezomib은 골수종 세포와 같이 많은 in vitro 시스템에서 NF-κB를 효과적으로 억제했다. 그러나 항골수종 효과가 NF-κB를 단일 표적으로 하여 완전히 억제되어 나타나는 것인지, 부분적인 억제로 인해 나타나는 것인지는 명확히 밝혀지지 않았다. 또한, Bortezomib은 암세포의 성장과 관련해서는 NF-κB에 대한 효과가 없었으나 Bortezomib이 가지는 프로테아좀 저해 특성으로 인해 NF-κB가 아닌 다른 암 관련 단백질에 영향을 미치는 것으로 알려졌다.

이상적인 NF-κB 저해제는 다른 신호전달 경로에 대해 어떠한 영향도 미치지 않고 NF-κB 활성을 억제해야 한다. 또한, NF-κB의 활성은 내재 면역과 획득 면역에 있어서 중요하기 때문에 장기간 지속되는 NF-κB 저해는 생체에 해로울 수 있다. 그러므로 NF-κB 저해제를 약물로 복용할 시에는 장기간 면역 억제를 피하기 위해 일시적이고 가역적으로 NF-κB 저해 효과를 나타낼 수 있는 NF-κB 저해제에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 염증 반응을 촉발시키는 사이토카인 중 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)는 주로 단구 및 대식 세포에 의해 생성되는데, 암세포를 죽이거나 암세포의 성장을 저해하고, 호중구성 백혈구의 식균작용을 강화하며, 과산화물의 생산을 상승조절하고, 감염 병원체를 죽이는 등의 다양한 역할을 한다.

그러나 이러한 사이토카인이 불필요하게 활성화되거나 과도하게 활성화되는 경우, 여러 가지 질환을 일으킬 수 있는 바, TNF-α가 관여하는 염증성 질환으로서는, 빈혈, 베쳇(Bechet)병, 강직성 척추염, 기관지 천식, 만성 기관지염, 만성 세기관지염, 특발성 폐섬유증, 크론병-관련 질환, 류마티스 관절염, 류마티스성 다발성근육통, 건선, 건선성 관절병증, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 복막염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 라이터 증후군, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 후-감염성 관절염, 결절성 다발동맥염, 루게닉 육아종증, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 비후성 골관절병증, 다중심성 세망 조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마 글로불린혈증, 가족성 지중해열, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)등이 있다(Ogata H, Hibi T. et al., Curr Pharm Des. 2003;9(14):1107-13; Taylor PC. et al., Curr Pharm Des. 2003;9(14):1095-106; Weinberg JM et al., Cutis. 2003 Jan:71(1) 41-5; Barnes PJ. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2002;42:81-98; Mageed RA et al.,Lupous.2002;11(12):850-5; Girolomoni G et al., Curr Opin Investig Drugs. 2002 Nov; 3(11):1590-5; Tutuncu Z et al., Clin Exp Rheumatol. 2002 Nov-Dec;; 20(6 Suppl 28):S146-51; Braun J et al., Best Pract Res Clin Rheumatol. 2002 Sep; 16(4):631-51; Barnes PJ. et al., Novartis Found Symp. 2001; 234:255-67; discussion 267-72; Brady M. et al.,Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 1999 Jul; 13(2):265-89; Mariette X. Rev Prat. 2003 Mar 1; 53(5):507-11.).

따라서 상기 TNF-α는 염증성 질환을 치료하기 위한 잠재적인 표적이 되는 바, 그 활성 내지 발현을 억제하여 불필요한 염증 반응 및 이에 의해 야기되는 질병들을 치료할 수 있는 치료제의 개발이 시급하다.

1. 일본공개특허 제2010-530431호 2. 한국공개특허 제10-2007-0049103호

본 발명의 목적은 안질환, 감염성 질환 및 염증성 질환과 같은 많은 질병의 원인이 되는 유도성 전사 인자 분자 핵 인자 카파 B(Nuclear factor kappa B, NF-κB)의 활성을 억제하기 위한 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체를 유효성분으로 함유하는 NF-κB 조절용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

A는 벤젠, 나프탈렌 또는 안트라센에서 선택되며, R은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시, 할로겐, 트리플루오로메틸 또는 페닐에서 선택됨.

또한, 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 조절용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

본 발명에 따른 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체는 염증 환경에서 분자 핵 인자 카파 B(Nuclear factor kappa B, NF-κB)의 유전자 발현 및 활성을 억제함으로써 염증성 사이토카인 전구물질인 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 및 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 생성을 억제하거나 NO 생산을 저해시키는 효과를 나타내므로, 본 발명의 신규한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 NF-κB 조절제로서, 안질환, 염증성 질환 및 감염성 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 하나의 실시예에서 합성한 이미다조티아졸 유도체 화합물 2a 내지 2m, 3 및 4의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 화합물의 생물학적 활성을 확인한 결과로, 도 2A는 LPS로 자극된 RAW 264.7에 화합물 2a, 2b, 2d, 2f 및 2g를 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하여 NO 생산량을 확인한 결과이며, 도 2B는 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성 수준을 확인한 결과이며, 도 2C는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 화합물 2a, 2b, 2d, 2f 및 2g의 세포독성을 확인한 MTT 결과로, 도 3A는 LPS로 자극된 RAW 264.7에 화합물 2a, 2b, 2d, 2f 및 2g를 10 μM 및 20 μM 농도로 24시간 처리하고 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3B는 LPS가 처리되지 않은 RAW 264.7 세포에 화합물 2a, 2b, 2d, 2f 및 2g를 10 μM 및 20 μM 농도로 24시간 처리하고 세포독성을 확인한 결과이다.
도 4는 화합물의 NO 생산 저해 효과를 확인한 결과로, 도 4A는 LPS로 자극된 RAW 264.7에 화합물 2c, 2e, 2l 및 2m을 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 NO 생산 저해 효과를 확인한 결과이며, 도 4B는 화합물 2h-k, 3 및 4를 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 NO 생산 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 화합물의 염증성 사이토카인 IL-6 생산 억제 효과를 확인한 결과로, 도 5A는 LPS로 자극된 RAW 264.7에 화합물 2c, 2e, 2l 및 2m을 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 IL-6 생산 억제 효과를 확인한 결과이며, 도 5B는 화합물 2h-k, 3 및 4를 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 IL-6 생산 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 화합물의 염증성 사이토카인 TNF-α 생산 억제 효과를 확인한 결과로, 도 6A는 LPS로 자극된 RAW 264.7에 화합물 2c, 2e, 2l 및 2m을 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 TNF-α 생산 억제 효과를 확인한 결과이며, 도 6B는 화합물 2h-k, 3 및 4를 10 μM 및 20 μM 농도로 처리하고 TNF-α 생산 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 화합물 2c, 2e, 2h-m, 3 및 4의 세포독성을 확인한 MTT 결과로, 도 7A는 LPS가 처리되지 않은 RAW 264.7에 화합물 2c, 2e, 2l, 2m을 10 μM 및 20 μM 농도로 24시간 처리하고 세포독성을 확인한 결과이며, 도 7B는 LPS가 처리되지 않은 RAW 264.7 세포에 화합물 2h-k, 3 및 4를 10 μM 및 20 μM 농도로 24시간 처리하고 세포독성을 확인한 결과이다.
도 8은 화합물 2f, 2i, 2k, 2l 및 2m의 NF-κB 핵 내 이동 억제 효과를 확인한 면역염색 결과이다.
도 9는 화합물 2a 내지 2m, 3 및 4의 NF-κB 유전자 발현 억제 효과를 확인한 루시퍼라아제 어세이(Luciferase assay)의 결과이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

구체적으로, 상기 이미다조티아졸 유도체는, 화학식 1에서 A가 벤젠, 나프탈렌이며, R은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 또는 할로겐일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 이미다조티아졸 유도체는 2-(4-플루오로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Fluoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-클로로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Chloro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-브로모)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Bromo)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-메톡시)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Methoxy)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-트리플루오로메틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Trifluoromethyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-메틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Methyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-에틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Ethyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-털트-부틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Tert-butyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(4-페닐)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Phenyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(3-나프틸)5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Naphthyl)5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(3-메톡시)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Methoxy)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole) 및 2-(3-플루오로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Fluoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

이러한 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 화합물은 NF-κB의 활성 내지 유전자 발현을 조절함으로써, 염증 반응에 영향을 미치는 다양한 사이토카인의 양을 조절할 수 있으므로, 상기 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 NF-κB 조절용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 조절용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 약학 조성물은, NF-κB를 조절함으로써 영향을 미칠 수 있는 질환이라면 제한되지 않으나, 예를 들어, 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis pigmentosa), 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration), 녹내장, 각막 이영양증(corneal dystrophy), 망막층간분리(retinoschises), 스타가르트병(Stargardt's disease), 상염색체 우성 드루젠(autosomal dominant druzen), 베스트의 황반 이영양증(Best's macular dystrophy), 낭포황반부종(cystoid macular edema), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 염증-유도 망막 퇴행성 질환(inflammation-induced retinal degenerative disease), X 염색체-관련 연소기 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis), 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese; ML), 도인 벌집 모양 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy) 및 안구 혈관 내피 세포 관련 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 예로, 상기 약학 조성물은 감염성 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 농양, 패혈증, 패혈성 쇼크, 결핵, 세균성 폐렴, 간염, 급성 기관지염, 급성 후두염, 세균성 부비강염, 세균성 질염, 세균성 장염, 세균성 대장염, 식중독, 세균성 요로 감염, 중증 열성 혈소판 감소 증후군, 말라리아, 일본뇌염, 감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 반응성 관절병증, 뇌막염, 봉와직염, 골수염, 급성 세기관지염, 라임병, 과민성 혈관염, 감염성 점액낭염, 감염성 건초염, 헤노흐-쉔라인 자반병 및 재귀열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 약학 조성물은 TNF-α 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 빈혈, 베쳇(Bechet)병, 강직성 척추염, 기관지 천식, 만성 기관지염, 만성 세기관지염, 특발성 폐섬유증, 크론병-관련 질환, 류마티스 관절염, 류마티스성 다발성근육통, 건선, 건선성 관절병증, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 복막염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 라이터 증후군, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 후-감염성 관절염, 결절성 다발동맥염, 루게닉 육아종증, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 비후성 골관절병증, 다중심성 세망 조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마 글로불린혈증, 가족성 지중해열, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이때, 상기 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 약학 조성물 총 100 중량부에 대하여, 0.1 내지 50 중량부로 포함될 수 있는 바, 0.1 중량부 미만으로 포함될 경우에는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료 효과가 제대로 나타나지 않고, 50 중량부를 초과하여 포함될 경우에는 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량 증가량 대비 치료 효과가 현저히 감소하므로 바람직하지 않다.

상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 겔제, 유제, 주사제, 산제, 과립제, 에어로솔제, 페이스트제, 경피흡수제 및 패치제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형으로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<참고예> 물질 및 기구

실험에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich, T.C.I, Alfa Aesar에서 구입하였고 더 이상의 정제는 하지 않았다. 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography; TLC)는 silica gel(Kiesegel 60 F₂₅₄, Merck)을 사용하였고 칼럼 크로마토그래피는 silica gel(ZEOprep 60, 40-63 μM)을 사용하였다. ¹H NMR(Nuclear Magnetic Resonance) 스펙트럼(spectra)은 Gemini 2000(300 MHz, Varian)와 VNS(600 MHz, Varian)를, ¹³C NMR은 VNS(600 MHz, Varian)를 이용하여 측정하였다. 테트라메틸실란(Tetramethylsilane, TMS)를 내부 표준물질로 사용하였으며 화학 이동(chemical shift)은 ppm(part per million), 결합 상수(coupling constant)는 Hz(Herts)를 단위로 하여 나타냈다. 마이크로파 반응기(Microwave reactor)는 Anton Paar Monowave 300을 사용하였다.

<합성예 1> 이미다조티아졸 유도체 합성

도 1에 도시된 이미다조티아졸 유도체들을 제조하기 위해, 하기와 같은 반응식들을 이용하여 합성을 진행하였다.

[반응식 1]

1. 4,5,6,7- 테트라하이드로벤조[d]티아졸 -2- 아민 (4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine; 1) 합성

사이클로헥사논(Cyclohexanone) 1.04 ml(10 mmol)에 티오유레아(Thiourea) 1.52 g(20 mmol)과 아이오딘(Iodine) 2538 mg(10 mmol)을 넣고 100℃에서 6시간 교반했다. 6시간 후 잔사에 뜨거운 물을 넣고 추가로 30분간 교반하였다. 잔사를 NaHCO₃(aq)로 중화하고 디에틸에터(Diethyl ether)로 추출했다. 추출한 유기층을 브라인(brine)으로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조하였다. 여액을 감압 농축하여 얻은 잔사를 칼럼 크로마토그래피(EtOAc only)하여 화합물 1(1.23 g, 80 %)을 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 4.96 (s, 2H), 2.51-2.56 (m, 4H), 1.78-1.80 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 164.92, 145.41, 118.17, 26.53, 23.52, 23.14, 22.94.

2. 2-(4- 플루오로 )페닐-5,6,7,8- 테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Fluoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2a) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 46.3 mg(0.3 mmol)과 2-브로모-4'-플루오로아세토페논(2-Bromo-4'-fluoroacetophenone) 65.1 mg(0.3 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기(microwave reactor)에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:5)하여 화합물 2a(26.8 mg, 33 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.75-7.78 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.04-7.08 (m, 2H), 2.61-2.69 (m, 4H), 1.90-1.98 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 162.86, 161.24, 148.22, 145.49, 130.70, 130.68, 126.57, 126.51, 125.71, 121.67, 115.49, 115.35, 105.20, 105.19, 105.19, 24.27, 23.10, 22.62, 21.65.

3. 2-(4-클로로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Chloro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2b) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine, 46.2 mg, 0.3 mmol)과 2-브로모-4'-플루오로아세토페논(2-Bromo-4'-chloroacetophenone, 70 mg, 0.3 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기(microwave reactor)에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:5)를 수행하여 화합물 2b(18.9 mg, 22 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.72-7.74 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.32-7.34 (m, 2H), 2.61-2.69 (m, 4H), 1.90-1.98 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.36, 145.24, 133.00, 132.50, 128.70, 126.16, 125.69, 121.91, 105.65, 105.64, 24.28, 23.09, 22.961, 21.64.

4. 2-(4-브로모)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Bromo)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2c) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 30 mg(0.19 mmol)과 2,4'-디브로모아세토페논(2, 4'-Dibromoacetophenone) 53 mg(0.19 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:5)하여 화합물 2c(14 mg, 22 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.68-7.70 (m, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.48-7.51 (m, 2H), 2.63-2.71 (m, 4H), 1.92-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.41, 145.30, 133.45, 131.66, 126.51, 125.68, 121.98, 120.65, 105.69, 105.66, 24.30, 23.10, 22.64, 21.66.

5. 2-(4-메톡시)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Methoxy)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2d) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 46.3 mg (0.3 mmol)과 2-브로모-4'-메톡시아세토페논(2-Bromo-4'-methoxyacetophenone) 68.7 mg(0.3 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc:Hex=1:5)하여 화합물 2d(19.8 mg, 23 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.72-7.75 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 6.91-6.93 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.61-2.69 (m, 4H), 1.89-1.97 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 158.85, 147.99, 146.29, 127.35, 126.23, 125.74, 121.26, 114.02, 104.58, 104.57, 24.28, 23.15, 22.66, 21.70.

6. 2-(4-트리플루오로메틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Trifluoromethyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2e) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 30 mg (0.19 mmol)과 2-브로모-4'-트리플루오로메틸아세토페논(2-Bromo-4'-trifluoromethylacetophenone) 50 mg(0.19 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2e(15 mg, 24 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 2.65-2.71 (m, 4H), 1.92-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.70, 144.90, 137.88, 129.02, 128.80, 128.59, 128.37, 125.69, 125.58, 125.55, 125.23, 124.95, 123.43, 122.38, 106.56, 106.54, 24.31, 23.07, 22.62, 21.63.

7. 2-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2f) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 46.3 mg(0.3 mmol)과 2-브로모아세토페논(2-Bromoacetophenone) 60 mg(0.3 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2f(23.6 mg, 31 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.81-7.83 (m, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.24-7.26 (m, 1H), 2.62-2.69 (m, 4H), 1.90-1.98 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.19, 146.36, 134.45, 128.58, 126.99, 125.71, 124.97, 121.62, 105.51, 105.49, 24.29, 23.12, 22.64, 21.67.

8. 2-(4-메틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Methyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2g) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 46.3 mg(0.3 mmol)과 2-브로모-4'-메틸아세토페논(2-Bromo-4'-methylacetophenone) 64 mg(0.3 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2g(22.3 mg, 28 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.70-7.72 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 2.61-2.68 (m, 4H), 2.36 (s, 3H), 1.89-1.97 (4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.03, 146.46, 136.67, 131.66, 129.27, 125.71, 124.88, 121.41, 105.10, 105.08, 24.28, 23.13, 22.64, 21.69.

9. 2-(4-에틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Ethyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2h) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 40 mg(0.26 mmol)과 2-브로모-4'-에틸아세토페논(2-Bromo-4'-ethylacetophenone) 59 mg(0.26 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:6)하여 화합물 2h(10 mg, 14 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.73-7.75 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.21-7.26 (m, 2H), 2.64-2.71 (m, 6H), 1.91-2.00 (m, 4H), 1.26 (t, J = 7.6 Hz, 3H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 164.09, 162.47, 148.41, 145.28, 136.80, 136.75, 130.08, 130.03, 125.70, 122.10, 120.52, 113.79, 113.65, 111.94, 111.78, 106.05, 106.02, 24.33, 23.13, 22.66, 21.68.

10. 2-(4-털트-부틸)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Tert-butyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2i) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 50 mg(0.32 mmol)과 2-브로모-4'-터트-뷰틸-아세토페논(2-Bromo-4'-tert-butyl-acetophenone) 83 mg(0.32 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2i(13 mg, 13 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.74-7.76 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.40-7.42 (m, 2H), 2.64-7.40 (m, 4H), 1.92-1.98 (m, 4H), 1.34 (s, 9H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 150.04, 148.04, 146.39, 131.58, 125.73, 125.52, 124.74, 121.53, 105.17, 105.16, 34.57, 31.35, 29.71, 24.31, 23.16, 22.69, 21.72.

11. 2-(4-페닐)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(4-Phenyl)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2j) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 40 mg(0.26 mmol)과 2-브로모-'-페닐아세토페논(2-Bromo-4'-phenylacetophenone) 45.5 mg(0.26 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2j(17.2 mg, 20 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.88-7.90 (m, 2H), 7.62-7.65 (m, 4H), 7.57 (s, 1H), 7.42-7.45 (m, 2H), 7.32-7.35 (m, 1H), 2.65-2.71 (m, 4H), 1.91-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.31, 146.05, 140.87, 139.69, 133.50, 128.72, 127.28, 127.12, 126.88, 125.72, 125.33, 121.72, 105.61, 105.58, 24.31, 23.13, 22.67, 21.69.

12. 2-(3-나프틸)5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Naphthyl)5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2k) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 40 mg(0.26 mmol)과 2-브로모-2'-아세토나프톤(2-Bromo-2'-acetonaphthone) 65 mg(0.26 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2k(14 mg, 18 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 8.36 (s, 1H), 7.80-7.89 (m, 4H), 7.65 (s, 1H), 7.41-7.47 (m, 2H), 2.66-2.71 (m, 4H), 1.92-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.48, 146.35, 133.81, 132.73, 131.75, 128.13, 128.12, 127.62, 126.14, 125.74,125.47, 123.55, 123.26, 121.76, 105.98, 24.31, 23.13, 22.66, 21.69.

13. 2-(3-메톡시)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Methoxy)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2l) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 30 mg(0.19 mmol)과 2-브로모-3'-메톡시아세토페논(2-Bromo-3'-methoxyacetophenone) 45 mg(0.19 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2l(6 mg, 11 %)을 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.54 (s, 1H), 7.43 (dd, J = 2.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.37-7.38 (m, 1H), 7.28 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.81-6.83 (m, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.65-2.71 (m, 4H), 1.92-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 159.98, 148.14, 146.28, 135.88, 129.55, 125.59, 121.72, 117.41, 113.36, 109.89, 105.76, 55.31, 24.30, 23.13, 22.65, 21.68.

14. 2-(3-플루오로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Fluoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole; 2m) 합성

4,5,6,7-테트라하이드로벤조[d]티아졸-2-아민(4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[d]thiazol-2-amine) 30 mg(0.19 mmol)과 2-브로모-3'-플루오로아세토페논(2-Bromo-3'-fluoroacetophenone) 41 mg(0.19 mmol)을 에탄올 2 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 2m(15 mg, 29 %)을 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.58-7.59 (m, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.52-7.54 (m, 1H), 7.31-7.35 (m, 1H), 6.92-6.95 (m, 1H), 2.64-2.71 (m, 4H), 1.92-2.00 (m, 4H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 164.07, 162.45, 148.38, 145.25, 136.78, 136.72, 130.06, 130.00, 125.67, 122.07, 120.50, 113.77, 113.62, 111.91, 111.76, 106.02, 106.00, 29.69, 24.31, 23.10, 22.64, 21.66.

<합성예 2> 2-페닐이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-Phenylimidazo[2,1-b]benzothiazole; 화합물 3) 합성

[반응식 2]

2-아미노벤조티아졸(2-Aminobenzothiazole) 30 mg(0.2 mmol)과 2-브로모아세토페논(2-Bromoacetophenone) 40 mg(0.2 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:4)하여 화합물 3(20 mg, 40 %)을 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.97 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 8.3 Hz, 1.1 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.41-7.47 (m, 3H), 7.29-7.36 (m, 2H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 148.11, 147.73, 133.84, 132.19, 130.33, 128.72, 127.52, 126.18, 125.20, 124.86, 124.41.

<합성예 3> 6-페닐이미다조[2,1-b]티아졸 (6-Phenylimidazo[2,1-b]thiazole; 화합물 4) 합성

[반응식 3]

2-아미노티아졸(2-Aminothiazole) 50 mg(0.5 mmol)과 2-브로모아세토페논(2-Bromoacetophenone) 99 mg(0.5 mmol)을 에탄올 3 ml에 녹이고 마이크로파 반응기에서 150℃에서 20분 교반하였다. 잔사를 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:3)하여 화합물 4(17 mg, 17 %)를 얻었다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃): δ 7.82-7.83 (m, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.39-7.42 (m, 3H), 7.28 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 4.4 Hz, 1H); ¹³C NMR (600MHz, CDCl₃): δ 150.18, 147.92, 134.10, 128.65, 127.37, 125.20, 118.44, 112.42, 107.89.

<실시예 1> 세포배양

RAW 264.7(a murine macrophage-like cell line) 세포는 10% 태아우혈청(fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 포함한 DMED(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다.

<실시예 2> NO 생산량 저해 효과에 대한 이미다조티아졸(Imidazothiazole) 유도체의 활성 확인

산화질소(Nitric oxide, NOs)는 NF-κB의 활성을 평가하는 중요한 지표로써 인식된다. NO를 생산하는 일산화질소 합성효소(Nitric oxide synthase, NOS)의 3개의 이형체(isoform) 중 유도성 이형체(inducible isoform) 인 NOS II(iNOS)는 주로 전사 단계에서 조절된다. iNOS의 발현은 LPS와 염증 유발 사이토카인(pro-inflamaatory cytokine, e.g. IL-1)에 의해 활성화되고, 이렇게 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성할 수 있다. iNOS의 생성을 유도하는 염증 유발 사이토카인의 발현은 NF-κB에 의해 조절되며, 대부분의 세포에서 NF-κB의 활성은 iNOS를 만들어 내기 위해 필수적인 것으로 알려져 있다. 그에 따라 iNOS에 의해 유도된 NO의 생산량은 염증의 정도와 염증 과정을 평가하기 위한 지표로 인식된다.

따라서 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 이미다조티아졸 골격을 갖는 15종의 화합물의 NO 생산 저해 효과를 확인하였다. 구체적으로, RAW 264.7 세포는 24-웰 플레이트에 2 × 10⁵ cells/well로 분주하였고 LPS (0.1 μM/ml)를 전 처리한 뒤 화합물을 10 μM과 20 μM 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 일산화질소(Nitric oxide, NO) 양의 지표로 사용되는 아질산염(nitrite, NO₂ ^-)의 양은 그리스 반응(Griess reaction)을 이용하여 배양 배지 상에서 측정하였다. 즉, 아질산염의 양을 측정하기 위하여, 세포배양액 100 μl를 동량의 그리스 시약(Griess reagent[5% (v/v) 인산(phosphoric acid) 및 0.1% 나프틸에틸렌디아민-HCl (naphtylethylenediamine-HCl)에서의 1% (w/v) 설파닐아마이드(sulfanilamide)와 동일한 부피])와 혼합하여 실온에서 10분간 배양하였고, 흡광도는 마이크로플레이트 리더기(Victor2, PerkinElmer, Turku, Finland)를 사용하여 540nm 파장에서 측정하였다. 모든 실험에서 세포 배양용 배지가 음성 대조군으로 사용되었고 시료의 아질산 양은 아질산나트륨(sodium nitrite) 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 도 2A 및 도 4와 같이 화합물 3 및 화합물 4를 제외한 융합된 카보사이클(Fused carbocycle)을 갖는 모든 화합물이 농도 의존적으로 NO 생산량 감소를 나타내었으며, 특히 화합물 2f 및 2g가 가장 뛰어난 감소 효과를 나타내었다.

< 실시예 3> 사이토카인 생산량 저해효과에 대한 이미다조티아졸 (Imidazothiazole) 유도체의 활성 확인

대식세포에 의해 방출되는 염증 유발 사이토카인은 염증 반응의 개시와 유지에 있어서 중요한 역할을 하므로, ELISA를 통해 염증 자극이 있을 때 15종의 화합물이 TNF-α, IL-6과 같은 염증 유발 사이토카인의 생성 저해 효과를 갖는지 조사하였다. 구체적으로, 죽은 RAW 264.7 세포와 세포 잔해들을 제거하기 위하여 배양된 세포의 상층액을 모아 4℃, 1500 rpm에서 15분간 원심분리를 행하였다. 원심분리 후, 상층액은 ―80℃에서 저장되었다. 상층액에 IL-6과 TNF-α에 대한 ELISA는 제조사의 실험 방법에 따라 각각 마우스 IL-6 ELISA kit (R&D systems)과 마우스 TNF-α ELISA kit (R&D systems)을 사용하여 3번 반복 실험하였다. IL-6 또는 TNF-α 생산량의 OD 값은 ELISA reader를 사용하여 450nm 파장에서 측정되었다.

그 결과, 도 2B 및 도 5와 같이 염증 환경에서 화합물 2i와 2k를 처리했을 때 IL-6 방출량이 가장 크게 감소하였고, 가장 적은 감소량을 보인 화합물 2a와 비교했을 때 약 8배 강한 활성을 나타내었다. 또한, 화합물 3 및 4도 부분적인 저해 효과를 나타내었다.

한편, TNF-α에 대해서는 도 2C 및 도 6과 같이 2b, 2e, 2j를 제외한 화합물들이 농도 의존적으로 억제 활성을 나타내었으며, 특히, 2l 및 2m이 가장 강한 억제 활성을 나타내었다.

<실시예 4> 구조활성 관계 (Structure Activity Relationship; SAR)

6 원자 카보사이클(6-membered carbocycle)이 가지는 효과를 비교하고자 융합된 카보사이클(fused carbocycle)을 방향족 고리(aromatic ring)로 교체하거나 제거한 화합물 3 및 화합물 4를, 상기 실시예 2의 어세이 결과를 토대로 화합물 2f와 비교하였다.

그 결과, NO 생산량에 대해 카보사이클을 가지는 화합물 2f는 뚜렷한 생산 감소 효과를 보였으나 카보사이클이 교체된 화합물 3과 제거된 화합물 4는 NO 생산 감소 효과를 보이지 않았다. 즉, 이미다조티아졸(Imidazothiazole)의 융합된 카보사이클은 항염증 효과를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.

또한, 2'-페닐 고리에서 치환기 위치에 대한 효과를 조사하기 위해 각각 R₁, R₂에 -F를 가진 화합물 2a와 2m 및 -OCH₃을 가진 화합물 2d와 2l을 비교하였다. IL-6의 방출 억제 효과에서, 메타 위치에 도입된 치환기가 파라 위치에 도입된 치환기보다 약 4배 강한 효과를 보였고 TNF-α의 방출 억제 효과에서도 파라 위치 보다 메타 위치가 더 우수한 효능을 나타냄에 따라, 2'-페닐 고리에서는 메타 위치의 치환기 도입이 항염증 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 한편 다른 전자 효과를 갖고 있는 치환기인 -F와 -OCH₃가 도입된 화합물 2m과 2l를 비교해봤을 때, 치환기가 갖는 전자 효과는 항염증 효과에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

<실시예 5> NF-κB의 핵 내 이동 억제 효과 확인

LPS 자극은 NF-κB를 인산화시키고 활성화된 NF-κB는 세포질에서 핵으로 이동한다. 15종의 화합물 중 앞선 실시예에서 우수한 항염증 효과를 나타낸 화합물 2f, 2i, 2k, 2l 및 2m을 선정하고 이들의 NF-κB 억제효과를 관찰하기 위하여 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포에서 화합물 2f, 2i, 2k, 2l 및 2m을 각각 처리했을 때 NF-κB의 핵 내 이동에 대한 저해 효과를 면역형광염색(Immunostaining)법으로 확인하였다. 구체적으로, RAW 264.7 세포를 2 × 10⁴ cells/ml 세포농도로 챔버 슬라이드(chamber slide; Thermofisher, Rochester, NY, USA)에 분주하였다. 화합물을 30 μM로 처리하거나 처리하지 않고 2시간 동안 전 배양한 후, 세포들을 1시간 동안 LPS(1 μM/ml)로 자극하였다. 이후 10분간 차가운 아세톤과 혼합시키고 60분간 1% BSA로 차단하였다. 세포들과 토끼 항-p65 NF-κB 항체(Cell signaling Technology Inc. Danvers, MA, diluted 1:100)를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰고, Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG 항체(Invitrogen, diluted 1:100)로 실온의 암조건에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS로 3번 세척한 다음, Hoechst dye로 1분 간 염색시켰다. Antifade reagent(Invitrogen)으로 봉입(mounting)한 후 형광 광학 현미경(fluorescent light microscope; Nikon, Tokyo, Japan)에 DS-R1 디지털 카메라(Nikon)를 연결하여 촬영하였다.

그 결과, 도 8과 같이 치환기가 최소화된 2f와 메타-플루오르(m-F)를 갖는 화합물 2m, 그리고 나프틸(naphthyl)기가 도입된 화합물 2k가 핵으로의 이동을 가장 강하게 억제하였다. 2'-페닐 고리에 치환기를 도입할 경우, 전자를 끌어당기는 효과를 가진 치환기를 메타 위치에 도입할 때 핵 내 이동을 잘 억제하는 것으로 보이며 또한 2'-페닐 고리 대신 사이즈가 더 커진 2'-나프틸을 도입했을 때 우수한 억제 효과를 나타내었다.

<실시예 6> NF-κB 유전자 발현 측정

상기 제조예에서 합성한 이미다조티아졸 유도체들의 NF-κB 유전자 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해, 루시퍼라아제(Luciferase)를 이용하여 NK-κB 리포터 어세이(Reporter assay)를 진행하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 2 × 10⁵cell/well이 되도록 분주한 후, 세포가 웰 플레이트의 80%~90%를 채울 정도로 증식한 후에, 다음과 같은 단계로 형질주입을 수행하였다: 파이어플라이 루시퍼라아제(Firefly luciferase) 및 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)가 포함된 DNA를 웰 당 4 ug/750 ul가 되도록 Opti-MEM 배지에 희석시킨 후 상온에서 5분 동안 혼합 및 인큐베이팅하였다. 이때, 파이어플라이 루시퍼라아제의 기질 및 Stop & Glo 시약을 넣고 파이어플라이 루시퍼라아제와 레닐라 루시퍼라아제의 발광량을 측정하였더니 파이어플라이 발광량:레닐라 발광량의 값이 10:1 이었다.

형질 주입용 시약인 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 웰 당 15 uL/750 ul가 되도록 Optu-MEM 배지에 희석시킨 후, 잘 혼합하여 상온에서 5 분간 인큐베이팅하였다. 상기와 같이 준비된 희석 DNA 용액 및 리포펙타민 용액을 섞고 다시 25분 간 상온에서 인큐베이팅하였다. 이후, 웰 플레이트의 RAW 264.7 세포에 DNA 및 리포펙타민 용액을 넣은 후 37℃에서 6시간동안 배양하였다.

6시간 배양 후, 배양 배지에서 배지를 제거하고, 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 0.5 mL를 처리한 후 37℃에서 1~2분 간 반응시켜 세포를 분리하였다. 이후 3 mL의 배지액(둘베코수정이글배지( DMEM), 10% 태아우혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신)을 첨가하여 플레이트에서 분리된 세포를 배지액에 모았다. 상기 세포가 포함된 배지액을 125 g에서 5분 간 원심 분리하여 세포를 침전 시켜 세포를 획득하고, 이렇게 획득한 세포를 다시 20,000 cell/well이 되도록 분주한 후, CO₂ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간이 지나고 세포를 무혈청배지로 옮겨 6시간 동안 다시 배양하였다.

이후, 상기 제조예에서 합성한 이미다조티아졸 유도체들을 각 세포에 10 ug을 각각 넣은 후 60분 간 배양하였고, 그 다음 TNF-6을 25 ng/ml만큼 처리하여 6시간 동안 반응시켜 세포의 염증 반응을 유도하였다.

마지막으로 염증 반응이 유도된 세포를 회수하여, Dual glo 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 진행하였다. 구체적으로, 파이어플라이 루시퍼라아제의 기질을 투입하여 파이어플라이 루시퍼라아제의 발광량을 측정하고, Stop & Glo 시약을 넣어 레닐라 루시퍼라아제의 발광량을 측정하여, Firefly/Renilla ratio를 계산하였다. 대조군은 아무 물질도 처리하지 않거나, DMSO 또는 BMS 345541을 처리하였다. 그 결과가 도 9에 도시되어 있다.

도 9를 참조하면, 대조군(DMSO, BMS 345541)에 비해, 화합물 2e, 4의 Firefly:Renilla ratio가 높았고, 반대로 화합물 2m 및 2k의 Firefly:Renilla ratio가 현저히 낮게 나타났다.

<실시예 7> 세포 생존도 확인을 위한 MTT 분석

상기 이미다조티아졸 유도체의 세포 독성을 알아보기 위하여, 먼저 24-웰 플레이트에, 2 × 10⁵cell/well/500μl만큼 존재하는 RAW 264.7 세포를 LPS 0.1 μg/ml 존재 하 또는 비존재 하에서 화합물 10 μM과 20 μM의 두 가지 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

배양된 웰(well)에 MTT(methylthiazoletetrazolium, 50 μg/ml)을 처리하여 1시간 동안 배양한 뒤 포르마잔(Formazan) 생성물을 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)로 용해시켰다. 흡광도(Optical density; OD)는 마이크로플레이트 리더기(microplate reader; Victor2, PerkinElmer, Turku, Finland)를 사용하여 570nm 파장에서 측정되었다. 대조군(Control; medium alone) 세포에서 생성된 포르마잔의 OD는 100%의 생존능(viability)으로 간주하였다.

그 결과, 도 3 및 도 7에 나타난 바와 같이, 화합물 2j를 제외한 모든 이미다조티아졸 유도체들은 세포 독성을 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 이미다조티아졸 유도체들은 세포 독성이 적으면서도 높은 항염 활성을 나타낼 수 있는 약학 조성물로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업의 통의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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2-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸(2-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(3-나프틸)5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸(2-(3-Naphthyl)5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole) 및 2-(3-플루오로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸(2-(3-Fluoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 이미다조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 인 비트로(in vitro)에서 NF-κB의 발현 또는 활성을 억제하는 시약 조성물.
2-페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸(2-Phenyl-5,6,7,8-tetrah ydroimidazo[2,1-b]benzothiazole), 2-(3-나프틸)5,6,7,8-테트라하이드로 이미다조[2,1-b]벤조티아졸 (2-(3-Naphthyl)5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole) 및 2-(3-플루오로)페닐-5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[2,1-b]벤조티아졸(2-(3-Fl uoro)phenyl-5,6,7,8-tetrahydroimidazo[2,1-b]benzothiazole) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 상기 조성물은 NF-κB의 발현 또는 활성을 억제하고, 상기 안질환은 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis pigmentosa), 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration), 녹내장, 각막 이영양증(corneal dystrophy), 망막층간분리(retinoschises), 스타가르트병(Stargardt's disease), 상 염색체 우성 드루젠(autosomal dominant druzen), 베스트의 황반 이영양증(Best's macular dystrophy), 낭포 황반부종(cystoid macular edema), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), X 염색체-관련 연소기 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis), 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese; ML) 및 도인 벌집 모양 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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