KR101817017B1

KR101817017B1 - 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법

Info

Publication number: KR101817017B1
Application number: KR1020160130749A
Authority: KR
Inventors: 정신교; 김보민; 손은지
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2016-10-10
Publication date: 2018-01-09

Abstract

본 발명은 영지버섯으로부터 베타글루칸을 높은 수율 및 함량으로 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추출방법에 의해 추출된 베타글루칸 추출물은 기존의 물 추출법에 의해 추출된 것과 순도는 동일하면서도 추출 수율이 월등히 높고, 우수한 항암 활성을 가지는 것을 확인했다. 따라서 본 발명의 추출물은 항암 활성을 나타내는 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물 등으로 활용될 수 있다.

Description

영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법{Extracting method of beta-glucan from Ganoderma lucidum}

본 발명은 영지버섯으로부터 베타글루칸을 높은 수율 및 함량으로 추출하는 방법에 관한 것이다.

영지버섯(Ganoderma lucidum)은 분류학적으로 대부분 담자균과 자낭균류에 속하는 고등균류이며 풍미가 뛰어나고 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질, 비타민 및 미네랄 등이 풍부하고, polysaccharide, triterpene, polyphenol, nucleoside, steroid 등의 다양한 생리활성 물질도 함유하고 있어 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어왔다.

영지버섯으로부터 추출된 다당류는 항종양 면역, 항산화 그리고 혈당감소 등과 같은 활성이 보고되었다. 특히 영지버섯의 베타글루칸(β-glucan)은 정상 세포의 면역 기능을 활성화 시켜 암세포의 증식을 저해하는 비특이적 면역 반응효과를 지니고 있다.

베타글루칸은 곡물, 효모, 버섯, 그리고 일부 세균이나 해조류에 포함된 고분자 물질의 다당류이다. β(1→3)의 주결합에 β(1→6)의 곁가지를 갖는 구조의 특성을 보이며, 개체에 따라 가지구조의 패턴이 달라지고, 물이나 buffer에 잘 녹는 gum과 같은 수용성 베타글루칸과 헤미셀룰로오스(hemicellulose)와 같은 불용성 베타글루칸으로 분류되기도 하며 구조적 특성에 따라 효능이 다양하게 나타난다.

종래의 특허기술들에서는 표고버섯에 물을 첨가하여 열수추출하는 방법(특허번호 10-1470949) 및 표고버섯에 열수 및 초고압 추출을 순차적으로 병행하여 베타글루칸을 추출하는 방법(공개특허 10-2015-0135904) 등의 버섯류의 균사체 또는 자실체로부터 다당류를 추출하고자 하는 노력들이 많이 이루어져 왔으나 추출 수율이 높지 않은 실정이다. 영지버섯은 현재 열수추출되어서 음료 및 액상차 등으로 가공되어 유통되고 있으나, 그 유용성분인 베타글루칸 소재의 추출 및 가공에 관한 연구는 많지 않다. 따라서 본 발명자들은 열수추출의 전처리방법으로써 고압 수증기 및 효소전처리 방법을 이용하여 영지버섯의 베타글루칸을 고효율로 추출할 수 있는 새로운 기술을 개발하고자 노력한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0084812호 대한민국 공개특허 제10-2011-0090433호

본 발명의 목적은 영지버섯으로부터 높은 수율로 베타글루칸을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 영지버섯 분말에 증류수를 가한 뒤 고압 수증기를 처리하는 단계; 및 효소 전처리하는 단계를 포함하는 영지버섯으로부터 베타글루칸을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 영지버섯 분말에 증류수를 가한 뒤 고압 수증기를 처리하는 단계; 상기 고압 수증기 처리한 결과물의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계; 상기 pH를 3 내지 5로 조절한 결과물에 효소를 처리하는 효소 전처리 단계; 상기 효소 전처리 단계를 거친 결과물의 pH를 9 내지 11로 조절하는 단계; 및 상기 pH를 9 내지 11로 조절한 결과물에 열수를 가하여 열수 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 열수 추출이 끝난 추출물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 영지버섯 분말은 25mesh 이상으로 분쇄한 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증류수는 영지버섯 분말 중량의 약 20배 중량을 가하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 증류수를 10배 내지 15배를 가하게 되면 분말에 비해 증류수가 적어 추출물의 점도가 상승하여 추출액을 가공함에 있어 어려움이 있으며, 30배 내지 40배의 증류수를 가하게 되면 추출액의 농도가 낮아서 가공공정에 농축과정을 추가해야하는 문제가 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압 수증기는 110 ~ 130℃의 온도 및 0.10 ~ 0.20 MPa의 압력을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압 수증기 처리는 10 내지 20분간 수행되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 15 내지 16분간 처리되는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 탄수화물 분해효소이다. 상기 효소의 예로는, 셀루레이즈, 헤미셀룰레이즈, 베타-글루카네이즈, 알파-아밀레이즈, 글루코아밀레이즈, 비스코자임L, 울트라플로L 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 효소는 단독으로 또는 둘 이상의 효소의 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 0.50 내지 1.00%(v/v)의 농도를 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 0.75%(v/v)의 농도를 갖는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소 전처리 단계는 40 내지 60℃의 온도에서 6 내지 8시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 열수 추출은 80 내지 100℃의 열수로 4 내지 8시간 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출방법은 건조된 영지버섯 분말에 증류수를 가하고 고압 수증기를 처리하는 단계; 40~60℃의 온도에서 1N Citric acid를 이용하여 pH 3~5로 조정하는 단계; 0.50~1.00%(v/v)의 효소를 가한 후 130RPM으로 6~8시간 교반시키는 단계; 1N sodium hydroxide를 이용하여 상기 효소 처리물의 pH를 9~11로 조정하는 단계; 및 알칼리 조건에서 80~100℃에서 4~8시간 열수 추출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 추출방법에 의해 추출된 베타글루칸 추출물은 기존의 물 추출법에 의해 추출된 것과 순도는 동일하면서도 추출 수율이 월등히 높고, 우수한 항암 활성을 가지는 것을 확인했다. 따라서 본 발명의 추출물은 항암 활성을 나타내는 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물 등으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 영지버섯을 원료로 하여 영지버섯 효소 추출물의 제조방법을 개략적으로 도시한 공정도이다.
도 2는 고압 수증기처리와 효소농도에 따른 베타글루칸 함량의 반응표면분석결과이다.
도 3은 효소반응시간과 효소반응온도에 따른 베타글루칸 함량의 반응표면분석결과이다.
도 4는 B16F10 암세포에 대하여 농도에 따른 추출물의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 5는 SK-MEL5 암세포에 대하여 농도에 따른 추출물의 세포 독성을 나타낸 결과이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

<실시예 1>

본 발명의 고압수증기 및 효소 전처리 조건의 최적화

1. 실험재료

본 발명에서 사용된 영지버섯은 칠곡군 농가에서 재배, 수확, 건조된 영지버섯을 분쇄기를 이용하여 분쇄 후 25 mesh를 통과한 분말을 사용하였다.

2. 추출방법

영지버섯 분말에 20배 중량의 증류수를 첨가하고 아래 표 1의 조건에 따라 고압 수증기(110~130℃, 0.10~0.20MPa)를 처리하고 1N citric acid로 pH를 3~5로 조정하고 효소처리 하였다. 효소처리가 종료되면 1N sodium hydroxide로 pH를 9~11로 조정하고 열수추출(80~90℃, 4~8시간)하여 추출물을 제조하였다.

3. 전처리 조건 최적화를 위한 실험계획

전처리 최적화를 위한 실험계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면 회귀분석을 위하여 SAS(statistical analysis system) 프로그램을 사용하였다. 총 2 단계의 중심합성계획에서 첫 번째 단계는 고압 수증기 처리시간(0~20분, X₁)과 효소농도(0~1%, X₂)를 독립변수(X_n)로 하고 효소처리 시간 및 온도는 각각 6시간, 50℃로 하였다. 두 번째 단계는 확립된 고압 수증기 처리시간(15.69분)과 효소농도(0.81%)를 고정한 상태에서 효소반응시간(2~10시간, X₃)과 반응온도(30~70℃, X₄)를 독립변수(X_n)로 설정하였다. 각 조건은 -2, -1, 0, 1, 2로서 5단계로 부호화하여 중심합성계획에 따라 표 1과 같이 설정하고 10구로 전처리 최적화 실험을 하였다. 각 실험구는 효소반응이 종료되고 열수추출(80~100℃, 4~8시간)하여 추출물을 제조하였다.

추출조건		-2	-1	0	1	2
1단계 최적화	고압 수증기 처리시간 (분, X₁)	0	5	10	15	20
1단계 최적화	효소농도 (%, X₂)	0.00	0.25	0.5	0.75	1.00
2단계 최적화	반응시간 (시간, X₃)	2	4	6	8	10
2단계 최적화	반응온도 (℃, X₄)	30	40	50	60	70

전처리 최적화 실험의 추출물의 종속변수(Y_n)는 베타글루칸 함량(Y₁)으로 하였으며, 각 추출조건에 따른 추출물의 베타글루칸 함량을 측정하였다.

상기 각 실험조건들에 대한 결과들은 아래 표 2와 같다.

구분	1단계 최적화			2단계 최적화
구분	고압 수증기 처리시간 (분)	효소농도 (%)	베타글루칸 함량 (g/100 g)	효소반응시간 (시간)	효소반응온도 (℃)	베타글루칸 함량 (g/100 g)
1	15(1)	0.75(1)	7.3995	8(1)	60(1)	7.8721
2	15(1)	0.25(-1)	6.6572	8(1)	40(-1)	7.8247
3	5(-1)	0.75(1)	7.0297	4(-1)	60(1)	7.7539
4	5(-1)	0.25(-1)	6.3449	4(-1)	40(-1)	7.7693
5	10(1)	0.50(0)	7.1964	6(1)	50(0)	7.7516
6	10(1)	0.50(0)	7.1565	6(1)	50(0)	7.7142
7	20(2)	0.50(0)	7.5815	10(2)	50(0)	7.5299
8	0(-2)	0.50(0)	5.1416	2(-2)	50(0)	7.4572
9	10(1)	1.00(2)	7.5948	6(1)	70(2)	6.8020
10	10(1)	0.00(-2)	4.9755	6(1)	30(-2)	7.1050

각각의 추출물의 베타글루칸 함량(Y1)은 상기 표 2에 나타내었으며 총 2단계 최적화의 반응표면은 도 2, 3과 같다.

1 단계 최적화 실험의 베타글루칸 함량에 대한 예측된 정상점은 최고점으로 표면반응분석결과 최대값은 7.84 g/100 g이었고, 이때의 전처리조건은 고압 수증기 처리시간 10~20분, 효소농도 0.5~1.0%이였다. 2 단계의 최적화 실험의 베타글구칸 함량에 대한 추출물의 예측된 정상점은 최고점으로 표면반응분석결과 최대값은 8.01 g/100 g이었고, 이때 전처리조건은 1단계의 최적화조건을 고정한 상태에서 반응시간 6~8시간, 온도 40~60℃이였다.

총 2단계 최적화 결과는 아래 표 3과 같이 고압 수증기 처리시간 10~20분, 효소농도 0.5~1.0%, 효소반응시간 6~8시간, 효소반응온도 40~60℃의 조건에서 최대 베타글루칸 함량은 8.01 g/100 g으로 예측되었다.

구분	조건				예측 베타글루칸 함량 (g/100 g)	실증 베타글루칸 함량 (g/100 g)
구분	고압 수증기 처리시간 (분, X₁)	효소농도 (%, X₂)	반응시간 (시간, X₃)	반응온도 (℃, X₄)	예측 베타글루칸 함량 (g/100 g)	실증 베타글루칸 함량 (g/100 g)
1st optimization	10~20	0.5~1.0	6.00	50.00	7.85	-
2nd optimization	10~20	0.5~1.0	6~8	40~60	8.01	7.88

또한, 열수추출 단계에서 용매의 pH에 따른 베타글루칸 함량의 변화를 알아보기 위하여 90℃, 6시간 조건에서 용매의 pH를 달리하여 추출해 본 결과, pH가 증가 할수록 베타글루칸 함량은 점차 증가하였으며 pH 10에서 5.20 g/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다(표 4).

pH	베타글루칸 함량(g/100g)
4	3.39
7	4.02
10	5.20

< 실시예 2>

영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출

상기 표 3과 같이 최적화된 추출조건에 따라 추출물을 제조하여 베타글루칸 함량을 측정하고 예측된 베타글루칸 함량과 비교하였다.

상기 최적화된 조건으로 추출물 제조시 베타글루칸 함량은 7.88 g/100 g으로 측정되었으며, 이는 예측된 결과의 98.38%에 해당하는 결과로서 5% 이내의 유의성을 가지는 것을 확인하였다(표 3 참조).

상기 표3의 최적화된 전처리 조건은 실험예 1의 추출물 제조시 사용하였다.

[실험예 1: 고압 수증기 및 효소전처리에 의한 추출물의 제조]

영지버섯 분말　1kg에 20배 량의 물을 가하고 １２１℃의 0.1５MPa의 압력에서 １５.６９분간 고압 수증기 처리한 다음 ５１.６０℃의 온도로 조정한 다음 1N Citric acid 용액으로 pH ４로 맞추고 ０.８１%(v/v)의 효소를 가해 130rpm에서 ７.７０시간 교반하였다. 전처리가 끝난 수득물은 1N sodium hydroxide로 pH를 １０으로 맞추고 ９０℃에서 ６시간 열수추출 하였다. 열수추출이 끝난 효소 추출물은 동결건조하여 베타글루칸 함량을 측정하고 이를 표 5에 나타내었다.

[비교예 1: 물 추출물의 제조]

영지버섯 분말 1kg에 20배 량의 물을 가하고, 고압 수증기 및 효소처리를 거치지 않고 실시예 1과 동일하게 추출하였다. 얻어진 추출물을 동결건조하여 베타글루칸 함량을 측정하고 이를 표 6에 나타내었다.

<실시예 3>

베타글루칸의 함량 분석

상기 실험예 1 및 비교예 1의 추출물의 베타글루칸 함량은 Megazyme사의 Mushroom and yeast beta-glucan assay procedure kit를 사용하고, 해당 키트에 기재된 실험방법에 따라 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 이를 표 5에 나타내었다.

실험예 1은 비교예 1에 비해 순도는　거의　동등하나，고형분 함량은 약 2배, 베타글루칸 함량은 약 1.7배 높은 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 4>

추출물의 세포독성

실험예 1 및 비교예 1의 추출물의 세포독성은 공지된 문헌에 기재된 방법을 응용하여 측정하였다(Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J immunol methods. 65(1-2), 55-63). 먼저 암세포주 B16F10 murine melanoma cells와 SK-MEL5 human melanoma cells은 한국세포주은행(KCLB, KOREA)에서 분양받아 사용하였으며 10% FBS, 1% antibiotic(100 unit/ml penicillin, 100 μg/mL streptomycin)를 첨가한 DMEM배지(Dulbecco's high glucose modified eagles medium, Hyclon, SH30022.01)와 RPMI배지(RPMI 1640 medium, Hyclon, SH30027.01)를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기(VS-9160GC, Hanbaek Scientific, KOREA)에서 배양하였다. 96 well plate에 B16F10 cells과 SK-MEL5 clles을 5.0 × 10⁴ cells/ mL 농도로 분주한 후 부착 및 안정화를 위해 24시간 동안 배양하였다. 1, 3, 10, 30, 100 μg/ mL의 농도별로 샘플을 처리한 후 24시간 동안 배양한다. 각 well에서 배양액을 제거한 후 MTT의 환원을 위하여 10% MTT(Thiazolylblue tetrazolium bromide) solution(5 mg/ mL in PBS(Phosphate-bufferedsaline) 100 uL를 처리하고 다시 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO를 100 uL를 처리하여 생성된 포르마잔(formazan)을 용해시킨 후, 590nm에서 Victor3 1420 multiable counter(PerkinElmerInc., Boston, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이를 도 4, 5에 나타내었다.

본 실험 결과, B16F10 및 SK-MEL5 암세포에서 실험예 1의 고압 수증기 및 효소전처리에 의한 추출물과 비교예 1의 물추출물은 100 ㎍/mL 농도까지 세포 생존율이 80% 이상으로 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.

<실시예 5>

추출물의 암세포 생육저해활성

실시예 1 및 비교예 1의 추출물의 암세포 생육저해활성을 확인하고자 공지된 문헌에 기재된 방법을 응용하여 측정하였다(Heo JC. Park JY. Lee JM. Kwon TK. Kim SU. Chung SK. Lee SH. 2005. Wisteria floribunda gall extract inhibits cell migration in mouse B16F1 melanoma cells by regulating CD44 expression and GTP-RhoA activity. J ethnopharmacol. 102(1), 10-14).

B16F10 cells 및 SK-MEL5 cells를 6 well 배양 접시에 3.0 × 10⁵ cells/ mL로 분주한 후에 배양 접시에 confluent 상태로 되었을 때 yellow pipette tip으로 직선의 선을 그어 wound를 형성하였다. phosphate-buffered salined(PBS)를 2차례 씻어주고 배양액을 교체한 다음, 샘플을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 음성 대조군은 샘플 대신 배양액만을 사용하고, 실시예 1 및 비교예 1의 샘플은 100 μg/ml로 사용하였으며, 양성대조군은 10 μg/mL의 resveratrol을 사용하였다. 0시간, 6시간, 12시간 간격으로 healing 정도를 현미경(ECLIPSE TE2000-U, Nikon, Japan)을 통해 wound healing된 거리를 측정하여 샘플의 암세포 생육억제활성을 측정하였다. 이를 표 6, 7에 나타내었다.

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시간이 지남에 따라 실험예 1의 고압 수증기 및 효소전처리에 의한 추출물은 배양액만 처리한 음성대조군에 비해 강력한 암세포 생육저해활성효과가 있음을 확인하였으며, 비교예 1의 물추출물과 유사한 정도의 암세포 생육저해활성 효과가 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

영지버섯 분말에 증류수를 가한 뒤 고압 수증기를 처리하는 단계;
상기 고압 수증기 처리한 결과물의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계;
상기 pH를 3 내지 5로 조절한 결과물에 효소를 처리하는 효소 전처리 단계;
상기 효소 전처리 단계를 거친 결과물의 pH를 9 내지 11로 조절하는 단계;
상기 pH를 9 내지 11로 조절한 결과물에 열수를 가하여 열수 추출하는 단계를 포함하며,
상기 효소는 비스코자임L인, 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 열수 추출이 끝난 추출물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 증류수는 영지버섯 분말 중량의 20배 중량으로 가하는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 고압 수증기는 110~130℃의 온도 및 0.10~0.20MPa의 압력을 갖는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제4항에 있어서,
상기 고압 수증기 처리는 10 내지 20분간 수행되는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 효소는 0.50 내지 1.00%(v/v)의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 효소 전처리 단계는 40 내지 60℃의 온도에서 6 내지 8시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 열수 추출은 80 내지 100℃의 열수로 4 내지 8시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 영지버섯으로부터 베타글루칸의 추출방법.