KR101814164B1 - 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 - Google Patents
미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 미강생물전환물을 함유하는 조성물은 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력을 증가시키고, 당뇨를 개선할 수 있으며, 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하고, 중성지방의 생성을 억제하는 효과를 발휘한다. 또한, 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염을 억제하는 효과를 보인다.
Description
본 발명은 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.
면역은 크게, 선청성면역(innate immunity, 일명 자연면역)과 후천성면역(acquired immuniry, 일명 획득면역)으로 구분된다. 2011년 노벨생리의학상 공동수상자 3명은 인체의 면역체계가 세균, 바이러스, 곰팡이 등의 침입에 맞서 작동하는 핵심 원칙들을 밝혀낸 업적으로 노벨의학상을 수상한 바 있다.
이들의 연구에 의하면, 병원성 미생물 등의 외부침입자들은 우리 몸에 들어와 제일 먼저 선천성면역을 담당하는 면역세포의 세포표면에 있는 특정 수용체와 결합하게 된다. 이때, 우리 몸은 외부침입자인 외부항원을 발견하고, 신속하게 대응하게 된다. 이 결과로 세포와 조직에 염증반응이 일어나, 우리 몸은 열이 나거나 몸살 기운을 느끼게 되는 것이다.
이런 초기 면역반응은 외부항원의 정체와 상관없이 즉각적으로 일어난다. 선천성면역은 항원에 대해 비특이적으로 반응하며, 선천성면역을 담당하는 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leucocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 자연살해세포(NK cell) 등이 있으며, 실제로 대부분의 감염은 선천성면역에 의해 방어된다.
다만, 다양한 이유로 인해 인체 내의 면역력이 약해진 경우, 면역을 증강시키기 위해 많은 면역증강제들이 개발되어 사용되고 있다. 근래에 들어, 곰팡이류와 버섯류를 포함하는 균류에서 추출된 전기 다당류의 항보체활성, 림프구 분열 유도활성 등의 면역활성이 주목받았다. 이에, 신규한 면역조절물질을 개발하기 위하여, 균류에서 생산되는 다당류가 집중적으로 연구되고 있다.
한편, 당뇨는 그 자체 뿐 아니라 다양한 합병증을 불러와 사망에 이를 수 있어 위험성이 강조되고 있다. 당뇨의 유병률은 전 세계적으로 높을 뿐만 아니라 특히 우리나라는 이미 당뇨 및 당뇨 합병증 발병률이 OECD 평균 이상이며, 선진국형 생활 패턴으로 바뀜에 따라 우리나라에서도 발병률이 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 이에 따른 사회적인 비용도 점차 증가하고 있어 해결되어야할 과제로 관심을 받고 있다.
당뇨는 크게 두 가지 종류로 분류하는데, 먼저 췌장의 베타세포 기능이 망가져 인슐린이 제대로 분비되지 않아 혈당 조절이 되지 않는 경우를 제1형이라 하고, 인슐린 분비에는 문제가 없으나 인슐린에 대한 민감도가 떨어져 인슐린 신호전달이 제대로 되지 않아 혈당조절을 제대로 하지 못하는 경우를 제2형 당뇨라고 한다.
제1형 당뇨는 주로 선천적으로 발생하는 경우가 대부분이며 인슐린 분비가 제대로 되지 않기 때문에 인슐린을 투여하는 간단치료법으로 관리가 가능하다.
반면, 제2형 당뇨는 주로 후천적인 요인으로 발생하게 되며, 주로 인슐린 저항성에 의하여 제2형 당뇨가 발생하게 된다고 알려져 있다. 정상인의 경우, 음식 섭취 후, 소화 흡수를 거쳐 혈중 포도당 농도가 증가하게 되면 인슐린 분비가 원활하게 이루어지고, 당을 받아들여야 하는 각 조직의 세포들이 인슐린을 정상적으로 인지하여 당을 흡수하고, 에너지 생산 또는 글리코겐 저장 등 다양한 용도에 맞게 당을 활용함으로써 혈당을 낮추게 된다.
그러나, 인슐린 저항성이 있는 사람의 경우에는 각 조직의 세포들이 인슐린에 대한 민감도가 낮아져 분비된 인슐린을 정상적으로 인지하지 못하고, 적절한 당 흡수 및 이용이 이루어지지 않아 혈당이 높은 상태로 유지된다.
이처럼 인슐린 저항성 상태에서 인슐린이 제 역할을 하지 못하면 각 조직에서 당을 흡수하여 에너지원으로 소비하지 못하거나 간에서 글리코겐을 포도당으로 분해하는 신생합성과정을 적절하게 억제하지 못해 혈당이 더 증가하게 된다. 결국에는 제2형 당뇨로 진행되게 되며, 이러한 당뇨는 중성지방, 콜레스테롤을 증가시키며, 간과 췌장 조직의 손상을 초래하기도 한다.
한편, 알코올로 인해 간이 손상되기도 하는데, 이와 같은 경우를 알코올성 지방간이라고 한다. 현재 전 세계 만성간질환환자 수는 약 6~8억 명에 이르고 우리나라 40대 사망원인 1위가 간질환일 정도로 사태는 심각하다. 그러나, 현재 시판되고 있는 의약품으로는 간섬유화나 간경화 치료 효과가 낮아 국내외에서 개발에 부단히 노력하고 있으나, 아직까지 그 결과가 미흡한 실정이다.
보다 효과적으로 당뇨를 관리하기 위해서는 기본적인 운동과 식단관리 이외에 추가적인 약물치료가 수반된다. 현재 제1형 당뇨 치료제로는 간단하게 인슐린 자체를 투여하거나 췌장의 베타세포를 자극하여 인슐린 분비를 촉진시키는 방법을 사용하여 치료가 가능하지만, 제2형 당뇨 치료제로는 당 생성 억제 또는 당 흡수 억제 등 복잡한 원인에 따른 여러 다양한 기작들을 타겟하는 약물들이 계속해서 개발되고 있으나 다양한 부작용 사례가 보고되고 있어 사용 범위에 제한을 두고 있다.
현재 당뇨병 치료제는 메트포르민(Metformin)만이 대부분의 환자에게 처방되고 있고 추가적으로 필요한 경우, 치아졸리딘다이온(Thiazolidinedione) 계열 및 DPP-Ⅳ 정도가 제한적으로 사용되고 있지만 이들 모두 부작용 사례가 적지 않게 발생하고 있어 또 다른 효과적인 다른 기작의 신약 및 건강기능식품이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 미강(米糠)은 벼에서 왕겨를 뽑고 난 후, 현미를 백미로 도정하는 공정에서 분리되는 쌀겨와 쌀눈으로 이루어진 속껍질 가루를 말한다. 쌀의 기능성성분을 분석해보면 쌀겨 부분에 29%, 쌀눈에 66%, 백미라고 일컫는 쌀에는 5%의 기능성성분이 분포되어 있어, 쌀이 가지고 있는 영양분의 95%는 쌀겨와 쌀눈 즉, 미강(米糠)이 보유하고 있다.
일반적으로, 미강의 성분은 혈액순환을 증진시키고, 인간본래의 자연 치유력을 활발하게 하며, 혈액을 적절한 알칼리성으로 보존하여, 체내의 노폐물이나 유해 금속을 배출시키는 것으로 알려져 있다.
또한, 미강은 내장의 연동운동을 활성화하여 숙변을 제거하고, 콜레스테롤과 중성지방을 감소시켜, 고혈압 및 동맥경화를 치유하는 효과가 있으며, 뇌세포의 기능을 활발하게 하여 집중력과 기억력을 높여주는 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 피부미용, 알레르기 개선에도 탁월하다고 보고되어 있으며, 미강에는 농약, 중금속 제거 성분인 '휘친산'이 다량으로 포함되어 있다.
그러나, 현재까지는 표고균사로 생물전환된 미강생물전환물을 포함하는 동시에, 면역 증강, 당뇨 개선, 중성지방 및 콜레스테롤 억제, 간 보호 효능을 모두 발휘하는 조성물은 연구된 바 없는 것으로 확인된다.
본 발명에서는 면역력 향상, 당뇨 개선, 고지혈증 개선 또는 간 보호용 효능을 발휘하는 새로운 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 미강(rice bran)을 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강(增强)용 식품 또는 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 미강생물전환물은 바람직하게 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 미강의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 발효를 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 미강을 가수분해할 수 있게 된다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 미강생물전환물은 바람직하게 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력(항병력)을 지니게 한다. 상기 면역력(항변력)은 병에 대한 저항력을 뜻한다.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 미강생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
본 발명의 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 미강을 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 미강의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 발효를 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 미강을 가수분해할 수 있게 된다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 바람직하게 당뇨로부터 발생하는 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선할 수 있다.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
본 발명의 당뇨개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 당뇨개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 미강을 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다. 이때, 상기 고지혈증은 바람직하게 '당뇨'로 인한 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 '고지혈증'이라 함은 체내의 중성지방 수치가 높아져 발생하는 고지혈증을 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명의 고지혈증은 체내 중성지방 함량이 높아져 발생하는 질환을 포함하는 개념으로서, 고중성지방혈증을 포함하는 개념이다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 미강의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 발효를 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 미강을 가수분해할 수 있게 된다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 중성지방 및 저밀도 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 생성을 억제하고, 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 생성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)인 것일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
한편, 본 발명의 고지혈증 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~99 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 고지혈증 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 미강을 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 미강의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 발효를 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 미강을 가수분해할 수 있게 된다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 바람직하게 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염을 억제할 수 있다.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 미강생물전환물은 바람직하게 다당체(polysaccharide)인 것일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
한편, 본 발명의 간 보호용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 미강생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.
본 발명의 간 보호용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미강생물전환물은 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력을 증가시키고, 당뇨를 개선할 수 있으며, 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하고, 중성지방의 생성을 억제하는 효과를 발휘한다. 또한, 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염을 억제하는 효과를 보인다.
도 1은 본 발명 미강생물전환물의 제조공정도이다.
도 2는 본 발명 미강생물전환물의 후처리 및 회수작업 공정도이다.
도 3은 본 발명 미강생물전환물에 의해 획기적으로 향상된 NO 생성능 및 농도의존적으로 증가하는 대식세포의 NO 생성 결과 그래프이다.
도 4는 미강 및 본 발명 미강생물전환물의 사이토카인(cytokine) 발현능 그래프이다.
도 5는 본 발명 미강생물전환물의 살모넬라 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 농도별 본 발명 미강생물전환물이 대식세포의 살모넬라 탐식능에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 7은 농도별 본 발명 미강생물전환물이 대식세포 내 살모넬라 증식 억제에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 8은 마우스의 살모넬라 감염에 의해 발생한 치사율에 있어서, 본 발명 미강생물전환물에 의한 지연 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명 미강생물전환물의 복강 내 살모넬라 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 10은 Caco-2 세포주를 이용하여, 살모넬라의 장관세포 내 침투에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 침투 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 INS-1 세포주의 사멸과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12(A)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 측정한 그래프이다.
도 12(B)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 13은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 췌장 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 14는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15(A)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 15(B)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 췌장 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 16은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에서 ROS 발생에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 발생 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 투여로 인한 간 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 투여로 인한 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 20은 본 발명 미강생물전환물로부터 다당체분획물을 수득하는 제조공정도 및 제조과정을 보여준다.
도 21은 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물 제조공정별 HPLC분석 크로마토그램 결과이다.
도 22는 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물들의 HPLC분석 크로마토그램 결과이다.
도 23은 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물들의 대식세포 활성화능 평가 결과이다.
도 24는 본 발명 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비패턴 조사 결과이다.
도 25는 TLR4 저해제 처리시, 본 발명 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비량 억제 평가 결과이다.
도 2는 본 발명 미강생물전환물의 후처리 및 회수작업 공정도이다.
도 3은 본 발명 미강생물전환물에 의해 획기적으로 향상된 NO 생성능 및 농도의존적으로 증가하는 대식세포의 NO 생성 결과 그래프이다.
도 4는 미강 및 본 발명 미강생물전환물의 사이토카인(cytokine) 발현능 그래프이다.
도 5는 본 발명 미강생물전환물의 살모넬라 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 농도별 본 발명 미강생물전환물이 대식세포의 살모넬라 탐식능에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 7은 농도별 본 발명 미강생물전환물이 대식세포 내 살모넬라 증식 억제에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 8은 마우스의 살모넬라 감염에 의해 발생한 치사율에 있어서, 본 발명 미강생물전환물에 의한 지연 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명 미강생물전환물의 복강 내 살모넬라 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 10은 Caco-2 세포주를 이용하여, 살모넬라의 장관세포 내 침투에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 침투 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 INS-1 세포주의 사멸과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12(A)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 측정한 그래프이다.
도 12(B)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 13은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 췌장 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 14는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15(A)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 간 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 15(B)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 췌장 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 16은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에서 ROS 발생에 본 발명 미강생물전환물이 미치는 발생 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 투여로 인한 간 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 미강생물전환물의 투여로 인한 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 20은 본 발명 미강생물전환물로부터 다당체분획물을 수득하는 제조공정도 및 제조과정을 보여준다.
도 21은 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물 제조공정별 HPLC분석 크로마토그램 결과이다.
도 22는 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물들의 HPLC분석 크로마토그램 결과이다.
도 23은 본 발명 미강생물전환물의 다당체분획물들의 대식세포 활성화능 평가 결과이다.
도 24는 본 발명 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비패턴 조사 결과이다.
도 25는 TLR4 저해제 처리시, 본 발명 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비량 억제 평가 결과이다.
본 발명에서는 미강(rice bran)을 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 포함하는 식품 또는 약학조성물을 제공한다.
하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 본 발명의 과정으로부터 수득한 미강생물전환물은 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력을 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 당뇨를 개선할 수 있으며, 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하고, 중성지방의 생성을 억제하여 고지혈증을 개선 또는 예방(또는 치료)할 수 있는 효과가 발휘됨이 확인되었다. 또한, 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염 등 간을 보호하거나 간질환을 예방(또는 치료)하는 효과가 발휘될 수 있는 것으로 확인되었다.
한편, 본 발명에서는 상기 단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 다당체분획물을 제공한다.
본 발명에서는 미강생물전환물로부터 다당체분획물을 수득한 후, 미강생물전환물 및 그로부터 분리한 다당체분획물이 면역세포의 특이수용체인 패턴인식수용체에 인식되어 신호전달이 매개되는지 확인하였다.
미강생물전환물 및 그 다당체분획물의 면역활성 관련 사이토카인을 분석한 하기 실험 결과, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 미강생물전환물의 상기 면역활성은 그로부터 분리된 다당체분획물에 기인한 것임을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 하기 실험에서는 미강생물전환물로부터 분리한 다당체분획물이 LPS(lipopolysaccharide)와 사이토카인 분비 패턴에 있어, 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었는데, 이를 통해 본 발명의 다당체분획물이 LPS의 안티아고니스트(antagonist)임을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 미강생물전환물 및 그 다당체분획물이 TLR4에 특이적으로 인식되어 신호를 매개하는 것인지 확인하기 위하여 TLR4에 대한 특이적 저해제인 TAK-242를 사용하여 확인하였다. 하기 실험 결과, 미강생물전환물 또는 그 다당체분획물의 처리에 의해 나타나는 반응들이 TLR4 특이적 저해제인 TAK242에 의해 모두 억제됨을 확인할 수 있었고, 이로부터, TLR4가 미강생물전환물 및 그 다당체분획물의 수용체임을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과로부터 본 발명에서 추구하는 생물전환공정에 의해 생산된 미강생물전환물 및 그 다당체분획물이 TLR4 아고니스트의 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 미강생물전환물 제조]
(1) 전처리공정(이물 및 곰팡이 세척공정)
미강생물전환물을 생산하기 위해, 현미의 이물 및 곰팡이 등의 오염물질을 제거하기 위하여 세척공정을 수행하였다.
1차로 고압의 에어건(air gun)으로 현미의 겉면에 붙어있는 이물 및 먼지 등을 제거하였다. 2차로 체를 쳐서 그 외 존재할 수 있는 이물을 제거하였다. 3차로 물 또는 에탄올을 처리하여 곰팡이 포자 등의 오염물질을 제거하는 공정을 거쳤다.
이렇게 3차의 세척공정을 거친 현미는 미생물오염 검사를 수행한 후, 도정 작업을 거쳐 미강을 수득하였고, 이를 원재료로 사용하였다.
(2) 배지화를 위한 가수분해효소에 의한 효소처리공정
미강에 다양한 가수분해효소를 사용하여 효소처리공정을 수행하였다. 가수분해효소는 미강의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있는 아밀라아제(amylase) 계열의 효소와 셀룰라아제(cellulase) 계열의 효소를 사용하여 실험을 수행하였다.
각각의 효소는 0.3%(w/v)으로 처리하고, 최적 활성을 나타내는 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 멸균과정을 거쳐 액상배지를 제조하였다.
(3) 발효 및 효소처리 생물전환공정
*미강를 배양배지화한 액상배지에 표고균사를 접종하여 30℃에서 배양하였다. 잔류 탄소원이 고갈되는 시점에서 농축된 액상배지를 첨가하는 유가식공정으로 8일간 배양하였다. 표고균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 미강를 가수분해할 수 있게 된다. 배양 후, 배양발효공정에 의해 생산된 표고균사발효미강에, 추가적으로 2차 생물전환공정인 효소처리공정을 수행하였다.
상기 발효 및 효소처리 생물전환공정은 배양발효기질인 미강과 함께, 배양발효산물인 표고균사로부터 세포벽 유래의 면역활성 물질을 효과적으로 생산하기 위한 것으로, 세포벽을 구성하고 있는 성분 중 특정성분의 구조변화를 통해 면역활성 물질로 전환시킴과 함께 효율적으로 추출할 수 있는 효과적인 추출방법을 고려하여 설계되었다.
따라서, 본 발명자들은 'cell wall lytic enzyme complex' (세포벽을 분해할 수 있는 세포벽 가수분해효소인 셀룰라아제(cellulase), 헤미-셀룰라아제(hemi-cellulase) 및 펙티나아제(pectinase) 및 베타글루칸 분해효소인 베타-글루칸(β-glucanase)의 효소복합제)를 사용하고, 50~60℃ 조건에서 250 rpm로 쉐이킹(shaking) 하여 효소/기질반응을 최적화하였다 (도 1 참조). 도 1은 미강생물전환물의 제조공정도이다.
(4) 후처리공정
2차 생물전환공정(효소 반응)에 의해 생산된 미강생물전환물은 90℃에서 1시간 동안 '효소불활성화 및 살균' 과정을 거친 후, 동결건조 및 분말화하여, 하기 실험예에서 사용하였다 (도 2 참조). 도 2는 미강생물전환물의 후처리 및 회수작업 공정도이다.
[ 실험예 1: 미강 및 미강생물전환물에 의한 대식세포( 마크로파지 )에서의 in vitro NO 생성능 측정]
미강 및 미강생물전환물의 대식세포 활성화 효능을 확인하기 위하여 대식세포(마크로파지), RAW264.7 세포주에서의 NO 생성능을 조사하였다.
96 웰 플레이트(well plate)에 미강생물전환물과 연속희석된 미강 및 미강생물전환물과 스탠다드(standard)를 100 ㎕ 분주하고, 'Griess reagent'(① N-(1-naphtyl) ethlene diamine dihydrochloride : 0.5 g/500 ml ② Sulfanilamide : 5 g / 85% H3PO4 29.5 ml/470.5 ml)를 100 ㎕ 분주한 후 1분간 반응시켰다. 이후, 'ELISA leader'를 이용하여 540 nm(또는 550 nm)에서 흡광값의 측정을 통해 시료의 대식세포 NO 생성능을 측정하여 면역활성 역가를 평가하였다.
실험결과, 미강생물전환물은 미강에 비해 1/256 보다 낮은 농도에서 대식세포가 NO 생성능을 나타내어, 미강생물전환물에 의한 대식세포의 NO 생성능이 획기적으로 향상되며 또한 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 미강생물전환물에 의해 획기적으로 향상된 NO 생성능 및 농도의존적으로 증가하는 대식세포의 NO 생성 결과 그래프이다.
[ 실험예 2: 대식세포에서의, 미강 및 미강생물전환물의 사이토카인(cytokine) 분비능 분석]
미강 및 본 발명의 미강생물전환물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 대식세포(마크로파지), RAW264.7 세포주에서의 사이토카인(Cytokine) 분비능을 조사하였다.
미강 및 본 발명의 미강생물전환물은 1, 10, 100 ㎍/ml의 농도로 각각 처리하여 실험을 수행하였다. 시료 처리 16시간 후 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interlukine-1β), IL-4(Interlukine-4), IL-5(Interlukine-5), IL-6(Interlukine-6), IL-10(Interlukine-10), IL-12p70(Interlukine-12p70), IFN-β(Interferon-β), IFN-α(Interferon-α)를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay) 실험법으로 분석하였다.
실험결과, 미강생물전환물을 처리한 경우, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 미강 및 미강생물전환물의 사이토카인(cytokine) 발현능 그래프이다.
TNF-α는 포식작용시, 대식세포와 단핵세포 등에서 분비되며, '유도형 일산화질소(NO)'와 함께 독감바이러스 등의 다양한 바이러스에 대하여 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
IL-6는 항원특이면역반응, 염증반응, 급성반응에서의 주요 중개자이며, 생체 내 방어체계에서 핵심역할을 담당하는 대표적 사이토카인(cytokine)이다.
IFN-β는 IFN-α와 함께 'type I 인터페론'으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며, Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로, Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있다.
시료 처리 시간대 별로(6시간, 12시간, 18시간 후) 배양상등액을 취하여 사이토카인(cytokine) 분비능을 조사하는 실험을 진행하였으며, 3번 반복 실험을 진행하였다.
따라서, 본 발명의 미강생물전환물은 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 소재로, 동시에 항진된 Th2 면역반응도 억제시킬 수 있을 것으로 판단되었다. 또한, Th1 면역반응을 향상시킬 필요가 있거나 또는 Th2 면역반응이 항진되어 발생하는 질환에도 효능을 나타낼 수 있을 것으로 예상되었다.
[ 실험예 3: 미강생물전환물의 , 대식세포에서의 in vitro 살모넬라 감염 억제능 평가]
본 실험예에서는 미강생물전환물이 대식세포를 이용한 in vitro 실험계에서 대식세포의 활성화를 유도하여 탐식작용 및 세포 내 미생물 생존 억제능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
(1) 미강생물전환물의 항균활성 측정
미강생물전환물의 살모넬라 감염 억제능을 평가하기 위하여, 미강생물전환물이 직접적인 항균활성을 갖는지 확인하고자 하였다.
지시균주로는 Salmonella typhimurium ATCC14028 균주를 사용하였고, 일반적인 살모넬라 배양배지인 'nutrient broth'와 지시약인 페놀 레드(phenol red) 및 발효를 위한 글루코스(glucose)가 포함된 'nutrient broth (NBGP)'를 사용하여 살모넬라의 성장 및 당발효로 인한 색 변화를 측정하였다.
살모넬라 배양 시, 미강생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 처리하여 살모넬라의 생존 억제를 유도하는지 확인하였으며, 배양 후 0, 2, 4, 8 시간에 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.
실험결과, 미강생물전환물은 직접적인 항균활성을 보이지 않는 것으로 확인되었다 (도 5). 도 5는 미강생물전환물의 살모넬라 항균활성을 나타낸 그래프이다.
(2) 미강생물전환물의 대식세포 탐식능 측정
대식세포 RAW 264.7 세포주에 미강생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 4시간 동안 처리한 후, Salmonella typhimurium ATCC14028를 30분, 60분간 감염시켰다.
실험결과, 살모넬라 30분 감염시에 미강생물전환물의 처리로 인한 탐식능의 증가가 최대 3.65배까지 증가함을 확인하였고, 살모넬라 60분 감염시에는 최대10.06배까지 증가함을 확인하였다 (도 6). 도 6은 농도별 미강생물전환물이 대식세포의 살모넬라 탐식능에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
(3) 미강생물전환물의 살모넬라 증식 억제능 측정
대식세포 RAW 264.7 세포주에 미강생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 4시간 동안 처리한 뒤, 살모넬라(Salmonella typhimurium ATCC14028)를 2시간, 4시간, 8시간 동안 감염시킨 후, 살모넬라의 증가 여부를 관찰하였다.
실험결과, 2시간 배양 시에는 세포 내 살모넬라의 증가가 일어났으며, 그 이후로는 감소하는 경향을 보였다. 100 ㎍/mL의 미강생물전환물을 처리하고 살모넬라를 감염시킨 군은, 최대 8시간 경과 시, 세포 내에 존재하는 살모넬라가 대조군에 비하여 감소하는 것으로 확인되었다 (도 7). 도 7은 농도별 미강생물전환물이 대식세포 내 살모넬라 증식 억제에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
[ 실험예 4: 살모넬라 감염으로 발생한 마우스 치사율에 대한 조절 효능 평가]
상기 실험을 통해 미강생물전환물이 대식세포를 이용한 in vitro 실험계에서 대식세포의 활성화를 유도하여 탐식작용을 증가시키고, 탐식작용 후, 세포 내 미생물 생존을 억제하는 것을 확인함에 따라, 본 실험예에서는 'Salmonella typhimurium ATCC14028)' 균주를 이용한 미생물 감염 마우스 모델을 제작하여 미강생물전환물의 in vivo 항미생물 활성을 검정하고자 하였다.
미강생물전환물의 투여가 살모넬라 감염으로 인한 마우스의 치사율을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 살모넬라(Salmonella typhimurium ATCC14028) 균주의 치사 농도인 105 CFU를 복강 내로 주사하여 감염에 의한 마우스의 사망을 유도하였다.
실험결과, 대조군 마우스는 감염 후 7일째 모든 마우스가 사망한데 비해 미강생물전환물을 10 mg/kg의 섭취량으로 투여한 경우, 최대 21일까지 마우스가 생존하여 미강생물전환물의 투여로 인해 마우스의 사망이 지연되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 8). 도 8는 마우스의 살모넬라 감염에 의해 발생한 치사율에 있어서, 미강생물전환물에 의한 지연 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
*[ 실험예 5: 미강생물전환물의 , 살모넬라 감염 마우스에서의 in vivo 살모넬라 감염 억제능 평가]
상기 실험을 통해 미강생물전환물의 투여가 치사 농도의 살모넬라 감염으로 인한 마우스의 치사율을 감소시켰음을 확인함에 따라, 본 실험예에서는 아치사 농도의 살모넬라 감염에서의 in vivo 항미생물 활성과 미강생물전환물에 의해 유도되는 면역반응의 활성화를 확인하고자 하였다.
미강생물전환물을 10 mg/kg 의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 'Salmonella typhimurium ATCC14028' 균주를 1x104 CFU 농도로 복강 주사하여 복강 내 살모넬라 감염을 유도하였다.
감염 2일 후, 마우스의 복강 내 살모넬라를 PBS를 이용해 회수한 뒤, LB 플레이트에 스프레딩(spreading)하여 복강 내 생존하는 살모넬라의 수를 측정하였다.
측정 결과, 미강생물전환물을 처리한 그룹에서 대조군에 비하여 생존하는 살모넬라가 월등히 감소함을 확인하였다 (도 9). 도 9는 미강생물전환물의 복강 내 살모넬라 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
[ 실험예 6: 살모넬라 감염 마우스에서의 림프구 증식 유도 및 인터페론-감마(interferon-γ) 생산 활성화 평가]
상기 복강 내 살모넬라 실험 후, 마우스의 비장을 적출하여 비장 내 림프구를 분리하였다. 분리한 림프구를 T세포 증식 유도물질인 콘칸나발린 A (concanavalin A)와 B세포 증식 유도물질인 LPS로 자극하여 세포의 증식이 얼마나 유도되는지 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 나타내었다.
샘플 | 림프구 증식 (fold-increase) | IFN-γ (pg/mL) |
vehicle | 1.38 ± 0.12 | 287.204 ± 13.586 |
10 mg/kg 미강생물전환물 | 1.89 ± 0.13 | 359.725 ± 22.614 |
실험결과, 대조군보다 미강생물전환물 투여 마우스의 경우, 마우스 비장 림프구가 더 많이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 대표적 Th1 사이토카인인 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 7: 살모넬라 감염 마우스에서의 Th1 사이토카인( cytokine ) 활성화 효능 평가]
미강생물전환물의 투여가 Th1 면역반응의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, 상기 아치사 농도의 살모넬라를 복강 내 감염시킨 마우스 비장에서의 Th1 사이토카인(cytokine)의 발현량을 측정하여 Th1 활성화 효과를 평가하고자 하였다. Th1 사이토카인(cytokine) 중 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12의 네 가지 사이토카인(cytokine)을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
살모넬라를 감염시키지 않은 마우스와, 살모넬라를 감염시킨 마우스에 미강생물전환물을 각각 투여하여 활성화 효과를 비교하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
sample | cytokines (pg/mL) | |||
IL-1β | IL-2 | IL-6 | IL-12 | |
salmonella (-) | ||||
vehicle | 171 ± 12 | 41.7 ± 3.7 | 57.3 ± 3.2 | 240 ± 13 |
10 mg/kg 미강생물전환물 |
186 ± 14 | 43.3 ± 2.8 | 58.0 ± 3.9 | 253 ± 17 |
salmonella (+) | ||||
vehicle | 239 ± 13 | 55.7 ± 3.8 | 73.4 ± 5.4 | 284 ± 13 |
10 mg/kg 미강생물전환물 |
256 ± 11 | 63.9 ± 4.3 | 77.3 ± 4.8 | 325 ± 29 |
*실험결과, 정상 마우스에 미강생물전환물을 투여한 경우, IL-1β의 발현량이 약간 증가한 것을 제외하면 사이토카인(cytokine)의 발현량에 있어 큰 차이를 보이지 않았다. 반면, 살모넬라에 감염된 경우, 살모넬라 감염에 의해 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 등의 사이토카인(cytokine)의 발현량이 많이 증가하며, 또한 미강생물전환물을 살모넬라 감염에 있어서 동시에 투여한 경우, 더 많은 사이토카인(cytokine)의 생산이 유도되는 것으로 확인되었으며, 특히 대표적 Th1 사이토카인인 IL-12에서 가장 현저히 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는 미강생물전환물의 투여가 정상 생체 내에서는 불필요한 면역반응의 활성화를 유도하지 않으며, 미생물 감염시, Th1 면역반응의 활성화를 유도하여 생체 내 감염된 미생물을 효과적으로 제어할 수 있음을 보여주는 것이다.
[ 실험예 8: 살모넬라 감염 마우스에서의 Th2 사이토카인( cytokine ) 발현 효능 평가]
상기 Th1 사이토카인(cytokine) 활성화 효능 평가 결과에서, 미강생물전환물의 투여가 Th1 사이토카인(cytokine)의 발현을 활성화 시킴에 따라, Th1 면역반응의 길항적 반응인 Th2 면역반응의 활성화 여부를 확인하기 위하여 Th2 사이토카인(cytokine) 발현량을 확인하고자 하였다.
대표적 Th2 사이토카인(cytokine)은 IL-4, IL-5, IL-10의 세 가지 사이토카인(cytokine) 발현량을 확인하였다. Th1 사이토카인(cytokine)과 마찬가지로 살모넬라에 감염되지 않은 정상 마우스와 살모넬라에 감염된 마우스 모두에서 확인하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
sample | cytokines (pg/mL) | ||
IL-4 | IL-5 | IL-10 | |
salmonella (-) | |||
vehicle | 52.1 ± 3.4 | 294 ± 17 | 44.7 ± 2.3 |
10 mg/kg 미강생물전환물 |
50.9 ± 3.6 | 290 ± 22 | 45.1 ± 3.1 |
salmonella (+) | |||
vehicle | 56.8 ± 4.3 | 289 ± 17 | 48.7 ± 3.3 |
10 mg/kg 미강생물전환물 |
57.2 ± 3.8 | 296 ± 15 | 49.2 ± 3.8 |
실험결과, 미강생물전환물의 투여는 살모넬라에 감염되지 않은 정상 마우스는 물론 감염된 마우스 모두에서 Th2 사이토카인(cytokine)의 생성을 증가시키지 않는 것으로 확인되었다
이와 같은 결과는 미강생물전환물의 투여가 정상 생체 내에서는 불필요한 면역반응의 활성활르 유도하지 않으며, 미생물 감염시, Th2 면역반응의 활성화도 유도하지 않음을 보여주는 것이다.
[ 실험예 9: 미강생물전환물의 , 장관세포에서의 in vitro 살모넬라 침투 억제능 평가]
본 실험예에서는 Caco-2 세포주를 이용하여 미강생물전환물이 살모넬라에 대해 장관세포 점착 및 침입 억제 효능을 나타내는지 평가하고자 하였다. 살모넬라 감염의 대부분은 장관 내 감염을 통해 일어나기 때문에, 미강생물전환물이 살모넬라의 장관세포 점착 및 침입을 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다. 사람 유래 대장암 세포주인 Caco-2 세포주와 Salmonella typhimurium SL1344 균주를 이용한 in vitro 실험계에서 평가하였다.
Caco-2 세포주에 100 ㎍/mL 농도의 미강생물전환물을 4시간 전처리 또는 Salmonella typhimurium SL1344 균주와 동시 처리한 후, 세포 내로 침투한 살모넬라의 수를 측정하였다.
실험결과, 4시간 전처리 경우, 10.7%의 살모넬라 침투 억제능을 보였으며, 동시처리의 경우, 58.4%의 살모넬라 침투 억제능을 나타내었다. 상기 실험에서 미강생물전환물은 항균활성을 가지지 않는 것으로 확인되었기 때문에, Caco-2 세포주에 직접 작용하여 미생물의 침투를 억제한 것으로 판단되었다 (도 10). 도 10은 Caco-2 세포주를 이용한 미강생물전환물의 장관세포 내 침투 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
[ 실험예 10: 살모넬라 감염 마우스에서의, 미강생물전환물의 in vivo 살모넬라 침투 억제능 평가]
본 실험예에서는 미강생물전환물의 in vivo 살모넬라 침투 억제능을 확인하고자 하였다.
(1) 분변으로 배출되는 살모넬라의 확인
세포주를 이용한 실험에서 미강생물전환물이 살모넬라의 장관세포 내 침투를 억제하는 효과가 있음을 확인함에 따라, 살모넬라 식중독 마우스 모델에서 살모넬라 침투 억제 효과를 평가하고자 하였다.
미강생물전환물을 각각 10 mg/kg의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 108 CFU의 'Salmonella typhimurium SL1344' 균주를 경구 투여하여 살모넬라의 감염을 유도하였다. 감염 24시간, 48시간 후 분변을 각각 채취하여 분변 내 살모넬라의 생균 수를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
Sample | Salmonella in feces (x104 CFU/g) | |
1 day | 2 day | |
normal mice | 0.00 ± 0.00 | 0.00 ± 0.00 |
SL1344 infection only | 338 ± 18 | 420 ± 31 |
SL1344 infection + 10 mg/kg 미강생물전환물 | 662 ± 48 | 729 ± 53 |
*실험결과, 미강생물전환물을 투여한 경우, 모두 대조군에 비하여 많은 양의 살모넬라가 장관 내로 침투되지 않았고, 분변으로 빠져나온 것으로 확인되었다.
(2) 조직 내로 침투한 살모넬라의 확인
상기 표 4의 결과에서, 미강생물전환물 투여 시, 생체 내로 들어간 살모넬라가 조직 내로 침투하지 못하고 체외로 배출되는 것을 확인함에 따라, 상기 분변 배출 실험 마우스를 대상으로 맹장과 장관막림프절, 비장, 간을 적출하여 조직 내로 침투한 살모넬라의 수를 측정하였다.
① 맹장 및 장관막림프절
살모넬라의 감염 후, 1차 침투 조직인 맹장과 그에 연결된 림프조직인 장관막림프절 내의 살모넬라를 측정하여 미강생물전환물의 조직 침투 억제 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
Sample | Salmonella in tissue | |
Cecum (x105 CFU/g) | Mesenteric lymph node (x103 CFU/organ) | |
normal mice | 0.00 ± 0.00 | 0.00 ± 0.00 |
SL1344 infection only | 489 ± 32 | 109 ± 8 |
SL1344 infection + 10 mg/kg 미강생물전환물 | 201 ± 12 | 26.8 ± 1.9 |
실험결과, 미강생물전환물은 살모넬라의 맹장 내 침투를 억제하였으며, 미강생물전환물은 58.9%의 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 미강생물전환물은 75.4%의 장관막림프절 내 살모넬라를 억제하는 것으로 확인되었고, 맹장보다 장관막림프절에서의 억제율이 더 큰 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 장관막림프절에 존재하는 면역세포가 미강생물전환물에 의하여 활성화됨으로써 살모넬라가 침투되었더라도 효과적으로 제거할 수 있었던 것으로 판단되었다.
② 비장 및 간
조직 내로의 침투 및 체액을 통한 이동이 가능한 비장과 간에서의 살모넬라의 양을 측정하였다.
Sample | Salmonella in tissue | |
Spleen (x102 CFU/organ) | Liver (x102 CFU/organ) | |
normal mice | 0.00 ± 0.00 | 0.00 ± 0.00 |
SL1344 infection only | 129 ± 11 | 77.4 ± 5.6 |
SL1344 infection + 10 mg/kg 미강생물전환물 | 21.0 ± 1.7 | 18.9 ± 1.3 |
실험결과, 미강생물전환물을 투여한 경우, 83.8%의 비장 내 살모넬라를 억제하는 효과를 보였다. 또한, 간에 존재하는 살모넬라에 대해 미강생물전환물은 75.6%의 억제율을 보였다. 비장과 간 모두 맹장에 비해 높은 억제율을 보였는데, 이러한 결과 또한 다양한 면역세포의 활성화로 인한 것으로 추측되었다.
[ 실험예 11: 베타세포에서의, 미강생물전환물의 in vitro 제1형 당뇨 억제능 평가]
본 실험예에서는 미강생물전환물이 제1형 당뇨에 대한 억제 활성을 갖는지 확인하기 위하여, 마우스 유래 췌장 베타세포주인 INS-1 세포주를 이용한 in vitro 실험계에서 미강생물전환물의 활성을 평가하고자 하였다.
(1) 베타세포에서 세포독성 및 활성산소 생성에 미치는 효과
췌장 베타세포, INS-1 세포주에 'Glucose transporter 2 (GLUT2)'를 통해 베타세포 특이적으로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산, 독성을 유발하는 알록산(alloxan)을 처리하여 세포의 사멸을 유도하고, 미강생물전환물을 처리하여 세포 사멸을 억제할 수 있는지 확인하였다.
INS-1 세포주를 5x105 cells/well의 농도로 96 웰 플레이트(well plate) 에 분주한 후, 10 mM의 알록산(alloxan)과 1, 10, 100 ㎍/mL의 미강생물전환물을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양 후, MTT assay를 통해 세포의 생존률을 측정하였다.
실험결과, 알록산(alloxan)을 처리한 경우, 약 62.5%의 세포가 사멸한 것으로 확인되었고, 미강생물전환물이 함께 처리된 경우, 사멸율이 최대 약 38.6%까지 감소하는 것으로 확인되었다.
또한, 알록산(alloxan)에 의해 생성되는 세포 내 ROS의 양을 DCF-DA로 표지하여 측정한 결과, 미강(생물전환)산물을 함께 처리한 경우 대조군에 비해 최대 34.9% 까지 ROS의 생성량이 감소하는 것으로 나타났으며, 이러한 효과는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었다 (도 11). 도 11은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 INS-1 세포주의 사멸과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 미강생물전환물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
(2) 베타세포에서 NO 생성 및 인슐린 분비에 미치는 효과
알록산(alloxan)의 처리에 의해 베타세포, INS-1 세포주 내 ROS 증가와 세포의 사멸이 일어나게 되면, 세포가 생성 및 분비하는 NO(nitric oxide)의 양이 증가하며, 인슐린의 분비는 감소하게 된다.
상기 실험에서 알록산의 처리에 의해 증가된 세포 내 ROS의 양과 세포 사멸율이 미강생물전환물의 동시처리에 의해 감소하였으므로, INS-1 세포주가 분비하는 NO(nitric oxide)의 양과 인슐린의 양에 대해서도 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
Sample | Nitric oxide (arbitrary fluorescent unit) |
Insulin release (ng/mL) | |
vehicle | 19.784 ± 1.253 | 1.809 ± 0.057 | |
10 mM Alloxan only | 82.479 ± 5.261 | 0.821 ± 0.034 | |
10 mM Alloxan + 미강생물전환물 | 1 ㎍/mL | 80.219 ± 6.463 | 0.830 ± 0.077 |
10 ㎍/mL | 66.890 ± 5.437 | 0.921 ± 0.059 | |
100 ㎍/mL | 50.429 ± 2.106 | 1.079 ± 0.086 |
실험결과, 알록산(alloxan)의 처리에 의해 증가된 NO의 분비가 미강생물전환물의 동시 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되고 또한 알록산(alloxan)의 처리에 의해 억제된 인슐린의 분비량이 미강생물전환물의 동시 처리에 의해 회복시키는 효과를 확인하였으며, 100 ㎍/mL의 최대 농도에서 미강생물전환물은 38.8%의 NO 생성 및 분비를 억제하는 것으로 확인되었다.
또한, 인슐린의 경우는 100 ㎍/mL의 최대 농도에서 31.4%까지 분비량이 회복되는 것으로 확인되었다.
[ 실험예 12: 제1형 당뇨 유발 마우스에서의, 미강생물전환물의 in vivo 제1형 당뇨 억제능 평가]
상기 in vitro 실험계에서 미강생물전환물의 처리가 제1형 당뇨에 대한 항당뇨 효과가 있음이 확인됨에 따라, 본 실험예에서는 제1형 당뇨의 마우스 모델에서 미강생물전환물의 항당뇨 효과를 검정하고자 하였다.
(1) 제1형 당뇨 마우스모델에서 혈당, 혈청 내 인슐린, 간 내 글리코겐 양에 미치는 효과 확인
미강생물전환물을 각각 10 mg/kg의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 100 mg/kg의 알록산(alloxan)을 복강주사로 투여하여 제1형 당뇨를 유도하였다. 1주일간 당뇨를 유도한 뒤, 당뇨의 지표로서 마우스의 혈당량, 혈중 인슐린 농도, 간 내 글리코겐의 농도를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
Sample | Blood glucose (mg/dL) | Serum insulin (ng/mg protein) |
Glycogen (mg/g liver wt.) |
vehicle | 127.0 ± 8.1 | 59.204 ± 4.283 | 3.041 ± 0.213 |
Alloxan only (100 mg/kg) | 308.4 ± 15.7 | 9.407 ± 0.821 | 2.427 ± 0.154 |
Alloxan + 10 mg/kg 미강생물전환물 |
263.0 ± 17.8 | 24.221 ± 1.556 | 2.613 ± 0.179 |
실험결과, 당뇨가 유도된 대조군은 혈당이 308.4 mg/dL로 증가하였으나, 미강생물전환물을 투여한 마우스에서는 혈당이 263.0 mg/dL로 혈당량의 증가가 억제되는 것으로 확인되었다.
또한, 혈중 인슐린 농도는 당뇨 유발 시, 정상 마우스에 비하여 15.9% 수준으로 감소하는데 반해, 미강생물전환물 투여 시, 40.9% 수준까지 회복되는 것으로 확인되었다. 혈중 인슐린의 감소로 인하여 감소하는 간 내 글리코겐 농도 역시 당뇨 유발 대조군이 정상 대비 79.8% 수준으로 감소됨에 반하여 미강생물전환물 투여 시, 85.9% 수준까지 회복되는 것으로 확인되었다.
(2) 당 대사 관련 효소에 대한 조절능 평가
당 대사 관련 효소 중 인슐린에 의해 조절되는 'Glucose-6-phosphatase (G6pase)', 'Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)', 'Glucokinase (GCK)'의 활성에 미강생물전환물의 투여가 미치는 효과를 측정하고자 하였다.
당뇨에 의해 혈중 인슐린의 농도가 감소하면, G6pase와 PEPCK가 활성화되어 포도당 신생합성이 촉진되며, GCK의 억제로 인하여 글리코겐의 합성이 억제된다. 따라서, 미강생물전환물의 투여 시, 인슐린 분비가 회복됨에 따라, 이 세 효소의 활성을 제어할 수 있는지 확인하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
Sample | enzyme activity (nmol/min/mg protein) | ||
G6pase | PEPCK | GCK | |
Vehicle | 71.422 ± 4.231 | 17.540 ± 1.161 | 10.840 ± 0.893 |
Alloxan only (100 mg/kg) | 172.559 ± 12.549 | 33.426 ± 2.076 | 5.224 ± 0.335 |
Alloxan + 10 mg/kg 미강생물전환물 |
128.304 ± 7.203 | 26.736 ± 1.948 | 7.990 ± 0.507 |
실험결과, G6pase 활성은 당뇨 유발 시, 정상 마우스 대비 2.4배로 활성이 증가하지만, 미강생물전환물 투여 시, 1.8배로 활성이 억제됨을 확인하였다. 또한, PEPCK의 경우, 당뇨 유발 마우스에서 약 1.9배 활성이 증가하였으나, 미강생물전환물 투여 시, 각각 약 1.5배로 억제되는 것으로 확인되었다. GCK의 경우, 당뇨 유발 시, 정상 마우스 대비 48.2% 수준으로 활성이 감소하였으나, 미강생물전환물 투여 시, 73.7% 수준으로 활성이 증가됨을 확인하였다.
(3) 간 조직 및 췌장 조직 보호 효과
제1형 당뇨로 인해 유발되는 간 손상을 미강생물전환물 투여로 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 혈중 GOT/GPT 농도의 측정 및 조직 염색을 수행하였다.
당뇨 유발 시, GOT는 정상 대비 1.8배 증가하며, GPT는 3.1배 증가하였으나, 미강생물전환물 투여 시에는 각각 1.4배와 1.8배로 감소하는 것으로 확인되어 당뇨에 의해 유발되는 간 손상을 효과적으로 억제할 수 있음이 확인되었다 (도 12(A)). 도 12(A)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 측정한 그래프이다.
또한, 간 조직을 적출하여 파라핀 블록 제작 후, 'hematoxylene'과 'eosin Y'로 염색하여 조직의 손상 정도를 확인한 결과, 알록산(alloxan)에 의한 당뇨 유발 시, 간 조직의 손상이 강하게 유도된 데 비해, 미강생물전환물의 투여 시, 간 손상의 정도가 완화된 것으로 확인되었다 (도 12(B)). 도 12(B)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
동일한 방법으로 췌장 조직을 염색하여 확인한 결과, 도 13과 같이 당뇨가 유발된 마우스의 췌장 조직 내 랑게르한스섬은 β-세포의 파괴로 인하여 크기가 작아졌으며, 조직이 치밀하지 못한 결과를 보이는데 비해, 미강생물전환물을 투여한 마우스의 경우, 췌장 랑게르한스섬의 조직 손상이 완화되는 것으로 확인되었다. 도 13은 미강생물전환물의 췌장 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
[ 실험예 13: 제2형 당뇨 유발 마우스에서의, 미강생물전환물의 in vivo 제2형 당뇨 억제능 평가]
본 실험예에서는 고지방식이로 인한 비만에 의해 유도되는 제2형 당뇨 마우스 모델에서 미강생물전환물의 항당뇨 효과를 평가하고자 하였다.
*
(1) 제2형 당뇨 마우스 모델에서 미강생물전환물의 투여가 체중, 간 무게, 백색지방 무게 변화에 미치는 효과 확인
당뇨 유발용 고지방식이는 'Dyet사'의 제품을 사용하였으며, 식이의 조성은 하기 표 10에 나타내었다.
component | normal diets (g/kg diet) | high-fat diets (g/kg diet) |
casein | 200.0 | 200.0 |
DL-methionine | 3.0 | 3.0 |
corn starch | 150.0 | 150.0 |
sucrose | 500.0 | 150.0 |
cellulose | 50.0 | 50.0 |
corn oil | 50.0 | |
salt mix #200000a | 35.0 | 35.0 |
vitamin mix #310025b | 10.0 | 10.0 |
choline bitartrate | 2.0 | 2.0 |
beef tallow | 400.0 |
(※ aDyets cat. no. 200000, bDyets cat. no. 310025)
한편, 미강생물전환물을 10 mg/kg의 섭취량으로 고지방식이에 섞어 식이 투여하였으며, 7주간 식이하여 제2형 당뇨를 유발하였다. 7주 후, 마우스의 체중, 간 무게, 백색지방 무게를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 11에 나타내었다.
Sample | initial weights (g) | final weights (g) | liver weights (g) | white adipose tissue weights (g) | feed intakes (g/day) |
normal control | 23.15 ± 1.75 | 31.16 ± 2.24 | 1.79 ± 0.12 | 0.41 ± 0.03 | 3.44 ± 0.22 |
HFD-control | 23.54 ± 1.43 | 35.58 ± 2.18 | 2.63 ± 0.16 | 1.77 ± 0.12 | 3.01 ± 0.19 |
HFD-10 mg/kg 미강생물전환물 |
23.48 ± 1.52 | 34.39 ± 2.56 | 2.20 ± 0.09 | 1.28 ± 0.09 | 3.03 ± 0.28 |
실험결과, 정상 마우스의 경우, 7주 간의 체중 증가가 8.01 g인데 비하여, 제2형 당뇨 유발 마우스는 12.04 g의 체중 증가가 일어났다.
고지방식이 마우스에 미강생물전환물을 투여한 경우, 10.91 g의 체중 증가를 보여 대조군 대비 체중 증가율이 감소함을 보였다. 간 무게 와 백색지방 무게 또한 당뇨 유발 대조군에 비하여 억제됨을 확인하였다. 다만, 평균 먹이 섭취량의 차이는 보이지 않았으므로 이러한 효과는 먹이의 미섭취 때문은 아닌 것으로 확인되었다.
(2) 혈당 및 혈청 내 인슐린에 미치는 효과 측정
제2형 당뇨 마우스 모델에서 혈당량 및 혈중 인슐린 농도에 미강생물전환물의 투여가 미치는 효과를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
Sample | Blood glucose (mg/dL) | Serum insulin (ng/mL) |
normal control | 113.5 ± 9.7 | 0.805 ± 0.053 |
HFD-control | 216.7 ± 10.8 | 0.412 ± 0.027 |
HFD-10 mg/kg 미강생물전환물 | 168.0 ± 8.9 | 0.489 ± 0.038 |
혈당 측정결과, 고지방식이 마우스의 경우, 혈당량이 약 1.9배 증가하였으나, 고지방식이 마우스에 미강생물전환물의 투여 시, 약 1.5배로 혈당량의 증가가 억제되었다.
혈중 인슐린 농도의 경우, 고지방식이 마우스에서 정상 대비 51.1% 수준으로 감소하여, 제2형 당뇨가 유발되는 것으로 확인되었고, 고지방식이 마우스에 미강생물전환물 투여 시, 60.7%로 회복되는 것으로 확인되었다.
(3) 당내성(glucose tolerance)에 미치는 효과
제2형 당뇨에 의한 혈당 조절 장애 측정을 위한 경구 당부하 검사를 실시하였다. 7주간 고지방식이를 섭취한 마우스를 16시간 동안 절식시킨 후, 포도당을 경구 투여하고, 30분 간격으로 마우스 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 혈당량을 측정하였다.
실험결과, 정상 마우스의 경우, 포도당 투여 시, 30분까지 혈당이 증가하며, 그 이후로 감소하기 시작하여 120분 후에는 정상 수치에 가깝게 감소하나 제2형 당뇨가 유발된 마우스의 경우, 이러한 혈당 강하 효과가 크게 감소된 것으로 확인되었다.
고지방식이 마우스에 미강생물전환물의 투여 시, 전체적인 혈당 증가폭이 감소하는 것으로 확인되었으며, 혈당 증가 억제 및 조절 능력이 뛰어난 것으로 확인되었다 (도 14). 도 14는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 효과를 나타낸 그래프이다.
(4) 지질 분석
고지방식이로 인하여 증가하는 혈청 내 지질을 분석한 결과, 제2형 당뇨 마우스의 경우, HDL의 양이 감소하며, 중성지방과 콜레스테롤, LDL의 양은 증가하는 것으로 확인되었다. 고지방식이 마우스에 미강생물전환물의 투여 시, 감소한 HDL의 양을 회복시키며, 증가된 중성지방과 콜레스테롤, LDL의 양은 억제하는 효과가 있음이 나타났다. 이는 하기 표 13에 나타내었다.
Sample | triglyceride (mg/dL) | total cholesterol (mg/dL) | HDL (mg/dL) | LDL (mg/dL) |
normal control | 112 ± 9 | 141 ± 8 | 84.2 ± 5.6 | 28.3 ± 1.7 |
HFD-control | 163 ± 12 | 169 ± 12 | 61.9 ± 6.0 | 35.7 ± 2.3 |
HFD-10 mg/kg 미강생물전환물 |
135 ± 8 | 154± 10 | 69.2 ± 5.3 | 31.0 ± 1.8 |
(5) 당 대사 관련 효소 조절능 평가
미강생물전환물의 투여가 제2형 당뇨로 인해 감소한 인슐린의 분비량을 회복시킴에 따라, G6pase, PEPCK, GCK의 활성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다.
Sample | enzyme activity (nmol/min/mg protein) | ||
G6pase | PEPCK | GCK | |
Vehicle | 62.419 ± 5.056 | 22.908 ± 1.087 | 11.524 ± 0.993 |
HFD control | 183.442 ± 10.115 | 41.438 ± 3.240 | 5.113 ± 0.427 |
HFD-10 mg/kg 미강생물전환물 |
125.019 ± 8.436 | 37.109 ± 2.053 | 7.426 ± 0.632 |
실험결과, 제1형 당뇨와 마찬가지로 미강생물전환물은 G6pase와 PEPCK의 활성을 억제하며, GCK의 활성을 회복시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이로부터, 미강생물전환물의 효소 활성 조절 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있었다.
(6) 염증성 사이토카인 분석
비만으로 인한 제2형 당뇨의 유발 기전은 아직 확실히 알려져 있지 않으나, 지방조직에서 분비하는 염증성 사이토카인(cytokine)이 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되어 있다. 따라서, 미강생물전환물의 투여가 지방조직 내 사이토카인(cytokine)의 발현과 혈액 내로 분비된 사이토카인(cytokine)에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과는 하기 표 15에 나타내었다.
Sample | serum (pg/mL) | adipose tissue (pg/mL) | |||||
TNF-α | IL-1β | IL-6 | TNF-α | IL-1β | IL-6 | ||
normal control | 2.87 ± 0.13 | 13.2 ± 1.1 | 16.9 ± 1.3 | 23.0 ± 1.1 | 58.3 ± 4.2 | 77.3 ± 5.8 | |
HFD-control | 15.2 ± 1.2 | 109 ± 8 | 58.9 ± 4.0 | 74.9 ± 5.6 | 175 ± 9 | 212 ± 16 | |
HFD-10 mg/kg 미강생물전환물 |
10.2 ± 0.8 | 78.9 ± 5.2 | 47.1 ± 2.5 | 56.0 ± 4.1 | 143 ± 11 | 155 ± 9 |
실험결과, 제2형 당뇨 유발 시, 지방조직과 혈청 내 TNF-α, IL-1β, IL-6 모두 증가하는 것으로 확인되었고, 미강생물전환물의 투여 시, 사이토카인(cytokine)의 발현이 억제되는 것으로 확인되었다.
베타세포의 인슐린 저항성에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 IL-1β의 경우, 미강생물전환물 투여 시에는 지방조직과 혈청에서 모두 감소하여 억제 효과를 보였다.
(7) 간 조직 및 췌장 조직 보호 효과
제2형 당뇨를 유발한 마우스에서 간 조직과 췌장 조직을 적출하여 염색한 결과, 당뇨 유발 시, 간에서는 조직의 손상 및 지방의 축적이 관찰되었고, 췌장에서는 랑게르한스섬의 파괴가 관찰되었다. 반면, 미강생물전환물의 투여시에는 이러한 간 조직의 손상 및 지방 축적이 완화되는 효과를 보였으며, 췌장의 랑게르한스섬 역시 보호되는 효과를 보였다 (도 15(A) 및 도 15(B)). 도 15(A)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 간 조직 보호 효과를 촬영한 사진이고, 도 15(B)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 췌장 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
[실험예 14: 간세포에서의, 미강생물전환물의
in vitro
간 보호 기능 평가]
본 실험예에서는 미강생물전환물의 알코올에 의한 간독성 억제 효과를 확인하기 위해 사람 유래 간암 세포주인 HepG2 세포주를 이용하여 실험하였다.
(1) HepG2 세포주를 이용한 세포독성 측정
1x105 cells/well의 밀도로 96 웰 플레이트(well plate)에 HepG2 세포주를 분주한 후, 1, 10, 100 ㎍/mL 농도의 미강생물전환물과 200 mM의 에탄올을 함께 처리하여 간세포의 사멸을 유도하였다. 24시간 배양 후, MTT assay를 통해 세포의 생존률을 측정하였다.
실험결과, 미강생물전환물의 처리 시, 농도 의존적으로 생존률이 증가하였으며, 100 ㎍/mL 농도에서 생존률은 80.1%로 확인되었다 (도 16). 도 16은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에 미강생물전환물이 미치는 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
(2) 에탄올 처리에 의해 유도된 ROS 소거 활성
간세포에 에탄올 처리 시, 세포의 사멸이 유도되는 기전 중 하나인 ROS의 발생을 미강생물전환물의 투여로 억제할 수 있는지 확인하였다. 미강생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 30분간 처리한 후, 200 mM의 에탄올을 30분간 처리하여 ROS의 발생을 유도하였다. 이후, ROS의 형광 표지자인 DCFH-DA를 처리하여 표지하였고, ROS에 의해 발생한 형광을 측정하였다.
실험결과, HepG2 세포주에 에탄올 처리 시 ROS가 발생되며, 형광으로 측정한 결과 대조군 대비 1.8배의 ROS가 생성되는 것으로 확인되었다. 또한, 미강생물전환물은 농도 의존적인 ROS 생성 억제 능력을 나타내었으며, 100 ㎍/mL 농도에서 30.6%의 ROS 억제 능력이 있음이 확인되었다 (도 17). 도 17은 알코올에 의해 유도되는 간세포에서 ROS 발생에 미강생물전환물이 미치는 발생 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
[ 실험예 15: 알코올에 의한 간 손상 유도 마우스에서의, 미강생물전환물의 in vivo 간 보호 기능 평가]
본 실험예에서는 in vivo 실험계에서 미강생물전환물의 알코올성 지방간 억제 효능을 확인하고자 하였다.
(1) 알코올의 투여로 유도된 알코올성 지방간 마우스 모델에서 간 무게의 변화
in vivo 실험계에서는 'Liber-Decarli' 액체기본식이를 이용한 에탄올 유도 지방간 마우스 모델을 이용하였다. 'Liber-Decarli' 액체기본식이의 조성은 하기 표 16과 같으며, 일반식이를 공급받는 일반식이군 (normal diets, AIN-93G)과 에탄올식이에 포함된 에탄올과 동일한 열량을 말토덱스트린으로 대체한 대조군 (control diet)을 포함하여 실험하였다.
component | control diets (g/kg diet) | ethanol diets (g/kg diet) |
casein (100 mesh) | 41.4 | 41.4 |
L-cystein | 0.5 | 0.5 |
DL-methionine | 0.3 | 0.3 |
corn oil | 8.5 | 8.5 |
olive oil | 28.4 | 28.4 |
safflower oil | 2.7 | 2.7 |
dextrin maltose | 115.2 | 25.6 |
cellulose | 10.0 | 10 |
choline bitartrate | 0.53 | 0.53 |
xanthan gum | 3.0 | 3.0 |
salt mixa | 8.75 | 8.75 |
vitamin mixb | 2.5 | 2.5 |
ethanol | 0 | 48 |
(※ asalt mix (g/kg mix): calcium phosphate, dibasic, 500; sodium chloride, 74; potassium citrate, monohydrate, 220; potassium sulfate, 52; magnesium oxide, 24; manganous sulfate H2O, 4.6; ferrous sulfate 7H2O, 4.95; zinc carbonate, 1.6; cupric carbonate, 0.3; potassium iodate, 0.01; sodium selenite, 0.01; chromium potassium sulfate, 0.55; sodium fluoride, 0.06; sucrose, finely powdered, 117.92./ bvitamin mix (g/kg mix): thiamin HCl, 0.6; riboflavin, 0.6; pyridoxine HCl, 0.7; niacin, 3.0; calcium pantothenate, 1.6; folic acid, 0.2; biotin, 0.02; vitamin B12 (0.1%), 10; vitamin A acetate (500,000 IU/g), 4.8; vitamin D3 (400,000 IU/g), 24; menadione sodium bisulfite, 0.08; p-aminobenzoin acid, 5; inositol, 10; dextrose, 939.)
미강생물전환물은 10 mg/kg의 섭취량으로 에탄올식이에 첨가하여 총 8주간 식이하여 에탄올에 의한 지방간 및 간염을 유도하였다.
8주 후, 마우스의 체중과 간 무게를 측정한 결과, 에탄올식이군의 경우, 간의 염증 및 지방간의 발생으로 인하여 간 무게/체중 비율이 정상 마우스 대비 13.0% 증가하는 것으로 확인되었다. 하지만, 미강생물전환물을 투여한 경우, 3.8% 증가하는 것으로 확인되어 간 조직 내 염증 반응 및 지방간 형성을 억제하는 것으로 판단되었다 (도 18). 도 18은 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 투여로 인한 간 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
(2) 혈청 내 생화학적 지표의 측정
마우스의 혈청을 분리한 후, 혈청 내 존재하는 생화학적 지표들을 측정하여 간손상 여부를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 17에 나타내었다.
Sample | Serum index (U/L) | |||
GOT | GPT | γ-GTP | billirubin | |
normal control | 63.7 ± 5.2 | 22.1 ± 1.7 | 5.56 ± 0.47 | 0.49 ± 0.03 |
control diet | 58.9 ± 4.9 | 26.7 ± 1.5 | 5.53 ± 0.39 | 0.51 ± 0.04 |
Ethanol diet-control | 75.5 ± 5.9 | 45.1 ± 3.6 | 6.38 ± 0.42 | 0.81 ± 0.05 |
Ethanol diet-10 mg/kg 미강생물전환물 |
62.9 ± 5.1 | 31.2 ± 2.9 | 5.80 ± 0.37 | 0.66 ± 0.04 |
실험결과, 에탄올에 의해 간손상이 유도된 마우스는 네 가지 생화학적 지표가 모두 증가하였으나, 미강생물전환물를 함께 투여한 경우에는 정상수치에 가깝게 감소하는 것으로 확인되었다.
*
(3) 간 조직 내 항산화물질의 변화
환원형 GSH는 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 보이지만, 알코올에 의해 간 독성이 유발되면 글루타치온(glutathione)이 산화되어 GSSG로 전환되고, 간 독성을 제어하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 간 조직 내 대표적 항산화물질인 글루타치온(glutathione, GSH)의 양과 형태를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 18에 나타내었다.
Sample | Total GSH (㎍/mg tissue) |
Reduced GSH (㎍/mg tissue) |
GSSG/GSH ratio (㎍/mg tissue) |
normal control | 4.27 ± 0.28 | 3.75 ± 0.27 | 0.16 ± 0.01 |
control diet | 4.95 ± 0.45 | 4.30 ± 0.38 | 0.17 ± 0.01 |
Ethanol diet-control | 3.82 ± 0.29 | 3.01 ± 0.21 | 0.22 ± 0.02 |
Ethanol diet-10 mg/kg 미강생물전환물 |
4.22 ± 0.30 | 3.71 ± 0.39 | 0.18 ± 0.01 |
알코올을 식이한 마우스의 경우, 총 GSH의 양과 환원형 GSH의 양이 모두 감소되어 있으며, GSSG/GSH 비율 역시 정상 대비 1.38배 증가한 결과를 보였다. 반면, 미강생물전환물을 처리한 경우, 총 GSH 양의 증가, 환원형 GSH 양의 증가가 일어났으며, 특히 GSSG/GSH 비율은 정상수치에 근접하게 감소하는 것으로 확인되었다.
(4) 간 조직 보호 효과
상기 미강생물전환물을 투여한 마우스로부터 간을 적출하여, 'hematoxylene'과 'eosin Y'로 염색한 후, 조직의 손상 및 지방축적 정도를 확인하였다.
실험결과, 정상 마우스와 대조군 식이 마우스는 간 손상 및 지방 축적이 없는데 비해 에탄올 식이 마우스에서는 간 조직의 손상과 출혈, 지방의 축적이 다량으로 일어난 것을 확인하였다. 하지만, 미강생물전환물을 투여한 경우에는 에탄올에 의한 간 손상이 강하게 억제되는 것으로 나타났으며, 지방축적 또한 매우 적게 일어나는 것으로 확인되어 미강생물전환물의 간 보호 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다 (도 19). 도 19는 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 미강생물전환물의 투여로 인한 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
[실시예 2: 면역활성 유효성분(다당체)의 분리·정제]
(1) 분리·정제공정
미강생물전환물로부터 다당체분획물을 수득하는 제조과정은 도 20과 같다. 분말화된 미강생물전환물(실시예 1)에, 약 20배수의 3차증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하였다. 수용성물질 추출 후 원심분리를 통해 잔사를 제거하고 추출상등액을 분리하였다. 추출상등액에 상등액의 4배수에 해당하는 양의 EtOH을 첨가하여 잘 섞어준 후, 4℃에서 밤새 보관하였다.
생성된 침전물을 원심분리를 통해 분리하고, 상등액을 제거한 침전물에 3차증류수를 첨가해 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하였다. 여과된 침전물용해액에 대해 투석용 튜브를 사용하여 투석을 진행하였다. 2시간에 한 번씩 3차증류수를 교체하고, 이를 10회 이상 반복하였다. 투석완료 후 동결건조를 통해 분말화하였다.
(2) 다당체분획물의 분석
다당체분획물의 분석에 사용한 기기는 Shimadzu LC 010Avp (Shimadzu Co., Japan)로, 분석조건은 아래 표 19와 같았다.
기기 | 조건 |
Instrument | SHIMADZU_HPLC, SEDEX 75_ELSD |
Column | UltrahydrogelTM 1000 (7.8x300mm) Waters, WAT011535 |
Column oven | 45 ℃ |
Flow rate | 0.6 ml/min |
Solvent | HPLC grade water |
Elution | Isocratic, HPLC water 100% |
Run time | 40 min |
Injection | 20 μl |
Sample extraction | 시료 100mg을 HPLC water 10ml로 250rpm 1시간 shaking 추출 후, 원심분리 후 분석 |
50L 발효조에서 생산된 2 배치(batch), 2톤 발효조에서 생산된 1 배치의 미강생물전환물을 사용하여 분리·정제한 다당체분획의 균일성을 확인하기 위해 반복실험을 진행하였다. 각 배치당 2번씩 반복하여 다당체분획물을 제조하였다.
각 배치 미강생물전환물의 다당체분획물에 대한 HPLC 분석 결과, 모두 저분자물질이 잘 제거되고, 면역활성 다당체의 분획이 잘 이루어졌음을 크로마토그램의 피크를 통해 확인할 수 있었다 (도 21).
다당체분획물 정제에 있어서, 50L 제1배치와 50L 제2배치의 다당체분획물 회수율은 각각 약 10.74%, 3.31%이었으며, 2톤 제1배치의 회수율은 10.92%로 나타났다 (표 20). 배치 간에 서로 차이를 보였지만, 이는 정제 순도와 함께 정제 규모에 따른 손실의 과다 여부에 의한 것으로, 각 배치의 2반복 다당체분획물의 분리·정제에 있어서, 각각 2.52, 0.86, 0.00으로 편차가 거의 없음을 확인하였다.
이를 통해 배치에 따른 다당체분획 제조공정 적용의 차이가 없음을 확인하였고, 본 발명의 공정이 재현성이 우수한 다당체분획물 제조공정임을 확인할 수 있었다.
다당체분획물 회수율(%) | 편차 | |
미강생물전환물 50L 제1배치 | 10.74 | 2.52 |
미강생물전환물 50L 제2배치 | 3.31 | 0.86 |
미강생물전환물 2톤 제1배치 | 10.92 | 0.00 |
n=2 |
한편, 미강생물전환물의 다당체분획물에 대해 제조공정별로 샘플을 채취하여, 공정에 따른 크로마토그램 패턴변화를 분석하였다. 비교물질로 상황버섯 균사체 유래의 면역활성 다당체로 항암치료에 사용되고 있는 전문의약품인 메시마캅셀550을 사용하였다.
미강생물전환물의 불용성물질을 제거한 상등액을 젤 필트레이션 (gel filtration) HPLC를 통해 분석한 결과, 도 22에서 보듯이, 16.7분 대에서 저분자물질의 피크가 나타났으며, 8.6~9.7분 대에서 고분자의 다당체분획 피크가 검출되었다.
저분자물질의 피크의 용출액과 고분자의 다당체분획 피크의 용출액에 대한 대식세포 NO생성능을 측정한 결과, 고분자의 다당체분획 피크에서만 대식세포 NO생성능이 관찰되었다.
EtOH침전공정과 투석공정을 진행 후, 저분자물질이 제거되어 분석시 저분자물질의 피크가 감소함을 확인하였고, 동결건조 후에도 큰 변화가 없음을 확인하였다.
[실험예 16: 대식세포 NO 생성 측정을 통한 대식세포 활성화능 평가]
50L 발효조와 2톤 발효조에서 각각 생산된 총 3배치의 미강생물전환물을 사용하여, 다당체분획물 분리·정제의 균일성을 확인하기 위해 반복실험을 진행하였다. 각 배치당 2번씩 다당체분획물을 제조하였고, 이들의 대식세포 NO 생성능을 측정하여 대식세포 활성화능을 평가하였다.
측정 결과, 50L 제1배치의 미강생물전환물로부터 제조한 다당체분획물들(RB_50L 제1배치-1, 2)와 제2배치의 미강생물전환물로부터 제조한 다당체분획물들(RB_50L 제2배치-1, 2), 2톤 제1배치 미강생물전환물로부터 제조한 다당체분획물들(RB_2톤 제1배치-1, 2)간, NO 생성능에서 큰 차이를 보이지 않았다. 각각의 배치에서 생산된 미강생물전환물로부터 제조한 다당체분획물들의 면역활성 역가 MEC100은 대략 1/4 ug/ml 임을 확인할 수 있었다 (도 23).
앞선 결과에서 50L 제2배치의 미강생물전환물의 다당체분획물 회수율이 3.1%로, 50L 제1배치의 미강생물전환물의 다당체분획물 회수율이 10.74%, 2톤 제1배치의 미강생물전환물의 다당체분획물 회수율이 10.92%인 것에 비해 더 낮은 회수율을 보였지만, 이상의 NO 생성능을 비교하였을 때 큰 차이가 없음을 확인하였다.
[ 실험예 17: 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴 조사 및 수용체 유추]
(1) 실험 개요
최근 면역활성을 나타내는 다당체에 의한 마크로파지(macrophage) 활성화, NK세포 자극활성 및 사이토카인(cytokine) 생산 자극 등과 같은 여러 생리활성에 대한 연구결과들이 속속 발표되고 있다.
또한, 면역활성을 나타내는 다당체의 특이적 구조가 대식세포 등 면역세포들이 세포표면에 발현하고 있는 특이수용체인 패턴인식수용체(pattern recognition receptor, PRR)에 인식되면서 신호전달을 매개한다고 밝혀지고 있다.
이러한 연구결과들에 근거하여, 앞에서 확립된 분리·정제공정을 통해 제조된 미강생물전환물의 다당체분획물도 면역세포의 특이수용체인 패턴인식수용체에 인식되어 신호전달이 매개되는지 확인하고자 하였다. 우선, 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴 비교를 통해 특이수용체(specific receptor)를 유추하였고, 이를 확인하기 위하여 유추된 특이수용체에 대한 저해제(inhibitor)를 처리하여 신호전달이 차단되는지 확인하는 실험도 함께 진행하였다.
저해제 처리 실험을 통해, 미강생물전환물에 대한 특이수용체가 패턴인식수용체의 하나인 TLR4(Toll-like receptor4)임을 확인할 수 있었으며, TLR4의 리간드(ligand)로 잘 알려진 LPS와 함께 TLR4 아고니스트(agonist)로 입증된 면역조절소재인 MPLA와의 비교를 통해, 미강생물전환물의 면역활성 특성을 조사하였다.
우선, 미강생물전환물 다당체분획물의 면역활성을 확인하기 위하여 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴을 조사하였다. 대조군 물질로는 LPS(lipopolysaccharide)를 각각 0.01 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL의 농도로 처리하였다. 미강생물전환물은 0.08 ㎍/mL, 0.8 ㎍/mL, 8 ㎍/mL의 농도로 처리한 반면, 미강생물전환물의 다당체분획물은 LPS와 동일한 농도인 0.01 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL의 농도로 실험을 수행하였다. 미강생물전환물의 처리농도 설정은 미강생물전환물로부터 다당체분획물의 회수율이 반복실험을 통해 약 12%로 나왔기 때문에 이를 근거로 하여 농도를 설정하였다.
(2) TNF-α 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 24와 같이 나타났다. 미강생물전환물의 경우, 처리농도 0.08 ㎍/mL에서부터 TNF-α가 분비되는 것을 확인할 수 있었으며, 처리농도가 증가함에 따라 TNF-α의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우, 0.01 ㎍/mL의 처리농도에서부터 TNF-α가 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 TNF-α의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 분비량 정도는 회수율을 근거로 설정한 농도에서의 미강생물전환물의 TNF-α 분비량과 비슷한 수치를 나타내었다. 또한, 미강생물전환물과 미강생물전환물 다당체분획물 모두에서 농도가 증가할수록 TNF-α 분비량이 유사하게 증가함을 확인하였다.
이를 통해 미강생물전환물에 함유된 여러물질 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 TNF-α를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다.
또한, 미강생물전환물 다당체분획물과 LPS의 TNF-α 분비량을 비교하였을 때, 0.01 ㎍/mL에서는 LPS가 더 높은 분비량을 나타냈으나, 0.1 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL에서는 서로 비슷한 정도의 TNF-α 분비량을 보였다.
(3) IL-1β 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-1β(Interlukine-1β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과, LPS, 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시).
(4) IL-4 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여, IL-4(Interlukine-4)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과, LPS, 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시).
(5) IL-5 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여, IL-5(Interlukine-5)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과, LPS, 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시).
(6) IL-6 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-6(Interlukine-6)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 24와 같았다. 미강생물전환물의 경우, 처리농도 0.8 ㎍/mL부터 IL-6가 분비되기 시작하여 8 ㎍/mL에서 IL-6의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
미강생물전환물 다당체분획물의 경우 0.01 ㎍/mL의 농도부터 IL-6가 소량 분비되기 시작하여 처리농도가 증가함에 따라 IL-6의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 미강생물전환물과 미강생물전환물 다당체분획물의 농도가 증가할수록 IL-6 분비량이 유사한 분비량을 보임을 확인하였다.
이를 통해 미강생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IL-6를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다.
미강생물전환물 다당체 분획물과 LPS의 IL-6 분비량을 비교하였을 때, 0.01 ㎍/mL 및 0.1 ㎍/mL의 농도에서는 LPS에 의한 IL-6의 분비량이 낮게 나타났으나, 1 ㎍/mL의 농도에서는 서로 비슷한 정도의 IL-6 분비량을 보였다.
(7) IL-10 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-10(Interlukine-10)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 24와 같았다. 미강생물전환물의 경우, 8 ㎍/mL에서 IL-10의 분비량이 측정되는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우, 1 ㎍/mL에서 IL-10의 분비량이 측정되었다.
미강생물전환물과 미강생물전환물 다당체분획물의 IL-10 분비량이 고농도에서 유사하게 측정된 것을 확인하였다. 이를 통해 미강생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IL-10을 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다.
LPS의 IL-10 분비량을 비교하였을 때, 0.01 ㎍/mL의 처리농도에서부터 IL-10이 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 IL-10의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물과 비교하여 1 ㎍/mL에서 LPS 보다 미강생물전환물 다당체분획물에서 IL-10의 분비량이 더 높게 나타났다.
(8) IL-12p70 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-12p70(Interlukine-12p70)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과, LPS, 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시).
(9) IFN-β 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IFN-β(Interferon-β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 24와 같았다. 미강생물전환물의 경우, 처리농도 0.08 ㎍/mL에서부터 IFN-β가 분비되는 것을 확인할 수 있었고, 처리농도가 증가함에 따라 IFN-β의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우, 0.01 ㎍/mL의 처리농도부터 IFN-β가 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 IFN-β의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 분비량 정도는 회수율을 근거로 설정한 농도에서의 미강생물전환물의 IFN-β 분비량과 비슷한 수치를 나타내었다. 또한, 미강생물전환물과 미강생물전환물 다당체분획물의 IFN-β 분비량이 농도가 증가할수록 유사하게 증가함을 확인하였다.
이를 통해 미강생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IFN-β를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다.
LPS의 IFN-β 분비량을 비교하였을 때, 농도 의존적으로 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물과 비교하여 모든 농도에서 LPS가 상대적으로 약간 높게 나타났다.
(10) 결과 분석
미강생물전환물의 면역활성 관련 사이토카인을 분석한 결과, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 미강생물전환물의 상기 면역활성은 다당체분획물에 기인한 것임을 확인할 수 있었다.
비교물질인 LPS와 비교평가시, LPS에서도 TNF-α, IL-6, IFN-β의 사이토카인 분비 패턴이 미강생물전환물 다당체분획물과 유사함은 물론 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-12p70도 함께 분비되지 않음을 확인할 수 있었다.
LPS는 TLR4(Toll-loke receptor4)에 인식되는 물질로 잘 알려져 있는 바, 이를 통해 미강생물전환물 다당체분획물이 TLR4에 인식되어 신호를 매개할 것이라 유추해석할 수 있었다.
한편, TNF-α는 탐식작용 시 대식세포와 단핵세포 등에서 분비되며, 유도성 NO (inducible nitric oxide; NO)와 함께 독감바이러스 등의 다양한 바이러스에 대하여 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, IL-6는 항원 특이 면역반응, 염증반응, 급성반응에서의 주요 중개자(mediator)이며, 생체내 방어체계에서 핵심역할을 담당하는 대표적 사이토카인이다. 또한, IFN-β는 IFN-α와 함께 타입-I 인터페론으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며, 특히 Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다.
결론적으로 본 발명의 미강생물전환물은 활성화시킨 대식세포에서 인터페론-β의 생성이 유도됨을 확인하여, Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 소재로 판단되며, 이들의 면역활성은 모두 고분자 다당체분획물에 의해 나타남을 확인할 수 있었다.
[실험예 18: 수용체(receptor) 확인]
(1) 실험 개요
현재까지 개발된 많은 면역소재의 경우, 대부분 수용체(receptor)가 확인되고 있지 않으며, 일부 베타글루칸 제품만이 주로 덱틴(dectin)-1 이라는 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 베타글루칸 제품조차도 불용성소재의 경우 덱틴-1에 결합하는 반면, 수용성소재는 덱틴-1에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다.
수용체가 알려져 있으면, 바이오마커(biomarker)가 확정될 수 있으며, 이를 바탕으로 의약품 및 동물용의약품 개발의 임상시험에 있어서도 바이오마커 설정에 활용이 가능하다는 장점이 있다.
앞선 실험결과들을 바탕으로 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물의 수용체가 TLR4임을 유추한 바, 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물이 TLR4에 특이적으로 인식되어 신호를 매개하는 것인지 확인하기 위하여 TLR4에 대한 특이적 저해제인 TAK-242를 사용하여 최종 확인하고자 하였다.
(2) TNF-α 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 25와 같이 나타났다. LPS의 경우, 0.01 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도에 있어서, TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 1 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물의 경우에서도 0.08 ㎍/ml 및 0.8 ㎍/ml의 농도에 있어서, TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때 TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 8 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, 0.01 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도에 있어서 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 1 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시, TNF-α의 분비가 완전히 차단되거나 매우 크게 대폭 감소되는 결과에 근거하여 미강생물전환물과 미강생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 TNF-α 분비 신호가 매개됨을 확인할 수 있었다.
(3) IL-6 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-6(Interlukine-6)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 25와 같이 나타났다. LPS의 경우 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IL-6의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물의 경우에도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IL-6의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, 3가지 농도 모두에서 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IL-6의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시, IL-6의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 미강생물전환물과 미강생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IL-6 분비 신호가 매개됨을 확인하였다.
(4) IL-10 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-10(Interlukine-10)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 25와 같았다. LPS의 경우, 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IL-10의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물의 경우에도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IL-10의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IL-10의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시 IL-10의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 미강생물전환물과 미강생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IL-10 분비 신호가 매개됨을 확인하였다.
(5) IFN-β 분비량 평가
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IFN-β(Interferon-β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.
분석 결과는 도 25와 같았다. LPS의 경우 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IFN-β의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물의 경우에도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IFN-β의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다. 미강생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IFN-β의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시, IFN-β의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 미강생물전환물과 미강생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IFN-β 분비 신호가 매개됨을 확인하였다.
(6) 결과 분석
미강생물전환물의 대식세포 면역활성은 다당체분획물에 의해 나타남을 확인하였으며, 대식세포 활성화에 의해 나타나는 반응들이 TLR4 특이적 저해제인 TAK242에 의해 모두 억제됨을 확인함으로써, TLR4가 미강생물전환물의 수용체임을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 본 발명에서 추구하는 생물전환공정에 의해 생산된 미강생물전환물 및 미강생물전환물 다당체분획물이 TLR4 아고니스트의 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (6)
- 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 액상배지를 제조하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하며,
상기 미강생물전환물은 다당체(polysaccharide)인 것을 특징으로 하는 당뇨개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 미강생물전환물은,
당뇨로부터 발생하는 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하는 것을 특징으로 하는 당뇨개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 다당체는,
단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가);
상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나);
상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다);
상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라);
상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및
상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 당뇨개선용 식품 조성물.
- 미강에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 액상배지를 제조하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 미강생물전환물을 함유하며,
상기 미강생물전환물은 다당체(polysaccharide)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 미강생물전환물은,
당뇨로부터 발생하는 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 다당체는,
단계 (c)를 통해 수득한 미강생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가);
상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나);
상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다);
상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라);
상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및
상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020170072512A KR101814164B1 (ko) | 2017-06-09 | 2017-06-09 | 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 |
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KR1020170072512A KR101814164B1 (ko) | 2017-06-09 | 2017-06-09 | 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 |
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KR1020160160737A Division KR101771209B1 (ko) | 2015-11-30 | 2016-11-29 | 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 |
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KR101814164B1 true KR101814164B1 (ko) | 2018-01-03 |
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ID=61002112
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KR1020170072512A KR101814164B1 (ko) | 2017-06-09 | 2017-06-09 | 미강생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물 |
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Country | Link |
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KR (1) | KR101814164B1 (ko) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005213211A (ja) * | 2004-01-30 | 2005-08-11 | Noda Shokukin Kogyo Kk | 血糖値上昇抑制剤 |
-
2017
- 2017-06-09 KR KR1020170072512A patent/KR101814164B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2005213211A (ja) * | 2004-01-30 | 2005-08-11 | Noda Shokukin Kogyo Kk | 血糖値上昇抑制剤 |
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