KR101810965B1 - 알코올로 유발된 간 기능 저하를 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물 - Google Patents
알코올로 유발된 간 기능 저하를 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변 완화시키는데 효과적이다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변 완화시키는데 효과적이다.
Description
본 발명은 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변 완화시키는데 효과적이다.
간질환은 지방변성에서 간염, 간섬유화성 간경변증 및 간암에 이르기까지 넓은 스펙트럼의 병리학적 진행 단계를 보여준다. 이러한 여러 형태의 간질환은 바이러스, 독성약물, 화학물질, 내분비·대사 질환 및 알코올 등 다양한 원인들에 의해 발생할 수 있다. 그중에서 전세계적으로 간질환의 가장 흔한 원인이 알코올 남용에 있으며, 미국, 유럽에서는 사망률이 5~6%에 이른다. 특히, 만성 알코올성 간질환 중에서 간섬유화로의 진행은 10~15%에 이른다.
간은 알코올 대사에 중요한 기관이지만 알코올을 처리하는 능력에는 일정한 한계가 있기 때문에 지나친 알코올 섭취는 대사 장애를 초래하게 된다. 알코올 대사과정에서 간손상과 직·간접적으로 관련된 몇가지 중간매개 물질들이 있다. 술에 함유된 에탄올은 위장관계에서 흡수된 후에 거의 대부분 간에서 대사된다. 알코올은 주로 간에서 alcohol dehydrogenase(ADH), cytochrome P450 2E1(CYP2E1), catalase 등 3가지 효소계에 의해 acetaldehyde로 대사되지만 과량의 알코올 섭취 시 microsomal ethanol oxidizing system(MEOS)에 의하여 acetaldehyde로 대사된다.
알코올이 산화되어 만들어지는 acetaldehyde는 숙취의 주요한 원인이고 알코올에 비해 반응성이 높아 독성이 강하므로 알코올성 간손상의 원인물질로 작용한다. Acetaldehyde에 의한 독성으로는 미토콘드리아의 기능저해로 인한 간염 및 간경변증, ALDH의 활성도 감소, 비타민의 활성억제, 심장 및 근육단백질 합성억제 등이 보고된 바 있다. (도 1 참조)
또한, 만성적인 알코올의 섭취는 간세포 내 NADH/NAD+의 비율을 증가시켜 탄수화물, 단백질 및 지질대사의 장애가 일어난다. 특히 간에서의 지방대사 장애로 인하여 지방산의 합성이 증가되고 산화가 억제되어 지방간이 유발되고 알코올성 간염이나 간경변증이 발생할 수 있다. 그리고 알코올을 장기간 섭취하면 MEOS의 활성이 강화되고 MEOS에 의한 에탄올의 산화가 증가되어 superoxide, hydroxyl radical 등 oxygen radical이 정상적인 조건에서 보다 4~8배 이상 많이 생성된다. Oxygen radical은 세포막에 다량 함유되어 있는 철, 구리, 망간 등의 금속이온과 함께 세포막의 인지질에 함유되어 있는 불포화지방산과 결합하여 지질과산화물을 생성한다. 지질과산화는 산화적 세포손상을 촉진시키고 간 손상을 유발하며 간세포의 세포사멸을 증가 시킨다.
따라서 알코올의 장기 섭취에 의해 간 손상이 일어나 간세포가 파괴되면 혈중의 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), GGT, ALP 및 LDH의 활성이 높아지게 되어, 이러한 간내 효소들의 혈중 활성정도로 간세포손상을 예측할 수 있다. 산화적 스트레스로 인해 생성된 reactive oxygenspecies (ROS)를 제거하기 위해서는 인체내 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione S-transferase(GST), glutathione peroxidase(GSH-px) 등과 같은 항산화효소의 활성을 증가시키고 식이를 통해 비타민이나 polyphenol류와 같은 항산화제를 공급함으로써 세포의 산화적 손상을 막을 수 있다. 그러나 합성 항산화제에 대한 소비자의 기피 성향과 합성 항산화제가 대량으로 투여된 동물 실험에서 발암성이 보고되고 있어 합성 항산화제의 사용에는 주의가 필요하다. 이로 인하여 효력이 탁월하고 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명은 상심자, 인진호, 노근 및 별갑을 주성분으로 하는 숙취 해소용 한방 복합 제제인 Hepaton extract(이하 HTX로 표기)의 숙취해소 효능과 간 기능 보호 효능을 실험적으로 검증하고자 하였으며 이를 위해 먼저 알코올을 투여한 실험용 쥐에서 알코올 대사와 관련된 주요효소인 alcohol dehydrogenase (ADH) 와 acetaldehyde dehydrogenase-2(ALDH2)의 효소활성 (enzyme activity)과 유전자 발현량 (gene expression)을 분석하였다. 그리고, 항산화계 효소인 SOD, catalase, GST의 활성과 간조직내 과산화지질의 분해산물인 malondialdehyde(MDA) 함량을 측정하여 지질산화에 대한 영향을 평가하고, 간의 섬유화 변성에 있어 주요 biomarker인 간조직내 하이드록시프롤린(Hydroxyproline)에 대한 정량적 분석을 하였다.
이를 통하여, 본 연구에서는 HTX가 Rat의 간 기능개선, 항산화 효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변등의 간 손상을 저하시키는데 유효한지 평가하여 간 기능개선 건강기능식품 및 천연물 신약의 소재로서 개발 가능성을 알아보고자 연구하였다. (도 2 참조)
한편, 선행특허문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0442771호에 상심자가 숙취 해소용 음료에 사용된 것이, 대한민국 등록특허공보 제10-0758267호의 숙취 해소용 조성물에 포함되는 약재로서 인진쑥이, 대한민국 등록특허공보 제10-0528388호에 오가피, 노근, 모과, 앵두 및 저두강의 추출물을 숙취 해소용 조성물의 유효성분으로 이용하는 것이, 대한민국 등록특허공보 제10-0647720호에 별갑이 숙취해소 식품에 사용되는 것이 각각 기재되어 있다. 그러나 상기 선행특허문헌들은 주로 숙취 해소에만 기술적 특징이 있는 것으로서, 간 손상을 억제하여 간 기능을 제고시켜주는 데에까지는 나아가지 못하였다.
본 발명은 천연물을 이용함으로써 부작용없이 알코올로 인한 간 손상을 억제할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은, 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에서, 상기 혼합 추출물은, 상심자 4~8 중량부, 노근 3~7 중량부, 인진호 1~5 중량부 및 별갑 1~5 중량부를 혼합하여 추출한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 혼합 추출물은, 200~400 mg/kg (마우스 기준, 경구투여)을 기준 농도로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 조성물은, 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변 완화시키는데 효과적인 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 식품 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은, 천연물을 이용함으로써 부작용없이 간 독성을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변등의 간 손상을 완화시키는데 효과적이다.
도 1은 알코올로 유도되는 간 독성으로 인한 간 손상의 기전을 개략적으로 도시한 그림이다.
도 2는 알코올로 유도되는 간독성을 본 발명에 따른 조성물이 억제하는 기전을 개략적으로 도시한 그림이다.
도 3은 체중, 간 및 비장 무게의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 ADH와 ALDH2 활성도와 아세트알데히드 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 RT-PCR 분석을 통한 ADH와 ALDH2 mRNA 유전자의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 간 기능 효소에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7 및 도 8은 항산화 효소 및 과산화지질에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 간조직내 하이드록시프롤린에 대한 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 간 조직의 병리학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 알코올로 유도되는 간독성을 본 발명에 따른 조성물이 억제하는 기전을 개략적으로 도시한 그림이다.
도 3은 체중, 간 및 비장 무게의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 ADH와 ALDH2 활성도와 아세트알데히드 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 RT-PCR 분석을 통한 ADH와 ALDH2 mRNA 유전자의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 간 기능 효소에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7 및 도 8은 항산화 효소 및 과산화지질에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 간조직내 하이드록시프롤린에 대한 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 간 조직의 병리학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
제조예
1. 간 독성에 따른 간 손상을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 약학적 조성물
1)
상심자
,
노근
,
인진호
및
별갑을
혼합 추출한다.
각 약재의 약용부위에 맞게끔 수치된 상심자(Mori Fructus), 노근(Phragmitis Rhizoma), 인진호(Artemisiae Capillaris Thunberg) 및 별갑(Trionycis Carapax)를 혼합 추출한다. 바람직하게, 6:5:3:3의 중량비율로 혼합하여 추출한다.
2) 상기 혼합추출물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제조한다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형 제형으로 제조한다.
여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
또한 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.
상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 제조예에 따른 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 제조예에 따른 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.
제조예
2. 간 독성에 따른 간 손상을 개선할 수 있는 식품 조성물
상기 제조예 1과 동일하게 혼합 추출물을 제조하고 이를 유효성분으로 하는 식품 조성물을 제조한다.
본 발명에 따른 식품 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 각종 식품류, 건강보조식품, 차, 과자류, 껌, 차, 비타민 복합제 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증, 통증 및 가래의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 자초를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리통 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 일긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 채소 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
제조예
3. 간 독성에 따른 간 손상을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 약학적 조성물
제조예 1의 혼합 추출과정에서, 구기자(Lycii Fructus), 백출(Atractylodes macrocephala Koidzumi), 지실(Ponciri Fructus Immaturus), 치자(Gardeniae Fructus) 중 선택적으로 1개 이상의 소재를 추가하여 혼합 추출할 수 있다. 중량비율면에서는, 상심자 6 중량부에 대하여, 구기자, 백출, 지실 또는 치자는 1~2중량부로 추가 혼합될 수 있다.
제조예
4. 간 독성에 따른 간 손상을 개선할 수 있는 식품 조성물
제조예 2의 혼합 추출과정에서, 구기자, 백출, 지실, 치자 중 선택적으로 1개 이상의 소재를 추가하여 혼합 추출할 수 있다. 중량비율면에서는, 상심자 6 중량부에 대하여, 구기자, 백출, 지실 또는 치자는 1~2중량부로 추가 혼합될 수 있다.
참조예
1. 실험준비 및 방법
[실험동물]
실험동물은 (주) 샘타코(경기 오산)로부터 구입한 웅성 Sprague-Dawley(스프라그-돌리)계 흰 쥐(체중 230g)을 사용하였다. 동물은 일정한 온도 (23±1℃)와 규칙적인 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 조절되는 동물실에서 사육되었고 사료와 음수가 자유롭게 공급되었으며, 일주일간의 적응기간을 거친 후 본 실험에 사용하였다.
[급성 :
실험군
분류 및 처치]
급성 알코올 중독 실험에서의 쥐 실험군은 알코올 단독투여 대조군, Silymarin 투여군, HTX 투여군의 세 군으로 나누었으며, 먼저 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 에탄올의 흡수 방해 현상을 배제하기 위해 알코올을 경구투여하기 전에 18시간 동안 절식시켰다.
알코올 투여 30분전에 Silymarin투여군에는 Silymarin(50mg/kg)을, HTX 투여군은 400mg/kg 고농도의 HTX를 경구 투여하였고, 모든 군에 에탄올을 체중kg 당 4 g 수준으로 1회 경구 투여하였다.
시간 경과에 따른 혈중 에탄올 농도와 아세트알데히드 농도 변화를 측정하기 위해 에탄올 경구투여 후 1, 2, 3, 5시간 후에 채혈을 실시하였다. 혈액은 4℃, 3000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 얻고, 즉시 -80 ℃의 초저온냉동고에 넣어 급속 동결시켜 보관하였다.
[만성 :
실험군
분류 및 처치]
만성 알코올 중독 실험에서의 쥐는 정상식이군 (Normal, n=6), 무처치 알코올 단독투여 대조군 (Control, n=6), Silymarin투여군(Silymarin, n=6), 저농도 HTX(200mg/kg)투여군(n=6) 및 고농도 HTX(400mg/kg)투여군(n=6)의 다섯 군으로 분류하였다.
실험기간은 4주 동안이며 매일 오전 10시에 1회씩 같은 시각에 알코올을 투여하였으며 투여 30분전에 Silymarin 투여군과 HTX 투여군에는 각각 Silymarin(50mg/kg), 저농도 HTX (200mg/kg) 와 고농도 HTX (400mg/kg)를 경구 투여하였다.
알코올은 체중 kg 당 4g 수준으로 경구 투여하였고, 정상군은 아무런 조건도 주지 않았다.
실험 15일째, 투여 5시간 후에 모든 군의 실험동물로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 4℃, 3000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 얻고, 즉시 -80℃의 초저온 냉동고에 넣어 급속 동결시켜 보관하였다.
[시료 제조]
한약 복합제제 추출물(Hepatone, HTX)은 상심자, 노근, 인진호 및 별갑을 이용하여 제조되었으며 각각의 한약재를 혼합하여 열탕 가열하여 추출하였다. (상심자 : 노근 : 인진호 : 별갑 = 6 : 5 : 3 : 3, 혼합중량비)
본 복합 제제의 열탕 추출액 제조는 다음과 같다. 5000ml 용량의 볼 플라스크에 세종 C&C로 부터 구입한 각 한약 제제 총 600g을 증류수 3L에 30분가량 담가 불려 놓는다. Multiple Roat Mantle (TOPS Co., 모델명 MS-EAM-JM) 약탕기에서 1.5시간을 끓인 후 거즈로 걸러서 추출액만 플라스크에 모은다. 약액을 플라스크에 담고 감압농축기 (R-124A, Buchi Ltd., Switzland)를 이용하여 감압농축 한다. 농축된 약액을 식힌 후, deep freezer (Upright type #725, Forma Scientific Co. USA) 에서 overnight 방치하여 충분히 얼린 후, 72시간 동안 완전히 동결건조(Telstar Lioalfa-6, Spain)시켰다.
[체중, 간 및 비장 무게 변화 측정]
실험기간 동안 체중 측정은 2일 간격으로 일정시간에 측정하였으며, 식이섭취로 인해 체중 변화 오차를 줄이고자 체중 측정 1시간 전에 사료를 제거하여 측정하였다. 간, 비장 조직은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 멸균된 생리식염수로 세척하고 여과지로 표면의 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.
[혈중 에탄올과 아세트알데히드 농도 측정]
혈청에 함유되어 있는 에탄올과 아세트알데히드는 에탄올 측정용 kit(#10-176-290-035, R-Biopharm, Germany)와 아세트알데히드 측정용 kit(#10-668-613-035, R-Biopharm, Germany)를 이용하여 측정하였다. 에탄올은 ADH에 의해 산화되어 아세트알데히드를 생성하고, 아세트알데히드는 ALDH에 의해 산화되어 acetate를 생성한다. 이 과정에서 NAD+가 NADH로 환원되므로 NADH양의 변화를 340nm에서의 흡광도 변화로 측정하게 된다.
[
ADH
,
ALDH2의
활성도와 RT-
PCR
분석]
에탄올 경구 투여 후 1시간 후에 간 전체를 적출하여 호모게나이져를 사용하여 균질화시킨 후 total RNA를 분리하였다. total RNA는 TRIzolTM (Life Technologies Ltd., MD, USA)을 사용하여 protocol에 따라 분리 정제하였으며 추출 후에는 분광분석기로 260nm에서 정량한 후 -80℃에서 보관하였다.
1 μg의 total RNA를 65 ℃에서 15분 동안 denaturation 시킨 후, 200 U moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (GIBCO BRL, MD, USA)를 이용하여 최종 부피가 20 μl 인 반응 혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.4 mM의 각 primer와 0.5 U Taq polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan)을 포함한 20 μl의 반응 혼합액에서 PTC-100 Programmable Thermal ControllerTM(MJ Research, Waltham, MA, USA)를 사용하여 증폭되었다.
각각의 primer는 Genbank에 기록된 염기서열을 토대로 적당한 부위를 선택하여 제작하였다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동(electrophoresis)하여 확인하였다. gel 상의 band intensity는 Image Master TotalLabTM (Amersham Biosceinces, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 분석하였고 내부 표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다.
[지표 물질 측정]
혈중 간 기능 지표 효소(Serum biochemical parameters, AST, ALT, GGT, ALP, LDH)의 측정은 통상적인 방법에 의해 수행되었다. 또한, 간 조직의 중성지방, 항산화효소 활성 및 과산화지질 함량은 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 측정과 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances) 방법에 의해 수행되었다. 또한, SOD(Superoxide Dismutase, 과산화물 제거효소) 및 CAT(catalase, 과산화수소 분해효소) 측정은 분석키트(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan, the manufacturer’ protocol)로 수행되었다. 또한, GSH(glutathione 글루타치온), GSH-Px(glutathione peroxidase 글루타치온 과산화효소) 및 GSH-Rd(glutathione reductase 글루타치온 환원효소)의 측정은 Ellman의 방법, Ursini의 방법 및 Smith의 방법으로 각각 수행되었다. 또한, 간 섬유화의 주요 표지물질인 히드록시프롤린의 측정은 Fujita방법에 의해 수행되었다.
[통계처리] 모든 실험 결과는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 다중분석을 위하여 Tukey's test를 사후검정으로 실시하여 95 % 신뢰 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
실험예
1. 체중, 간 및 비장 무게 변화 분석
도 3은 체중, 간 및 비장 무게의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다. (#P<0.05, ##P<0.01 compared with the normal group. *P<0.05, **P<0.01 compared with the alcohol group)
도 3을 살펴보면, 실험기간 동안 실험동물의 체중 증가량 및 간, 비장 무게 변화에는 통계적으로 처리군간 유의적인 차이는 없었다.
실험예
2. 간의 에탄올 대사효소 활성과 혈장 아세트알데히드 농도 분석
도 4는 ADH와 ALDH2 활성도와 아세트알데히드 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.(* Values are expressed as the mean ± S.E . NS:Not significant, Means in a row not sharing a common letter are significantly different among groups (P<0.05))
도 4를 살펴보면, 무처치 대조군의 혈중 아세트알데히드 농도는 에탄올 투여 후 1시간 후 부터 5시간 후까지 점차 높아지는 양상을 보였다. 그에 비해 HTX군의 혈중 아세트알데히드 농도는 무처치 대조군과 Silymarin 투여군과 비교할 때 1시간째에 유의하게 높은 수준에 이른 후, 5시간째에 유의하게 감소하였다.
도 5는 RT-PCR 분석을 통한 ADH와 ALDH2 mRNA 유전자의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.(Expression of GAPDH , ADH and ALDH2 mRNAs in rat liver. Lane 1: non-treated alcohol only group (Control, n=3); lane 2: Silymarin -treated group(n=5), lane 3: HTX -treated group(n=5). Each PCR product was normalized to GAPDH., GAPDH, 579bp; ADH, 520bp; ALDH, 323bp)
도 5를 살펴보면, 알코올대사에서 중요한 역할을 하는 ADH와 ALDH2 유전자의 발현 정도를 비교해 보기 위해 알코올을 경구 투여한 후 1시간 후에 간을 적출하여 RT-PCR분석을 실시하였다. HTX군에서 ADH의 mRNA 발현은 Silymarin투여군에 비해 68% 증가하였고 통계적으로 유의하였다. ALDH2의 mRNA 발현은 HTX군에서 Silymarin투여군에 비해 38% 증가하였다.
실험예
3. 간 기능 효소에 미치는 영향
도 6은 간 기능 효소에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 에탄올 및 HTX 투여 후 혈청 중 AST, ALT, GGT 및 LDH 활성을 분석한 결과이다.(P<0.01)
에탄올을 단독 투여한 대조군(control)의 경우 혈청내 AST, ALT, GGT, ALP, LDH 활성은 정상 식이군(normal)에 비해 각각 61.86%, 148.34% 및 45.97%로 유의하게 증가하였다.
HTX(200 mg/kg BW) 투여군은 ALT 및 GGT가 52.63% 및 29.90% 유의하게 감소하였고, AST 및 LDH의 경우 감소하는 것으로 나타났으나 통계적으로 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.
HTX(400 mg/kg BW) 투여군의 경우 AST, ALT, GGT ALP 및 LDH가 각각 41.66%, 68.14%, 30.76% 및 37.58% 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.
일반적으로 AST, ALT 활성은 간 질환시 증가하며 고지방식, 알코올 등으로 지방간이 유발되거나 간에 유해물질이 존재할 때 간세포가 손상되어 혈액 속으로 AST, ALT 유리가 증가되어 효소활성도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 HTX가 AST, ALT, GGT, ALP 및 LDH 활성을 유의하게 감소시키는 것으로 보아 HTX가 간세포의 손상을 억제함으로써 간을 보호하는 것으로 사료된다.
실험예
4. 항산화 효소 및 과산화지질에 미치는 영향
도 7 및 도 8은 항산화 효소 및 과산화지질에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.(도7 :* Values are expressed as the mean ±S.E. NS:Not significant, Means in a row not sharing a common letter are significantly different between groups (P<0.05), 도8 : Nine male Sprague Dawley (SD) rats per group were treated with alcohol together with HTX (200, 400 mg kg), silymarin ( 50 mg kg), or distilled water. At the end of the experiment, MDA , superoxide dismutase (SOD), catalase , glutathione reductase ( GSH -red), glutathione peroxidase ( GSH -px) and GSH were determined in the liver tissues. #p < 0.05, ##p < 0.01, compared with the normal group, *p < 0.05, **p < 0.01, compared with the alcohol group.)
만성적인 알코올 섭취는 알코올 대사과정 중 산화적 스트레스를 유발하여 ROS(reactive oxygen species)를 생성하며, NADH의 전자전달체계 방해로 인해 미토콘드리아 내에 생성된 ROS는 지질산화를 일으켜 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)를 생성하고 간세포 내 염증반응을 유발하여 간 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
산화적 스트레스로 인해 생성되는 ROS는 생체 내 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), xathine oxidase(XO), glutathione peroxidase(GSH-Px) 등의 항산화효소들에 의해 대부분 소거되지만, 과량의 ROS 생성으로 인해 항산화 방어계의 균형이 깨지면 각종 질환의 발생 및 노화가 촉진된다. 따라서 항산화 효소의 활성이 증가하게 되면 세포손상을 막아 질환의 발생과 노화 촉진을 억제할 수 있다고 보고되어 왔다.
본 HTX를 실험동물에 투여하였을 때 SOD 활성변화를 나타낸 결과는 도 7 및 8과 같다. 에탄올을 단독 투여한 대조군의 경우 정상식이군과 비교하여 SOD 활성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며, HTX 투여군에서는 SOD 활성이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.
도 8에서 보는 바와 같이 간 조직 내 과산화지질의 분해산물인 MDA 함량을 측정한 결과 에탄올을 단독 투여한 대조군에서 MDA 함량이 가장 높게 나타났다. 그러나 HTX를 투여한 처리군에서는 대조군과 비교하여 MDA 함량이 감소하는 것으로 나타났으며, HTX를 400 mg/kg BW 투여군에서 MDA 함량이 유의적로 감소하였다(P<0.05).
실험예
5.
간조직의
하이드록시프롤린에
대한 영향
도 9는 간조직내 하이드록시프롤린에 대한 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. (Rats were orally administered 30% alcohol ( 10 mL /kg) with or without Hepaton extract ( HTX ; 200 or 400 mg /kg) for 4 wk. Hydroxyproline contents in the liver tissue were measured. Data are expressed as means ± SD (n = 6-9). aP < 0.05 vs normal group, bP < 0.01 vs normal group, cP < 0.05 vs control group.)
하이드록시프롤린은 콜라겐 단백질의 주성분으로 간의 섬유화 변성에 있어 주요 biomarker 이다. 본 연구에서 간조직내 하이드록시프롤린의 양이 정상군에 비해 알코올 단독 투여 대조군에서 2.4배 유의하게 증가되었으며, HTX 투여군에서 유의하게 이러한 변화를 정상화시켰다. 이러한 결과는 HTX가 간손상 억제 작용이 있으며 특히, 간조직의 섬유화를 막아 간경화발생을 억제시키는데 효과가 있음을 보여주고 있다.
실험예
6. 간 조직 병리학적 분석
도 10은 간 조직의 병리학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.( (A) Mildly degenerative change around central venule is noted in control group (H&E, ×20). (B) Section shows well preserved lobular architectures with no evidence of liver damage in HTX treated group (H&E, ×20) in a 4-week alcohol ingestion rat model.)
간조직 병리소견 상, 알코올을 투여한 대조군에서 미세공포와 풍선모양세포변성이 중심정맥주변에서 관찰되었으며(A), HTX를 처리한 경우에는 거의 정상군과 유사한 정상 간조직 형태를 보였다(B). 세포괴사 혹은 세포사멸 현상의 경우 대조군에서 세포사멸 현상을 국소적으로 관찰하였으나, HTX를 처리한 경우 세포괴사 혹은 세포사멸 현상은 관찰되지 않았다.
참조예
2.
실험예들의
총괄 분석
상기 실험들에서는, 에탄올을 투여한 쥐에서 HTX가 간 기능 개선 및 혈청지질의 변화에 미치는 효과를 검증하고 향후 간 기능개선 건강기능식품 개발 소재로써의 가능성을 확인하고자 하였다.
HTX를 알코올로 간 독성 유발한 실험쥐에게 경구투여한 후 정상식이군, 알코올 단독 투여군, 저농도 HTX (200 mg/kg BW)투여군, 고농도 HTX (400 mg/kg BW) 투여군 및 실리마린(Silymarin 50mg/kg) 투여 대조군으로 나눠 실험하였다. 실험 결과 실험기간 동안 실험동물의 체중 증가량 및 간 무게 변화에는 통계적으로 처리군 간 유의적인 차이는 없었다. 실험종료 후 혈청과 간 조직을 사용하여 분석한 결과, 간 기능의 주요 지표인 AST, ALT 및 GGT 효소 활성 측정 결과 정상 식이군에 비해 알코올 투여군에서 각 효소 활성이 유의하게 증가하였으며, LDH의 경우 정상식이군에 비해 증가하는 것으로 나타났으나 처리군 간 유의성은 없었다. HTX 저농도 투여군의 경우 ALT 및 GGT 활성이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, 고농도 투여군에서는 AST 및 LDH 활성도 유의하게 감소함을 알 수 있었다. 또한 에탄올을 단독 투여한 처리군의 경우 정상식이 군에 비하여 중성지방 함량이 유의하게 증가하였으며, HDL-콜레스테롤 함량이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. HTX 투여군에서는 중성지방 함량이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며, HDL-콜레스테롤의 경우 함량이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.
간 조직에서 항산화효소 활성 및 과산화지질 함량을 알아보고자 SOD 활성 측정 결과 에탄올을 단독 투여한 대조군에서는 정상 식이군과 비교하여 SOD 활성이 유의하게 감소하였으며, HTX 투여군에서는 SOD 활성이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 간 조직 내 과산화지질의 분해산물인 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 함량을 측정한 결과 에탄올을 단독 투여한 대조군에서 MDA 함량이 가장 높게 나타났고 HTX 투여군에서 MDA 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 그리고 간의 섬유화 변성의 주요 표지물질인 하이드록시프롤린(Hydroxyproline)의 분석에서 간조직내 하이드록시프롤린의 양이 정상군에 비해 알코올 단독 투여 대조군에서 2.4배 유의하게 증가되었으며, HTX 투여군에서 유의하게 이러한 변화를 정상화시켰다. 이러한 결과는 HTX가 간손상 억제 작용이 있으며 특히, 간조직의 섬유화를 막아 간경화발생을 억제시키는데 효과가 있음을 보여주고 있다. 간 조직 염색결과 알코올을 투여한 대조군에서 미세공포와 풍선모양세포변성이 중심정맥 주변에서 관찰되었으며, HTX를 처리한 경우에는 거의 정상군과 유사한 정상 간 조직 형태를 보였다. 이상의 결과로 보아 HTX가 쥐의 간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변등의 간 손상을 완화시키는데 효과적일 것으로 판단되며, 향후 간 기능 개선 식품 및 다양한 간질환의 치료를 위한 천연물신약의 소재로 활용 가능할 수 있을 것으로 사료된다.
Claims (5)
- 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
상기 혼합 추출물은,
상심자 4~8 중량부, 노근 3~7 중량부, 인진호 1~5 중량부 및 별갑 1~5 중량부를 혼합하여 추출한 것이고,
200~400 mg/kg (마우스 경구투여 기준) 용량이 포함되며,
간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변을 완화시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는,
알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 상심자, 노근, 인진호 및 별갑의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
상기 혼합 추출물은,
상심자 4~8 중량부, 노근 3~7 중량부, 인진호 1~5 중량부 및 별갑 1~5 중량부를 혼합하여 추출한 것이고,
200~400 mg/kg (마우스 경구투여 기준) 용량이 포함되며,
간 기능개선, 항산화효소의 활성 증가 및 섬유화 변성억제 작용을 통하여 알코올 섭취로 인한 지방간 변화, 간염 및 간섬유화로 인한 간경변을 완화시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는,
알코올로 유발된 간 손상을 억제하기 위한 식품 조성물.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020170007022A KR101810965B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 알코올로 유발된 간 기능 저하를 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물 |
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KR1020170007022A KR101810965B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 알코올로 유발된 간 기능 저하를 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물 |
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KR1020170007022A KR101810965B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 알코올로 유발된 간 기능 저하를 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물 |
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KR (1) | KR101810965B1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115161149A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-10-11 | 贵州九龙天麻有限公司 | 一种天麻配制酒及其制备工艺与应用 |
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2017
- 2017-01-16 KR KR1020170007022A patent/KR101810965B1/ko active IP Right Grant
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