KR101806624B1 - 글루타티온 검출용 프로브 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

글루타티온 검출용 프로브 화합물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 요산 검출용 프로브 화합물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 하기 화학식 1로 표시되는 글루타티온 검출용 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112015104054497-pat00012
.
본 발명에 따른 글루타티온 검출용 화합물은 타 분석물 대비 글루타티온에 대해서 우수한 선택성으로 반응하며, 글루타티온에 대해서 높은 검출 감도를 나타내는 바, 턴-온 방식에 의해서 글루타티온을 단순하고 효과적으로 검출해낼 수 있어서, 생물학 및 환경 분야에서 매우 높은 효용성을 나타낸다.

Description

글루타티온 검출용 프로브 화합물 및 그 제조방법 {Probe compound for detection of glutathione and method for preparing the same}
본 발명은 글루타티온 검출용 프로브 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
생물학적 티올류는 세포 항산화 방어체계의 여러 중요한 역할에 관여하며, 글루탐산, 글리신과 시스테인의 트리펩티드인 글루타티온 (glutathione, GSH)은 농도 범위가 1.0 내지 15 mM인 가장 풍부한 비단백질 티올이다. 글루타티온은 세포내 산화환원 활성 유지, 생체 이물 대사, 세포내 신호전달, 생체촉매작용과 유전자 조절을 포함한 많은 세포 기능을 도와준다. 그러나, GSH의 농도가 비정상이 되면, 백혈구 손실, 건선, 간 손상, 천식, AIDS, 알츠하이머와 암과 같은 각종 인간 질환이 야기되는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 생리적 조건에서 이들을 검출하기 위한 단순한 시약/기술 개발은 의학 및 생물학에 있어 매우 중요하다 (비특허문헌 1).
형광 프로브는 다른 유형의 프로브와 비교하여 특유의 높은 감도, 특이성을 갖고 실시가 단순하며 반응시간이 빠르다는 장점을 갖기 때문에, 시험관내 분석 뿐 아니라 생체내 영상화 연구를 위한 특유의 응용기술을 제공할 수 있다. 따라서, 생체 시료에서 다양한 응용을 위해서 새로운 프로브를 설계 및 개발하려는 상당한 노력이 있어왔다. 티올 검출용으로 보고된 대부분의 형광 프로브는 Michael 첨가반응, 알데히드와의 고리화, 티올에 의한 다이설파이드와 설폰아미드의 분해, Cu 착물로부터 탈금속화 및 이민 작용기에 대한 첨가반응과 같은 다양한 접근법을 기반으로 하고 있다.
관련하여, 이민기의 가수분해를 통해서 특정 물질을 선택적으로 형광 검출하기 위한 기술들이 개시된 바 있으며, 예를 들어 본 발명자들은 파이렌계 화합물 및 이를 포함하는 수은 이온 검출 시스템으로서, 상기 파이렌계 화합물과 수은의 결합에 의해서 UV 흡수, 형광 방출, 색상 등의 변화를 이용하여 수은을 검출할 수 있는 기술을 보고한 바 있고 (특허문헌 1), 시프 염기를 가진 화합물이 산성 음이온 (HSO4 -)에 의한 가수분해를 통해서 선택적으로 형광을 방출하는 기술도 보고된 바 있으며 (비특허문헌 2), 이민 작용기를 갖는 퀴놀린계 화합물 및 생세포 내에서 생물학적 티올에 의한 친핵성 첨가반응에 따른 형광 온-오프를 통해서 티올을 선택적으로 검출하는 기술도 보고된 바 있다 (비특허문헌 3).
특허문헌 1: 대한민국 공개특허번호 제2012-0062223호
비특허문헌 1: Chen, X. et al.: Fluorescent chemosensors based on spiroring-opening of xanthenes and related derivatives. Chem. Rev. 112, 1910-1956 (2012). 비특허문헌 2: Virendra Kumar et al.: Uncovering the true mechanism of optical detection of HSO4- in water by Schiff-base receptors - hydrolysis vs. hydrogen bonding. Chem. Commun. 48, 9540-9542 (2012). 비특허문헌 3: Priyadip Das et al.: Designing a thiol specific fluorescent probe for possibleuse as a reagent for intracellular detection andestimation in blood serum: kinetic analysis to probe therole of intramolecular hydrogen bonding. Org. Biomol. Chem. 11, 6604-6614.
이에, 본 발명에서는 글루타티온이 존재하는 생리적 조건 하에서 턴-온 (turn-on) 프로브 형광 반응을 일으킴으로써, 글루타티온을 선택적으로 검출하는 것이 가능한 글루타티온 검출용 프로브 화합물 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 하기 화학식 1로 표시되는 글루타티온 검출용 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015104054497-pat00001
.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시킴으로써 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 글루타티온 검출용 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112015104054497-pat00002
[화학식 3]
Figure 112015104054497-pat00003
.
본 발명에 따른 글루타티온 검출용 화합물은 타 분석물 대비 글루타티온에 대해서 우수한 선택성으로 반응하며, 글루타티온에 대해서 높은 검출 감도를 나타내는 바, 턴-온 방식에 의해서 글루타티온을 단순하고 효과적으로 검출해낼 수 있어서, 생물학 및 환경 분야에서 매우 높은 효용성을 나타낸다.
도 1a 및 1b는 다양한 티올 (도 1a) 및 다양한 농도의 GSH (도 1b) 첨가시 화합물 1의 UV/Vis 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 2는 GSH 첨가 전후의, 10% D2O+DMSO-d 6 중 a) 화합물 2 및 3 (10 mM), b) 화합물 1 (10 mM), 및 c) 화합물 1+GSH (5당량) 시료에 대한 부분 1H NMR 질량 스펙트럼을 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 3a 및 3b는 다양한 티올 (도 3a) 및 다양한 농도의 GSH (도 3b) 첨가시 화합물 1의 형광 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 4는 HeLa 세포주에 대한 화합물 1의 세포 생존율을 분석한 그래프이다.
도 5는 화합물 1로 처리한 HeLa 세포에 대한 공초점 레이저 형광 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 6은 화합물 1의 가수분해 후 세포내 방출된 화합물 2의 위치를 확인하기 위해서 공초점 레이저 현미경 검사를 이용하여 공국재화 실험을 실시한 결과를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에서는 글루타티온 선택적 화학도시미터 (chemodosimeter)로서, 이미노피렌 형태의 화합물을 제공한다. 본 발명에 따른 프로브 화합물은 생리적 조건 하에서 다른 티올에 비해서 특히 글루타티온에 대해서 매우 선택적인 형광 발광 및 색변화 현상을 나타낸다.
이를 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 글루타티온 검출용 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015104054497-pat00004
.
상기 화학식 1에 따른 화합물은 다른 티올 존재 하에서는 반응하지 않지만, 글루타티온이 존재하는 환경 하에서는 하기 화학식 2의 화합물로 가수분해되며, 이러한 화학식 2의 화합물은 430 nm 근방에서 매우 강한 형광을 발광하며, 이러한 발광의 세기는 글루타티온의 농도에 비례하는 바, 화학식 1에 따른 화합물을 사용하여 글루타티온을 정량적으로 검출하는 것이 가능하다.
한편, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시킴으로써 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 글루타티온 검출용 화합물의 제조방법을 제공하며:
[화학식 2]
Figure 112015104054497-pat00005
[화학식 3]
Figure 112015104054497-pat00006
예를 들어, 상기 반응은 상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 3의 화합물을 에탄올 환류 조건 하에서 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
화학식 1에 따른 화합물의 합성
하기 반응식 1에 따라서 화학식 1에 따른 화합물을 합성하였다.
[반응식 1]
Figure 112015104054497-pat00007
구체적으로, 살리실알데히드 (화합물 3, 0.05 g, 0.46 mmol)와 1-아미노파이렌 (화합물 2, 0.1 g, 0.46 mmol)을 고온 순수 에탄올에서 2시간 동안 혼합하여 녹황색 오일 상태의 화학식 1의 화합물 (0.1 g, 2.52 mmol)을 얻었으며, 수율은 68%였다.
IR (KBr pellet, cm-1): 1687, 1624;
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ6.98 (t, 1H), 7.12(d, 1H), 7.42 (t, 1H), 7.49 (d, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.99 (t, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.11 (d, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.49(d, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 13.65 (s, 1H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ163.8, 161.4, 142.6, 133.6, 132.7, 131.6, 130.4, 128.2, 127.4, 126.5, 125.8, 125.6, 125.5, 125.4, 125.1, 124.9, 122.6, 119.9, 119.5, 117.5, 115.9 ppm. FAB MS m/z (M+): calcd, 321.37. Found, 321.50.
시료 및 기기
Varian 300 MHz (δ. TMS 기준으로 ppm으로 표시, J 헤르츠로 표시)를 이용하여 1H-NMR 스펙트럼을 측정하였다. FAB MS 질량 스펙트럼은 고려대학교에서 JEOL-JMS-HX 110A/ 110A High Resolution Tendem Mass Spectrometry를 이용하여 측정하였다. 모든 시약과 용매는 공업용이었고 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. 흡수 스펙트럼은 S-2000 UV-분광계로 측정하였고, 형광 스펙트럼은 RF-5301PC 형광분광계로 측정하였다. 모든 형광 스펙트럼 측정을 위해서 각각 1.5 및 1.5 nm의 여기 및 방출 슬릿 폭으로 320 nm에서 여기시켰다. 모든 UV/Vis 실험은 인산완충용액 중 20.0 μM의 화합물 1을 사용하여 수행하였다. 형광 실험은 인산완충용액 중 20.0 μM의 화합물 1을 사용하여 수행하였다. 총 부피를 4.0 mL로 고정하여 인산완충용액의 농도를 변화시켰다. 혼합물을 교반한 후, 430 nm에서 형광 방출을 측정하였다.
세포 배양물의 경우, 인간 자궁경부 선암 상피세포 (KCLB, 서울, 한국)를 10% FBS (WelGene), 페니실린 (100 단위/ml)과 스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 첨가된 MEM (WelGene Inc, 서울, 한국)에서 배양하였다. 영상화 이틀 전에, 세포를 계대 배양하여 유리 바닥 접시 (MatTek)에 도말하였다. 모든 세포를 5/95 (v/v)의 CO2/공기의 가습 분위기에서 37℃로 유지하였다. 표지하기 위해서 성장 배지를 제거하고 FBS가 없는 MEM으로 교체하였다. 세포를 5% CO2하 37℃에서 리간드로 처리하여 함께 배양하였다. 세포를 인산 완충 생리식염수 (PBS; Gibco)로 3회 세척한 다음, 15분 동안 무색 무혈청 배지에서 더 배양한 후 영상화하였다. 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고 밤새 안정화시켰다. 화합물 1을 세포에 도포하여 그 흡수와 약물 방출을 모니터링하였다. 일부 실험에서, 세포를 화합물 1로 처리하기 전에 Mito-, Lyso- 또는 ER tracker를 함유한 배지와 함께 배양하였다. 다음, 세포를 1 ml의 PBS로 짧게 세척하고, PBS에서 화합물 1로 처리하였다. 배양 후, 세포에 흡수되지 않은 화합물 1의 잔류량은 세포를 1 ml의 PBS 용액에 넣기 전에 PBS로 3회 세척함으로써 제거하였다. 형광 사진은 공초점 레이저 주사 현미경 (Zeiss LSM 510, Zeiss, 오베르코, 독일)을 이용하여 촬영하였다.
결과 및 고찰
화합물 1에 의한 티올의 인식 패턴은 첨가시 수용체의 전자 및 흡수 스펙트럼 패턴 변화로서 모니터링하였다. 도 1a 및 1b에는 320 nm에서 여기와 함께, 다양한 티올 (GSH, Cys, Hcy) (도 1a) 및 다양한 농도 (0-100 당량)의 GSH (도 1b) 첨가시 화합물 1 (20.0 μM)의 UV/Vis 스펙트럼을 도시하였다.
도 1a에서, PBS 중 화합물 1 (2.0 mM)의 옅은 황색 용액은 382 nm (ε=1.72·104 M-1cm- 1)에서 흡수 밴드를 나타내었다. GSH (100 당량)를 화합물 1의 용액에 도입하였더니 뚜렷한 청색 이동이 유도되었지만, 이러한 유의미한 스펙트럼 변화는 다른 티올의 첨가에 의해서는 관찰되지 않았다. GSH의 양이 증가할수록 382 nm의 흡수 밴드는 사라지고 329 nm에서 새로운 밴드가 나타났는데, 1:1 화학양론 반응의 추세로 화합물 1이 새로운 화합물종으로 전환되었음을 의미한다 (도 1b). 329 nm에서 새로운 밴드의 형성은 GSH에 의해 화합물 1이 화합물 2로 가수분해 되었음을 보여주는 것이다.
상기 가정을 더욱 뒷받침하기 위해서 GSH 첨가 전후에 10% D2O-DMSO-d 6에서 프로브 1의 1H NMR을 측정하였다. GSH는 D2O-DMSO-d 6에서 용해도가 낮아 5 당량만 첨가하였고 유의미한 변화를 위해 24시간 후에 1H NMR을 측정하였다. δ 10.23 ppm에서 피크 (CHO 작용기에 해당함)의 출현과 δ 9.24 ppm에서 피크 (화합물 1의 CH=N 양성자)의 소멸은 화합물 1에서 이민 작용기가 가수분해되었음을 의미하는 것이다. 따라서, 화학도시미터의 가수분해에 의해 다른 티올에 비해 화합물 1이 GSH에 대해 높은 선택성을 보였다는 것은 주목할 가치가 있다.
또한, GSH 첨가 전후의 시료에 대한 부분 1H NMR 질량 스펙트럼을 측정하였으며, 도 2에는 그 결과를 도시하였다 (10% D2O+DMSO-d 6 중 a) 화합물 2 및 3 (10 mM), b) 화합물 1 (10 mM), c) 화합물 1+GSH (5당량)). 도 2를 참조하면, 화합물 1에 GSH를 첨가함으로써, 화합물 2가 생성되었음을 확인할 수 있다.
한편, 형광 반응속도 연구를 통해서 화합물 2를 형성하는 화합물 1과 GSH의 반응은 30분 안에 거의 완료되었음을 알 수 있었다. 도 3a 및 3b에는 320 nm에서 여기와 함께, 다양한 티올 (GSH, Cys, Hcy)과 (도 3a), 다양한 농도 (0-100 당량)의 GSH (도 3b) 첨가시, 화합물 1 (20.0 μM)의 형광 스펙트럼을 도시하였다 (삽입 그래프는 시간 함수로서 GSH에 따른 형광 세기 변화). 다른 티올에 대해서 화합물 1의 형광 변화는 관찰되지 않았는데, 이는 GSH에 대한 화합물 1의 높은 선택성을 의미하는 것이다. 화합물 1의 형광 세기는 인산 완충 생리식염수 (PBS)에 GSH를 첨가함으로써 442 nm에서 크게 증가하였다. 442 nm에서의 형광 증강은 정량 수율로 형광이 강한 1-아미노피렌인 화합물 2를 생성하는 화합물 1의 화학도시미터형 반응 때문이었으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
세포 독성 실험
HeLa 세포 (인간 암세포)에 대한 화합물 1의 세포독성을 종래의 MTT 분석법을 이용하여 평가하였다. 실험란에 제공되어 있는 표준 프로토콜에 따라 24시간 후에 세포 증식을 체크하였다. 1-20 μM의 화합물 1이 존재 및 부재하는 상태에서 세포 증식에 있어서 주목할 만한 차이는 관찰되지 않았다 (도 4). 화합물 1이 존재하는 경우에 세포 생존율은 ≤20 μM의 농도로 함께 24시간 배양한 후에 94.3%인 것으로 평가되었다. 30분의 반응시간을 고려하면, 화합물 1 (≤ 20 μM)의 예상 세포독성은 낮을 것으로 예상되었다.
세포 영상화 및 세포내 티올 검출 실험
화합물 1의 생존율 분석과 선택적 반응에 의해 시험관내 생세포 형광 영상화를 위한 프로브 용도를 확대할 수 있었다. 살아있는 HeLa 세포를 37 ℃에서 30분 동안 인산완충용액 (pH 7.4) 중 화합물 1과 함께 배양한 다음, 인산 완충 생리식염수 (PBS)로 3회 세척하여 미결합 프로브 분자를 제거하였다. 상기 프로브는 세포 투과성이 있고 세포내 GSH와 반응하여 강력한 턴-온 형광을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 티올 유도 이민 결합 가수분해와 이에 따른 형광-온에 대한 확실한 증거를 제공하기 위해서 화합물 1의 형광 방출 반응을 N-에틸말레이미드 (NEM)(GSH 억제제)가 존재하는 상태에서 연구하였다.
도 5는 화합물 1로 처리한 HeLa 세포에 대한 공초점 레이저 형광 현미경 사진을 도시한 것으로서, 하였으며, 다양한 농도 (0, 0.1, 0.2와 0.3 μM)의 N-에틸말레이미드 (NEM)를 함유한 배지와 함께 세포를 37℃에서 30분 동안 전배양하고, 각각 740 nm의 이광자 여기 파장과 400-500 nm의 방출 파장을 이용하여 세포 사진을 얻은 결과이다. 도 5를 참조하면, NEM의 농도가 증가함에 따라 (0-0.3 mM) HeLa 세포에서 화합물 1의 형광 세기는 감소하였다. 이는 화합물 1에서 형광 증강은 세포내 GSH가 존재하는 상태에서 화합물 1의 가수분해에 의한 것임을 더욱 뒷받침하는 것이다.
또한, 화합물 1의 가수분해 후 세포내 방출된 화합물 2의 위치를 확인하기 위해서 공초점 레이저 현미경 검사를 이용하여 공국재화 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 6에 도시하였으며, 도 6에서 각각 a)는 ER-tracker Red (0.5 μM)가 공국재된 HeLa 세포의 공초점 레이저 형광 현미경 사진 (514 nm에서 여기, 570-600 nm에서 취합)이고; d)는 Lyso tracker red DND-99 (1.0 μM)가 공국재된 HeLa 세포의 공초점 레이저 형광 현미경 사진 (514 nm에서 여기, 570-650 nm에서 취합)이고; g)는 Mito tracker Deep red (0.1 μM)가 공국재된 HeLa 세포의 공초점 레이저 형광 현미경 사진 (514 nm에서 여기, 650-750 nm에서 취합)이고; b), e), 및 h)는 각각 37 ℃에서 1.5 시간 동안 리간드 (5 μM)의 공초점 레이저 형광 현미경 사진 (740 nm에서 여기, 400-500 nm에서 취합)이고; c), f), 및 i)는 각각 합성사진이다.
도 6을 참조하면, ER-tracker red (a), lyso tracker red DND-99 (d)와 mito tracker Deep red (g)는 적색으로, 프로프 (b, e 및 h)는 녹색으로 영상화될 수 있다. 합성사진으로부터 명백하게 (f, i)에 비해 (c)에서 황색이 더 뚜렷한데, 이는 GSH가 소포체 (ER)에서 일어난 이민 가수분해를 유도하였음을 시사하는 것이다.
종합하면, 본 발명에서는 GSH 선택적 화학도시미터로서 단순한 이미노피렌 프로브인 화합물 1을 제공한다. 화합물 1은 다른 티올에 비해 생리적 조건에서 GSH에 대해 선택적인 형광 발광과 색 변화를 나타내었으며, 430 nm에서의 형광 증강은 형광이 강한 화합물 2를 생성하는 화합물 1의 화학도시미터형 반응 때문이다. 이러한 뚜렷한 형광 변화로 인해서, 화합물 1을 생물학 및 환경 분야에서 GSH의 형광 검출용으로 유용하게 활용할 수 있다.

Claims (2)

  1. 하기 화학식 1로 표시되고,
    글루타티온이 존재하는 환경에서 하기 화학식 2의 화합물로 가수분해되는 것을 특징으로 하는 글루타티온 검출용 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112017063366264-pat00021

    [화학식 2]
    Figure 112017063366264-pat00022
    .
  2. 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 에탄올 환류 조건하에서 반응시켜 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하고,
    글루타티온이 존재하는 환경에서 하기 화학식 2의 화합물로 가수분해되는 것을 특징으로 하는 글루타티온 검출용 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure 112017063366264-pat00023

    [화학식 3]
    Figure 112017063366264-pat00024

    [화학식 1]
    Figure 112017063366264-pat00025
    .
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