KR101803149B1 - 미노사이클린을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미노사이클린을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포, 이의 제조방법 및 면역관용 수지상 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 유효성분으로 포함하는 면역관용 수지상 세포 생산용 배지조성물을 이용할 경우, 면역관용 수지상세포의 생산을 크게 증가시킬 수 있으며, 분화된 면역관용 수지상 세포는 염증성사이토카인의 생산이 감소되고, 동종항원(alloantigen) 특이 T세포 프라이밍 유도능이 저하되어 있고, 미성숙 상태를 유지하며, MHC 클래스 II 제한적 외부항원제시능이 감소되어 있어 과도한 면역반응에 의해 유발되는 질환, 예컨대 자가면역질환 또는 이식거부질환의 치료를 위한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

미노사이클린을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포 및 이의 제조방법{A tolerogenic dendritic cell prepared by using minocycline and a preparation method thereof}

본 발명은 미노사이클린을 이용하여 면역관용 활성을 갖는 수지상 세포, 이의 제조방법 및 면역관용 수지상 세포의 용도에 관한 것이다.

수지상 세포는 주로 T세포에 항원제시 기능을 수행하는 전문적 항원 제시 세포의 일종으로, 림프절, 비장, 흉선, 피부 밑 또는 여러 조직의 세포 간극에서 나뭇가지 모양으로 존재한다. 수지상 세포는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 Ⅰ 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 다양한 항원 샘플을 T세포에 제시함으로써, T세포 활성화에 중요한 역할을 한다.

또한, 수지상 세포는 주위에 존재하는 환경적 신호의 종류에 따라 성숙도가 상이한 상태로 분화되어, 미성숙, 준성숙 또는 성숙 수지상 세포로 존재하는데 미성숙 수지상 세포는 초기 성숙 단계에서 발견되는 것으로서 세포 간액으로부터 데브리스(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행하나, 미성숙 수지상 세포는 발현되는 염증성 사이토카인의 수준이 낮기 때문에 T세포와 접촉하여도 T세포를 활성화 시키지 못한다. 반면, 성숙 수지상 세포는 원시 T세포를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다. 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화되기 위해서는 다수의 특정 신호에 노출되어 toll-like 수용체가 활성화되어야 하며, 이에 의하여 다수의 공동자극분자들과 IL-12와 같은 친-염증성 사이토카인이 상향조절되고 조직으로부터 림프절로 이동하게 되며, 성숙 수지상 세포의 형태적 특징인 손가락 같은 돌기들이 나타난다.

또한, 미성숙 수지상 세포가 다른 환경 조건에 놓일 경우 준성숙 수지상 세포로 분화할 수 있는데, 예를 들어, 세포자살 과정 중 세포에서 방출되는 TNF-α가 준성숙 수지상 세포로의 분화에 기여하는 것으로 생각된다. 준성숙 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포의 특성의 일부를 상실하고 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 가지게 된다.

한편, 전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있다. 그러나 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이며, 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다. 면역과민반응 억제를 위해 사용되고 있는 것 중에 하나가 면역억제제인데 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

그러나 현재 사용되고 있는 면역억제제인 사이클로스포린 A와 FK506 등 다수의 약물들은 복잡한 화학구조를 가진 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용으로 인해 비경제적이고 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성을 가지며 면역관용 유도 효과가 우수한 새로운 면역억제제의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있으며, 이러한 세포들을 이용한 면역질환을 치료하는 기술에 대해 연구가 증가하고 있다.

이러한 시점에서 본 기술은 면역조절 이상, 특히 과도한 면역반응으로 유발되는 질환을 효과적으로 치료하기 위한 세포치료제로서 수지상세포를 이용하는 방법을 연구하던 중, 미노사이클린을 처리하여 수지상세포를 수득한 경우, 수지상 세포가 면역관용 활성을 우수하게 가지고 있어 자가면역질환 또는 이식 거부질환 등 각종 질환의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하였다.

한국공개특허 제2010-0109099호 한국등록특허 제542,817호

따라서 본 발명의 목적은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 유효성분으로 포함하는 면역관용 수지상 세포 생산용 배지조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4 및 미노사이클린(Minocycline)가 포함된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 배양하는 단계를 포함하는, 면역관용 수지상 세포의 제조방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 면역관용 수지상 세포를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 유효성분으로 포함하는 면역관용 수지상 세포 생산용 배지조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지조성물에는 GM-CSF이 10~50 ng/ml. IL-4가 10~50 ng/ml 및 미노사이클린 1~10 uM의 농도로 함유되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지조성물은 골수 유래 수지상 세포의 세포수를 증가시키고, 상기 수지상 세포는 면역관용 활성을 가지며 미성숙 상태를 유지할 수 있다.

또한, 본 발명은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4 및 미노사이클린(Minocycline)가 포함된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 배양하는 단계를 포함하는, 면역관용 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 GM-CSF이 10~50 ng/ml. IL-4가 10~50 ng/ml 및 미노사이클린 1~10 uM의 농도로 함유된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 3~8일 동안 배양할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 면역관용 수지상 세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역관용 수지상 세포는 염증성사이토카인의 생산이 감소되고, 동종항원(alloantigen) 특이 T세포 프라이밍 유도능이 저하되어 있고, 미성숙 상태를 유지하며, MHC 클래스 II 제한적 외부항원제시능이 감소되어 있는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 다발성 경화증, 건선, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 유효성분으로 포함하는 면역관용 수지상 세포 생산용 배지조성물을 이용할 경우, 면역관용 수지상세포의 생산을 크게 증가시킬 수 있으며, 분화된 면역관용 수지상 세포는 염증성사이토카인의 생산이 감소되고, 동종항원(alloantigen) 특이 T세포 프라이밍 유도능이 저하되어 있고, 미성숙 상태를 유지하며, MHC 클래스 II 제한적 외부항원제시능이 감소되어 있어 과도한 면역반응에 의해 유발되는 질환, 예컨대 자가면역질환 또는 이식거부질환의 치료를 위한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 미노사이클린 첨가 유무에 따른 골수세포 유래 수지상세포의 수 차이를 확인한 결과이다.
도 2는 미노사이클린 처리 유무에 따른 수지상세포의 성숙을 확인한 결과이다.
도 3은 미노사이클린 처리 유무에 따른 MHC class II 제한적 외부항원제시능을 확인한 결과이다.
도 4는 미노사이클린 처리 유무에 따른 염증성 사이토카인 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 미노사이클린 처리 유무에 따른 allogenic T세포의 자극력을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료를 위해 수지상세포를 이용하는 기술을 연구하던 중, 미노사이클린을 이용하여 골수근간세포를 배양할 경우, 배양하여 수득한 수지상세포가 우수한 면역관용 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

일반적으로 수지상세포는 발명의 배경이 되는 기술 부분에서 기술한 바와 같이, 강력한 항원제시세포 (Antigen-presenting cell: APC)로서 항원을 접한 적이 없는 native T 세포를 자극시킬 수 있는 일차면역반응 (primary immune response)을 유도하는 능력이 있으며 면역기억을 갖게 할 수 있다. 성숙 수지상세포는 T 세포 활성화 및 증식에 필요한 모든 신호를 제공할 수 있는데, 이러한 수지상세포에서 발현되는 특정 마커로 세포의 종류와 분화여부를 확인할 수 있으며, 이를 통하여 인간 및 인간 이외의 포유동물에 관하여 수지상세포를 특정할 수 있다

한편, 본 발명에서 제조한 수지상세포는 이러한 기능을 갖는 수지상 세포가 아닌 면역관용 활성을 갖는 수지상세포를 제공하는 것이며, 특히 미노사이클린을 첨가한 배지 조성물로 세포를 배양할 경우, 면역관용이 유도된 수지상세포를 수득할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.

그러므로 본 발명은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 유효성분으로 포함하는 면역관용 수지상 세포 생산용 배지조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 배지 조성물에 함유된 유효성분 중 하나인 미노사이클린(Minocycline)은 테트라사이클린핵을 갖는 항생물질로, 광역성을 나타내고 리켓치아나 어떤 종류의 바이러스, 아메바에도 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 미노사이클린은 여드름 및 요도감염의 치료에 사용된다고 알려져 있을 뿐 본원발명과 같이 면역관용 수지상세포를 제조 및 배양하는데 사용된 예는 알려진 바가 없다.

상기 본 발명의 배지조성물에는 GM-CSF이 10~50 ng/ml. IL-4가 10~50 ng/ml 및 미노사이클린 1~10uM의 농도로 함유되어 있는 것이 바람직하며, 특히 상기 미노사이클린은 5uM의 농도로 함유되어 있는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 상기 배지조성물로 세포, 즉, 골수근간세포를 배양하게되면 분화된 골수 유래 수지상 세포의 세포수가 미노사이클린을 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 증가되어 있었고, 분화된 수지상 세포는 면역관용 활성을 가지며 미성숙 상태를 유지하는 것으로 나타났다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포는 처리하지 않은 군에 비해 수지상세포의 수가 65.3%로 증가된 것으로 나타났고, 저농도의 GM-CSF (20 ng/ml)와 저농도의 IL-4 (20 ng/ml) 조건하에서도 미노사이클린 처리시 수지상세포의 수는 60.5%로 증가된 것으로 나타났다(도 1 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4(interleukin-4) 및 미노사이클린(Minocycline)을 함유한 배지를 이용할 경우, 면역관용 활성을 갖는 수지상세포를 편리하게 다량 확보 및 수득할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한 본 발명은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4 및 미노사이클린(Minocycline)가 포함된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 배양하는 단계를 포함하는, 면역관용 수지상 세포의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.

상기 방법은 GM-CSF이 10~50 ng/ml. IL-4가 10~50 ng/ml 및 미노사이클린 1~10uM의 농도로 함유된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 3~8일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있으며 더욱 구체적으로는 하기 본 발명의 일실시예에 기재되어 있다.

나아가 본 발명의 상기 방법으로 제조된 면역관용 수지상 세포는 염증성사이토카인의 생산이 감소되고, 동종항원(alloantigen) 특이 T세포 프라이밍 유도능이 저하되어 있고, 미성숙 상태를 유지하며, MHC 클래스 II 제한적 외부항원제시능이 감소되어 있는 특징이 있다.

또한 본 발명에서 분화 유도한 면역관용 수지상 세포는 면역조절 T 세포(Treg)를 활성화 시킬 수 있는 특징이 있다.

보통 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 연구가 진행되고 있으며, Treg 세포는 Foxp3를 발현하는 특징이 있다.

그러므로 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 수지상세포는 과도한 면역반응으로 유발되는 질환을 치료 및 예방할 수 있는 치료제의 용도로 사용될 수 있다.

상기 과도한 면역반응으로 유발되는 질환으로는 자가면역질환 또는 이식거부질환일 수 있다.

본 발명에서 상기 “자가면역질환”은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 다발성 경화증, 건선, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한 상기 이식저부질환은 세포, 조직 또는 장기 이식 시 거부반응에 의해 유발되는 질환일 수 있다.

성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제시키려고 하는데, 본 발명에서 수득한 면역관용 수지상 세포는 이러한 T 세포-매개 면역반응을 억제할 수 있다.

그러므로 본 발명은 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환; 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 방법으로 제조된 면역관용 수지상세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 이종장기 이식에 따른 면역거부 반응 또는 자가면역질환 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 면역관용 수지상세포의 약학적으로 유효한 양은 4x10⁵~6x10⁵의 세포수일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 이종장기 이식에 따른 면역거부 반응 또는 자가면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 근육 또는 정맥 주사제나 흡입 같은 형태의 비경구 투여뿐 아니라 직접 질환 부위에 투여할 수 있으나, 가장 바람직하게는 정맥 주사에 의한 투여이다.

주사를 위해서, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와 같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형 될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 면역관용 수지상 세포를 함유하는 조성물을 정맥 투여하는 단계를 포함하는 이종장기 이식에 따른 면역거부 반응 또는 자가면역질환의 치료방법을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 이종장기 이식에 따른 면역거부 반응 또는 자가면역질환 치료용 세포치료제를 제공할 수 있다.

사람의 경우, 세포치료제의 통상적인 투여량은 5x10⁶~7x10⁶ cells/Kg일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 실험방법

<1-1> 실험동물 준비

본 발명에서 사용한 실험동물은 C57BL/6 암컷 마우스 및 BALB/c 8~12주령의 암컷 마우스를 사용하였다. 모든 동물실험은 충북대학교 동물실험위원회의 기준에 따라 수행하였다.

<1-2> 골수세포로부터 수지상세포로의 분화유도

쥐의 대퇴골로부터 채취한 골수를 20 ng/mL 또는 40 ng/mL　GM-CSF 및 20 ng/mL 또는 40 ng/mL IL-4가 함유된 배지를 이용하여 6웰 플레이트 상에서(5×10⁶/well) 배양하였다. 이때 상기 GM-CSF 및 IL-4는 크레아젠(creagen)사로부터 구입하여 사용하였다.

Mino-DC(미노사이클린 처리로 수득한 수지상세포)를 수득하기 위해, 배양 초기부터 5 μM의 미노사이클린(minocycline, 산타쿠르즈 바이오테크놀러지사)을 첨가하여 사용하였고, 배양 후 3일, 4일 및 6일 후에 플레이트를 가볍게 흔들어 미부착세포를 제거한 후 새로운 미디어로 교체하였다. 7일째 가볍게 파이펫팅을 수행하여 수지상세포를 수득하였고, 일부 하기 실험에서는 수득한 수지상 세포에 100 ng/mL LPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, USA) 또는 50 ng/mL IFN-γ 와 50 ng/mL TNF-α(PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)을 24 시간 처리하여 수지상 세포의 성숙을 유도하였다.

<1-3> 마이크로스피어 ( Microsphere ) 제조

물에 녹인 400 μl OVA (50 μg/mL)를 100 mg/mL의 poly lactic-co-glycolic acid 가 에틸아세테이트(ethyl acetate)에 용해된 용액 2ml와 혼합하였고, 이후 용해버퍼(0.1 % SDS 및 0.1 N NaOH)를 이용하여 마이크로스피어를 용해시킨 후, OVA의 함량을 Micro Bicinchoninic Acid assay kit를 이용하여 측정하였다. 형광이 표지된 마이크로스피어는 FITC를 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 층에 첨가하여 제조하였다.

<1-4> MHC class II 제한적 항원제시능 분석

MHC　class II 제한적 외부항원제시능 분석은 OVA[323-339]-I-A^d 복합체를 인지하고 IL-2를 생산하는 OVA 특이 CD⁺4 T 세포인 DOBW 세포를 이용하여 분석하였다.

먼저, 96 웰 플레이트에 수지상세포를 1x10⁵ cells/well로 분주한 후, OVA-마이크로스피어를 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 세포들을 미리 따뜻하게 데워둔 PBS 버퍼로 300 μl/well씩 2회 세척한 다음, 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 웰당 100 μl씩 5분간 상온에서 처리하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS 버퍼로 300 μl/well씩 3회 세척한 후, DOBW 세포를 2 × 10⁵ cells/well로 첨가한 다음 37℃에서 18시간 배양하였다. 이후 플레이트(Plate)를 400 x g로 원심분리한 후, 세포배양 상층액을 수집하고 IL-2 ELISA　kit(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용해 IL-2 농도를 측정하였다.

<1-5> 포식작용( Phagocytic activity) 분석

수지상세포에 FITC가 표지된 OVA　마이크로스피어를(1mg/well OVA)넣어 2 시간 반응시킨 후, 포식되지 않은 마이크로스피어들은 미리 데워놓은 PBS로 2회 세척하여 제거하였고, 포식된 세포들은 수집한 후, 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 함유된 PBS 용액으로 고정시킨 후, 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

<1-6> T세포 준비

BALB/c 마우스의 비장세포를 나일론울컬럼(nylon wool column)에 1시간 동안 반응시켜 부착된 세포들은 제거하여 총 T 세포를 분리하였다. 이후 CD4⁺ 분리 키트를((Militeny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 부착세포가 제거된 비장세포에서 CD4⁺ T 세포를 분리하였다.

<1-7> 혼합림프구 반응

림프구의 증식을 분석하기 위해 allogenic CD4⁺ T cell를 바닥이 둥근 96웰 플레이트에 1x10⁵ cells/well의 세포수로 분주한 후, 수지상세포를 농도별로 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 또한, 이때 세포 배양을 완료하기 18시간 전에 [³H]-thymidine을 0.5 μCi/well(Du Pont, Boston, MA, USA)을 이용하여 합성된 DNA 양을 측정하였다.

<1-8> in vivo 상에서 미노- 수지상세포의 생성

C57BL/6 마우스에 GM-CSF(2 μg/mouse) 및 미노사이클린(10 mg/kg)을 1일에 2회씩 6일동안 지속적으로 복강내 투여하였다. 이때 대조군으로는 PBS를 주입한 군을 사용하였다. 7일째에 마우스들을 치사시키고 비장을 제거한 후, 70-μm의 셀스트레너(cell strainer; BD Falcon, San Jose, CA, USA)를 이용하여 단일 세포 현탁액(single cell suspension)을 수득하였다. 적혈구는 ACK 용해버퍼(0.15 M NH₄Cl,1.0mMKHCO₃,0.1mMEDTA)로 3분동안 처리하여 용해시켰고, CD11c⁺ 수지상세포는 면역자성비드( MACS, Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA)를 이용하여 음성석 선택을 통해 분리하였다. 분리한 CD11c⁺ 수지상세포 집단은 유세포 분석기를 통해 90% 이상 순도를 가지고 있다는 것을 확인하였다.

<1-9> in vivo 상에서 리챌린지 (re-challenge) 실험

C56BL/6 마우스를 대상으로 GM-CSF 단독처리군 및 GM-CSF 와 미노사이클린을 함께 처리한 군으로부터 CD11c⁺ 수지상세포을 분리하였고 분리된 상기 세포를 BALB/c 마우스에게 정맥주사하였다. 10일 후, 면역화된 마우스로부터 Pan T 세포 분리키트(MACS, Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA)를 이용하여 T 세포를 분리하였고, 96웰 플레이트(2 ×10⁵/well)에서 naive C57BL/6 마우스의 골수세포로부터 유래되어 조사된 정상 수지상세포와 함께 배양하였다. T 세포 증식은 앞서 기술된 방식인 [³H]-thymidine 도입방법을 이용하여 배양 3일 후에 측정하였다.

<1-10> 유세포분석

유세포 분석을 위한 세포들은 마우스 표면 마커인 I-A^b,CD80,CD86,CD54,CD11c, CD4, CD25 및 Foxp3의 모노클로날 항체로 반응시키고이소타입-매칭의 대조군 항체(BD Biosciences)로 반응시켜 염색하였다. 세포내의 Foxp3 염색을 위해, BD Cytofix/Cytoperm Plus kit를 이용하여 제조사의 프로토콜 대로 수행하여 세포들을 세포투과성을 갖도록 하였고, 이후 분석은 FlowJo software (TreeStar, Ashland, OR, USA)을 이용하여 분석하였다.

참고로 본 발명의 실험에서 사용된 통계처리는 Student’s t test를 적용하여 분석하였으며, 데이터가 정상 분포도가 아닌 경우에는 A Man-Whitney rank sum test 로 수행하였다. 원 또는 투웨이 분석의 변이는 다수 그룹을 비교하여 분석하였고 p < 0.05 인 경우 유의미한 분석 값으로 처리하였다.

< 실시예 2>

미노사이클린 처리에 의한 골수근간세포 유래 수지상세포 증가 분석

본 발명자들은 미노사이클린의 처리가 골수근간세포 유래 수지상세포의 세포수를 증가시킬 수 있는지 확인하기 위해, 골수세포를 GM-CSF (40 ng/ml)와 IL-4 (40 ng/ml)이 처리된 조건에서 7일간 배양하면서, 미노사이클린을 첨가한 군(Mino-DCs)과 첨가하지 않은 군(Ctrl-DCs)을 대상으로 골수성 수지상 세포의 생성을 분석하였다.

분석결과, 골수세포를 GM-CSF와 IL-4 조건에서 배양할 때 미노사이클린을 첨가한 군은 미노사이클린을 첨가하지 않은 군에 비해 수지상세포수가 약 65.3% 증가되는 것으로 나타났다(도 1A 참조). 뿐만 아니라 미노사이클린은 저농도의 GM-CSF (20 ng/ml)와 IL-4 (20 ng/ml) 조건하에서도 수지상세포의 수를 대조군과 비교하여 60.5% 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 유세포분석기를 통한 세포 표면 분석에서는 Mino-DC와 Ctrl-DC 모두 CD11c 발현 차이는 거의 없는 것으로 나타났다(도 1B 참조). 따라서 본 발명자들은 이후 실험부터는 미노사이클린을 5 μM의 농도로 사용하였고, GM-CSF은 40 ng/mL, IL-는 40 ng/mL의 농도에서 Mino-DC을 생산한 후, 이를 실험에 사용하였다.

< 실시예 3>

미노사이클린이 처리된 수지상세포의 성숙화 지연특성 분석

미노사이클린 처리된 배양액으로 배양하여 수득한 수지상세포는 세포의 성숙이 지연 또는 미성숙 상태를 유지하는 특성이 있는지 다음과 같은 실험을 수행하였다.

미성숙 Mino-DC(미노사이클린을 처리하여 생산된 수지상세포)와 미성숙 Ctrl-DC(미노사이클린을 처리하지 않고 생산한 수지상세포)를 대상으로, 미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포와 대조군 수지상세포에 LPS (100 ng/mL) 또는 IFN-γ (50 ng/mL) 와 TNF-α (50 ng/mL)을 24시간 처리해 세포의 성숙을 유도하였다.

분석 결과, Mino-DC가 Ctrl-DC에 비해 MHC class II (I-Ab), CD54, CD80, 및 CD86을 낮은 수준으로 발현하고 있는 것으로 나타남에 따라(도 2A 참조), Mino-DC는 Ctrl-DC와 비교해 세포 성숙시 발현이 증가되는 세포 분자들의 발현이 감소하고 있다는 것을 알 수 있었다(도 2A 및 B 참조). 또한, 미노사이클린 없이 수득한 미성숙 수지상세포에 미노사이클린을 첨가하여도 IFN-γ/TNF-α에 의한 세포 표현형에는 큰 변화를 보이지 않는 것으로 나타났다(도 2C 참조).

< 실시예 4>

미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포의 MHC class II 제한적 외부항원제시능 감소 확인

항원제시세포로써 수지상세포의 기능을 OVA를 포함한 마이크로스피어(microsphere) 이용해 분석하였다. 마이크로스피어를 2시간 배양한 후, 세포를 고정시키고 OVA 특이적 CD4⁺ T 하이브리드 세포인 DOBW에 의해 분비되는 IL-2의 양을 측정하여 수지상세포 표면의 OVA peptide-class II　MHC 복합체 발현 정도를 측정하였다.

그 결과, 미노사이클린을 처리하여 생산한 수지상세포가 대조군(미노사이클린 미처리) 수지상세포에 비해 CD4⁺ T 세포에 의한 IL-2 생산이 낮아진 것으로 보아, 미노사이클린을 처리하여 생산한 Mino-DC가 MHC class II 제한적 외부항원제시능이 대조군 수지상 세포에 비해 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 3A 참조). 한편, 이러한 외부항원제시능의 차이는 Mino-DC의 포식작용 결핍과는 관련이 없다는 것을 알 수 있었는데, 이는 2가지 세포군 모두 세포 집단수에는 거의 차이가 없는 것으로 나타났다(도 3B 참조).

< 실시예 5>

미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포의 염증성 사이토카인 생성 저하 확인

미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포(Mino-DC)와 미노사이클린을 처리하지 않은 상태에서 수득한 수지상세포(Ctrl-DC)를 대상으로 염증성 사이토카인의 생성정도를 비교분석하였다. 염증성 사이토카인으로는 IL-1, IL-12, IL-6 및 TNF-a의 생성정도를 분석하였다.

그 결과, Mino-DC는 Ctrl-DC와 비교해 LPS 처리에 의한 세포 성숙시 전염증성 사이토카인인 IL-12, IL-1, IL-6, 및 TNF-α 분비가 현저하게 감소되었음을 알 수 있었고(도 4A 참조), OVA-마이크로스피어 탐식으로 인한 사이토카인 생산에서도, Mino-DC 미노사이클린을 처리하지 않은 Ctrl-DC와 비교해 염증성사이토카인의 생성이 감소되어 있다는 것을 알 수 있었다(도 4B 참조).

따라서 본 발명자들은 미노사이클린을 처리하여 수득(생산)한 수지상세포는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 효과가 우수하여 염증성 반을을 억제 및 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

미노사이클린을 처리하여 수득한 수지상세포의 allogenic T세포 자극력 감소 확인

본 발명자들은 Mino-DC의 면역관용 여부를 혼합림프구반응을 통해 확인하였다. 먼저, C57BL/6 골수에서 생성한 Ctrl-DC 및 미노사이클린을 처리하여 수득한Mino-DC를 LPS로 자극시켜주어 세포의 성숙을 유도한 후, BALB/C 유래 CD4⁺ T 세포와 혼합 배양하였으며, Ctrl-DC와 allogenic T cells은 1:40 비율로 반응시킬 때 증식 유도가 가장 강력하였다.

분석 결과, Mino-DC의 allostimulatory activity는 Ctrl-DC와 비교해 매우 감소한 것으로 나타났고(도 5A 참조), 나아가 본 발명자들은 Allogenic mice를 이용해 Mino-DC가 allogenic T cells priming에 미치는 영향을 확인하였는데, 이를 위해 LPS로 자극한 C57BL/6 유래 Mino-DC를 BALB/c 쥐에게 주사하고 10일 후, 비장에서 T 세포를 분리해 정상 C57BL/6 유래 수지상세포와 혼합배양해 재자극해 주었다.

그 결과, Mino-DC는 allogenic mice 내에서 alloantigen 특이 T cells priming을 유도하는 능력이 저하되어져 있음을 알 수 있었다(도 5B 참조).

이러한 결과들을 통해 본 발명자들은 골수세포 배양액에 GM-CSF, IL-4 이외에 미노사이클린을 추가로 첨가하여 세포를 배양할 경우, 면역관용 활성을 갖는 수지상세포를 수득할 수 있다는 것을 확인하였고, 또한 면역관용 수지상 세포수를 증가시킬 수 있어 상기 수지상세포를 다량 수득할 수 있었고, 나아가 이러한 면역관용 수지상세포를 과도한 면역반응으로 유발되는 질환, 예컨대 자가면역질환 또는 이식거부질환의 치료 용도로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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4. GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor), IL-4 및 미노사이클린(Minocycline)으로 이루어진 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 배양하는 단계를 포함하는, 골수 유래 면역관용 수지상 세포의 제조방법으로,
   상기 골수 유래 면역관용 수지상 세포는 염증성 사이토카인의 생산이 감소되고, 동종항원(alloantigen) 특이 T세포 프라이밍 유도능이 저하되어 있고, 미성숙 상태를 유지하며, MHC 클래스 II 제한적 외부항원제시능이 감소되어 있는 세포인, 방법.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 방법은 GM-CSF이 10~50 ng/ml. IL-4가 10~50 ng/ml 및 미노사이클린 1~10uM의 농도로 함유된 배지에서 골수세포(골수근간세포)를 3~8일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조방법.
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