KR101797529B1 - 피부 광손상 판단용 내인성 대사체 마커 및 이의 용도 - Google Patents

피부 광손상 판단용 내인성 대사체 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 광손상 판단용 장내 미생물 또는 내인성 대사체 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 자외선 B를 조사한 피부 광손상 마우스에 비해 피부 광손상 보호 효과가 있는 녹차 식이를 한 자외선 B 조사 마우스의 분변에서 알로바쿨룸(Allobaculum), 래크노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 및 파비박터(Parvibacter)가 풍부하고, 락토바실러스(Lactobacillus)는 억제되며, 다중 오믹스 분석법을 이용하여 상기 장내 미생물과 관련된 분변, 혈청, 간 및 피부 대사체의 변화가 경감 또는 촉진되는 것을 확인하였으므로, 상기 장내 미생물 또는 내인성 대사체 마커를 피부 광손상 여부를 판단하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

피부 광손상 판단용 내인성 대사체 마커 및 이의 용도{Endogenous metabolite marker for discriminating skin photodamage and use thereof}
본 발명은 피부 광손상 판단용 내인성 대사체 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 내인성 대사체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 피부 광손상 판단 방법에 관한 것이다.
피부 노화는 염증 반응, 호르몬 불균형, 자외선(UV) B 조사 및 흡연 등을 포함한 다양한 내인성 및 외인성 인자에 의해 촉진된다. 상기 스트레스 인자들은 잠재적으로 피부 세포막, 지방, 단백질 및 DNA를 손상시킬 수 있는 산화 스트레스를 유발한다. 특히, UV에 대한 만성적 및 반복적인 노출은 외적인 피부 광손상과 그의 복합증에서 주요한 병리학적 원인으로, 심각한 미용 문제인 피부 광노화를 유발한다. 또한, 최근에는, 오존층 파괴로 인하여, 피부에 대한 과도한 UV 노출에 의해 피부암, 기미 및 염증과 같은 피부 광손상 복합증의 우려가 증가하고 있다. 따라서, 콜라겐, 녹차, 프로바이오틱스, 불포화지방산 및 비타민과 같은 다양한 식이보충제가 피부 표면 및 내부의 질을 향상시키는 피부 상태 항상성을 유지하는데 좋은 영향을 주는지에 대한 연구가 이루어지고 있다(Clin. Dermatol ., 2010, 28, 400-408). 특히, 항산화물질인 녹차에 포함된 녹차 폴리페놀이 UV 방사선에 의한 피부손상에 광범위한 보호 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다(동의생리병리학회지 제 24권 4호).
식이를 통한 다양한 영양소의 섭취가 미생물 군집의 조성에 영향을 미치고 미생물 대사를 위한 기질을 제공한다. 에피카테킨(epicatechin, EC), 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)과 같은 녹차 폴리페놀의 경우, 장내 미생물 군집에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있으며 다양한 생리활성 성분으로 변환된다(J. Nutr. Biochem., 2013, 24, 1415-1422). 건강 측면에서 장내 미생물 군집의 효과에 대한 중요성이 관심 받고 있다. 장내 미생물 군집이 비만, 당뇨 및 염증성 장질환과 같은 대사 장애의 발병을 매개하는 중요한 인자이다. 그러나 장내 미생물 및 피부 상태 간 관계를 밝힌 연구는 거의 없다. Abrahamsson et al .은 유아에서 장내 미생물 다양성은 아토피 피부염과 관련이 있음을 밝혔다(J. Allergy Clin. Immunol., 2012, 129, 434-440). Satoh T et al .은 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)의 경구 투여가 만성 UVB 조사에 의해 유도된 마우스 피부 보습 및 표피비후 변화를 억제한다고 밝혔다(Benef. Microbes., 2015, 6, 497-504). 그러나 피부에서 장내 미생물 군집의 영향에 대한 연구는 명확하지 않다.
장기 간 대사체학은 특정 자극에 조사된 신체 여러 부위에서 물질 대사 변화를 설명하는데 유용하다. 상기 방법은 하나의 장기 대사로부터 얻는 결과보다 더 완벽한 기전적 결과를 밝힐 수 있다. 최근 몇 년간, 살아있는 유기체에서 세포 기능을 포괄적으로 이해하기 위하여 유전체학, 전사체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 다중 오믹스 데이터를 통합하는 연구가 증가하고 있다. 고속대량 오믹스 데이터를 다루기 위하여, 인실리코(in silico) 대사 모델과 같은 대규모 컴퓨터 모델을 이용하여 장기의 대사 상태를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 피부 광손상 판단을 위한 신규한 장내 미생물 마커 및 피부 광손상으로부터 상기 장내 미생물과 관련된 장기 간 대사체 조절 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 자외선 B를 조사한 피부 광손상 마우스에 비해 피부 광손상 보호 효과가 있는 녹차 식이를 한 자외선 B 조사 마우스의 분변에서 알로바쿨룸(Allobaculum), 래크노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 및 파비박 터(Parvibacter)가 풍부하고, 락토바실러스(Lactobacillus)는 억제되며, 다중 오믹스 분석법을 이용하여 상기 장내 미생물과 관련된 분변, 혈청, 간 및 피부 대사체의 변화가 경감 또는 촉진되는 것을 확인하였으므로, 상기 장내 미생물 또는 내인성 대사체 마커를 이용한 피부 광손상 여부 판단 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명의 목적은 개체 유래 샘플에서 피부, 혈청 또는 분변 대사체 수준을 측정하여 피부 광손상을 판별하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 개체에 녹차를 처리하는 단계를 포함하는 분변, 혈청, 간 및 피부 대사체 수준을 조절하는 방법에 관한 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 분변, 혈청, 간 및 피부 대사체 수준을 측정하여 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실험군인 개체 유래 샘플에서 아스파르트산(aspartic acid), 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; 리소PC)(20:4), 리소PC(22:6), 리소PC(16:1), 리소PC(16:0), 리소PC(18:2) 모노글리세라이드(monoglyceride; MG)(18:4), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine; 리소PE)(dm 16:0e) 및 올레오아미드(oleamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 여부의 정보를 제공하기 위한 대사체 수준 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에 녹차를 처리하는 단계를 포함하는, 아스파르트산, 리소PC(20:4), 리소PC(22:6), 리소PC(16:1), 리소PC(16:0), 리소PC(18:2) MG(18:4), 리소PE(dm 16:0e) 및 올레오아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피부 광손상 개체에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 개체의 혈청 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(16:1), 리소PC(22:6) 및 리소PC(20:4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준을 감소시키고, 및 분변 샘플에서 MG(18:4)의 수준을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 인간을 제외한 피부 광손상 개체에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 개체의 피부 샘플에서 무처리 대조군에 비해 아스파르트산의 수준을 증가시키고, 혈청 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(18:2)의 수준이 증가시키고, 간 샘플에서 무처리 대조군에 비해 올레오아미드의 수준이 증가시키고, 및 분변 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(16:0) 및 리소PE(dm 16:0e)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 자외선 B를 조사한 피부 광손상 마우스에 비해 피부 광손상 보호 효과가 있는 녹차 식이를 한 자외선 B 조사 마우스의 분변에서 알로바쿨룸(Allobaculum), 래크노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 및 파비박터(Parvibacter)가 풍부하고, 락토바실러스(Lactobacillus)는 억제되며, 다중 오믹스 분석법을 이용하여 상기 장내 미생물과 관련된 분변, 혈청, 간 및 피부 대사체의 변화가 경감 또는 촉진되는 것을 확인하였으므로, 상기 장내 미생물 또는 내인성 대사체 마커를 피부 광손상 여부를 판단하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1a는 Shannon and Simpson's 다양성 지수를 이용한 대조군(NOR), 자외선 B 조사군(UND) 및 녹차 식이를 한 자외선 B 조사군(UGD)의 대장 내 분변 미생물 군집 변화를 확인한 도이다.
도 1b는 NOR군, UND군 및 UGD군의 대장 내 분변 미생물 군집의 UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean) 트리 클러스터링(clustering)을 도식화한 도이다.
도 1c는 NOR군, UND군 및 UGD군에서 상대적으로 풍부한 분변 미생물 문(phylum)을 확인한 도이다.
도 1d는 NOR군, UND군 및 UGD군에서 분변 미생물 강(class), 목(order), 과(family) 변화를 확인한 도이다.
도 1e는 NOR군, UND군 및 UGD군에서 분변 미생물 속(genus) 변화를 확인한 도이다.
도 2는 NOR군, UND군 및 UGD군의 분변, 간, 혈청 및 피부 추출물의 대사체에 대한 PLS-DA(partial least squres-discriminant analysis) 스코어 플롯(score plot)을 나타낸 도이다:
검은색 스팟(spot): NOR군;
빨간색 스팟: UND군; 및
녹색 스팟: UGD군.
도 3은 NOR군, UND군 및 UGD군의 분변, 간, 혈청 및 피부 추출물의 대사체에 대한 PCA(principal component analysis) 스코어 플롯을 나타낸 도이다.
도 4a는 분변, 간, 혈청 및 피부에서 녹차 식이에 의해 현저하게 변화한 미생물 대사체를 나타낸 도이다.
도 4b는 대장에서 유래한 분변에서 분변 미생물 군집 및 미생물 대사체의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 5a는 UVB 조사에 의해 내인성 대사체의 변화가 녹차 식이에 의해 경감된 내인성 대사체를 확인한 도이다.
도 5b는 UVB 조사에 의해 내인성 대사체의 변화가 녹차 식이에 의해 촉진된 내인성 대사체를 확인한 도이다.
도 6a는 다중오믹스 분석법을 이용한 NOR군, UND군 및 UGD군의 피부 전사체 분석을 통해 UVB 조사에 의해 변화된 대사체 경로에서 대사체 유전자 발현을 확인한 도이다.
도 6b는 다중오믹스 분석법을 이용한 NOR군, UND군 및 UGD군의 피부 전사체 분석을 통해 UVB 조사에 의해 대사체 유전자 발현 변화가 녹차 식이에 의해 감소한 대사체 유전자를 확인한 도이다.
도 6c는 다중오믹스 분석법을 이용한 NOR군, UND군 및 UGD군의 피부 대사체 분석을 통해 NOR군과 비교하여 UND군에서 변화된 대사체를 확인한 도이다.
도 6d는 다중오믹스 분석법을 이용한 NOR군, UND군 및 UGD군의 피부 대사체 분석을 통해 UND군과 비교하여 UGD군에서 변화된 대사체를 확인한 도이다.
도 7은 피부 대사체(대사체학), 리포터 대사체(전사체학) 및 상대적 유전자 발현을 이용하여 제안된 피부 대사체 경로를 도식화한 도로, UVB 조사에 의한 변화가 녹차 식이에 의해 경감되는 경향을 보이는 모든 선별된 대사체 및 유전자 발현을 나타내었다. 점선은 다중 단계를 말한다. 녹색 글자를 포함한 검정 네모 박스는 대사체학 분석으로부터 유래한 피부 대사체를 말한다. 파란색 글자는 인실리코 모델을 이용한 전사체 분석으로부터 유래한 리포터 대사체를 말한다. 노란색 네모 박스는 피부 대사체 및 리포터 대사체 간 겹치는 대사체를 말한다. 경로는 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)로부터 변형되었다. 효소에 대한 EC 번호는 다음과 같다: 1.1.1.170 [NAD(P) 의존 스테로이드 탈수소효소-유사(NAD(P) dependent steroid dehydrogenase-like)], 1.1.3.8 [굴로노락톤(L)-산화 효소(gulonolactone (L-) oxidase)], 1.13.99.1 [미오이노시톨 산소화효소(myo-inositol oxygenase)], 1.14.11.2 [프로콜라겐-프롤린(procollagen-proline), 2-옥소글루타레이트 4- 이산소화 효소(프롤린 4-수산화 효소)(2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-hydroxylase)), α-II 폴리펩티드(alpha-II polypeptide)], 1.14.13.15 [사이토크롬 P450(cytochrome P450), 패밀리 27, 서브패밀리 a, 폴리펩티드 1], 1.14.13.39 [산화 질소 합성 효소 1(nitric oxide synthase 1), 신경의], 1.14.13.70 [시토크롬 P450, 패밀리 51], 1.3.1.21 [7-디하이드로 환원 효소(7-dehydrocholesterol reductase)], 1.3.1.70 [막횡단 7 수퍼패밀리 멤버 2(transmembrane 7 superfamily member 2)], 1.3.5.1 [숙신산 탈수소 효소 복합체(succinate dehydrogenase complex), 서브 유닛 A, 플라빈단백질(flavoprotein, Fp)], 1.4.3.4 [모노아민 산화효소 B(monoamine oxidase B)], 2.1.3.3 [오르니틴 카르바모일전달효소(ornithine transcarbamylase)], 2.3.1.65 [담즙산-코엔자임 A(bile acid-Coenzyme A) : 아미노산 N - 아실기전이효소(amino acid N-acyltransferase)], 2.5.1.21 [파르네실 디포스페이트의 파르네실 전이효소 1(farnesyl diphosphate farnesyl transferase 1)], 2.6.1.1 [글루타메이트 옥살로아세테이트 아미노기 전이효소2(glutamate oxaloacetate transaminase 2), 미토콘드리아의], 2.6.1.5 [티로신 아미노기 전이효소(tyrosine aminotransferase)], 2.7.1.36 [메발로네이트 키나아제(mevalonate kinase)], 3.1.1.17 [레규칼신(regucalcin)], 3.1.3.3 [포스포세린 인산가수분해효소(phosphoserine phosphatase)], 3.1.3.5 [5' 뉴클레오티드가수분해효소(nucleotidase), 체외의], 3.5.3.11 [아그마틴 유레오가수분해효소 (아그마티나아제) (agmatine ureohydrolase (agmatinase))], 3.6.1.6 [체외뉴클레오사시드 트리포스페이트 이인산가수분해효소 4(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 4)], 4.1.1.- [피리독살 의존적 탈탄산효소 도메인 포함 1(pyridoxal-dependent decarboxylase domain containing 1)], 4.1.1.15 [글루타메이트 암모니아 리가아제 (글루타민 합성효소) (glutamate-ammonia ligase (glutamine synthetase))], 4.1.1.17 [오르니틴 탈탄산효소(ornithine decarboxylase), 구조상 1], 4.1.1.28 [도파 탈탄산효소(dopa decarboxylase)], 4.1.1.33 [메발로네이트 (디포스포) 탈탄산효소(mevalonate (diphospho) decarboxylase)], 4.2.1.11 [에놀라제 3(enolase 3), 베타 근육], 5.1.99.4 [C1q 및 종양 괴사 인자 관련 단백질 3(C1q and tumor necrosis factor related protein 3)] 및 5.4.99.7 [라노스테롤 합성효소(lanosterol synthase)].
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 실험군인 개체 유래 샘플에서 아스파르트산(aspartic acid), 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; 리소PC)(20:4), 리소PC(22:6), 리소PC(16:1), 리소PC(16:0), 리소PC(18:2) 모노글리세라이드(monoglyceride; MG)(18:4), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine; 리소PE)(dm 16:0e) 및 올레오아미드(oleamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 여부의 정보를 제공하기 위한 대사체 수준 측정 방법을 제공한다.
상기 실험군인 개체의 피부 유래 샘플에서 아스파르트산(aspartic acid)의 수준이 정상 대조군과 비교하여 낮은 경우 상기 개체의 피부가 광손상된 것으로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 실험군인 개체의 혈청 유래 샘플에서 리소PC(20:4), 리소PC(22:6) 및 리소PC(16:1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준이 정상 대조군과 비교하여 높고, 리소PC(18:2)의 수준이 정상 대조군과 비교하여 낮은 경우 상기 개체의 피부가 광손상된 것으로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 실험군인 개체의 분변 유래 샘플에서 MG(18:4)의 수준이 정상 대조군과 비교하여 높고, 리소PC(16:0) 및 리소PE(dm 16:0e)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준이 정상 대조군과 비교하여 낮은 경우 상기 개체의 피부가 광손상된 것으로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 실험군인 개체의 간 유래 샘플에서 올레오아미드의 수준이 정상 대조군과 비교하여 낮은 경우 상기 개체의 피부가 광손상된 것으로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 수준이란 샘플에서 대사체의 발현양, 생성양 또는 활성 정도를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 UND군과 UGD군에서 현저한 차이를 보이는 대장 유래 분변 미생물과 양성 상관관계를 가지는 내인성 대사체의 변화를 확인한 결과, 아스파르트산을 포함한 피부 대사체, 리소PC(16:1), 리소PC(22:6), 리소PC(20:4) 및 리소PC(18:2)를 포함한 혈청 대사체, 올레오아미드를 포함한 간 대사체, MG(18:4), 리소PC(16:0) 및 리소PC(dm16:0e)를 포함한 분변 대사체가 대조군(NOR 군)에 비해 UVB 조사군(UND 군)에서 현저한 차이를 보이는 것을 확인하였으므로(도 5a 및 도 5b 참조), 상기 대사체의 수준을 측정하여 피부 광손상 여부를 판단하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에 녹차를 처리하는 단계를 포함하는 대사체 수준을 조절하는 방법으로서,
상기 개체 유래 샘플에서 아스파르트산, 리소PC(20:4), 리소PC(22:6), 리소PC(16:1), 리소PC(16:0), 리소PC(18:2) MG(18:4), 리소PE(dm 16:0e) 및 올레오아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준을 조절하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 피부 유래 샘플에서 아스파르트산의 수준이 피부 광손상에 의해 감소하고, 녹차 처리에 의해 증가하는 것이 바람직하다.
상기 개체의 혈청 유래 샘플에서 리소PC(16:1), 리소PC(22:6) 및 리소PC(20:4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준이 피부 광손상에 의해 증가하고, 녹차 처리에 의해 감소하고, 리소PC(18:2)의 수준이 피부 광손상에 의해 감소하고, 녹차 처리에 의해 증가하는 것이 바람직하다.
상기 개체의 분변 유래 샘플에서 MG(18:4)의 수준이 피부 광손상에 의해 증가하고, 녹차 처리에 의해 감소하고, 리소PC(16:0) 및 리소PE(dm 16:0e)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준이 피부 광손상에 의해 감소하고, 녹차 처리에 의해 증가하는 것을 바람직하다.
또한, 상기 개체의 분변 유래 샘플에서 우라실의 수준이 피부 광손상에 의해 증가하고, 녹차 처리에 의해 추가적으로 증가하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 개체의 분변 유래 샘플에서 트립토판, 리소PE(18:0) 및 리소PC(20:1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체 수준이 피부 광손상에 의해 감소하고, 녹차 처리에 의해 추가적으로 감소하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 개체의 간 유래 샘플에서 올레오아미드의 수준이 피부 광손상에 의해 감소하고, 녹차 처리에 의해 증가하는 것이 바람직하다.
상기 수준이란 대사체의 발현양, 생성양 또는 활성 정도를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 UND군과 UGD군에서 현저한 차이를 보이는 대장 유래 분변 미생물과 양성 상관관계를 가지는 내인성 대사체의 변화를 확인한 결과, 상기 분변, 간 혈청 및 피부 내인성 대사체가 UND군에서 현저한 변화를 나타내고, UGD군에서 상기 변화가 경감 또는 촉진되는 것을 확인하였으므로(도 5a 및 도 5b 참조), 본 발명은 개체에 녹차를 처리하여 상기 대사체를 조절하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피부 광손상 개체에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 개체의 혈청 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(16:1), 리소PC(22:6) 및 리소PC(20:4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준을 감소시키고, 및 분변 샘플에서 MG(18:4)의 수준을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피부 광손상 개체에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 개체의 피부 샘플에서 무처리 대조군에 비해 아스파르트산의 수준을 증가시키고, 혈청 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(18:2)의 수준이 증가시키고, 간 샘플에서 무처리 대조군에 비해 올레오아미드의 수준이 증가시키고, 및 분변 샘플에서 무처리 대조군에 비해 리소PC(16:0) 및 리소PE(dm 16:0e)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 대사체의 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 피검물질은, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 수준이란 대사체의 발현양, 생성양 또는 활성 정도를 의미한다.
또한, 상기 단계 2)의 수준은 UPLC-Q-TOF MS(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry) 분석 또는 GC-TOF-MS(gas chromatography mass spectrometry) 분석을 사용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법이라면 모두 사용가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 UND군과 UGD군에서 현저한 차이를 보이는 대장 유래 분변 미생물과 양성 상관관계를 가지는 내인성 대사체의 변화를 확인한 결과, 상기 분변, 간 혈청 및 피부 내인성 대사체가 UND군에서 현저한 변화를 나타내고, UGD군에서 상기 변화가 경감 또는 촉진되는 것을 확인하였으므로(도 5a 및 도 5b 참조), 상기 내인성 대사체를 이용하여 피부 광손상 예방 또는 억제제의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 시료의 준비
아세토나이트릴(Acetonitrile), 다이클로로메테인(dichloromethane), 메탄올(methanol) 및 물은 Fisher Scientific(미국)에서 구매하였다. 포름산(Formic acid), 피리딘(pyridine), 메톡시아민 염산염(methoxyamine hydrochloride), MSTFA(n-methyl-n-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) 및 표준 화합물은 Sigma Chemical Co.(미국)에서 구매하였다. 녹차 추출물(GTE)은 아모레퍼시픽(한국)에서 구매하였다. GTE는 상당한 양의 총 카테킨(50%) 및 카페인(4.5%)를 포함하는 것을 사용하였다.
< 실시예 2> 실험 동물의 준비
암컷 알비노 무모쥐(Skh:HR-1, 6-8주령)는 오리엔트바이오(한국)에서 구매하였고, 24±2℃, 55±10% 습도 및 12시간 낮/밤 주기의 조명 하에서 사육하였다. 1주일간 적응시킨 후, 36마리 마우스를 무작위로 3군으로 나누었다: 대조군(NOR, n=12), UVB 조사군(UND, n=12) 및 녹차 식이한 UVB 조사군(UGD, n=12). UVB 조사를 위하여, 4 형광 램프(TL 20W/12 RS SLV, 피크 방출 315 nm, 파장 290-390 nm; Philips, 네덜란드)를 사용하였고, UVB 강도는 UV 미터(VARIOCONTROL, Waldmann ver. 2.03, 독일)를 이용하여 모니터링하였다. 마우스는 10주 동안 1주일에 한 번씩 자외선 B(ultraviolet B, UVB) 방사선에 조사되었다. UVB 조사하는 동안 마우스는 우리에서 자유롭게 움직일 수 있었고 등쪽 전체 피부가 UVB에 조사되었다. 램프로부터 마우스의 거리는 약 30 cm였다. UVB 조사는 75 mJ/cm2(1 초소홍반양(minimal erythema dose, MED))에서 시작하였고, 조사량은 1 MED에서 4 MED까지 매주 증가시켰다. 총 UVB 방사선 조사량은 약 7650 mJ/cm2으로 하였다. 10주 동안 NOR군 및 UND군은 대조군 먹이(Ain-93G)를 주었고, UGD군은 GTE 1% 포함 먹이(Ain-93G + 1% GTE)를 주었다. 실험 기간 동안, 먹이 섭취 및 마우스 체중은 매주 측정하였고 3군 간 차이는 없었다. 10주 후, 상기 마우스에서 등쪽 피부, 간, 혈청, 대장 샘플을 적출하여 -80℃에서 저장하였다. 실험에 사용된 마우스 관련 진행 과정은 경기과학기술진흥원 동물 실험 관련 위원회로부터 검토되고 승인받았다.
< 실시예 3> 분변 미생물 군집 분석
<3-1> DNA 추출 및 emPCR (emulsion-based PCR )
미생물 DNA 추출을 위하여 Power water®DNA Isolation 키트(MO BIO)를 이용하였다. 라이브러리는 GS FLX plus 라이브러리 프랩 가이드에 따라 PCR 산물을 이용하여 제작하였다. 라이브러리는 Picogreen 분석법을 이용하여 정량화하였다(Victor 3). 정제된 라이브러리의 클론 증폭과 상응하는 emPCR은 GS-FLX plus emPCR 키트(454 Life Sciences)를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 라이브러리는 DNA 캡쳐 비드에 고정하였다. 상기 획득한 라이브러리-비드를 증폭 믹스 및 오일 혼합물에 첨가하고 Tissue Lyser II(Qiagen)에서 혼합하여 증폭 믹스 및 단일 비드가 포함된 "마이크로-반응체(micro-reactors)"를 제작하였다. 유화는 96웰 플레이트에서 수행하였고 PCR 증폭 프로그램은 제조사의 절차에 따라 수행하였다. 20 ng의 각 샘플 DNA 50 ㎕를 PCR 반응을 위해 사용하였다. 16s rRNA 유전자 증폭을 위하여 다음 프라이머를 사용하였다: 16S 일반적 프라이머 정방향 27F; 5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 16S 일반적 프라이머 역방향 800R; 5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'. PCR 반응 조건은 다음과 같이 하였다: 94℃에서 3분, 94℃에서 15초(35 사이클), 55℃에서 45초, 72℃에서 1분, 72℃에서 8분 반응종료.
<3-2> Roche 454 GS - FLX plus를 이용한 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing, NGS )
시퀀싱은 마크로젠(한국)에 의뢰하여 수행하였다. PCR 증폭 후, 화학적으로 유화를 깨고 증폭 DNA 라이브러리를 가진 비드를 여과하여 회수 및 세척하였다. 양성 비드는 스트랩타비딘-코팅된 마그네틱 비드에 결합하는 비오틴화 프라이머 A(어댑터 A에 상보적)를 사용하여 정제하였다. DNA 라이브러리 비드는 이중 가닥 증폭 산물 및 비드-결합된 단일 가닥 주형 DNA 절편을 제거함으로써 마그네틱 비드에서 분리하였다. 시퀀싱 프라이머는 증폭된 단일 가닥 DNA에 어닐링 되었다. 그 다음, Particle Counter(Beckman Coulter)를 이용하여 증폭된 단일 가닥 DNA를 포함하는 비드 수를 계산하였다. 시퀀싱은 Genome Sequencer FLX plus (454 Life Sciences)를 이용하여 수행하였다.
<3-3> 16S rRNA의 선별 및 분류 배정(taxonomic assignment)
BLAST에 의해 모든 시퀀스 리드는 Silva rRNA 데이터베이스와 비교하였다. 0.01 이하 E-값의 유사 시퀀스를 가지는 시퀀스 리드는 부분 16S rRNA 시퀀스로서 인정된다. 비-16S rRNA 시퀀스 리드는 1% 이하였다. 시퀀스 리드의 분류 배정은 NCBI 분류 데이터베이스를 이용하여 수행하였다. 데이터베이스로부터, 각 시퀀스 리드에 대한 가장 유사한 5가지 시퀀스를 BLAST 프로그램으로부터 비트(bit) 스코어 및 E-값에 의해 확인하였다. Needleman-Wunsch global alignment algorithm을 이용하여 전체 길이를 따라 2개 시퀀스의 최적 배치를 확인하였다. 선별된 후보 히트(hit)에 대해 pairwise global alignment를 수행하고 최적의 배치 히트를 확인하였다. 최대 유사성을 갖는 시퀀스의 분류는 시퀀스 리드에 배정되었다. 유사성에 따라 다음 분류 체계 하에 분류를 배정하였다: 97% 이상의 유사성을 갖는 종, 94% 유사성을 갖는 속, 90% 유사성을 갖는 과, 85% 유사성을 갖는 목, 80% 유사성을 갖는 강 및 75% 유사성을 갖는 문.
<3-4> 군집 풍부도를 위한 조작 분류 단위(Operational taxonomic unit, OTU) 분석
클러스터링(clustering)을 위하여 CD-HIT-OUT 소프트웨어를 사용하였다. 미생물 군집 분석에 있어서, Shannon-Weaver 다양성 지수 및 Simpson 지수를 종 다양성을 위해 이용하였다.
< 실시예 4> 대사체 프로파일링을 위한 샘플 준비
대사체 프로파일링을 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스의 피부, 혈청, 간 및 분변 추출물을 제조하였다. 피부 추출 전에, 마우스 등쪽 중앙에 있는 피부 조직(2×2 cm)을 적출하였다. 1 ㎖ 메탄올을 상기 피부 조직에 첨가한 후 MM400 mixer mill(Retch®, 독일)을 이용하여 15분 동안 30 s-1 주파수에서 균질화하였다. 그 다음, 현탁액을 4℃, 30분 동안 휴지 후 4℃, 10분, 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 0.2 ㎛ PTFE(polytetrafluoroethylene) 여과지를 이용하여 여과하고 스피드 진공농축기(Modulspin 31, 한국)를 이용하여 건조하였다. 혈청 추출을 위하여, 600 ㎕ 메탄올을 200 ㎕ 혈청에 첨가하고 15분 동안 초음파 처리하고 흔들어서 추출하였다. 12,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 0.2 ㎛ PTFE 여과지를 이용하여 여과하고 스피드 진공농축기를 이용하여 건조하였다. 간 조직 추출을 위하여, 메탄올 및 물 용매 혼합물(1:1, v/v) 1 ㎖를 간 조직(150 mg ± 1 mg)에 첨가하고 MM400 mixer mill을 이용하여 15분 동안 30 s-1 주파수에서 균질화하여 제작하였다. 균질화 후, 현탁액을 4℃, 10분, 13,000 rpm으로 원심분리하고 0.2 ㎛ PTFE 여과지를 이용하여 여과하고 스피드 진공농축기를 이용하여 건조하였다. 분변 추출을 위하여, 80% 메탄올 1 ㎖를 대장으로부터 유래한 분변에 첨가하고 10분 동안 초음파 처리하여 추출하였다. 12,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 0.2 ㎛ PTFE 여과지를 이용하여 여과하고 스피드 진공농축기를 이용하여 건조하였다. UPLC-Q-TOF-MS 분석을 위해 상기 건조한 피부 및 혈청 추출물은 메탄올을 이용하여 재용해하였고, 건조한 간 추출물은 50% 메탄올을 이용하여 재용해하였으며, 건조한 분변 추출물은 80% 메탄올을 이용하여 재용해하였다. GC-TOF-MS 분석을 위하여, 상기 건조한 추출물은 50 ㎕ 메톡시아민 염산염(피리딘에서 20 mg/㎖)을 이용하여 30℃, 90분 동안 옥시메이트화(oximate)하여, 50 ㎕ MSTFA를 이용하여 37℃, 30분 동안 실릴레이트화(silylate)하였다. GC-TOF-MS 분석은 Aglent 7693 auto-sampler(Agilent Technologies)가 연결되고 Pegasus® HT TOF MS 시스템(LECO, 미국)을 갖춘 Agilent 7890 가스 크로마토그래프 시스템(Agilent Technologies, 미국)을 이용하여 수행하였다. 그 다음, LECO Chroma TOFTM 소프트웨어(version 4.44; LECO Corp.)를 이용하여 GC-TOF-MS 데이터를 획득하고 NetCDF 포맷(*.cdf)으로 변환하였다. MassLynx 소프트웨어(version 4.1; Waters Corp.)를 이용하여 UPLC-Q-TOF-MS 데이터를 획득하고, MassLynx DataBridge(version 4.1; Waters Corp.)를 이용하여 NetCDF 포맷(*.cdf)으로 변환하였다. 변환 후, 피크 확인, 머무름 시간 보정 및 졍렬(alignment)은 Metalign software package (http://www.metalign.nl)를 이용하여 진행하였다. 다변량 통계 분석은 SIMCA-P+ (version 12.0, Umetrics; Umea, Sweden)을 이용하여 진행하였다. 상기 데이터 세트는 auto-scaling 및 mean-centring 후 PCA 및 PLS-DA를 수행하여 각각의 데이터 세트를 비교하였다. 변수는 VIP 값에 기반하여 선별하였고 유의차(significant differences)는 PASW Statistics 18 소프트웨어(SPSS Inc., 미국)를 이용하여 ANOVA 분석법 및 Duncan's 다중 범위 검정에 의해 확인하였다.
< 실시예 5> 녹차 미생물 유래 대사체의 분석
녹차 카테킨 대사체의 구조를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 4>에서 획득한 분변 및 간 추출물을 80% 메탄올 100 ㎕에서 재구성하고, 상기 재구성한 샘플 5 ㎕를 LC MS/MS 시스템에 주입하였다. LC-MS/MS 분석은 음성 모드에서 전자분무이온화 질량분석기(LC-MS 8040; Shimadzu)를 갖춘 Nexera2 LC 시스템(Shimadzu Corporation, 일본)을 이용하여 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 Kinetex C18 컬럼(100×2.1 mm, 2.6 ㎛, Phenomenex, 캐나다)에서 수행하였다. 컬럼을 용매 A(0.1% 포름산을 포함하는 물) 및 용매 B(0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile)), 유속 200 ㎕/분 조건에서 용출하였다. 농도구배 용출은 다음에 의해 수행하였다: 용매 B는 7분 동안 5%에서 7%로 선형적으로 증가시키고, 그 다음 바로 5%로 감소시켰다. ESI source 조건은 다음과 같았다: 모세관 전압-3000 V, 기화기 온도 300℃, 모세관 온도 350℃, 차단가스(Neb) 3 ℓ/분, 이온 스위프 가스(ion sweep gas) 2.0 Arb, Aux 가스 10 Arb, 및 건조 가스 8 ℓ/분. 카테킨 대사체의 구조는 상업적으로 이용 가능한 카테킨 표준 및 교내 카테킨 라이브러리의 MS/MS 절편 패턴을 비교하여 시험적으로 확인하였다.
< 실시예 6> UVB 조사 및 녹차 식이에 의해 발현이 변화한 유전자 분석
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스 군 중 NOR군과 UND군 간 및 UND군과 UGD군 간 다르게 발현된 유전자를 R-값 내에서 limma package를 이용하여 수행된 변형된 t-통계검정에 기초하여 확인하였다. 그 다음, p-값을 Benjamini 및 Hochberg's 방법을 이용하여 다중 가설 검정으로 조절하였고, FDR(False Discovery Rate)을 5%로 조절하였다.
< 실시예 7> UVB 조사 및 녹차 식이에 의해 변화한 리포터 대사체 분석
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스 군 중 NOR군 대비 UND군, UND군 대비 UGD군의 리포터 대사체의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 마우스 게놈 수준 모델에서 각각의 대사체는 상응하는 유전자의 다른 발현의 p-값을 이용하여 이웃하는 다르게 발현되는 효소의 p-값에 기반하여 점수화되었다. 동질효소 또는 효소 복합체의 경우, 가장 낮은 p-값을 갖는 동질효소 또는 효소 서브유닛이 사용되었다. 그 다음, p-값은 각 효소 i에 대하여 하기 [수학식 1]과 같이 역 정규 CDF(inverse normal cumulative distribution)를 이용하여 Z 점수로 변환하였다.
[수학식 1]
Z i = θ -1(1-p i )
각 효소에 대하여 상기와 같이 Z 점수를 구한 후, 각 대사체에 대한 Z 점수(Z metabolite )를 계산하였다. 그 다음, 이웃한 효소의 축적된 Z 점수를 하기 [수학식 2]에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
Z metabolite = 1/k∑Z i
마지막으로, 대사체 Z 점수는 하기 [수학식 3]과 같이 기존 대사체 Z 점수(Z metabolite )에서 평균(μk)을 빼고, 표준 편차(σk)로 나눠서 보정하였다.
[수학식 3]
Zcorrected metabolite = (Z metabolite -μk/σk)
보정된 Z 점수는 정규 CDF를 이용하여 p-값으로 다시 변환하고, 0.05 이하의 p-값을 가지는 대사체를 통계학적으로 풍부해진 리포터 대사체로 분류하였다. COBRA toolbox를 이용하여 마우스 게놈 수준 대사체 모델로부터 리포터 대사체를 확인하였다.
< 실시예 8> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 표적화된 피부 세라마이드(ceramide) 분석
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스의 표피를 적출한 후 상기 표피 샘플(5 mg)을 500 ㎕ 메탄올을 포함한 Tissue Lyser(30 Hz (1/s), 30초, QIAGEN)를 이용하여 균질화하였다. 상기 균질화된 샘플은 4℃, 10분, 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 침전물은 500 ㎕ 다이클로로메탄/메탄올(3/1, v/v)를 이용하여 균질화하고 원심분리하였다. 결과 상층액은 멸균된 튜브에 옮기고 진공에서 건조하였다. 건조한 샘플은 100 ㎕ 클로로포름/메탄올(1/9, v/v)에 재현탁하고 7.5 mM 아세트산암모늄(ammonium acetate)을 포함한 클로로포름/메탄올(1/9, v/v)을 이용하여 10배 희석하였다. 피부 세라마이드 프로파일링은 Triversa Nanomate(Advion Biosciences, 미국) 장치를 갖춘 LTQ XL 질량분석계(Thermo Fischer Scientific, 미국)를 이용하여 수행하였다. 피부 세라마이드는 상업적으로 이용 가능한 세라마이드 표준 및 교내 세라마이드 라이브러리의 MS/MS 절편 패턴과 비교하여 시험적으로 확인하였다.
< 실시예 9> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 표적화된 간 지방산 분석
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스의 간을 적출한 후 상기 간 샘플(150 mg)은 900 ㎕ 클로로포름/메탄올(1:2, v/v)을 포함한 Tissue Lyser를 이용하여 균질화하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 300 ㎕ 클로로포름을 추가하고 섞어서 상 분리를 하였다. 원심분리 후, 저유기상을 새로운 튜브에 옮겼다. 재추출은 600 ㎕ 클로로포름을 이용하여 수행하였고 결합된 유기상은 진공에서 증발시켰다. 그 다음, 잔여물은 100 ㎕ 클로로포름/메탄올(1:9, v/v)로 재구성하였고 7.5 mM 아세트산암모늄을 포함하는 클로로포름/메탄올(1:9, v/v)을 이용하여 50배 희석하였다. 상기 희석액은 마우스 간 지방을 프로파일링 하기 위하여 직접 분사 나노전기스프레이-이중질량분석법(direct-infusion nanoelectrospray-tandem mass spectrometry)을 수행하였다. 간 지방 프로파일링은 Triversa Nanomate 장치를 갖춘 LTQ XL MS 질량분석계를 이용하여 수행하였다. 분석 조건은 피부 지방 분석 조건과 동일하게 하였다. 간 인지질 및 중성지방은 상업적으로 이용 가능한 표준 및 교내 지방 라이브러리(LipidBlast)의 MS/MS 절편 패턴과 비교하여 확인하였다.
< 실시예 10> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 생화학 분석
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스의 혈청 및 간에서 생화학 파라미터는 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA; 700870, Cayman Chemical), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha, MTA00, R&D Systems), 총 콜레스테롤(TC; ab65359, Abcam) 및 트리글리세리드(triglyceride, TG; ab65336, Abcam)에 대한 상업화된 키트를 이용하여 제조사의 절차에 따라 측정하였다.
< 실시예 11> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 분변 , 간, 혈청 피부 대사체 상관 관계 분석
분변 미생물 군집 및 대사체 간, 그리고 피부, 혈청, 간 및 분변의 내인성 대사체의 쌍 상관관계는 PASW statistics 18 소프트웨어를 이용하여 Pearson's 상관계수를 이용하여 계산하였다. 상관관계 맵은 MeV 소프트웨어(http://www,tm4.org/)를 이용하여 나타내었다. 대사체 네트워크 분석은 web-based tool iPath2.0(http://pathways.embl.de)을 이용하여 마우스 특이적 대사체 경로에 있어서 다른 피부 대사체 수준의 시각화를 위해 수행하였다.
< 실시예 12> 임상 및 조직학적 평가
상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스의 피부 주름은 Visioline VL 650(CK electronics, 독일)을 이용하여 측정하였다. 주름의 전체 부위, 수, 평균 길이 및 깊이는 피부 레플리카 평가(skin replica assessment)에 의해 분석하였다. 피부 레플리카는 마우스의 등쪽 피부에 실리콘 고무(SILFLO, J&S Davis, 영국)를 적용하여 수행하였다. 조직학적 평가를 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제작한 마우스에서 절제한 등쪽 피부 및 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하고 파라핀포매 동결 절편화(5 ㎛)하였다. 상기 절편은 H&E(hematoxylin and eosin) 및 Masson's Trichrome 용액으로 염색하였다. 표피층 두께는 5개의 다른 부위에서 측정하였고 평균값을 계산하였다. 염색한 절편은 ECLIPSE Ti-E 도립현미경(Nikon, 일본) 및 NIS-Elements BR 3.00 소프트웨어를 이용하여 관찰하였다. 임상 및 조직학적 결과는 평균±표준편차로 표현하였다. 3 군은 Duncan's 다중 범위 검정으로 비교하였다.
< 실험예 1> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 대장의 분변 미생물 군집 및 외인성 대사체 변화 확인
마우스에서 UVB 조사 및 UVB 조사 후 녹차 식이에 따른 대장의 분변 내 미생물 군집의 반응을 알아보기 위하여, 미생물 군집 분석을 수행하여 Shannon 및 Simpson 다양성 지수를 이용하여 NOR군, UND군 및 UGD군에서 미생물 다양성을 비교한 결과, NOR군 및 UND군보다 UGD군에서 더 다양한 미생물 군집이 나타나는 것을 확인하였다(도 1a). UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean) 트리에 따르면, UGD군 및 NOR군과 UND군에 의해 미생물 군집이 나뉘어지는 반면, NOR군과 UND군 간에는 미생물 군집이 구별되지 않음을 확인하였다(도 1b). 또한, 박테리아 문(phylum) 수준에서 상기 3 군 간 엑티노박테리아(Actinobacteria), 박 테로이데 트(Bacteroidetes), 퍼미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 테네리쿠테스(Tenericutes) 및 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia)의 비율이 차이가 있음을 확인하였다. 퍼미쿠테스를 제외한 모든 박테리아 문의 비율이 NOR군과 UND군보다 UGD군에서 더 높음을 확인하였다(도 1c). 녹차 식이에 의한 분변 미생물 조성의 변화를 밝히기 위하여, 상기 3 군에서 현저하게 차이가 나는 박테리아를 선별하였다. 14강(class) 중 3강, 16목(order) 중 3목, 29과(family) 중 3과 및 46속(genus) 중 6속이 NOR군과 UND군보다 UGD군에서 더 현저한 차이가 남을 확인하였다(도 1d 및 도 1e). 문 수준에서는 녹차 식이가 퍼미쿠테스 조절에 가장 큰 영향을 미쳤고, 강 수준에서는 녹차 식이에 의해 바실리(Bacilli)가 현저하게 감소하고 클로스트리 디아(Clostridia) 및 에리시페로트리치아(Erysipelotrichia)는 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 과 수준에서는 에리시페로트리카시에(Erysipelotrichaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 래크노스피래세에(Lachnospiraceae) 및 코리오박테리아시 에(Coriobacteriaceae)가 UND군에서 현저하게 감소하고 UGD군에서 현저하게 증가하는 반면, 락토바실라시에(Lactobacillaceae)는 UND군에서 현저하게 증가하고 UGD군에서 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 속 수준에서는 알로바쿨룸(Allobaculum), 래크노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 및 알려지지 않은 박테리아 2속(루미노코카시에(Ruminococcaceae)과 및 래크노스피래세에(Lachnospiraceae)과)이 UGD군에서 풍부한 반면, 락토바실러스(Lactobacillus)는 억제되는 것을 확인하였다.
삼중-사극자(triple-quadrupole) MS를 이용하여 대장의 분변에서 미생물에 의해 변환된 녹차 대사체를 분석하였다. 총 26가지의 녹차 카테킨 유사체를 분변에서 확인하였다(표 1). 상기 유사체는 2개는 카테킨, 6개는 2상(phase II) 대사 카테킨, 18개는 미생물 분해 대사체임을 확인하였다. 반면, 간 조직에서는 27가지의 녹차 카테킨 유사체를 확인하였다. 상기 유사체에는 5-(3',4',5-트리하이드록시페닐)-γ-발레로락톤 설페이트(5-(3',4',5-trihydroxyphenyl)-γ-valerolactone sulfate, M4), 5-(3'4'-디하이드록시페닐)-γ-발레로락톤/5-(3'5'-디하이드록시페닐)-γ-발레로락톤(5-(3'4'-dihyroxyphenyl)-γ-valerolactone/5-(3'5'-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone, M6/M6'), 트리하이드록시-벤젠펜탄산 설페이트(trihydroxy-benzenepentanoic acid sulfate), 페룰산 설페이트(ferulic acid sulfate), M4 디설페이트(M4 disulfate), 메틸 M6/M6', 5-(3,4-디하이드록시페닐)-발레르산 설페이트 글루쿠로니드(5-(3,4-dihydroxyphenyl)-valeric acid sulfate glucuronide), 3-하이드록시페틸아세트산 설페이트(3-hydroxyphenylacetic acid sulfate) 및 하이드록시페닐 프로피온산(hydroxyphenyl propionic acid)와 같은 대사 작용으로 분해된 대사체가 많이 포함되어 있음을 확인하였다.
Figure 112017014202900-pat00001
< 실험예 2> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 분변 , 간, 혈청 및 피부의 대사체 변화 확인
NOR군, UND군 및 UGD군에서 현저하게 구별되는 1차 및 2차 대사체를 알아보기 위하여, GC-TOF-MS(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry) 및 (UPLC-Q)-TOF-MS(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole)를 이용하여 마우스의 분변, 간, 혈청 및 피부 추출물의 대사체 프로파일링 및 다변량 통계 분석법을 수행한 결과, PLS-DA(partial least squares-discriminant analysis) 스코어 플롯(score plot)을 통해 상기 3 군을 R2X(cum), R2Y(cum), Q2 (cum) 및 p-값을 이용하여 명확하게 구별할 수 있음을 확인하였다(도 2). PCA(principal component analysis) 스코어 플롯을 통해서도 상기 결과와 유사한 결과를 얻었다(도 3). 간 및 분변 대사체 프로 3파일에 대한 PLS-DA 스코어 플롯을 통해 UGD군 및 NOR군과 UND군을 PLS1에 의해 명확하게 구별할 수 있는 반면, 혈청 및 피부 대사체 프로파일에 대한 PLS-DA 스코어 플롯을 통해서는 UGD군 및 NOR군과 UND군을 PLS1에 의해 명확하게 구별할 수 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 녹차 식이는 분변 및 간 대사체에 더 많은 영향을 미치고, UVB 조사는 혈청 및 피부 대사체에 더 많은 영향을 미침을 확인하였다. 상기 구별에 대한 변수를 선별하기 위하여, VIP 값(>0.7) 및 p-값(<0.05)을 적용하였다. NOR군, UND군 및 UGD군의 분변, 간, 혈청 및 피부 프로파일 각각에서 총 38, 44, 46 및 56 대사체를 선별하여 확인하였다. 구체적인 정보 및 상대적 수준의 대사체로부터 변환된 배수 변화를 [표 2] 및 [표 3]에 나타내었다.
No. Metabolites Faeces
( large intestine) 		Liver Serum Skin
Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND)
Amino acids
1 5-Oxoproline - - 1.00 1.17* - - - -
2 Alanine - - 1.08 0.80* 1.59* 0.76 - -
3 Asparagine 0.81 0.17* - - - - - -
4 Aspartic acid - - 1.52* 2.04* - - 0.95* 1.06*
5 Citrulline - - - - - - 1.35* 0.96
6 Glutamic acid - - 0.96 1.39* - - 0.99 1.08*
7 Glutamine - - - - - - 1.21* 0.97
8 Glycine - - - - 1.02 1.18*
9 Histidine - - - - - - 1.43* 1.01
10 Isoleucine 0.98 0.76* - - - - - -
11 Leucine 0.92 0.56* - - - - - -
12 Lysine 0.90 0.61* - - - - - -
13 Methionine 0.98 1.59* - - - - - -
14 Ornithine 0.75* 1.03 - - - - 1.55* 0.82*
15 Phenylalanine 1.01 0.89* 1.20* 1.31* - - - -
16 Proline 1.01 0.82* - 0.60* 1.05 0.95 0.86*
17 Serine 1.00 0.70* 1.08 1.31* - - 1.13* 0.96
18 Threonine 1.02 0.76* 1.17 1.25* 0.76* 1.18 0.88* 1.07
19 Tryptophan 0.85* 0.33* - - - - - -
20 Tyrosine 0.97 0.86* - - - - - -
21 Valine 0.92 0.43* - - 0.77* 1.05 - -
Organic compounds
22 2-Ketoglutaric acid - - 0.79* 0.69* - - - -
23 Ascorbic acid - - - - - - 2.16* 0.49*
24 Ethanolamine - - - - - - 1.25* 0.88*
25 Fumaric acid - - 1.07 1.37* - - - -
26 Histamine - - - - - - 1.36* 0.95
27 Lactic acid - - - - 0.96* 1.01 - -
28 Malic acid 1.38 17.1* 1.04 1.66* 1.16 0.68* - -
29 Pyruvic acid 1.12 0.27* - - - - - -
30 Succinic acid 1.23 5.71* - - - - - -
31 trans-Urocanic acid 1.33 0.48* - - - - 1.77* 0.90
32 Urea - - - - 0.90* 1.01 0.84* 1.04
Nucleobases
33 Hypoxanthine 1.09 1.20* 1.62* 1.20 - - - -
34 Inosine 0.39 3.85* - - - - - -
35 Uracil 1.22* 1.75* - - - - 1.14* 1.12*
Carbohydrates
36 Adonitol - - 1.41* 1.24 - - - -
37 Fructose 1.32 1.51* - - - - - -
38 Fructose 1.31 1.69* - - - - - -
39 Fucose 1.16 0.67* - - - - - -
40 Glucose - - - - 0.96* 1.01 0.71* 1.15
41 Glucose - - - - 0.95* 1.01 0.69* 1.24
42 Glyceric acid 1.24 2.32* - - - - - -
43 Glycerol 1.02 1.22* - - - - -
44 Mannose 0.71 6.23* - - - - - -
45 myo-Inositol 0.99 1.07* - - - - - -
46 Sucrose 1.01 3.15* 1.04 5.34* 0.98 0.48* - -
47 Xylitol - - 0.72* 1.02 - - - -
48 Xylose 1.04 1.85* - - - - - -
Fatty acids and Lipids
49 Arachidic acid - - - - - - 1.23* 0.92
50 Arachidonic acid - - - - - - 1.02 0.92*
51 Cholesterol - - 1.44* 2.05* - - - -
52 Docosanoic acid - - - - - - 1.34* 0.96
53 Hexanoic acid 0.71* 0.76 - - - - - -
54 Lanosterol 1.05 0.39* - - - - - -
55 Linoleic acid 1.01 0.35* 1.00 1.47* 0.88 1.57* - -
56 Monoolein 1.07 0.12* - - 1.24 1.94* - -
57 Monopalmitin 0.85 0.03* - - - - - -
58 Oleamide - - 0.74* 1.35* - - - -
59 Oleic acid 1.01 0.26* - - 1.04 1.34* 0.96 0.89*
60 Palmitic acid 1.18 0.56* - - 0.99 1.08*
61 Palmitoleic acid 0.87 0.52* - - - - 0.93 0.71*
*p<0.05
No. Tentative Metabolites a Faeces
( large intestine) 		Liver Serum Skin
Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND) 		Fold
change
(UND/
NOR) 		Fold
change
(UGD/
UND)
62 Oxidized glutathione - - 1.11 0.84* - - - -
63 Gulonic acid or Gluconic acid
or Galactonic acid		 1.00 138.38* - - - - - -
64 Tryptophan - - - - - - 0.81* 1.07
65 Taurocholic acid - - - - 1.22 5.36* - -
66 Taurocholic acid 1.05 0.13* 0.94 1.86* 0.72 5.03* - -
67 Taurodeoxycholic acid 1.44 0.05* - - - - - -
68 Taurocholic acid - - - - - - 0.85 5.29*
69 2-(14,15-Epoxyeicosatrienoyl)
glycerol		 1.71 3.68* - - - - - -
70 Taurodeoxycholic acid - - - - 0.95 2.48* - -
71 Taurocholic acid - - - - 0.77 4.66* - -
72 Taurocholic acid 0.76 0.14* 1 1.49* - - - -
73 Cholic acid 1.14 1.54* 0.93 4.31* 0.94 4.63* - -
74 2-(14,15-Epoxyeicosatrienoyl)
glycerol		 1.52 2.74* - - - - - -
75 Cholic acid - - - - 0.91 2.16* - -
76 Deoxycholic acid 1.22 0.38* - - - - - -
77 Cholic acid - - 0.54 4.17* 0.71 3.22* - -
78 MG (18:4) 1.74* 0.26* - - - - - -
79 Deoxycholic acid 1.13 0.59* - - - - - -
80 LysoPC (18:3) - - - - 0.74* 1.13 - -
81 LysoPC (16:1) - - - - 1.18* 0.68* - -
82 LysoPC (16:1) - - - - 1.15* 0.73* 1.01 0.86*
83 LysoPC (22:6) - - 0.77* 0.76* 1.10* 0.88* 0.75* 1.14
84 LysoPE (15:0) 1.38 6.40* - - - - - -
85 LysoPC (18:2) - - 0.86* 0.92 0.83* 1.17* 1.21* 0.99
86 LysoPC (20:4) - - 0.90* 0.87* 1.13* 0.93* - -
87 LysoPE (18:2) - - - - - - 1.35* 1.05
88 LysoPE (20:4) - - - - - - 1.10* 1.09
89 LysoPC (22:6) - - 0.88* 0.72* 1.02 0.89* 0.74* 1.01
90 LysoPC (20:4) - - 0.98 0.81* 1.14* 0.88* - -
91 LysoPC (18:2) - - 0.92 0.85* 0.91* 1.09* - -
92 LysoPE (18:2) 0.94 0.53* - - - - 1.34* 1.1
93 LysoPE (16:0) 0.66* 1.21 1.50* 1.25* - - - -
94 LysoPC (20:3) - - - - 1.1 0.85* - -
95 LysoPC (16:0) 0.73* 1.22 1.19* 1.20* 0.90* 1.01 - -
96 LysoPC (22:5) - - 0.64* 0.74* - - - -
97 LysoPE (16:0) 0.66* 1.34 1.76 1.66* - - - -
98 LysoPC (22:5) - - 0.63* 0.46* - - - -
99 LysoPC (16:0) 0.75* 1.50* 1.29 1.36* - - - -
100 LysoPC (18:1) - - 0.78* 0.67* - - - -
101 LysoPC (22:4) - - - - - - 1.16 1.15*
102 LysoPC (18:1) 0.75* 0.96 1.03 0.79* 0.97 0.93* 0.93 0.88*
103 LysoPE (18:1) 0.67* 0.75 - - - - - -
104 LysoPC (20:2) - - - - 1.25* 1.05 - -
105 LysoPE (dm16:0e) 0.58* 2.20* - - - - - -
106 LysoPE (20:0) - - - - 1.18* 0.91 1.35* 0.71*
107 LysoPC (20:2) - - - - 1.11* 1.03 - -
108 LysoPE (20:0) - - - - 0.96 1.27* - -
109 LysoPC (18:0) 0.64* 0.74 - - 0.98 0.92* - -
110 LysoPC (20:1) 0.30* 0.57 - - 1.07 0.80* - -
111 LysoPC (18:0) 0.72* 0.88 1.71 1.55* - - - -
112 LysoPE (18:0) 0.70* 0.45* - - - - - -
113 LysoPC (20:1) 0.68* 0.39* - - - - - -
*p<0.05
< 실험예 3> UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 미생물 대사체 변화 확인
UVB 조사 및 UVB 조사 후 녹차 식이가 미생물 대사체에 미치는 영향을 알아보기 위하여, NOR군, UND군 및 UGD군에서 상기 <실험예 2>에서 선별한 대사체의 변화를 확인한 결과, 많은 분변 미생물 대사체가 UGD군에서 현저하게 변화하였으며, 상기 대사체에는 5 아미노산, 4 유기 화합물, 8 탄수화물, 4 지방산, 7 지방 및 6 담즙산이 포함되어 있음을 확인하였다(도 4a). 특히, 다음의 대사체들이 현저한 변화를 보였다: 에너지 대사 관련 대사체; 피루브산(pyruvic acid, 0.27배), 말산(malic acid, 17.1배) 및 숙신산(succinic acid, 5.71배), 탄수화물; 만노오스(mannose, 6.23배) 및 수크로오스(sucrose, 3.15배), 지방산 및 지방; 올레산(oleic acid, 0.26배), 모노올레인(monoolein, 0.12배), 모노팔미틴(monopalmitin, 0.03배), 2-(14,15-에폭시에이코사트리에노일)글리세롤(2-(14,15-epoxyeicosatrienoyl) glycerol, 3.68배) 및 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine; 리소PE)(15:0)(lysoPE (15:0), 6.40배), 및 담즙산; 타우로콜린산(taurocholic acid, 0.13 및 0.14배), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid, 0.05배). UGD군의 간, 혈청 및 피부에서도 상기와 유사한 대사체, 특히 담즙산이 현저하게 변화하였다. UGD군의 간, 혈청 및 피부에서 콜산(cholic acid) 및 타우린 접합된 콜산을 포함한 1차 담즙산이 1.86-5.29배 증가하였다.
녹차 식이에 의한 분변 미생물 군집 조절 및 분변 미생물 대사체의 변화의 관계를 밝히기 위하여 분변 미생물 군집 및 분변 미생물 대사체의 상관관계 분석을 수행한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 메티오닌(methionine), 말산(malic acid), 히포크산틴(hypoxanthine), 이노신(inosine), 우라실(uracil), 프럭토스(fructose), 글리세르산(glyceric acid), 만노오스(mannose), 미오이노시톨(myo-inositol), 자일리톨(xylitol), 굴론산/글루콘산/갈락톤산(gulonic acid/gluconic acid/galactonic acid), 2-(14,15-에폭시에이코사트리에노일)글리세롤(2-(14,15-epoxyeicosatrienoyl) glycerol), 리소PE(15:0)(lysoPE (15:0)), 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; 리소PC)(16:0)(lysoPC (16:0)), 리소PE(dm 16:0e)(lysoPE (dm 16:0e)) 및 콜산(cholic acid)을 포함한 다양한 분변 미생물 대사체가 UGD군에서 풍부한 박테리아인 알로바쿨룸(Allobaculum), 래크노클로스트리디움(Lachnoclostridium) 및 알려지지 않은 박테리아 2속(루미노코카시에(Ruminococcaceae)과 및 래크노스피래세 에(Lachnospiraceae)과)과 양성 상관관계를 나타냄을 확인하였다(도 1e 및 도 4b).
< 실험예 4> UVB에 의해 유도된 분변 , 간, 혈청의 내인성 대사체 변화에 있어서 녹차 식이의 영향 확인
UVB에 의해 유도된 분변, 간, 혈청 및 피부에 존재하는 내인성 대사체의 변화에 있어서 녹차 식이의 영향을 알아보기 위하여, NOR군, UND군 및 UGD군에서 상기 <실험예 2>에서 선별한 대사체의 변화를 확인한 결과, UVB에 의해 변화된 내인성 대사체에 대하여 서로 다른 2가지 패턴의 녹차 식이 효과를 확인하였다(도 5a 및 도 5b). 녹차 식이는 UVB에 의해 유도된 분변, 간, 혈청 및 피부 대사체의 변화를 현저하게 억제하거나(도 5a) 촉진하는 것을 확인하였다(도 5b). MG (18:4), 리소PC(16:0)(lysoPC (16:0)) 및 리소PE(으 16:0e)(lysoPE (dm 16:0e))를 포함한 분변 대사체, 리소PC(16:1), 리소PC(22:6), 리소PC(20:4) 및 리소PC(18:2)를 포함한 혈청지방, 아스파르트산(aspartic acid), 오르니틴(ornithine), 아스코르브산(ascorbic acid), 에탄올아민(ethanolamine) 및 리소PE(20:0)을 포함한 피부 대사체의 수준이 UVB 조사에 의해 현저하게 변화하였고 녹차 식이에 의해 상기 변화가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5a). 특히, 피부의 아스코르브산은 UND군에서는 2배로 증가하였고, UGD군에서는 2배로 감소하였다. 반면, 트립토판(tryptophan), 우라실(uracil), 리소PE(18:0) 및 리소PC(20:1)을 포함한 분변 대사체, 아스파르트산, 페닐알라닌(phenylalanine), 2-케토글루타르산(2-ketoglutaric acid), 콜레스테롤, 리소PE (16:0), 리소PC (16:0), 리소PC (22:6), 리소PC (20:4), 리소PC (22:5) 및 리소PC (18:1)을 포함한 간 대사체, 우라실을 포함한 피부 대사체의 수준이 UVB 조사에 의해 현저하게 변화하였고, 녹차 식이에 의해 상기 변화가 현저하게 촉진되었다(도 5b).
< 실험예 5> 다중- 오믹스 분석법(multi- omics approach)을 이용한 UVB 조사 및 녹차 식이에 따른 피부의 대사체 조절 경로 변화 확인
UVB 조사 및 UVB 조사 후 녹차 식이가 피부 대사체 기전에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 인실리코(in silico) 모델을 이용하여 대사체 및 전사체의 분석을 결합한 다중-오믹스 분석법을 수행하고 유전자-단백질 반응(gene-protein-reaction, GPR) 연관성을 이용하여 유전자 수준의 마우스 대사체 네트워크에서 전사체 데이터를 지도화하였다(도 6a 및 도 6b). 2011 가지 반응에 존재하는, 1366 대사체 유전자의 발현 수준이 상기 분석법을 통한 모델과 관련이 있음을 확인하였다. 그 다음, 다중 가설 검정을 위해 조절된, 변형된 t-통계를 이용하여 쌍 방식으로 다양한 처리하에 각각의 반응의 다른 발현을 계산함으로써, 각각의 반응 및 대사체 수준에서 발현을 확인하였다. 각각의 분석을 통해 UVB 조사 및 녹차 식이 하에 현저하게 경로가 변화된 것을 확인하였고, 특히 케라틴 설페이트(keratin sulfate) 생합성/분해, 지방산 산화 및 스테로이드 대사 경로가 UVB 조사에 의해 촉진되고 녹차 식이에 의해 억제 효과가 있음을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).
또한, 상기 <실험예 2>에서 선별한 대사체 및 [표 4]에 나타낸, 아미노산, 유기산, 핵염기, 탄수화물, 지방산, 지방 및 세라마이드(ceramide)를 포함한 77 피부 대사체를 이용하여 KEGG(iPath2.0)에서 정의한 마우스-특이적 대사 경로에서 대사체 발현 수준을 맵핑하였다(도 6c 및 도 6d).
Type a Total
Carbon 		Acyl Sphingoid Adduct
( m/z ) b 		Fold change
(UND/NOR) 		Fold change
(UGD/UND)
AP 44 26:0 18:0 770.6 1.46 1.14
AS 34 16:0 18:1 612.4 3.64 1.10
AS 44 28:0 16:1 752.5 1.70 1.11
AS 46 30:0 16:1 780.5 1.80 1.03
AS 48 32:0 16:1 808.5 1.68 1.12
AS 50 34:0 16:1 836.6 1.64 1.15
Nds 33 16:0 17:0 584.5 2.09 1.15
Nds 34 16:0 18:0 598.5 2.83 1.16
Nds 36 18:0 18:0 626.5 3.28 0.97
Nds 37 20:0 17:0 640.5 3.86 0.92
Nds 38 20:0 18:0 654.5 4.49 0.88
Nds 39 22:0 17:0 668.4 4.53 0.89
Nds 40 22:0 18:0 682.4 3.52 0.92
Nds 41 24:0 17:0 696.4 3.02 0.93
Nds 42 24:0 18:0 710.5 1.99 1.05
Nds 43 26:0 17:0 724.5 1.64 1.02
Nds 46 28:0 18:0 766.5 1.55 1.13
Nds 47 30:0 18:0 794.6 1.49 0.87
Nds 50 32:0 18:0 822.6 1.47 1.14
NP 33 16:0 17:0 600.6 2.35 1.09
NP 34 16:0 18:0 614.5 2.55 1.08
NP 36 18:0 18:0 642.6 2.81 0.96
NP 37 20:0 17:0 656.6 4.47 0.86
NP 38 20:0 18:0 670.6 4.31 0.91
NP 39 22:0 17:0 684.6 3.45 0.92
NP 40 22:0 18:0 698.6 2.79 0.97
NP 41 23:0 18:0 712.6 2.21 1.02
NP 42 24:0 18:0 726.6 1.68 1.05
NP 45 27:0 18:0 768.5 1.80 1.10
NP 47 29:0 18:0 796.6 1.44 0.87
NP 48 30:0 18:0 810.7 1.34 1.17
NS 33 16:0 17:1 582.6 1.95 1.19
NS 34 16:0 18:1 596.6 2.41 1.24
NS 36 18:0 18:1 624.5 1.64 1.05
NS 37 20:0 17:1 638.6 2.39 1.01
NS 38 20:0 18:1 652.5 1.85 1.02
NS 40 22:0 18:1 680.6 2.20 0.98
NS 41 24:0 17:1 694.6 1.78 1.02
NS 42 24:0 18:1 708.6 1.72 1.10
NS 44 26:0 18:1 736.5 1.24 1.24
NS 45 28:0 17:1 750.6 1.32 1.25
NS 46 28:0 18:1 764.6 1.34 1.35
NS 47 30:0 17:1 778.6 1.34 1.31
NS 48 30:0 18:1 792.6 1.58 1.20
NS 49 32:0 17:1 806.6 1.50 1.11
NS 50 32:0 18:1 820.7 1.68 1.14
NS 53 35:0 18:1 862.7 2.02 1.05
OS 49 31:1 18:1 821 1.34 1.02
OS 50 32:1 18:1 835 1.58 1.08
a: A α-hydroxy fatty acid, S sphingosine, N non-hydroxy fatty acid, P phytosphingosine, H 6-hydroxysphingosine, ds dihydrosphingosine, OS oligosaccharide
그 결과, 도 6c 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, 녹차 식이가 UVB에 의해 유도된 아미노산 대사, 요소 회로, 지방 대사 및 스테로이드 대사에 포함된 다양한 대사체의 변화를 뒤바꿈을 확인하였다.
또한, 가장 현저한 전사적 변화를 갖는 반응의 리스트로부터, 마우스 네트워크에서 대사 핫스팟(hotspot) 및 이들에 상응하는 전사 조절 기전을 찾기 위하여 하기 [표 5]에 나타낸 바와 같이 리포터 대사체를 선별하고, 선별된 리포터 대사체, 녹차 식이에 의한 UVB-유도된 변화 경감 패턴을 보이는 선별된 피부 대사체 및 이들과 관련된 유전자 발현의 리스트에 기반하여 피부 대사체 경로를 시각화하였다(도 7).
No. Reporter metabolite
1 L-erythro-4-Hydroxyglutamate
2 UDP
3 dCMP
4 CMP
5 UMP
6 dUTP
7 4-Methylzymosterol intermediate 2
8 Prostaglandin H2
9 S-Adenosyl-L-methionine
10 D-Fructose 6-phosphate
11 (S)-Methylmalonyl-CoA
12 keratan sulfate I, degradation product 4
13 3-(4-Hydroxyphenyl)pyruvate
14 1D-myo-Inositol 4-phosphate
15 1-Phosphatidyl-1D-myo-inositol 3-phosphate
16 L-Cysteate
17 L-Cysteine
18 Mercaptopyruvate
19 L-Phenylalanine
20 Phenylpyruvate
21 L-Tyrosine
22 chondroitin sulfate E (GalNAc4,6diS-GlcA), precursor 4
23 Phenylacetaldehyde
24 phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate
25 Putrescine
26 cAMP
27 trans-2-Methylbut-2-enoyl-CoA
28 Propenoyl-CoA
29 Geranyl diphosphate
30 Agmatine
31 myo-Inositol*
32 trihexosyl ceramide
33 Dolichol diphosphate, human liver homolog
34 3-Hydroxy-2,6-dimethyl-5-methylene-heptanoyl-CoA
35 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine
36 (S)-3-Hydroxybutanoyl-CoA
37 3-Sulfopyruvate
38 L-Citrulline*
39 zymosterol intermediate 2
40 L-Fucose 1-phosphate
41 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycolaldehyde
42 4-Methylzymosterol intermediate 1
43 Acetoacetyl-CoA
44 dADP
45 dGDP
46 GDP
47 3-Methylimidazole acetaldehyde
48 Methylamine
49 Ornithine*
50 (S)-Squalene-2,3-epoxide
51 Dimethylallyl diphosphate
52 Protein N6,N6-dimethyl-L-lysine
53 3-Hydroxypropionyl-CoA
54 20alpha-Hydroxyprogesterone
55 4-Acetamidobutanoate
56 N-Methylhistamine
57 chondroitin sulfate A (GalNAc4S-GlcA) and B (IdoA2S-GalNAc4S), precursor 2
58 Urea
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산염의 대사 및 요소 회로에 있어서 유전자 발현 및 대사체 변화가 UVB에 의해 유도되고 녹차 식이에 의해 현저하게 경감됨을 확인하였다. 특히, 미오-이노시톨(myo-inositol), 시트룰린(citrulline), 오르니틴(ornithine) 및 요소(urea)로 구성된 4 대사체가 리포터 대사체 및 대사체학 분석법에 의해 유도된 대사체 간 겹치는 것을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 실험군인 개체의 분변 유래 샘플에서 모노글리세라이드(monoglyceride; MG)(18:4), 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine; 리소PC)(16:0) 및 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine; 리소PE)(dm 16:0e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 대사체 수준을 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 피부 광손상 여부의 정보를 제공하기 위한 대사체 수준 측정 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 MG(18:4)는 대사체 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하고, 리소PC(16:0) 및 리소PE(dm 16:0e)는 대사체 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소하는 것을 특징으로 하는 피부 광손상 여부의 정보를 제공하기 위한 대사체 수준 측정 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 분변 유래 샘플에서 오르니틴(ornithine), 트립토판(tryptophan), 우라실(uracil), 헥사노익산(hexanoic acid), 리소PE(16:0), 리소PC(18:1), 리소PE(18:1), 리소PC(18:0), 리소PE(18:0) 및 리소PC(20:1)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 대사체 수준을 추가적으로 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 피부 광손상 여부의 정보를 제공하기 위한 대사체 수준 측정 방법.
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