KR101789590B1

KR101789590B1 - 신규한 피라졸 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 TrkA 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101789590B1
Application number: KR1020160045453A
Authority: KR
Inventors: 이광호; 최상운; 최현정; 손유화
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2017-10-25
Also published as: KR20170117704A

Abstract

본 발명은 신규한 피라졸 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 TrkA 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 피라졸, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, TrkA(Tropomyosin receptor kinase A)에 대하여 효과적인 억제 활성을 나타내어 이로부터 유발되는 질환, 대표적으로 암 및 종양의 치료에 유용한 효과가 있다.

Description

신규한 피라졸 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 TrkA 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel pyrazole derivatives, preparation method thereof, and pharmaceutical composition for use in preventing or treating TrkA relating diseases containing the same as an active ingredient}

본 발명은 신규한 피라졸 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 TrkA 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Trk는 뉴트로핀(neurotrophin: NT)에 의해 활성화되는 티로신 키나제이고, TrkA, TrkB 및 TrkC가 있다. Trk는 신경 조직에서 광범위하게 발현되며 신경 세포의 유지, 신호전달 및 생존에 관여한다.

한편, Trk는 지금까지 많은 연구를 통해 Trk의 과발현, 과활성, 증폭 및/또는 돌연변이로부터 다양한 질병이 발생할 수 있는 것으로 입증되었는데, 예를 들어 신경아세포종, 난소암, 결장암, 흑색종, 두경부암, 위 암종, 폐 암종, 유방암, 교모세포종, 수모세포종, 분비성 유방암, 유두 갑상선 암종 및 성인 골수성 백혈병을 포함하는 많은 종류의 암이 Trk와 연관되어 있음이 확인되었다. 이에, Trk를 겨냥한 저해제를 개발함으로써 암, 종양 등과 같은 질환 치료를 위한 하나의 수단으로 생각할 수 있게 되었고, 최근 Trk를 겨냥한 저해제 개발이 활발하게 이루어지고 있다(비특허문헌 1).

현재까지 개발된 Trk 저해제로는 통증 또는 염증 질환의 치료에서 효과를 나타내는 저해제가 있고, 암 또는 종양의 치료에서도 저해제 개발이 이루어지고 있으나, 아직까지 원하는 수준의 저해 활성을 나타내는 저해제가 개발되지 못하고 있어 지속적인 노력이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 Trk를 겨냥하여 저해 활성을 나타내고, 이로부터 암의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있는 저해제를 개발하기 위해 노력하던 중, 본 발명에 따른 화합물이 Trk에 대하여 우수한 저해 활성을 나타내고, 암세포 성장을 효과적으로 저해할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Du, J. et al., World Journal of Gastroenterology 2003, 9 (7), pp. 1431-1434

본 발명의 목적은 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

(상기 화학식 1에서,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이거나 R¹ 및 R²는 함께 사이클로프로필을 형성할 수 있다).

또한, 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

화학식 2로 표시되는 화합물과, 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과, 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물을 화학식 1로 표시되는 화합물로 제조하는 단계(단계 3);를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,

R¹ 및 R²는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 피라졸, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, TrkA(Tropomyosin receptor kinase A)에 대하여 효과적인 억제 활성을 나타내어 이로부터 유발되는 질환, 대표적으로 암 및 종양의 치료에 유용한 효과가 있다.

도 1은 실시예 1 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 2 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 3 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 4 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하 설명은 발명의 이해를 돕기 위해서 제시하는 것이며, 본 발명이 이하 설명의 내용으로 제한되지 않는다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이거나 R¹ 및 R²는 함께 사이클로프로필을 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다.

(1) 벤질 (5'-(부틸카바모일)-4',5'-다이하이드로-2'H-스피로[사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-3'-일)카바메이트;

(2) 벤질(5-(부틸카바모일)-1,4,5,6-테트라하이드로피롤[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트;

(3) 벤질(5-(부틸카바모일)-6,6-디메틸-2,4,5,6-테트라하이드로피롤[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트; 및

(4) 벤질(5-(부틸카바모일)-6-메틸-2,4,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물을 화학식 1로 표시되는 화합물로 제조하는 단계(단계 3);를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,

R¹ 및 R²는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).

이하, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 화학식 2로 표시되는 화합물과, 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.

이때, 상기 단계에서 사용 가능한 용매로는 메탄올, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 다이클로로메탄(DCM), 톨루엔, 아세토나이트릴 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란(THF)을 사용할 수 있다.

또한, 상기 단계에서 사용 가능한 염기로는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게, N,N-다이아이소프로필에틸아민이다.

나아가, 상기 단계에서 반응온도는 특별한 제약이 없으나, -20℃ 내지 30℃에서, 바람직하게는 0℃에서 수행하는 것이 바람직하고, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 0.5-40시간, 바람직하게 12시간 동안 반응하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과, 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.

이때, 상기 단계에서 사용 가능한 용매로는 디메틸포름아미드(DMF), 메탄올, 에탄올, 아이소프로판올, 테트라하이드로퓨란(THF), 다이클로로메탄(DCM), 톨루엔, 아세토나이트릴 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있고 또는 이를 트리플루오로아세트산과 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 단계 2에서 화학식 4로 표시되는 화합물을 화학식 5로 표시되는 화합물과 반응시킬때, 염기를 사용할 수 있는데, 바람직하게 트리에틸아민을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 단계에서 반응온도는 특별한 제약이 없으나, 바람직하게 0℃에서 수행하는 것이 바람직하고, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 0.5-72시간 동안, 바람직하게 48시간 동안 반응하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물을 화학식 1로 표시되는 화합물로 제조하는 단계이다.

이때, 상기 단계 3은 화학식 6으로 표시되는 화합물로부터 보호기를 제거하는 단계이다. 단계 3에 사용 가능한 보호기는 특별한 제약이 없으나, 에틸 아세테이트를 제거하는 단계이다.

또한, 상기 단계 3의 화학식 6으로 표시되는 화합물로부터 보호기를 제거하는 방법으로, 바람직하게 Et₃N을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 단계에서 사용 가능한 용매로는 다이클로로메탄(DCM), 디메틸포름아미드(DMF), 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 에톡시에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 톨루엔, 아세토나이트릴 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

또한, 상기 단계에서 반응온도는 특별한 제약이 없으나, 바람직하게 실온에서 수행하고, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 0.5-20시간 동안 반응하는 것이 바람직하다.

여기서, 상기 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환은,

TrkA의 이상발현, 돌연변이 등으로부터 기인하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 중추신경계 종양 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것이 될 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제공함에 있어서, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 TrkA의 발현 또는 활성을 저해하거나 조절하는 것을 특징으로 하는 상기 약학적 조성물의 유효성분으로 포함되는 것으로 이해될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공한다.

여기서, 상기 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A) 관련 질환은,

상기 건강기능 식품을 제공함에 있어서, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 TrkA의 발현 또는 활성을 저해하거나 조절하는 것을 특징으로 하는 상기 건강기능 식품의 유효성분으로 포함되는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에 따른 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, TrkA를 효과적으로 억제할 수 있어, 이로부터 암의 예방 및 치료에 유용한 효과가 있음을 실험을 통해 확인하였다.

먼저, 본 발명의 화합물의 TrkA에 대한 발현 억제 활성을 평가하기 위한 실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 실시예 화합물의 TrkA 발현에 대한 IC₅₀값이 0.019-10 μM로 확인되어, 본 발명에 따른 화합물이 TrkA의 발현을 나노몰의 단위로 우수하게 억제할 수 있음을 알 수 있어, TrkA 관련 질환 예를 들어, 암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(하기 실험예 1 참조).

또한, 본 발명에 따른 화합물의 암세포 사멸효과를 측정하기 위하여, 세포주 실험을 다음과 같이 수행한 결과, 본 발명에 따른 화합물은 μM 이하의 단위농도로 우수하게 암세포 성장을 억제할 수 있어, 암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(하기 실험예 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 에틸 3'-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-5'-(부틸카바모일)-4',5'-다이하이드로-2'H-스피로[사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-2'-카복시레이트의 제조

단계 1: 5 '-( tert -부틸)2'-에틸 3'-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)- 2'H - 스피로 [사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-2',5'(4'H)-디카복시레이트의 제조

5'-(tert-부틸) 2'-에틸 3'-아미노-2'H-스피로[사이클로프로판]-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-2',5'(4'H)-디카복시레이트는 공개되어 있는 방법으로 제조되었다. 벤질 클로로포르메이트(0.066 mL, 0.47 mmol)가 녹아있는 THF(3 mL) 용액을 한 방울씩 5'-(tert-부틸) 2'-에틸 3'-아미노-2'H-스피로[사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-2',5'(4'H)-디카복시레이트(100 mg, 0.31 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(0.16 mL, 1.9 mmol)이 녹아있는 THF(2 mL)의 냉각된(0℃) 용액에 첨가하였다. 결과 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하였다. 상기 잔여물은 EtOAc에 녹여주고 물로 씻어주었다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과한 뒤, 농축하였다. 상기 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 무색의 오일로 목적 화합물을 제조하였다(30 mg, 20%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.51 (s, 1 H), 7.38-7.37 (m, 5 H), 5.22 (s, 2 H), 4.74-4.71 (m, 2 H), 4.50 (q, J= 7.1 Hz, 2 H), 2.18-2.17 (m, 1 H), 1.65 (s, 1 H), 1.47 (s, 9 H), 1.43 (t, J= 7.1 Hz, 3 H), 1.25 (s, 1 H), 1.15-1.12 (m, 2 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₂₃H₂₈N₄O₆ 456.2, found 457.2.

단계 2: 에틸 3'-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)-5'-( 부틸카바모일 )-4',5'- 다이하이드로 -2'H-스피로[사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-2'-카복시레이트의 제조

상기 단계 1에서 제조한 화합물(30 mg, 0.064 mmol)을 CH₂Cl₂/트리플루오로아세트산(1:1, 3 mL)에 녹여주었다. 결과 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 상기 용액을 감압하에 증발시켜주고 잔여물을 CH₂Cl₂(2 mL)에 녹여준 뒤, 0℃에서 트리에틸아민(8.9 μL, 0.064 mmol) 및 n-부틸 이소시아네이트(0.072 mL, 6.4 mmol)로 처리해주었다. 결과 용액을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 증발하여 황색의 오일로 목적 화합물을 제조하였다. 상기 제조된 목적 화합물은 추가적인 정제없이 하기 실시예 화합물 제조에 사용되었다.

LC-MS (M + H⁺) calcd for C₂₃H₂₉N₅O₅ 455.2, found 456.2.

< 실시예 1> 벤질 (5'-( 부틸카바모일 )-4',5'- 다이하이드로 - 2'H - 스피로 [ 사이클 로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-3'-일)카바메이트의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 화합물을 Et₃N/MeOH(1:1, 3 mL)에 녹여주고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 결과 용액을 농축하고 prep-HPLC로 정제하여 오일의 목적 화합물을 제조하였다(16.8 mg, 69%).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.54 (s, 1 H), 7.40-7.36 (m, 5 H), 5.25 (s, 2 H), 4.73-4.70 (m, 2 H), 3.19-3.18 (m, 2 H), 2.41 (s, 2 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₂₀H₂₅N₅O₃ 383.2, found 384.2.

< 실시예 2> 벤질(5-(부틸카바모일) -1,4,5,6- 테트라하이드로피롤[3,4-c]피라 졸-3-일)카바메이트의 제조

상기 실시예 1과 유사한 방법으로 수행하여 목적 화합물을 제조하였다(수율: 63%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.2 (br s, 1 H), 10.0 (br s, 1 H), 7.40-7.33 (m, 5 H), 6.22 (br s, 1 H), 5.13(s, 2 H), 4.34-4.24 (m, 4 H), 3.07-3.01 (m, 2 H), 1.46-1.34 (m, 2 H), 1.31-1.22 (m, 2 H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₁₈H₂₃N₅O₃ 357.2, found 358.2.

< 실시예 3> 벤질(5-(부틸카바모일) -6,6-디메틸-2,4,5,6- 테트라하이드로피롤[3,4-c]피라졸 -3-일)카바메이트의 제조

상기 실시예 1과 유사한 방법으로 수행하여 목적 화합물을 제조하였다(수율: 90%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.95 (br s, 3 H), 7.35 (s, 5 H), 5.21 (s, 2 H), 4.58 (br s, 2 H), 3.27-3.17 (m, 2 H), 1.77 (s, 6 H), 1.55-1.44 (m, 2 H), 1.40-1.28 (m, 2 H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3 H); LC-MS (M + H+) calcd for C₂₀H₂₇N₅O₃ 385.2, found 386.2.

< 제조예 2> 5- 메톡시 -N ⁴ -(5- 메틸 -1H- 피라졸 -3-일)-N ² -(4-(( 메틸설포닐 ) 메틸 )페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조

단계 1: 메틸(2-시아노에틸)알라니네이트의 제조

(2-시아노에틸)알라니네이트는 D,L-알라닌으로부터 알려진 제조방법으로 제조되었다. H₂SO₄(98%, 3.9 mL, 0.074 mol)를 한 방울씩 (2-시아노에틸)알라닌(7.0 g, 0.049 mol)이 녹아있는 MeOH(50 mL)의 현탄액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시켜주었다. 용액을 진공상태에서 제거해주고, 잔여물을 20%의 NaOH 수용액으로 pH 8이 되도록 완충하였다. 수층을 DCM(3×200 mL)으로 추출해 주고, 분리된 유기상을 무수 황산마그네슘하에 건조하였다. 상기 용액을 증발 건조하여 황색 오일의 목적화합물을 제조하였다(4.5 g, 59%). 상기 제조된 목적 화합물은 추가적인 정제없이 하기 실시예 화합물 제조에 사용되었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.74 (s, 3 H), 3.39 (q, J = 7.0 Hz, 1 H), 3.01-2.95(m, 1 H), 2.78-2.74(m, 1 H), 2.50 (t, J = 6.7 Hz, 2 H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3 H).

단계 2: 메틸N -( tert - 부톡시카보닐 )-N-(2- 시아노에틸 ) 알라니네이트

디-tert-부틸 디카보네이트(6.8 g, 0.031 mol) 및 포화 NaHCO₃ 수용액(4.5 mL)를 상기 단계 1에서 제조한 화합물(4.4 g, 0.028 mol)이 녹아있는 CH₂Cl₂(56 mL)의 혼합용액에 첨가하였다. 결과 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 유기층을 분리하고, 수층을 CH₂Cl₂(3 × 200 mL)로 씻어주었다. 상기로부터 합하여진 유기상을 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 상기 용액을 증발시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 무색의 오일로 목적화합물을 제조하였다(6.2 g, 80%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ as rotamers 4.61-4.61 (m, 0.5 H), 4.23-4.21 (m, 0.5 H), 3.72 (s, 3 H), 3.64-3.57 (m, 1 H), 3.45-3.41 (m, 1 H), 2.70-2.68 (m, 2 H), 1.48-1.41(m, 12 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₁₂H₂₀N₂O₄ 256.1, found (M+H⁺-Boc) 157.1.

단계 3: tert - 부틸4 - 시아노 -2- 메틸 -3- 옥소피롤리딘 -1- 카복시레이트의 제조

질소 기체하에 상기 단계 2에서 제조한 화합물을 1,4-디옥산(100 mL)에 녹여주고, 60%의 NaH(2.4 g, 0.06 mol)로 처리하였다. 혼합물을 흰색의 침전물이 형성될 때까지 3시간 동안 환류시켰다. 결과 혼합용액을 실온으로 냉각하였다. 상기 용액을 증발시키고 물(100 mL)에 녹여준 뒤, 에틸 아세테이트(300 mL)로 추출하였다. 수층을 pH3-4가 되도록 시트릭산으로 저어주면서 산화시키고 에틸 아세테이트(3 × 200 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 씻어주고 건조하고 증발시켜 적량의 수율로 흰색 고체의 목적 화합물을 제조하였다. 상기 제조된 목적 화합물은 추가적인 정제없이 하기 실시예 화합물 제조에 사용되었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.42-4.31 (m, 1 H), 4.24-3.88 (m, 3 H), 1.49-1.46 (m, 12 H); LC-MS (M - H^-) calcd for C₁₁H₁₆N₂O₃ 224.1, found 223.1.

단계 4: tert - 부틸3 -아미노-6- 메틸 -2,6- 디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸 -5(4H)-카복시레이트의 제조

상기 단계 3에서 제조한 화합물(5.6 g, 0.025 mol)을 무수에탄올(50 mL) 및 아세트산(12.2 mL, 0.21 mol)의 혼합용액에 녹여주고 실온에서 한 방울씩 하이드라진 하이드레이트 98%(6.55 mL, 0.13 mol)을 처리해 주었다. 반응 혼합물을 18시간 동안 환류시켰다. 상기 에탄올은 증발하여 제거해주었다. 잔여물을 EtOAc(300 mL)로 용해시키고 포화 NaHCO₃ 수용액(100 mL)로 씻어주었다. 유기상을 황산 마그네슘으로 건조하고 증발시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 밝은 황색의 형태로 목적화합물을 제조하였다(4.3 g, 72%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.92-4.79 (m, 1 H), 4.40-4.26 (m, 2 H), 1.52-1.47 (m, 12 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₁₁H₁₈N₄O₂ 238.1, found 239.1.

단계 5: 5 -( tert -부틸) 2-에틸 3-아미노-6- 메틸피롤로[3,4-c]피라졸 -2,5(4H,6H)-디카복시레이트의 제조

0℃, 질소 기체하에 상기 단계 4에서 제조한 화합물(154 mg, 0.65 mmol)이 녹아있는 무수 THF(2 mL)의 용액에 한 방울씩 N,N-디아이소프로필에틸아민(0.068 mL, 3.9 mmol) 및 클로로포르메이트(0.062 mL, 0.65 mmol)가 녹아있는 무수 THF(2 mL)를 첨가하였다. 0.5시간 후, 용액을 증발시키고 미정제 생성물을 플레쉬 크로마토그래피로 정제하여 무색의 오일로 목적화합물을 제조하였다(90 mg, 45%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ as rotamers 5.47-5.37 (m, 2 H), 4.84-4.82 (m, 0.5 H), 4.71-4.69 (m, 0.5 H), 4.50-4.48 (m, 2 H), 4.36-4.20 (m, 2 H), 1.54-1.44 (m, 15 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₁₄H₂₂N₄O₄ 310.2, found 311.2.

단계 6: 5 -( tert -부틸) 2-에틸 3-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)-6- 메틸피롤로[3,4-c]피라졸 -2,5(4H,6H)-디카복시레이트의 제조

벤질 클로로포르메이트(0.082 mL, 0.58 mmol)이 녹아있는 THF(1 mL)를 한 방울씩 상기 단계 5에서 제조된 화합물(79 mg, 0.25 mmol) 및 N,N-디아이소프로필에틸아민(0.26 mL, 1.5 mmol)이 녹아있는 THF(1 mL)의 냉각된(0 ℃) 용액에 첨가하였다. 결과 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 감압하에 증발시켰다. 잔여물을 에틸아세테이트에 녹여주고 물로 씻어주었다. 유기층을 황산 마그네슘으로 건조한 뒤, 여과하고, 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 적량의 수율로 무색 오일의 목적화합물을 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.37 (br s, 5 H), 5.20-5.05 (m, 3 H), 4.64-4.46 (m, 4 H), 1.57-1.51 (m, 12 H), 1.45-1.43 (m, 3 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₂₂H₂₈N₄O₆ 444.2, found 445.1.

단계 7: 에틸 3-((( 벤질옥시 ) 카보닐 )아미노)-5-( 부틸카바모일 )-6- 메틸 -5,6-디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-2(4H)-카복시레이트의 제조

상기 단계 6에서 제조한 화합물(110 mg, 0.25 mmol)을 CH₂Cl₂/트리플루오로아세트산(1:1, 3 mL)에 녹여주었다. 결과 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 감압하에 증발시키고 잔여물을 CH₂Cl₂(2 mL)에 녹여주었고, 0℃에서 트리에틸아민(0.052 mL, 0.38 mmol) 및 n-부틸 이소시아네이트(0.085 mL, 0.75 mmol)로 처리하였다. 결과 용액을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 증발시켜 무색의 오일로 목적 화합물을 제조하였다. 상기 제조된 목적 화합물은 추가적인 정제없이 하기 실시예 화합물 제조에 사용되었다.

LC-MS (M + H⁺) calcd for C₂₂H₂₉N₅O₅ 443.2, found 444.2.

< 실시예 4> 벤질(5-(부틸카바모일) -6- 메틸 -2,4,5,6- 테트라하이드로피롤 로[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트의 제조

상기 제조예 2에서 제조한 화합물(110 mg, 0.25 mmol)을 Et₃N/MeOH(1:1, 3 mL)에 녹여주고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 결과 용액을 농축하고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고체의 목적화합물을 제조하였다(90 mg, 97%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.54 (br s, 1 H), 9.16 (br s, 1 H), 7.30 (br s, 5 H), 5.14 (s, 2 H), 4.99 (br s, 1 H), 4.52-4.45 (m, 2 H), 3.21 (br s, 2 H), 1.44 (br s, 5 H), 1.33-1.26 (m, 2 H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3 H); LC-MS (M + H⁺) calcd for C₁₉H₂₅N₅O₃ 371.2, found 372.2.

상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 제조한 화합물의 구조를 하기 표 1에 나타내었다.

실시예	구조식
1
2
3
4

< 실험예 1> TrkA 발현 억제 활성 평가

본 발명의 화합물의 TrkA에 대한 발현 억제 활성을 평가하기 위해, 다음과 같이 실험하였다.

비오틴(Biotin)이 표시(labeling)된 펩티드 기질인 TK, HTRF^RKinEASE^TM-TK 키트(cisbio)와 티로신 키나제(TK) 단일 클론 항체(monoclonal antibody)를 사용하여 본 발명에 따른 실시예 화합물의 TrkA의 발현 억제 활성을 측정하였다.

비오틴-표시된 펩티드의 인산화 정도를 확인하기 위해 TR-FRET(Time-Resolved Fluorescence Energy Transfer) 신호를 측정하는 HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence technology) 기법을 사용하였다. 시험 화합물을 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 10 mM로 용해시킨 후, DMSO 농도가 1%가 되도록 희석시켰다. 25℃에서 희석된 화합물, TrkA 및 비오틴이 표시된 펩티드(1μM)를 반응 완충액(HTRF 키트 5X buffer-cisbio, 1 M MgCl₂, 1 M Dithiothreitol(DTT))중에서 15분 동안 전 배양(pre-incubation)시킨 다음, ATP 100 μM을 첨가한 후, 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. 키나제 활성 반응을 중단시키는 역할을 하는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)가 포함된 검출 버퍼(HTRF 키트, cisbio)에 희석된 스트렙타비딘(streptavidin)-XL665와 Eu³ ⁺-크립테이트로 표시된 TK 항체를 첨가하였다. 25℃에서 1시간 배양한 후, 형광 편광을 다중표시 판독기(Wallac EnVision 2103, PerkinElmer)로 측정하였다. 프리즘(Prism, 버전 5.01, Graphpad Software, Inc.)을 사용하여 IC₅₀값을 산출하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

실시예	TRKa IC50(μM)
1	0.019
2	＞10
3	0.21
4	0.39

상기 표 2를 살펴보면, 본 발명의 실시예 1-4 화합물의 TrkA 발현에 대한 억제활성이 우수한 것으로 확인되었으며, 특히 실시예 1 화합물은 IC₅₀값이 0.019로 매우 우수한 TrkA 발현 억제능이 있음을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 TrkA에 대하여 나노몰의 단위로 우수한 저해 활성을 나타낼 수 있어, TrkA 관련 질환 예를 들어, 암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 세포독성 실험

본 발명에 따른 화합물의 암세포 사멸효과를 측정하기 위하여, 세포주 실험을 다음과 같이 수행하였다.

본 발명에 따른 실시예 화합물 1-4를 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도로 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대하여 각각 처리한 뒤, 이로부터 암세포 증식률(%)을 측정하여 평가하였다.

구체적으로, 마이크로웰(96 웰) 플레이트에 각 세포를 분주하고 24 시간 동안 배양하여 세포를 바닥면에 고착시킨 후, 본 발명에 따른 실시예 화합물 1-4를 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도로 처리한 후 72 시간 연속 배양하였다. 약물과의 배양이 끝난 후, 배양액을 제거하고 10% 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 TCA 용액을 제거하고 물(tap water)로 플레이트를 세척하고 실온에서 건조시킨 후, SRB 용액(1% 아세트산에 0.4%)을 각 웰당 100 μL씩 첨가하여 1시간 동안 실온에서 바닥면에 붙어있는 세포를 염색하였다. 1% 아세트산 용액으로 세척하여 세포와 결합하지 않은 SRB를 제거한 후 건조키고, 10 mM의 트리스 염기(Trisma Base) 용액을 각 웰당 100 μL씩 첨가하여 10 분 동안 처리한 뒤, 염색약을 용출시켰다. 마티크로플레이트 판독기를 이용하여 520 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 약물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상대적 세포 성장을 측정하였고, 그 결과를 도 1-4에 나타내었다.

도 1은 실시예 1 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.

도 2는 실시예 2 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.

도 3은 실시예 3 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.

도 4는 실시예 4 화합물의 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 3.0 μM 또는 10.0 μM의 농도별 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대한 세포 증식률(%)을 나타낸 그래프이다.

도 1-4를 살펴보면, 본 발명에 따른 실시예 1-4 화합물이 A549, SK-OV-3, HCC-1937 및 Bt549에 대하여 0.03-10 μM의 농도에서 세포 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있고, 특히 실시예 1 화합물은 0.30 μM부터 눈에 띄는 활성을 나타내기 시작하여 10 μM에서는 A549 및 SK-OV-3에서 0%의 증식률을 보이고, HCC-1937 및 Bt549에서도 0%에 가까운 증식률을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 상기 실험예 2에서 살펴본 바와 같이, μM 이하의 단위농도로 우수하게 암세포 성장을 억제를 할 수 있어, 암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

(상기 화학식 1에서,
R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이거나 R¹ 및 R²는 함께 사이클로프로필을 형성할 수 있되,
R¹ 및 R²가 동시에 수소는 아니다).
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
(1) 벤질 (5'-(부틸카바모일)-4',5'-다이하이드로-2'H-스피로[사이클로프로판-1,6'-피롤[3,4-c]피라졸]-3'-일)카바메이트;
(3) 벤질(5-(부틸카바모일)-6,6-디메틸-2,4,5,6-테트라하이드로피롤[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트; 및
(4) 벤질(5-(부틸카바모일)-6-메틸-2,4,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일)카바메이트.
하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물과, 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물과, 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 제조한 화학식 6으로 표시되는 화합물을 화학식 1로 표시되는 화합물로 제조하는 단계(단계 3);를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,
R¹ 및 R²는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
삭제
제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 화합물은 TrkA(Tropomyosin receptor kinase A)를 억제하여 암을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 암은 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 중추신경계 종양 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
삭제
제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.