KR101783676B1 - 혈액암의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 난치성 또는 저항성 혈액암을 포함하는 혈액암을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 기술되어 있다.

Description

혈액암의 치료 방법{METHOD FOR TREATING HEMATOLOGICAL CANCERS}
본 발명은 일반적으로 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 방법, 특히 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)을 갖는 약제학적 조성물 및 혈액암을 치료하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
혈액 악성종양 또는 혈액암은 다양하지만, 골수 또는 림프 조직으로부터 기원하여 혈액 기능에 영향을 미치는 연관된 암이다. 매년, 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종 및 골수종의 새로운 사례가, 미국에서 진단되는 모든 새로운 암 사례의 거의 10%를 차지한다. 항체 및 키나제 억제제(예: 이마티니브 - BCR-ABL 억제제)를 사용하는 표적 치료요법이 개발되었지만, 혈액암을 다루는데 있어서 여전히 화학 치료요법 및 방사선 치료요법에 많이 의존한다. 이들은 통상적으로 상당한 부작용을 나타내며, 낮은 효능을 생성한다. 혈액암을 치료하는데 있어서 분명한 작용 기전을 갖는 새로운 부류의 약물이 필요하다. 미국 특허 공보 제2009/0137620호는 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 흑색종 세포주에서 아폽토시스 및 세포 사멸을 일으키는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다고 기술하고 있다. 그러나, 상기 화합물이 혈액암, 특히 다른 항암 약물에 대해 난치성인 혈액암을 치료하는데 유용한지의 여부는 알려져 있지 않다.
본 발명은 다양한 혈액암의 치료 방법을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은, 혈액암을 갖는 환자에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 하기의 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))을 투여하는 것을 포함하는, 혈액암을 치료, 예방 또는 이의 발병을 지연시키는, 특히 환자의 혈액 종양 세포에서 아폽토시스 및 세포 사멸을 일으키는 방법을 제공한다.
다른 양상에 따라, 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린(예: 독소루비신), 안트라센디온, 에피포도필로톡신, 캄토테신, 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 프레드니손, 시타라빈, Ara-C 및 플루다라빈으로부터 선택된 하나 이상의 약물에 대해 난치성인 환자에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 하기의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 난치성 혈액암을 치료, 예방 또는 이의 발병을 지연시키는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 약제 제조용의 하기의 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))의 용도가 제공된다.
본 발명에 대한 상기의 이점 및 특징, 및 다른 이점 및 특징, 및 이를 달성하는 방식은, 바람직하고 예시적인 실시형태를 설명하는 첨부한 실시예와 함께 본 발명에 대한 하기의 상세 설명을 고려하여 더욱 쉽게 분명해질 것이다.
도 1은, 용량-의존적 방식으로 증식을 100%까지 억제시키는 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)에 의한 BJAB 림프종 세포의 세포 생존력 및 증식 억제를 나타내는 그래프이다(노출 시간: 24시간).
도 2는 BJAB 세포를 상이한 농도의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)과 48시간 인큐베이션하고 양이온성 염료 JC-1(5,5',6,6'-테트라클로로-1,1,3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴카보시아닌 요오다이드)로 염색한 후 유동 세포계측 분석으로 측정한 미토콘드리아 막 전위의 손상을 나타내는 그래프이다. 미토콘드리아 투과성 변환의 값은 ΔΨ±SD(n=3)가 낮은 세포의 비율(%)로 제시된다.
도 3은 BJAB 세포에서 72시간 동안 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 처리 후 저이배체 DNA의 유동 세포계측 측정을 통해 측정된 아폽토시스 유도를 나타내는 다이아그램이다. 데이터는, 아폽토시스 세포의 수와 일치하는, 저이배체 (subG1) ± ESD(n=3)의 비율(%)로 제시된다.
도 4a 및 도 4b는 빈크리스틴 (도 4a) 및 다우노루비신 (도 4b) 내성 Nalm-6 세포에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)에 의한 아폽토시스 유도를 나타내는 그래프이다. 상이한 농도의 제제와 72시간 인큐베이션한 후, FACS 스캔 분석을 통해 DNA 단편화를 측정하였다. 그 결과는, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 통상의 약물인 빈크리스틴 및 다우노루비신에 대한 내성을 극복할 수 있다는 것을 분명히 나타낸다. DNA 단편화 값은 저이배체 DNA ± s.d.(n=3)를 갖는 세포의 비율(%)로 제시된다.
도 5는 72시간 동안 상이한 농도의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)로 벡터-형질감염된 BJAB 세포(BJAB mock) 또는 FADD-dn-형질감염된 BJAB 세포(BJAB FADDdn)를 처리한 후 유동 세포계측 분석으로 측정된 DNA 단편화를 나타낸다. DNA 단편화 값은 저이배체 DNA ± s.d.(n=3)를 갖는 세포의 비율(%)로 제시된다.
도 6은 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)-처리된 BJAB 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 크로마토그램을 포함한다. 에피루비신은 양성 대조군으로 사용되었다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 단백질 추출물을 변성 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분획화시키고, 니트로셀룰로스로 이동시킨 후, 항-카스파제-3/-9 및 항-β-액틴 항체로 검출하였다. A: 카스파제-9(프로카스파제: 47 kDa; 절단 생성물: 37 kDa), B: 카스파제-3(프로카스파제: 32 kDa; 절단 생성물: 18 및 17 kDa), C: β-액틴(42 kDa).
도 7은 DoHH2 세포에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)(MTT 검사)에 의한 용량-의존적 성장 억제를 나타내는 그래프이다. X 축: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 농도(μM), Y 축: 대조군에 대한 비율(%).
도 8은 Granta 519 세포에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)(MTT 검사)에 의한 용량-의존적 성장 억제를 나타내는 그래프이다. X 축: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 농도(μM), Y 축: 대조군에 대한 비율(%).
도 9는 WSU-DLCL2 세포에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)(MTT 검사)에 의한 용량-의존적 성장 억제를 나타내는 그래프이다. X 축: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 농도(μM), Y 축: 대조군에 대한 비율(%).
본 발명은 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 백혈병 및 림프종을 포함한 다양한 혈액암을 치료하는데 특히 효과적이라는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명의 제1 양상에 따라, 혈액암의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 혈액암의 치료가 필요한 환자를 치료학적 유효량의 화학식 I의 갈륨 착물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 치료하는 것을 포함한다:
[화학식 I]
Figure 112012073545269-pct00001
상기 화학식 I에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 설포노 그룹 SO3M을 나타내고, 여기서, M은 금속 이온이고, R2는 수소를 나타내거나,
R1은 Cl이고 R2는 I이다.
하나의 실시형태에서, 상기 혈액암의 치료 방법은 급성 전골수구성 백혈병이 아닌 혈액암의 치료가 필요한 환자를 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 치료하는 것을 포함한다. 즉, 본 발명은 혈액암, 바람직하게는 급성 전골수구성 백혈병이 아닌 혈액암을 갖는 것으로 확인되거나 진단된 환자에서 혈액암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 갈륨 착물은 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
혈액 악성 종양은 전형적으로 2개의 주요 혈액 세포 계통(lineage)인 골수성 및 림프성 세포 중 어느 하나로부터 유도된다. 림프종 및 림프구성 또는 림프아구성 백혈병은 림프성 세포로부터 유도된다. 이들은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모상 세포 백혈병(Hairy Cell Leukemia: HCL), T-세포 또는 B-세포 전림프구성 백혈병 (T-PLL 또는 B-PLL) 및 골수종을 포함한다. 골수성 또는 골수성 백혈병, 골수 형성 이상 증후군(MDS) 및 골수 증식성 질환(MPD)은 골수성 세포로부터 유도된다. 이들은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 과립구성 백혈병(CGL), 급성 단핵아구성/단구성 백혈병(AMOL) 및 골수섬유증을 포함한다.
상이한 실험 모델이 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)으로 시험되었으며, 놀랍게도 이 화합물이 상이한 종류의 혈액암에 대해 광범위한 스펙트럼의 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 혈액암은 골수 기원, 즉 골수성 세포로부터 유도된 혈액암, 바람직하게는 급성 전골수구성 백혈병이 아닌 혈액암이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 골수성 백혈병을 치료하는데 사용된다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 급성 전골수구성 백혈병이 아닌 골수성 백혈병을 치료하는데 사용된다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 과립구성 백혈병(CGL), 급성 단핵아구성/단구성 백혈병(AMOL), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수 형성 이상 증후군(MDS), 골수증식성 질환(MPD) 및 골수섬유증, 바람직하게는 급성 전골수구성 백혈병이 아닌 혈액암을 치료하는데 사용된다.
다른 실시형태에서, 혈액암은 림프 기원(예: 림프종, 림프구성 백혈병 또는 골수종)이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 B-세포 백혈병 또는 T-세포 백혈병을 치료하는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 림프아구성 또는 림프구성 백혈병, 예를 들어 급성 림프아구성 백혈병(ALL)(예를 들어, 전구(precursor) B 급성 림프아구성 백혈병, 전구 T 급성 림프아구성 백혈병 및 급성 이표현형 백혈병을 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL)(예: B-세포 전림프구성 백혈병), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL)을 치료하는데 적용된다. 다른 실시형태에서, 혈액암은 다발성 골수종이다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은 림프종(예: 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종)을 치료하는데 사용된다. 비-호지킨 림프종에 대해, 상기 방법은 T-세포 림프종 또는 천연 킬러(NK)-세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 다발성 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 소포성 림프종(FL), 미만성 거대 세포 림프종, 림프형질세포 림프종, 버킷 림프종(BL), 변연부 림프종(MZL), 이식후 림프증식성 장애(PTLD), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 말초 T-세포 림프종(PTCL) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증/모상 세포 백혈병을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 이러한 양상에 대한 다양한 실시형태에서, 상기 치료 방법은 또한 임의로 환자를 혈액암 중 어느 하나의 혈액암을 갖는 것으로 진단 또는 확인하는 단계를 포함한다. 이어서, 확인된 환자는 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물, 예를 들어 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)으로 치료되거나 투여된다. 다양한 혈액암이 전혈구 수, 혈액 도말(blood film), 림프절 생검, 골수 생검, 세포유전학 분석(예를 들어, AML, CML에 대해) 또는 면역표현형 검사(immuophenotyping)(예를 들어, 림프종, 골수종, CLL에 대해)를 포함한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상의 진단 방법으로 진단될 수 있다.
또한, 놀랍게도 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 안트라센디온, 에피포도필로톡신, 캄토테신, 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, 시타라빈, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신 및 프레드니손을 포함한 하나 이상의 약물에 내성인 혈액암에 동등하게 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 난치성 혈액암을 갖는 것으로 확인된 환자를 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))으로 치료하는 것을 포함하는, 난치성 혈액암의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 환자는 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 안트라센디온, 에피포도필로톡신, 캄토테신, 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, 시타라빈, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는, 치료에 난치성인 혈액암을 갖는다. 즉, 본 발명은 또한 난치성 혈액암, 예를 들어 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈), 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신), 안트라센디온(예: 미톡산트론 및 픽산트론), 에피포도필로톡신(예: 에토포시드 및 테니포시드), 캄토테신(예: 토포테칸, 이리노테칸), 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, Ara-C(시타라빈), 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손, 탁산(예: 파클리탁셀 및 도세탁셀)으로부터 선택되는 하나 이상의 약물에 난치성인 혈액암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "난치성 혈액암"은, 화학식 I의 화합물을 포함하지 않는 항-신생물 치료에 바람직하게 반응하지 않거나 또는 화학식 I의 화합물을 포함하지 않는 항-신생물 치료에 바람직하게 반응한 후 회귀 또는 재발하는 혈액암을 말한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "치료에 대해 난치성인 혈액암"은 치료에 대해 바람직하게 반응하지 않거나 내성이거나 치료에 대해 바람직하게 반응한 후 회귀 또는 재발하는 혈액암을 의미한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 종양을 갖고 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈), 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신), 안트라센디온(예: 미톡산트론 및 픽산트론), 에피포도필로톡신(예: 에토포시드 및 테니포시드), 캄토테신(예: 토포테칸, 이리노테칸), 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, Ara-C(시타라빈), 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손, 탁산(예: 파클리탁셀 및 도세탁셀)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는 치료에 대해 내성을 나타내는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다. 즉, 상기 방법은 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈), 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신), 안트라센디온(예: 미톡산트론 및 픽산트론), 에피포도필로톡신(예: 에토포시드 및 테니포시드), 캄토테신(예: 토포테칸, 이리노테칸), 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, Ara-C(시타라빈), 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손, 탁산(예: 파클리탁셀 및 도세탁셀)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는 치료 요법으로 이전에 치료되고, 이러한 치료 요법에 비-반응성이거나 이러한 치료 요법에 대해 내성을 나타내는 것으로 밝혀진 혈액암 환자를 치료하는데 이용된다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈), 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신), 안트라센디온(예: 미톡산트론 및 픽산트론), 에피포도필로톡신(예: 에토포시드 및 테니포시드), 캄토테신(예: 토포테칸, 이리노테칸), 레날리도미드, 탈리도미드, 메토트렉세이트, Ara-C(시타라빈), 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손, 탁산(예: 파클리탁셀 및 도세탁셀)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 처치로 이전에 치료되었으나 혈액암이 회귀 또는 재발된 혈액암 환자, 즉 하나 이상의 이러한 약물로 이전에 치료되어 초기에는 이전에 투여된 하나 이상의 이러한 약물에 반응성이었으나 그 후 재발된 것으로 밝혀진 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴 또는 비노렐빈)로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종 또는 급성 림프아구성 백혈병을 갖는 환자), 예를 들어 빈카 알칼로이드(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴 또는 비노렐빈)를 포함하는 치료에 내성을 나타내거나 치료 후 재발된 종양을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신 또는 에피루비신)으로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 백혈병, 호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 갖는 환자), 예를 들어 안트라사이클린(예: 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신 또는 에피루비신)을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 안트라센디온(예: 미톡산트론 또는 픽산트론)으로 이전에 치료된 혈액암(예: 비-호지킨 림프종) 환자, 예를 들어 미톡산트론 또는 픽산트론을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 비-호지킨 림프종)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 캄토테신 약물(예: 토포테칸, 이리노테칸)로 이전에 치료된 혈액암 환자, 예를 들어 토포테칸 또는 이리노테칸을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 PDGF-Rβ 억제제(예: 이마티니브)로 이전에 치료된 혈액암(예: 만성 골수성 백혈병(CML)) 환자, 예를 들어 이마티니브를 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 만성 골수성 백혈병(CML))을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 레날리도미드 또는 탈리도미드로 이전에 치료된 혈액암(예: 다발성 골수종) 환자, 예를 들어 레날리도미드 또는 탈리도미드를 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 다발성 골수종)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 레날리도미드 또는 탈리도미드로 이전에 치료된 혈액암(예: 골수섬유증) 환자, 예를 들어 레날리도미드 또는 탈리도미드를 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 골수섬유증)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 시타라빈으로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 림프종을 갖는 환자), 예를 들어 시타라빈을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 림프종)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 메토트렉세이트로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 비-호지킨 림프종을 갖는 환자), 예를 들어 메토트렉세이트를 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병(ALL) 또는 비-호지킨 림프종)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 플루다라빈으로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML)을 갖는 환자), 예를 들어 플루다라빈을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML))을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 아자시티딘 또는 데시타빈으로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 골수 형성 이상 증후군(MDS)을 갖는 환자), 예를 들어 레날리도미드, 아자시티딘 또는 데시타빈을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 골수 형성 이상 증후군(MDS))을 갖는 환자를 치료하는데 사용된다.
또 다른 특정 양태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))은 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물로 이전에 치료된 혈액암 환자(예: 비-호지킨 림프종을 갖는 환자), 예를 들어 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손(예: CHOP 요법)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함한 치료에 내성을 나타내거나 이러한 치료 후 재발된 혈액암(예: 비-호지킨 림프종)을 갖는 혈액암 환자를 치료하는데 사용된다.
난치성 혈액암을 검출하기 위해서, 초기 치료를 받은 환자를 내성, 비-반응성 또는 재발 혈액암의 징후에 대해 주의 깊게 모니터링할 수 있다. 이는, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 안트라사이클린, 안트라센디온, 에피포도필로톡신, 캄토테신, 레날리도미드, 탈리도미드, 시타라빈 및 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함할 수 있는 초기 치료에 대한 환자의 암 반응을 모니터링함으로써 달성될 수 있다. 초기 치료에 대한 암의 반응, 반응 결여 또는 재발은 당해 기술 분야에서 실시되는 임의의 적합한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 이는 종양 크기 및 수를 평가함으로써 달성될 수 있다. 종양 크기의 증가 또는 달리 종양 수의 증가는 종양이 화학 치료요법에 반응하지 않다는 것을 나타내거나 재발이 일어났다는 것을 나타낸다. 그 결정은 문헌[참조: Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216 (2000)]에 상세히 기술되는 바와 같은 "RECIST" 기준에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 혈액암의 발병 또는 재발의 예방 또는 지연이 필요한 환자를 예방학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))으로 치료하는 것을 포함하는, 혈액암의 발병을 예방 또는 지연시키거나 혈액암의 재발을 예방 또는 지연시키기 위한 방법이 제공된다.
혈액암의 재발을 예방하거나 지연시키기 위해서, 치료되었고, 완화되거나 진정되거나 안정한 상태이거나 진행이 없는 상태의 혈액암 환자를 예방학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))으로 치료하여 혈액암의 회귀 또는 재발을 효과적으로 예방하거나 지연시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "...를 ...로 치료하는" 또는 이의 부연은 환자에게 화합물을 투여하거나 환자의 신체 내에서 화합물의 형성을 야기하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 따라, 혈액암은 단일 제제로서 단독으로 또는 대안으로 하나 이상의 다른 항암제와 병용하여 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))으로 치료될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 알칼리 금속 염(예: 나트륨 또는 칼륨 염), 암모늄 염 등을 포함한다.
화학식 I의 약제학적 화합물은 정맥내 주사 또는 경구 투여 또는 임의의 다른 적합한 수단을 통해 총 체중을 기준으로 하여 환자의 체중 kg 당 0.1 mg 내지 1000 mg의 양으로 투여될 수 있다. 활성 성분은 예정된 시간 간격으로, 예를 들어 1일 3회씩 투여될 수 있다. 상기된 용량 범위는 단지 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 치료학적 유효량의 활성 화합물은 당해 기술 분야의 전문가에게는 명백한 바와 같이, 사용되는 화합물의 활성, 환자 신체에서 활성 화합물의 안정성, 완화될 병태의 중증도, 치료되는 환자의 총 체중, 투여 경로, 신체에 의한 활성 화합물의 흡수, 분배 및 배출의 용이성, 치료되는 환자의 연령 및 민감도 등을 포함하나 이들에 제한되지는 않는 인자들과 함께 다양할 수 있다. 투여량은 다양한 인자가 시간이 경과함에 따라 변화하는 바에 따라 조절될 수 있다.
본 발명에 따라, 혈액암을 치료하는데 유용한 약제를 제조하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))을 갖는 화합물의 용도가 제공된다. 상기 약제는, 예를 들어 정맥내, 피내 또는 근육내 투여에 적합한 경구 또는 주사가능한 형태일 수 있다. 주사가능한 형태는 당해 기술 분야에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어 완충된 용액 또는 현탁액이다.
본 발명의 다른 양상에서, 용기에 단위 용량 형태의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)), 및 임의로 본 발명에 따른 방법, 예를 들어 혈액암 발병을 치료, 예방 또는 지연, 혈액암 재발을 예방 또는 지연 또는 난치성 혈액암을 치료하는 방법에서 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 약제학적 키트가 제공된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 단위 용량 형태 중의 치료학적 화합물의 양은 본 발명의 방법에서 환자에게 사용될 용량에 의해 결정된다. 키트에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III))을 갖는 화합물은 정제 형태로 예를 들어 1 mg의 양으로 존재할 수 있다.
실시예 1
충분한 세포가 검사에 대해 이용가능할 때까지 적합한 배양 조건 하에서 세포를 증식시켰다. 부착 세포는 트립신처리하였다. 세포 수 및 세포의 생존력을 측정하였다(Casy TT, Scharfe Systems). 세포(95% 초과의 생존력)를 100 μl의 세포 배양 배지 중 적합한 밀도의 생 세포로 96-웰 조직 배양 플레이트에 식종하였다. 세포를 24시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 인큐베이션하였다.
100 μl의 각각의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)("약물") 희석액을 삼중으로 세포에 가하였다. 음성 대조군으로서, 100 μl의 세포 배양 배지를 3개의 웰에 가하였다(100% 값). 양성 대조군으로서, 모든 세포를 페놀로 둔화시켰다(0% 값). 세포를 추가의 48시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 약물과 함께 인큐베이션하였다.
XTT 검사를 상기 처리된 세포에 대해 수행하였다. XTT는 생 세포에서 유일하게 활성인 미토콘드리아 산화환원-시스템인 "숙시네이트-테트라졸륨 리덕타제"에 의해 절단될 수 있는 테트라졸륨 염이다. 절단에 의해 450 nm에서의 비색 측정에 의해 정량화될 수 있는 가용성 포르마잔 염이 생긴다. 오렌지색의 강도는 대사적으로 활성인 생 세포의 수와 직접적으로 연관된다. XTT(Sigma- Aldrich)의 농축된 스톡 용액(1 mg/ml PBS)을 제조하고, 분획한 후, 여과하고, -20℃에서 저장하였다. 40 μl의 XTT-용액을 검사 플레이트의 각각의 웰에 가하고, 세포를 8시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 XTT와 함께 인큐베이션하였다. 발색된 포르마잔을 흡광도 마이크로 플레이트 판독기(Genios, Tecan)에서 450 nm의 측정 파장 및 690 nm의 참조 파장으로 정량화하였다.
시험된 종양 세포주가 하기 표 1에 요약되어 있다. 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 모든 세포주에서 모두 3.5 μM 이하의 IC50 값으로 세포 성장 및 증식을 억제하는데 효과적이었다.
세포주 설명
CCRF-CEM 사람 T 세포 림프아구-유사 세포주
Jurkat 사람 T 림프구 세포주
MOLT-4 사람 급성 림프아구성 백혈병
실시예 2
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)("약물")의 활성을 시험하기 위해서, 선택된 혈액암 세포주를 사용하여 MTT 검사를 수행하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고(웰 당 100 μl 중 2x103개 세포), 24시간 동안 회수하였다. 약물을 또 다른 100 μl의 성장 배지에 가하고, 약물을 제거하기 위해 세포 배양 배지를 교체하기 전 3시간 동안 배양된 세포와 함께 인큐베이션하였다. 초기 인큐베이션한지 72시간 후 제작자의 지침(EZ4U, Biomedica, Vienna, Austria)에 따라 MTT 검사로 세포 사멸을 측정하였다. 시험된 세포주가 하기 표 2에 요약되어 있다. 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 약 1.8 μM 내지 약 3.5 μM 범위의 IC50 값으로 표 2에 나타낸 모든 세포주에서 세포 사멸을 유도하는데 효과적이었다. MRP-1 또는 Pgp 단백질을 과다-발현하는 세포 및 이러한 MDR 단백질을 과다-발현하지 않는 세포를 모두 시험하였으며, IC50 값에 통계학적 차이가 없었다. 즉, MRP-1 또는 Pgp 단백질을 과다-발현하는 세포는 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)에 대해 내성이 아니었다. PGP/MRP-1-과다발현은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 탁솔, 도세탁셀, 에토포시드, 미톡산트론, 독소루비신, 에피루비신, 토포테칸, 이리노테칸, 메토트렉세이트 및 이마티니브 등과 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. Fojo & Menefee, Ann. Oncol., 18 (Supplement 5):v3-v8 (2007)을 참조한다. 따라서, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 이러한 약물에 대해 내성인 혈액암 세포에 효과적임이 틀림없다.
세포주 설명
HL-60 사람 급성 전골수구성 백혈병 세포
HL60/adr (mrp1 overex) 사람 급성 전골수성 백혈병 세포 (MRP1 과다-발현)
HL60/vinc (Pgp overex) 사람 급성 전골수성 백혈병 세포 (빈칼로이드에 대해 내성, Pgp 단백질 과다-발현)
K562 만성 골수구성 백혈병 세포주
K562 (Pgp overex) 만성 골수구성 백혈병 세포주 (Pgp 단백질 과다-발현)
실시예 3
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 및 레날리도미드의 성장 억제 활성을 측정하기 위해서, 사람 다발성 골수종 종양 세포주의 대표적인 패널(OPM-2, RPMI-8226, NCI-H929 및 ARH-77)을 항-증식 검사에서 상기 화합물을 이용하여 시험하였다. 구체적으로, 사람 종양 세포를 96시간의 총 성장 시간 동안 적합한 밀도로 96-웰 미세배양 플레이트에 가하였다. 37℃의 가습 인큐베이터에서 5% C02 및 95% 공기와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 성장 배지 중의 일련의 희석된 시험 제제를 각각의 웰에 가하였다. C02 인큐베이터에서 총 96시간의 배양 후, 플레이트를 제작자의 지침에 따라 Cell Titer-Glo(Promega #G7571)로 프로세싱하였다. Tecan GENios 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 발광을 검출하였다. 세포 성장 억제율(%)을 미처리 대조군 웰과 비교하여 계산하였다. 모든 시험은 각각의 농도 수준에서 이중으로 수행하였다.
시험 제제에 대한 IC50 값을 Prism 3.03을 사용하여 하기 4개 변수-로지스틱 방정식을 이용한 데이터를 커브-피팅하여 추정하였다:
Figure 112012073545269-pct00002
상기 식에서, 최대(Top)는 대조군 흡광도의 최대 비율(%)이고, 최저(Bottom)는 최고 제제 농도에서의 대조군 흡광도의 최저 비율(%)이고, Y는 대조군 흡광율(%)이고, X는 제제의 농도이고, IC50은 대조군 세포와 비교하여 세포 성장을 50% 억제하는 제제의 농도이고, n은 곡선의 기울기이다. IC50 데이터가 하기 표 3에 요약되어 있다.
세포주 약물 IC50 (μM) 레날리도미드 IC50 (μM)
OPM-2 0.74 5.83
RPMI-8226 0.82 비활성
H929 1.57 5.28
ARH-77 0.89 비활성
실시예 4
사람 백혈병 세포에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 활성
사람 백혈병 세포주 MV4-11 세포를 총 90 μl/웰의 총 용적으로 96-웰 미세배양 플레이트(Costar white, 편평한 바닥 #3917)에 가하였다. 37℃의 가습 인큐베이터에서 5% C02 및 95% 공기와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 성장 배지 중의 10 μl의 10X 일련 희석된 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)을 각각의 웰에 가하였다. C02 인큐베이터에서 총 96시간의 배양 후, 플레이팅된 세포 및 Cell Titer-Glo(Promega #G7571) 시약을 실온이 되게 하여 30분 동안 평형화시켰다. 100 μl의 Cell Titer-Glo® 시약을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 2분 동안 진탕시킨 후, 정치시켜 Tecan GENios 마이크로플레이트 판독기 상에서 발광을 판독하기 전 10분 동안 평형화시켰다. 세포 성장 억제율(%)을 미처리 대조군 웰과 비교하여 계산하였다. 모든 시험은 각각의 농도 수준에서 이중으로 수행하였다. 시험 제제에 대한 IC50 값을 Prism 3.03을 사용하여 하기 4개 변수-로지스틱 방정식을 이용하여 데이터를 커브-피팅하여 추산하였다:
Figure 112012073545269-pct00003
상기 식에서, 최대(Top)는 대조군 흡광도의 최대 비율(%)이고, 최저(Bottom)는 최고 제제 농도에서의 대조군 흡광도의 최저 비율(%)이고, Y는 대조군 흡광율 (%)이고, X는 제제의 농도이고, IC50은 대조군 세포와 비교하여 세포 성장을 50% 억제하는 제제의 농도이고, n은 곡선의 기울기이다. 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 MV4-11에 대해 1.44μM의 IC50을 가졌다. MV4-11 세포가 Ara-C, 플루다라빈 및 독소루비신에 대해 내성이라는 것이 공지되어 있다. Colado et al., Haematologica., 93(l):57-66 (2008); Scatena et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 66(5):881-8 (2010)을 참조한다. 따라서, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 Ara-C, 플루다라빈 및 독소루비신에 대해 내성인 백혈병 세포에 대해 활성이다.
실시예 5
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 전임상적 활성 프로필을 더욱 조사하기 위해서, 림프종 및 백혈병의 사람 악성종양 세포주에서의 이의 항증식 효과 및 세포독성 잠재성을 조사하였다. 본 연구의 추가 목표는 통상의 암 치료요법에 대한 다중 약물 내성을 극복하는 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 능력을 조사하고 새로운 제제에 의해 유발되는 아폽토시스 시그널전달 경로를 평가하는 것이었다.
A. 방법 및 재료
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)을 확립된 절차에 따라 기관(the Institute of Inorganic Chemistry, University of Vienna, Austria)에서 고순도로 합성하였다. 이 제제를 Serva(Heidelberg, Germany)로부터의 DMSO에 용해시켜 40 mM 스톡 용액을 수득하였다.
하기 세포를 사용하였다: BJAB(버킷 유사 림프종) 세포, mock 및 FADD 형질감염된 BJAB 세포(BJAB FADD 세포는 CD95 수용체 의존적 아폽토시스 경로를 활성화시키는 FADD 단백질을 발현하지 않는다); Nalm-6(사람 B 세포 전구 백혈병) 세포; 및 빈크리스틴- 및 다우노루비신-내성 Nalm-6 세포. 상기 세포를 3 내지 4일마다 1 x 105/ml의 농도로 희석시켜 서브-배양하였다. 모든 실험은 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 0.56 g/1 L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지(GIBCO, Invitrogen)에서 수행하였다. 검사를 수립하기 24시간 전, 세포를 3 x 105/ml의 농도로 배양하여 표준화된 성장 조건을 달성하였다. 아폽토시스 검사를 위해, 세포를 상이한 약물을 첨가하기 직전 1 x 105/ml의 농도로 희석시켰다.
상이한 약물의 세포독성을 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 방출에 의해 측정하였다. 1시간 동안 상이한 농도의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)과 인큐베이션한 후, BJAB 세포에 의해 방출되는 LDH 활성을 회사(Boehringer Mannheim® (Mannheim, Germany))로부터의 세포독성 검출 키트(Cytotoxicity Detection Kit)를 사용하여 세포 배양 상청액에서 측정하였다. 상청액을 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 20 μl의 세포-불포함 상청액을 80 μl의 포스페이트-완충된 식염수(PBS)로 희석하고, 2-[4-요오도페닐]-3-[4-니트로페닐]-5-페닐테트라졸륨 클로라이드 (INT), 나트륨 락테이트, NAD+ 및 디아포라제를 포함하는 100 μl의 반응 혼합물을 가하였다. 이어서, 반응 생성물의 시간-의존적 형성을 490 nm에서 광도 측정으로 정량화하였다. 배양 배지 중의 0.1% Triton X-100를 사용한 세포 용해 후 세포에 의해 방출되는 LDH 활성의 최대량을 측정하고, 100% 세포 사멸을 나타내도록 하였다.
세포 생존력을 CASY® Cell Counter + Analyzer System of Innovatis(Bielefeld, Germany)를 사용하여 측정하였다. 사용된 세포의 필요에 따라 세팅을 특별히 정의하였다. 이러한 시스템으로 세포 농도가 3가지의 상이한 크기 범위에서 동시에 분석될 수 있고: 따라서, 세포 파편, 사멸 세포 및 생존 세포가 한번의 측정으로 측정될 수 있다. 세포를 1 x 105개 세포/ml의 밀도로 식종하고, 상이한 농도의 [FeIII(salophene)Cl]로 처리하였고; 미-처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 완전히 재현탁시키고, 각각의 웰의 100 μl를 즉시 자동화 계수를 위한 10 ml CASYton(바로 사용할 수 있는 등장성 식염수 용액)에 희석시켰다.
아폽토시스 세포 사멸을, 단일 세포 수준에 대한 DNA 단편화를 검출하는 변형된 세포 주기-분석으로 측정하였다. 세포를 1 x 105개 세포/ml의 밀도로 식종하고, 상이한 농도의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)으로 처리하였다. 37℃의 온도에서 72시간 인큐베이션한 후, 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 4℃에서 PBS로 세척하고, 30분 동안 얼음 상의 PBS/2%(v/v) 포름알데하이드에 고정시켰다. 고정 후, 세포를 펠렛화시키고, 15분 동안 에탄올/PBS(2:1, v/v)과 함께 인큐베이션하고, 40 μg/ml RNase를 포함하는 PBS 중에 재현탁시켰다. RNA를 37℃의 온도에서 30분 동안 분해시킨 후, 세포를 다시 펠렛화시키고, 마지막으로 50 μg/ml 프로피듐 요오다이드를 포함하는 PBS 중에 재현탁시켰다. 핵 DNA 단편화를 저이배체 DNA의 유동 세포계측 측정으로 정량화하였다. 데이터를 수집하고 CELL Quest 소프트웨어가 장착된 FACScan 장치(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)를 사용하여 분석하였다. 데이터를, 아폽토시스 세포의 수를 반영하는 저이배체(subG1) 비율(%)로 나타낸다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포질 단백질(15 mg)을 각각의 레인에 로딩하고, 나트륨 도데실설페이트(SDS) PAGE로 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(Schleicher and Schuell, Dassel, Germany)에 블롯팅한 후, 막을 3% 탈지 분유를 포함하는 PBST(0.05 % Tween-20을 포함하는 PBS)에서 1시간 동안 차단시키고, 4℃에서 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 막을 PBST 중에서 3회 세척한 후, PBST 중의 이차 항체를 1시간 동안 적용하였다. 마지막으로, 막을 다시 PBST로 세척하고, Amersham Buchler(Braunschweig, Germany)로부터의 ECL(향상된 화학발광: enhanced chemiluminescence) 시스템을 사용하여 문제의 단백질 밴드를 가시화하였다.
상이한 아폽토시스 경로에 수반되는 다수 유전자의 차등 발현을 분석하기 위해, 아폽토시스-특이적 RT2 프로필러(폴리머라제 연쇄 반응) PCR 발현 어레이(SuperArray PAHS-012; SABiosciences Corporation, Frederick, MD, USA)를 제작자의 지침에 따라 사용하였다. 총 RNA를 8시간 동안 Titanocene Y(30 μM)로 처리된 BJAB 세포로부터 추출하고, RNA를 DNase I(2 U/μl)로 처리하여 가능한 게놈 DNA 오염물을 제거하였다. 이어서, 총 RNA(700 ng/μl)를 cDNA 프로브를 합성하기 위한 템플레이트로 사용하고, LightCycler480(Roche Diagnostics)을 사용하여 제작자의 지침에 따라 정량적 실시간 PCR SuperArray 분석을 수행하였다. 9개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자를 사용하여 하이브리드화 시그널을 정규화하였다. 결과를 SuperArray Analyser Software를 이용하여 분석하고, 데이터를 8시간 동안 비히클-포함 배지에서 인큐베이션된 대조군 세포와 비교하여 각각의 유전자의 배수 (-fold) 발현으로 나타내었다.
B. 결과
1. 트리스 (8- 퀴놀리노라토 )갈륨(III)의 항증식 효과
괴사와 같은 제제의 비특이적 세포독성 효과는 ELISA 검출을 통해 세포외 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 측정에 의해 배제되었다. 림프종 세포(BJAB)를 1시간 동안 상기 제제에 노출시킨 후, 어떠한 유의한 LDH 방출도 관찰되지 않았으며, 이는 세포 사멸이 비특이적 효과에 의해 야기되지 않았다는 것을 나타낸다.
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 항증식 효과를 평가하기 위해서, BJAB 림프종 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 약물에 노출시켰다. 세포 생존력의 측정 및 세포 계수를 CASY® Cell Counter 및 Analyzer System으로 수행하였다. 도 1에 도시되는 바와 같이, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 용량-의존적 방식으로 종양 세포 증식을 고효능으로 억제하여, 1 μM 약간 아래의 IC50 값 및 2 μM 이상의 농도에서의 완전한 증식 차단과 함께 가파른 농도-효과 곡선을 나타내었다.
2. 트리스 (8- 퀴놀리노라토 )갈륨(III) 유도된 아폽토시스는 미토콘드리아 막 전위의 감소에 의해 매개된다
유동 세포계측 측정을 통한 미토콘드리아 투과성 변환의 측정은 감소된 미토콘드리아 막 전위를 갖는 세포를 반영하며, 따라서 이들 세포가 미토콘드리아 내인성 경로를 통해 아폽토시스를 겪는다는 것을 나타낸다. 도 2로부터 판단될 수 있는 바와 같이, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 손상된 미토콘드리아 투과성 변환을 갖는 림프종 세포(BJAB)의 용량-의존적 증가를 나타내었다.
3. 시험관내에서의 아폽토시스의 유도
트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)에 의해 유발되는 아폽토시스의 유도를 정량화하기 위해, 본 발명자들은 아폽토시스 세포 사멸의 특징적 효과로서 DNA 단편화(저이배체)를 측정하였다. 림프종 세포(BJAB)를 상기 제제와 함께 72시간 동안 인큐베이션한 후, 저이배체 DNA의 유동 세포계측 측정에 의해 절차를 수행하였다. 도 3에 도시되는 바와 같이, 낮은 농도의 제제(AC50: 약 1 μM)에서도 광범위한 아폽토시스가 유도될 수 있었다.
4. 트리스 (8- 퀴놀리노라토 )갈륨(III)은 빈크리스틴에 대한 내성을 극복한다.
다중 약물 내성(MDR)은 비관련 화학 치료요법 약물에 대한 동시적 내성 현상이다. P-당단백질은 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체 부류의 일원이며, 이의 과다발현에 의해 MDR을 야기시키고 세포 밖으로의 독성 화합물의 능동 수송을 매개하는 것으로 알려져 있다. 종양 세포는 잠재적으로 다양한 ABC 수송체를 사용하여 다중 약물 내성을 증강시키며, 이로써 악성종양 질환의 치료학적 처치에 대해 직접 관련이 있는 장애를 수반한다. Fojo & Menefee, Ann. Oncol, 18 Suppl 5:v3-8 (2007)를 참조한다. 다우노루비신과 같은 안트라사이클린 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드는 세포독성 화학 치료요법에 사용되는 강력한 제제이다. 그러나, 두 부류의 화합물 모두 다중 약물 내성을 유도할 수 있다. P-gp의 상당한 과다발현은, 플루다라빈 및 파클리탁셀에 대해 추가로 내성인, 빈크리스틴 및 다우노루비신 내성 Nalm-6 세포에서 FACS 분석을 통해 입증될 수 있었다. 내성 세포주 둘 모두를 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)과 함께 72시간 동안 인큐베이션시킨 후, DNA 단편화를 측정하였다. 도 4는, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 대조군 세포와 비교하여 상기 내성 세포에서 더욱 많은 양의 아폽토시스를 유도할 수 있어 다중 약물 내성을 극복한다는 것을 입증한다.
5. 트리스 (8- 퀴놀리노라토 )갈륨(III)은 내인성 경로를 통해 아폽토시스를 유도한다
내인성 경로는, 도 2에 나타내는 바와 같이, 미토콘드리아 막 전위의 손실을 특징으로 한다. 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 내인성 경로를 통해 아폽토시스를 유도한다는 제안을 강조하기 위해, CD95/Fas 죽음 수용체-매개된 아폽토시스의 연루를 배제시킬 수 있었다. 그러한 목적상, 우세한-음성 FADD 돌연변이체(BJAB FADDdn)을 과다발현하는 BJAB 세포 및 BJAB 대조군 세포(BJAB mock)로 이루어진 세포 모델 시스템을 사용하였다. DNA 단편화를 통한 아폽토시스 세포의 측정 결과, 유사한 아폽토시스 비율(도 5)이 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 BJAB 세포에서의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 유도된 아폽토시스가 CD95/Fas 및 FADD 시그널전달과 독립적으로 발생한다고 결론지었다.
내인성 경로를 통한 아폽토시스에 대한 추가의 증거가 웨스턴 블롯 분석에 의해 카스파제-9 및 -3의 연속적 활성화를 조사함으로써 얻어졌다. 상기 2가지 카스파제 모두 아폽토시스 시그널 형질도입 및 실행의 중요한 이펙터 단백질이다. 단백질분해성 절단에 의한 카스파제 둘 모두의 활성화는 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)으로 BJAB 세포를 처리한 후 측정하였다. 도 6에 도시되는 바와 같이, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 프로카스파제-3(p32) 및 프로카스파제-9(p47)의 프로세싱을 유도하여 상기 2가지 카스파제 모두의 활성 서브유닛(p17, p18; p37)을 생성하였다. 동일한 단백질 로딩을 β-액틴으로 확인하였다.
6. 트리스 (8- 퀴놀리노라토 )갈륨(III)-유도된 아폽토시스는 카스파제 -5 및 하라키리 (Harakiri)의 상향조절을 초래한다
아폽토시스 관련 유전자의 전사 수준의 변화를 2.5 μM 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)과의 8시간의 인큐베이션 후 BJAB 세포로부터 분리된 RNA에서 분석하였다. 본 발명자들은 실시간 PCR을 통해 카스파제-5(118배 상향조절) 및 하라키리(29배 상향조절) 유전자 발현의 상당한 증가를 검출하였다. 하라키리(Hrk)는 Bcl-2 부류의 유일한 단백질인 아폽토시스-촉진(pro-apoptosis) Bcl-2 상동성 도메인 3이다. 이들 결과는 아폽토시스-촉진 유전자 둘 모두의 전사에 대한 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 처리의 큰 영향을 나타낸다.
C. 논의
아폽토시스는 발달, 항상성 및 암을 포함한 다양한 질환에서 주요한 역할을 하는 프로그래밍된 세포 사멸의 형태학적으로 구별되는 형태이다. 악성종양의 출현은 비통제된 증식 및 아폽토시스에 대한 세포의 무능력에 기인하므로, 종양 세포에서 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도하는 능력을 갖는 잠재적인 항암 약물이 긴급히 필요하다. 빈크리스틴, 빈카 알칼로이드 및 유사분열 억제제뿐만 아니라 DNA-손상 특성을 갖는 안트라사이클린, 다우노루비신이 이용가능한 가장 중요한 항종양 악물이고 백혈병을 치료하기 위해 독점적으로 사용된다.
본원에서의 상기 결과는 조사된 새로운 제제인 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 림프종 세포(BJAB)의 증식을 100%까지 강력하게 억제하고 림프종 세포(BJAB)에서 아폽토시스를 농도-의존적으로 유도한다는 것을 설득력 있게 입증한다. 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 유도된 아폽토시스의 정량화는 72시간 후 FACS 분석을 통해 DNA 단편화에 의해 측정되었으며, 낮은 마이크로몰 농도(BJAB 세포에서의 LC50: 약 1 μM)에서 높은 아폽토시스 효능을 나타내었다. 세포내 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 조기 방출로 특징지어지는 괴사성 세포 사멸은, 1시간 인큐베이션 후 LDH 검사에서 보여지는 효과가 무시 할만하였기 때문에, 제외될 수 있었다. 세포독성제로서의 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 상당한 잠재성은, 실시간 PCR로 수득되는 다양한 아폽토시스 관련 유전자의 유전자 발현 프로파일링 데이터에 의해 더욱 강조되며, 아폽토시스-촉진 유전자 카스파제-5(118배) 및 하라키리(29배)의 상향조절을 나타내었다. 또한, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 카스파제 의존적 방식으로 내인성 미토콘드리아 경로를 통해 아폽토시스를 현저하게 유도하는 것으로 입증되었다. 이러한 관찰은 각각 미토콘드리아 막 전위의 손실, FADD 의존성 및 BJAB 세포에서의 카스파제-3 및 카스파제-9의 검출에 의해 나타내어질 수 있었다. 세포독성 약물을 사용한 항암 치료는, 아폽토시스 프로그램에 대한 주요 요소로서 작용하고 주요 이펙터로서 사용되는 단백질분해 효소인 카스파제를 활성화시킴으로써 세포 사멸을 매개하는 것으로 여겨진다.
치료학적 처치의 실패는, 종양 세포로부터의 세포독성 약물의 유출에 수반되는 P-당단백질(P-gp)과 같은 막 수송체를 상향조절하는데 책임이 있는 기전인 다중 약물 내성(MDR)의 발달에 기인할 수 있다. 급성 림프아구성 백혈병(ALL)을 갖는 어린이의 치료는 P-gp-의존적 세포 증식 억제성 약물에 기초하고 P-gp 발현은 좋지 못한 예후 및 높은 재발 가능성과 상호연관되는 것으로 고려되기 때문에, 각각 플루다라빈 및 파클리탁셀에 대해 추가로 내성이고 P-gp를 과다발현하는, 빈크리스틴- 및 다우노루비신-내성 Nalm-6 세포가 조사되었다. 내성 세포주는 모두 대조군 세포와 비교하여, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)으로의 처리에 대해 더욱 높은 민감성을 나타내었다. 이러한 발견은 분명히 상기 제제가 상기 세포에서 다중 약물 내성을 극복할 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 여기서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)이 P-pg를 과다발현하기 때문에 통상의 화학 치료요법 형태에 내성인 세포 모델에서조차도 유지되는 항-백혈병 특성을 갖는 유망한 새로운 항암제라는 것을 제시한다.
실시예 6
사람 림프종 종양 세포주에서 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)의 항증식 활성을 측정하기 위해서, 항-증식 검사를 DoHH2, Granta 519 및 WSU-DLCL2 세포주에서 수행하였다. DoHH2 사람 EBV-음성 B 세포 림프종 세포를 5,000개 세포/웰로 식종하고, 20% FBS 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 RPMI1640 배지에서 성장시켰다. Granta 519 사람 외투 세포 림프종 세포를 10,000개 세포/웰로 식종하고, 10% FBS 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. WSU-DLCL2 사람 B 세포 림프종 세포를 5,000개 세포/웰로 식종하고, 10% FBS 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 RPMI1640 배지에서 성장시켰다. 구체적으로, 사람 종양 세포를 96시간의 총 성장 시간 동안 적합한 밀도로 96-웰 미세배양 플레이트에 가하였다. 37℃의 가습 인큐베이터에서 5% C02 및 95% 공기와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 성장 배지 중의 일련의 희석된 시험 제제를 각각의 웰에 가하였다. C02 인큐베이터에서 총 96시간의 배양 후, 플레이트를 제작자의 지침에 따라 Cell Titer-Glo (Promega #G7571)로 프로세싱하였다. Tecan GENios 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 발광을 검출하였다. 세포 성장 억제율(%)을 미처리된 대조군 웰에 대해 상대적으로 계산하였다. 모든 시험은 각각의 농도 수준에서 이중으로 수행하였다. 시험 제제에 대한 IC50 값을 Prism 3.03을 사용하면서 상기 실시예 4에 기재된 4개 변수-로지스틱 방정식을 이용하여 데이터를 커브-피팅하여 추산하였다. 화합물 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 DoHH2(도 7)에서 0.213 μM의 IC50, Granta 519(도 8)에서 2.9 μM의 IC50, 및 WSU-DLCL2(도 9)에서 1.47 μM의 IC50을 가졌다. WSU-DLCL2 세포는 CHOP(사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손) 요법에 대해 내성인 것으로 알려져 있다. Levi et al., Cancer Chemother. Pharmacol., (published online August 31, 2010)를 참조한다. 따라서, 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III)은 또한 사이클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손과 같은 약물에 대해 내성인 림프종 세포에 대해 활성이다.
본 명세서에서 기술되는 모든 공개문 및 특허원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 공개문 및 특허원은, 각각의 개별적 공개문 또는 특허원이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 바와 같이, 동일한 정도로 참조로 본원에 인용된다. 공개문 및 특허원에 대한 단순 언급이 반드시 이들이 본원에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
비록 상기한 발명은 이해를 돕기 위해 설명 및 예시에 의해 다소 상세히 기술되었으나, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 변화 및 변형이 가능하다는 것이 자명할 것이다.

Claims (24)

  1. 트리스(8-퀴놀리노라토)갈륨(III) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 혈액암(hematological cancer)의 치료를 위한 약제학적 조성물로서, 상기 혈액암이 안트라사이클린(anthracycline), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 탁솔, 사이클로포스파미드 또는 프레드니손에 대해 내성인 백혈병 또는 림프종인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액암이 안트라사이클린에 대해 내성인 백혈병인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 백혈병이 AraC, 플루다라빈 또는 독소루비신에 대해 내성인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈액암이 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드 또는 탁솔에 대해 내성인 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL)인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 급성 림프구성 백혈병이 빈크리스틴, 다우노루비신, 플루다라빈 또는 파클리탁셀에 대해 내성인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혈액암이 사이클로포스파미드, 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드 또는 프레드니손에 대해 내성인 림프종인, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 림프종이 아드리아마이신® 또는 빈크리스틴에 대해 내성인, 약제학적 조성물.
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