KR101775998B1 - 알파-토코페롤 및 베타-사이클로덱스트린 포접체와 아마유 또는 아마종실을 포함하는 사료첨가제 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 코어에 포함하며, 상기 코어 주위를 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 및 유화제로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체에 대한 것으로서, 혼합유화제와 베타-사이클로덱스트린을 이용하여 알파-토코페롤 포접체를 형성하고, 상기 포접체와 아마유 또는 아마종실을 포함하는 사료첨가제 조성물에 관한 것이다. 베타-사이클로덱스트린에 포접된 알파-토코페롤과 아마종실을 동시에 이용함으로써, 저장 및 운송 기간 동안의 보존률을 높이고 급여 시 체내에서의 전달효율 및 흡수효율이 증진할 수 있는 사료첨가제를 개발할 수 있다. 최종적으로는 이를 산란계 사료로 이용함으로써 계란 내의 오메가-3지방산 및 항산화 물질의 함량을 높일 수 있다. 따라서 본 발명은 산란계용 기능성 사료 개발 분야에 이용될 것이며, 알파-토코페롤 포접체는 더 나아가 식품 및 제약 분야에서도 응용이 가능할 것이다.
Description
본 발명은 혼합유화제와 베타-사이클로덱스트린을 이용하여 알파-토코페롤 포접체를 형성하고, 상기 포접체와 아마유 또는 아마종실을 포함하는 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.
기능성 축산물을 생산하기 위해서는 사료에 기능성 물질을 첨가하고 이 기능성 물질이 소장까지 도달하여 흡수되고 이것이 계란, 고기, 우유 등에 포함되도록 하여야 한다. 따라서 기능성 축산물을 생산하기 위해 가장 중요한 것은 효과적인 기능성물질 전달 기술을 지니는 것이다. 사료에 첨가되는 대표적인 기능성 물질로써 강한 항산화 작용을 지니고 있는 비타민E(알파-토코페롤)가 가장 대표적이다. 기능성 물질이 사료로 이용되고 가축 체내에 축적되기까지는 많은 장벽들이 존재한다. 우선 기능성 물질이 사료에 이용되기까지 혹은 사료에 혼합된 기능성 물질이 가축에게 급여되기까지의 보관 및 운송기간 동안 빛, 온도 등의 외부 환경으로부터의 안정성 문제가 있다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 알파-토코페롤은 벤젠고리를 지니고 있는 구조적 특성상, 외부 환경에 의해 화학적 구조가 쉽게 변성될 수 있고 이럴 경우 고유의 생리적 기능을 잃게 된다. 따라서 기능성 물질의 보관, 운송기간 동안 물질의 변성을 최소화하는 것이 중요하다.
이렇게 외부로부터 보호된 기능성 물질을 포함한 사료를 가축에게 급여하게 된다 하더라도, 가축 체내에서도 거치게 되는 장벽들이 있다(도 2). 우선 사료가 위를 지나면서 위산에 의한 낮은 pH에 의해 그 구조가 변성될 수가 있고, 이러한 물질이 소장에 도달하게 되면 다양한 소화 효소에 의해 분해될 수가 있다. 또한 알파-토코페롤은 다른 많은 기능성 물질들과 마찬가지로 강한 소수성 물질이기 때문에 물에 대한 수용성이 낮고, 이러한 낮은 수용성 때문에 소장에서의 흡수율이 매우 낮아지게 된다. 물론 소수성 물질의 흡수를 위해 체내에는 담즙산이라는 천연 유화제를 분비하고 있어, 지방과 같은 물질들을 일차적으로 작은 덩어리로 나누어 소화효소의 접근을 높이거나 흡수율을 증진시킨다. 하지만, 기능성 물질을 임의로 다량 사료에 첨가한 경우 이러한 천연 유화 기능으로는 그 흡수율 증진에 한계가 있기에, 추가적인 흡수율 증진 전략이 필요하다.
기능성 물질의 안정성 및 생체이용률을 높이기 위한 기술은 오랜 옛날부터 수없이 연구되어 온 분야이다. 기능성 물질의 안정성을 높일 수 있는 첫 번째 방법은 화학적 가공을 하는 방법이다. 기능성 물질의 취약한 안정성을 보완하기 위해 PEGylation을 시키거나 효소처리를 통한 약간의 구조변형을 통해 물질의 안정성 혹은 생체이용률을 증진 시킬 수가 있다. 하지만 이러한 방법은 기능성 물질 자체에 화학적 구조가 변형되기 때문에 결과적으로 새로운 물질을 생성하게 되는 것이고 이에 따라서 식품업계나 사료업계에 적용하기에는 안전 검증이 어려워 허가를 받기 까다롭다는 단점이 있다. 기능성 물질을 보호하기 위한 두 번째 방법은 물리적 코팅방법이다. 이러한 방법의 경우 키토산, 전분, 사이클로덱스트린과 같은 포접체를 이용하여 물질을 감싸게 되는데 이러한 방법은 화학적인 구조변화가 없기 때문에 상대적으로 안전성 검증이나 허가를 받기 간단하다는 장점이 있지만 담지하고자 하는 기능성 물질의 특성에 따라 까다롭게 코팅물질을 골라야 한다는 어려움이 있다. 마지막으로 상대적으로 간단한 방법으로 유화제를 이용하여 물질을 감싸고 수용성을 증진시키는 방법이 있다. 이러한 방법은 소수성 물질의 체내 전달 및 흡수효율 증진을 위해 많이 이용되고 있는 방법이긴 하나, 상대적으로 물질의 보호효과나 안정성 증진효과가 낮다는 단점이 있다.
이러한 각 방법들의 단점들을 보완하고자, 본 발명에서는 물리적 코팅방법인 베타-사이클로덱스트린에의 포접체 형성 기술과 혼합 유화제를 동시에 이용함으로써 각각의 기술들이 지니고 있는 단점들을 보완하고 신규한 코팅방법을 발명하고자 하였다.
본 발명의 목적은 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 코어에 포함하며, 상기 코어 주위를 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 및 유화제로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체, 상기 포접체의 생산방법 및 상기 포접체를 포함하는 사료첨가제 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 코어에 포함하며, 상기 코어 주위를 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 및 유화제로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 알파-토코페롤 포접체 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 알파-토코페롤 포접체와, 아마유, 아마종실 또는 이들의 혼합물을 유효성분 포함하는 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명은 혼합유화제와 베타-사이클로덱스트린을 이용하여 알파-토코페롤 포접체를 형성하고, 상기 포접체와 아마유 또는 아마종실을 포함하는 사료첨가제 조성물에 관한 것으로서, 베타-사이클로덱스트린에 포접된 알파-토코페롤과 아마종실을 동시에 이용함으로써, 저장 및 운송 기간 동안의 보존률을 높이고 급여 시 체내에서의 전달효율 및 흡수효율이 증진할 수 있는 사료첨가제를 개발할 수 있다. 최종적으로는 이를 산란계 사료로 이용함으로써 계란 내의 오메가-3 지방산 및 항산화 물질의 함량을 높일 수 있다. 따라서 본 발명은 산란계용 기능성 사료 개발 분야에 이용될 것이며, 알파-토코페롤 포접체는 더 나아가 식품 및 제약 분야에서도 응용이 가능할 것이다.
도 1은 알파-토코페롤의 구조를 나타낸다.
도 2는 기능성 물질 전달 과정 중 체내에서 거치게 되는 장벽들을 나타낸다.
도 3은 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 내에 알파-토코페롤을 포접시키기 위한 모식도를 나타낸다.
도 4는 혼합유화제와 베타-사이클로덱스트린을 이용한 알파-토코페롤 포접체의 모식도를 나타낸다.
도 5는 in vivo 분석을 위한 실험 계획을 요약한 그림이다.
도 6은 스프레이-건조한 샘플의 크기 및 형태를 나타낸다. (a) 샘플의 FE-SEM 이미지. (b) DLS에 의해 측정된 샘플의 입자 크기.
도 7은 알파-토코페롤의 포접 효율을 나타낸다.
도 8은 in vitro 방출 분석 결과를 나타낸다. 방출실험은 SGF (PBS, pH 1.2)(a) 및 SIF (PBS, pH 7.4)(b) 조건에서, 37℃ 진탕배양기를 이용하여 수행하였다.
도 9는 열 안정성 분석 결과를 나타낸다. 각 샘플은 40℃ (a), 60℃ (b) 및 80℃ (c)에서 10분, 20분 및 30분 동안 반응시켰다.
도 10은 UV 안정성 분석 결과를 나타낸다. 샘플 68.3cm 위에 위치한 살균 램프의 UV 하에서 각 샘플을 10분, 20분 및 30분 동안 반응시켰다.
도 11은 밀착연접(tight junction)을 확인한 결과를 나타낸다. 밀착연접 형성은 TEER 인덱스(a), FITC-덱스트란 투과성(b) 및 Papp 인덱스(c)를 측정함으로써 확인하였다.
도 12는 ZO-1의 면역형광분석 결과를 나타낸다. 밀착연접은 항-ZO-1 항체 및 Alexa488-접합 2차 항체로 염색되었고(녹색 신호), 핵은 DAPI로 염색되었다(청색 신호).
도 13은 Caco-2 투과성 분석 결과를 나타낸다. (a) 5mM 프리 비타민 E 또는 다양한 VitE-CD 샘플을 Caco-2 트랜스-웰 삽입체에 30분 동안 로딩하였고, 투과된 알파-토코페롤의 양을 분석하였다. (b) 반응 동안 밀착연접의 유지를 확인하기 위해 배양 전후의 TEER 인덱스를 계산한 결과이다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 14는 계란 노른자 내 알파-토코페롤의 양을 나타낸다.
도 15는 DPPH 프리 라디컬 소거 분석 결과를 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 16은 계란 노른자 내 콜레스테롤 양을 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 17은 혈청 콜레스테롤 수치(a) 및 GOT 인덱스(b)를 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다.
도 18은 다양한 형태의 알파-토코페롤 첨가시 암탉의 산란 결과를 나타낸다. (a) 그룹 당 하루 생산하는 계란의 수(n=10). (b) 각 그룹 당 평균 계란의 무게.
도 19는 4주 동안 각 실험군의 노른자 내 지방산 함량을 나타낸다. 계란을 구성하는 (a) ALA, (b) omega-6, (c) omega-3 및 (d) omega-6/omega-3.
도 2는 기능성 물질 전달 과정 중 체내에서 거치게 되는 장벽들을 나타낸다.
도 3은 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 내에 알파-토코페롤을 포접시키기 위한 모식도를 나타낸다.
도 4는 혼합유화제와 베타-사이클로덱스트린을 이용한 알파-토코페롤 포접체의 모식도를 나타낸다.
도 5는 in vivo 분석을 위한 실험 계획을 요약한 그림이다.
도 6은 스프레이-건조한 샘플의 크기 및 형태를 나타낸다. (a) 샘플의 FE-SEM 이미지. (b) DLS에 의해 측정된 샘플의 입자 크기.
도 7은 알파-토코페롤의 포접 효율을 나타낸다.
도 8은 in vitro 방출 분석 결과를 나타낸다. 방출실험은 SGF (PBS, pH 1.2)(a) 및 SIF (PBS, pH 7.4)(b) 조건에서, 37℃ 진탕배양기를 이용하여 수행하였다.
도 9는 열 안정성 분석 결과를 나타낸다. 각 샘플은 40℃ (a), 60℃ (b) 및 80℃ (c)에서 10분, 20분 및 30분 동안 반응시켰다.
도 10은 UV 안정성 분석 결과를 나타낸다. 샘플 68.3cm 위에 위치한 살균 램프의 UV 하에서 각 샘플을 10분, 20분 및 30분 동안 반응시켰다.
도 11은 밀착연접(tight junction)을 확인한 결과를 나타낸다. 밀착연접 형성은 TEER 인덱스(a), FITC-덱스트란 투과성(b) 및 Papp 인덱스(c)를 측정함으로써 확인하였다.
도 12는 ZO-1의 면역형광분석 결과를 나타낸다. 밀착연접은 항-ZO-1 항체 및 Alexa488-접합 2차 항체로 염색되었고(녹색 신호), 핵은 DAPI로 염색되었다(청색 신호).
도 13은 Caco-2 투과성 분석 결과를 나타낸다. (a) 5mM 프리 비타민 E 또는 다양한 VitE-CD 샘플을 Caco-2 트랜스-웰 삽입체에 30분 동안 로딩하였고, 투과된 알파-토코페롤의 양을 분석하였다. (b) 반응 동안 밀착연접의 유지를 확인하기 위해 배양 전후의 TEER 인덱스를 계산한 결과이다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 14는 계란 노른자 내 알파-토코페롤의 양을 나타낸다.
도 15는 DPPH 프리 라디컬 소거 분석 결과를 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 16은 계란 노른자 내 콜레스테롤 양을 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, one-way ANOVA.
도 17은 혈청 콜레스테롤 수치(a) 및 GOT 인덱스(b)를 나타낸다. 에러바는 표준편차로 나타냈다.
도 18은 다양한 형태의 알파-토코페롤 첨가시 암탉의 산란 결과를 나타낸다. (a) 그룹 당 하루 생산하는 계란의 수(n=10). (b) 각 그룹 당 평균 계란의 무게.
도 19는 4주 동안 각 실험군의 노른자 내 지방산 함량을 나타낸다. 계란을 구성하는 (a) ALA, (b) omega-6, (c) omega-3 및 (d) omega-6/omega-3.
이에 본 발명자들은 기능성 물질인 알파-토코페롤을 혼합 유화용액 상에서 스프레이 건조 방법으로 베타-사이클로덱스트린과 함께 포접체를 형성하고, 이렇게 형성된 포접체와 오메가-3 지방산(주로 알파-리놀렌산) 함유율이 높은 아마종실을 함께 이용하여 항산화 기능이 강화되고 오메가-3 지방산이 강화되는 계란 생산을 위한 기능성 사료첨가제 조성물을 개발하고자 하였다. 이에 알파-토코페롤과 베타-사이클로덱스트린 포접체의 효과를 검증하기 위해서 빛과 온도로부터의 안정성, SGF(simulated gastric fluid)와 SIF(simulated intestinal fluid)에서의 방출(release) 효율, Caco-2(소장상피세포)에서의 투과율을 비교하였다. 또한, 새롭게 혼합유화용액을 함께 사용하는 방식으로 포접체를 형성함으로써 그 수용성 및 방출(release) 효율을 보완한 포접체를 이용하고자 하였고, 이때 혼합유화제는 소수성유화제인 Span 80과 친수성유화제인 Tween 80을 함께 이용함으로써 담지효율, 방출(release) 효율 및 소장에서의 흡수효율이 최적화된 유화제 형태(formula)를 찾고자 하였다.
본 발명은 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 코어에 포함하며, 상기 코어 주위를 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 및 유화제로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 유화제는 Tween 80, Span 80 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 용액 및 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 용액을 혼합하는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 혼합물에 유화제를 첨가하여 혼합하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계의 혼합물을 건조시키는 단계를 포함하는 상기 알파-토코페롤 포접체 생산방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유화제는 Tween 80, Span 80 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 혼합물은 Tween 80 및 Span 80을 1 : 1 ~ 4의 중량비로 혼합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 건조는 스프레이 건조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "베타-사이클로덱스트린"은 당분자 7개가 원형으로 연결된 고리형 다당체의 일종으로써, 제약업계, 식품업계, 사료업계 등에서 널리 이용되고 있는 물질이다. 구조적 특성상 고리형 구조의 안쪽은 소수성 잔기들이 위치하고 있고 바깥쪽은 친수성 잔기들이 위치하고 있어서, 내부에서는 소수성 물질과의 소수성 작용(hydrophobic interaction)에 의해 소수성 물질을 담지시킬 수 있고 바깥쪽의 -OH기와 물분자와 수소결합을 함으로써 물에는 잘 녹아, 내부에 담지된 물질을 외부 환경으로부터 보호하면서 동시에 수용성을 높일 수 있다는 기능을 지니고 있다. 베타-사이클로덱스트린에 물질을 담지하기 위한 방법은 여러 가지가 있는데, 그 중에서 효율이 높고 scale-up에 용이한 방법이 스프레이 건조 방법이기에 본 발명에서는 스프레이 건조 방법으로 포접체를 생성하였다.
본 발명에 있어서, "유화제"란 소수성 잔기와 친수성 잔기를 모두 지니고 있는 물질로써 서로 다른 물리적 특성을 지닌 물질들을 잘 섞이게 해주기 때문에 비누, 세제 등으로 많이 쓰이는 물질들을 총칭한다. 유화제의 종류는 매우 많은데, 다양한 유화제들의 특성을 규정하기 위한 수치로 HLB(hydrophile-lipophile balance) value가 있다. 이 HLB value는 유화제들의 소수성 및 친수성 정도를 1~14 사이의 숫자로 나타내는 것인데, 친수성일수록 숫자가 크고 소수성일수록 숫자가 작다. 어떠한 물질을 물에 녹일 때에는 이에 가장 적합한 HLB value가 존재하게 되는데, 두 가지 이상의 유화제를 혼합가게 되면 섞어 준 두 유화제의 평균 값의 HLB value를 지니게 되고 그 비율을 조정함으로써 HLB value에 변화를 줄 수 있기에 혼합 유화제를 많은 경우 이용하게 된다.
또한, 본 발명은 상기 알파-토코페롤 포접체와, 아마유, 아마종실 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 사료는 산란계용 사료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 알파-토코페롤 포접체와 함께 사료에 포함하고자 하는 아마종실은, 아마라는 꽃의 종실로써, 높은 ALA(알파-리놀렌산)함량을 지니고 있다. ALA는 대표적인 오메가-3계 지방산으로써, 다른 기능성 오메가-3 지방산인 EPA와 DHA의 전구체로 작용할 수도 있게, 이러한 ALA 고함유 원료를 오메가-3 지방산이 강화된 축산물을 생산하기 위해 사료첨가제로 많이 이용하고 있다. 이 중 가공 아마종실은 그 값이 매우 싸면서 오메가-3지방산 함량이 약 17%인 원료이기에 이러한 가공 아마종실을 함께 이용함으로써 알파-토코페롤 포접체를 통한 항산화 물질 전달과 동시에 오메가-3 지방산 전달 효율도 동시에 높일 수 있는 사료를 개발하고자 하였다.
상기 사료는 일반적으로 가축 사육에 사용되는 공지된 구성의 사료에 본 발명의 사료 첨가용 조성물을 추가하여 구성될 수 있다.
상기 공지된 구성의 사료는 시판되고 있는 일반사료를 모두 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않으나, 미강, 옥수수, 대두박, 콩, 수수, 쌀, 보리, 밀, 귀리, 호밀, 좁쌀, 메밀, 티리티게일, 고구마, 타피오카, 밀기울, 맥강, 대두피, 옥수수겨, 맥아근, 전분박, 커피박, 잠분, 잠사, 해조분, 면실박, 채종박, 캐놀라밀, 임자박, 호마박, 아마박, 해바라기씨박, 낙화생박, 야자박, 옥수수 글루텐, 주정박, 옥수수 배아박, 고추씨박, 루핀종실, 어분, 우모분 및 육분일 수 있다.
또한 상기 조성물에는 일반적인 사료 첨가제, 예를 들면, 소금, 골분, 인산칼슘제, 무기물 혼합제, 비타민제, 아미노산제, 항생물질, 호르몬제 등의 특수목적을 위한 사료 첨가제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가용 조성물은 가축 또는 가금류에게 1 일 0.5 내지 1.0g/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 이러한 투여량은 투여대상이 되는 동물의 종류, 동물의 나이, 동물의 체중, 동물의 예방하고자 하는 질병, 원하는 효과 등에 따라 당해 분야의 전문가가 적절히 조절할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험재료
알파-토코페롤(α-Tocopherol), 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD), 클로로포름, 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; DPPH), Triton X-100 및 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)은 Sigma (St. Louis, Mo. USA)로부터 구입하였다. 에탄올, 메탄올 및 헥산은 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 비신코닌산(Bicinchoninic acid; BCA) 시약은 THERMO Scientific (PA, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)은 Hyclone (Utah, USA)으로부터 구입하였다. 유화제인 Tween 80 및 Span 80은 DAEJUNG (Siheung, Korea)으로부터 구입하였다. 세포 배양 삽입체 (6-well, 3.0 um pore size)는 BD bioscience (CA, USA)로부터 구입하였다. Rabbit-anti-ZO-1 antibody 및 Alexa 488-conjugated anti-rabbit Fc-antibody는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)로부터 구입하였다. in vivo 분석에서 사용한 가축 사료, 아마유 및 가공된 아마종실은 Seoul Feed (Incheon, Korea)로부터 구입하였고, Amplex Red cholesterol assay kit는 Invitrogen (CA, USA)으로부터 구입하였다.
2. 알파-토코페롤(α-
Tocopherol
)/β-CD
포접체
형성
5.44g의 β-CD를 320ml DW에 섞어 녹였다. 그 후, 2.06g의 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 80ml 에탄올에 녹였고, 녹인 알파-토코페롤을 β-CD 용액에 첨가하였다. 다양한 혼합 비율의 Tween 80 및 Span 80을 유화제 농도 0.1%로 하여 상기 용액에 첨가하였다. 그 후, 상기 용액은 상온에서 24시간 동안 혼합하였다. 혼합 후, 샘플은 spray-dryer (Mini Spray Dryer B-290, Buchi)를 사용하여 건조시켰다. 스프레이 건조 조건은 다음과 같다: 흡입 장치(aspirator) : 90 ; 내부 온도 : 170℃ ; 외부 온도 : 90℃ ; PUMP : 15 (도 3 및 도 4).
3. 크기 측정 및 형태 관측
스프레이 건조에 의해 제조된 고체 분말의 크기 및 형태는 Field-Emission Scattered Electron Microscopy (FE-SEM, AURIGA)에 의해 측정되었다. 물에 분산된 입자의 형태는 dynamic light scattering spectrophotometer (DLS-7000)에 의해 측정되었다.
4.
포접
효율의 측정
헥산을 첨가하여 1분 동안 혼합시킴으로써, 알파-토코페롤은 샘플(10mg/ml)로부터 방출되었다. 그 후, 샘플을 14000 rpm으로 5분 동안 원심분리시켰고, HPLC에 분석을 위해 상등액을 모았다. 포접 효율은 다음과 같이 계산되었다: (최종 샘플 내 알파-토코페롤 농도) / (스프레이 건조 전 알파-토코페롤 농도) x 100.
5.
In vitro
방출 분석
pH가 1.2가 되도록 PBS에 HCl을 첨가하여 인공 위액(simulated gastric fluid; SGF)을 제조하였고, pH가 7.4가 되도록 PBS에 NaOH를 첨가하여 인공 장액(simulated intestinal fluid; SIF)을 제조하였다. 각각의 샘플 60mg를 재서 14ml 둥근 튜브에 담고, 각 튜브에 SGF 또는 SIF를 첨가하였다. 혼합(1-2초) 후, 용액을 진탕 배양기에서 37℃로 8시간 동안 방출실험을 수행하였다. 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 4 및 8 h에, 각 샘플 50ul를 취하여, 용액의 전체 부피를 맞추기 위해 50ul의 프리 SGF 또는 SIF를 추가적으로 첨가하였다. 방출 단계 후, 용액은 1400 rpm에서 3분 동안 원심분리시켰고, 투명한 상등액을 새로운 튜브에 옮겼다. 알파-토코페롤의 양은 BCA 분석을 통해 분석하였다.
6. 열 안정성 분석
대조군 샘플을 제조하기 위해서, 알파-토코페롤 및 여러 고체 (CD, 글루코스, 말토스, 수크로스, 스타치 및 아마종실) 파우더 중 하나를 혼합하였다. 소량의 각 샘플 또는 제조된 대조군을 1.5ml 튜브에 담고, heat-block으로 40, 60 또는 80℃에서 10, 20 또는 30분 동안 총 9가지의 조건으로 반응시켰다. 가열 후, 에탄올을 첨가하여 1분 동안 혼합시킴으로써 샘플(10mg/ml)은 풀어졌고, 5분 동안 원심분리하였으며, 최종적으로 상등액을 모았다. 샘플 내 알파-토코페롤의 양은 BCA 분석을 통해 분석하였고, 보존 효율은 다음과 같이 계산하였다 : (가열 후 샘플 1 g 당 알파-토코페롤 양) / (가열 전 샘플 1 g 당 알파-토코페롤 양) x 100.
7. UV 안정성 분석
대조군 샘플은 열 안정성 분석과 동일한 방법으로 제조하였다. 각 샘플 및 대조군은 6-웰 플레이트에 로딩하였고, 클린 벤치 (CLEAIR, CHC Lab) 내에 위치한 germicidal UV lamp (SANKYO DENKI G40T10) 하에서 68.3cm 거리를 두어 24h, 36h 및 72h 동안 반응시켰다. 반응 후, 에탄올을 첨가함으로써 알파-토코페롤은 샘플로부터 방출되었고, 혼합 및 원심분리하여 BCA 분석을 통해 분석하였다. 보호 효율은 열 안정성과 동일한 방법으로 계산하였다.
8. 알파-토코페롤 정량 분석
Cu2 + 환원을 통해 알파-토코페롤을 정량하고자, 알파-토코페롤 용액에 BCA 시약 처리 후 흡광도를 측정하였다. 먼저, 표준곡선을 그리기 위해 2 mg 알파-토코페롤을 1ml 해당 검출 용질(SIF, SGF 용액 혹은 알코올)에 녹이고 2배씩 7회 계열희석 하였다. 알파-토코페롤 용액 20ul 또는 표준곡선 샘플 20ul를 96-웰 플레이트에 로딩하였고, BCA 시약 100ul을 멀티-피펫을 이용하여 각 웰에 첨가하였다. 5분 반응 후, 각 웰 내 알파-토코페롤의 양은 microplate reader를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
9.
Caco
-2 세포 배양
20% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM에 Caco-2 세포 (인간 대장 선암 세포주; ATCC number HTB-37)를 접종하고 배양하였다. 세포들이 80% 컨플루언트(confluent) 상태로 자라면, 세포를 트립신화 방법으로 서브-배양하였다. 준비된 Caco-2 세포의 투과성 분석을 위해, 삽입체 아래에 2 ml의 배지를 첨가하고, 삽입체 내에 1 ml의 배지를 첨가하여 6-웰 플레이트의 트랜스-웰 삽입체(trans-well insert) 상에 분리된 세포를 재접종하였다. 배지는 트랜스-웰 배양 동안 이틀에 한 번씩 교체하였다. 10일 후, 세포는 완전히 배양되었고, TEER 수치가 500Ω·cm2에 도달하면 세포를 투과성 분석에 사용하였다.
10.
면역형광분석
Caco-2 트랜스-웰 삽입체의 상단 및 하단을 PBS로 씻어냈다. 세포는 4% PFA로 고정시켰고, PBS로 다시 씻어냈다. 차단 용액 (3% BSA 및 0.2% Triton X-100이 포함된 PBS)은 세포를 투과시키기 위해 첨가하였고, 1차 항체로서 rabbit-anti-ZO-1 antibody를 차단 용액으로 처리하였다. 세포는 0.2 % Triton X-100이 포함된 PBS로 씻어냈고, 차단 용액에 녹인 Alexa488-접합 2차 항체를 세포에 첨가하였다. 세포는 0.2% Triton X-100을 가진 PBS로 씻어냈다. 1ug/ml DAPI를 첨가하였고, 세포는 PBS로 다시 씻어냈다. 최종적으로, 트랜스-웰 삽입체의 멤브레인을 깎아냈고, 마운팅 용액을 첨가하여 공기-건조 및 밀폐한 후, Super-resolution Confocal Microscope (SP 8 X STED, Leica)를 이용하여 분석하였다.
11.
Caco
-2 상피 투과성 분석
PBS로 삽입체를 씻어냈고, Caco-2 세포를 준비하였다. 각 샘플을 PBS에 첨가하여 샘플 용액을 제조하였고, 5mM 알파-토코페롤로 표준화시켰다. 또한, 0.1% DMSO가 포함된 프리 알파-토코페롤 및 알파-토코페롤과 β-CD의 물리적 혼합물이 대조군으로서 제조되었다. 1.6ml PBS/웰로 채워진 새로운 6-웰 플레이트로 Caco-2 삽입체를 옮겼다. 0.8ml 샘플 용액 또는 대조군 용액을 각 Caco-2 삽입체 내에 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 삽입체를 제거하였고, 하단 용액을 각각의 새로운 1.5ml 튜브에 모았다. 모아진 용액은 BCA 분석시까지 -20℃에서 보관하였다.
12. ALA 및 알파-토코페롤/베타-
사이클로덱스트린
포접체
첨가에 대한
In vivo
분석
30주령 암탉 (70 마리)을 그룹당 10 마리씩 임의로 7개의 그룹으로 나누었고, 케이지당 5마리씩 사육하였다. 4주의 실험 동안, 각 그룹의 암탉은 알파-토코페롤 및 ALA가 포함된 기본 사료를 공급하였다. 기본 사료에는 3.25g/kg ALA 및 20mg/kg 알파-토코페롤이 포함된다. 프리 알파-토코페롤, 알파-토코페롤 및 β-CD의 물리적 혼합물 또는 알파-토코페롤을 Tween 80:Span 80(1:2 비율) 용액에서 β-CD 포접한 포접체를 각 그룹의 암탉에게 각각 공급하였다. 0, 7, 14, 21 및 24일째, 계란을 수집하였다. 각 그룹으로부터 15개의 계란을 수집하였고, 각 그룹당 3개로 나누어 5개의 노른자를 모았다. 그 후, 모아진 노른자로 HPLC, GC, 콜레스테롤 분석 및 DPPH 분석 등을 수행하였다. 0, 14 및 28일째, 혈액 샘플링을 수행하였다. 혈구 분석 및 혈청 분석을 각각 수행하였다(도 4).
13. 노른자 콜레스테롤 분석
노른자 총 지질은 Folch et al.(Folch & Lebaron, 1956)의 방법에 의해 추출하였다. Folch solution (클로로포름 : 메탄올 = 2:1)을 67mg/1ml로 첨가한 후, 노른자 부분은 1.5ml 튜브에서 균질기로 균질화되었고, 원심분리하였으며, 상등액을 수집하였다. 지질 추출물은 작용 완충액(working buffer)으로 희석하였고, 콜레스테롤 분석 키트 (Red cholesterol assay kit, Amplex)로 키트 내 제시된 프로토콜에 따라 분석하였다.
14. 노른자 총 항산화 활성 분석
노른자의 총 항산화 활성은 DPPH 소거능 분석에 의해 분석되었다. 각 노른자 샘플의 지질은 콜레스테롤 분석과 동일하게 Folch 방법에 의해 추출하였다. 지질 추출물은 메탄올로 1/5 희석하였다. 희석된 지질 추출물 샘플 50ul를 96-웰 플레이트에 로딩하였고, 메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 100ul를 각 웰에 첨가하였다. DPPH 용액이 포함된 메탄올이 양성 대조군으로 사용되었고, DPPH 용액이 포함되지 않은 메탄올이 음성 대조군으로 사용되었다. 37℃에서 30분 동안 반응 후, microplate reader를 통해 400nm에서 흡광도를 검출하였다.
15. 통계분석
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. unpaired t-tests를 사용하여 계산된 통계적 유의성은 p 수치가 0.05 이하일 때 표시하였다.
<
실시예
1> 알파-토코페롤(
VitE
)/베타-
사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체의
입자 크기 및 형태 분석
스프레이 건조에 의해 제조된 알파-토코페롤/β-CD(CD) 포접체를 유화제(Tween 80=Tw; Span 80=Sp)의 비율에 따라 6개의 다른 형태로 준비하였다(표 1).
| Name(VitE-CD-Tw/Sp(ratio) | HLB value |
| VitE-CD | - |
| VitE-CD-Tw | 15.0 |
| VitE-CD-Tw/Sp(1:1) | 9.7 |
| VitE-CD-Tw/Sp(1:2) | 7.8 |
| VitE-CD-Tw/Sp(1:4) | 6.4 |
| VitE-CD-Sp | 4.3 |
스프레이 드라이 방식으로 포접체 형성 후, 입자의 형태 및 크기는 FE-SEM에 의해 관측되었다(도 6(a)). 입자의 표면 형태는 불규칙했다. 입자의 크기는 1 내지 10 um 범위로서, 유화제를 사용한 샘플은 크기가 증가하는 양상을 보였다. 입자들을 물에 분산시켜 입자 크기를 DLS로 측정하였다(도 6(b)). DLS 분석 결과, 샘플의 크기는 90 내지 250nm범위로서, 유화제와 혼합한 샘플은 크기가 증가하는 양상을 보였다. 이로서 스프레이 드라이 과정에서 응집해 있던 입자들이 물에 고르게 분산됨을 확인하였다.
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실시예
2> 알파-토코페롤(
VitE
)/베타-
사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체에서
알파-토코페롤(VitE)의
포접
효율 분석
포접 효율을 분석하기 위해서, 알파-토코페롤을 각 샘플로부터 방출시켰고, HPLC로 분석하였다(도 7). 포접 효율은 다음과 같이 계산되었다: 포접 효율 = (최종 샘플 내 알파-토코페롤 함량) / (스프레이-건조 전 알파-토코페롤 함량) x 100. 포접 효율은 유화제의 존재에 의해 강하게 영향을 받았다. VitE-CD의 포접 효율은 약 18 wt.-%인 반면, VitE-CD-Tw 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:1)는 약 60 wt.-%의 포접 효율을 보였고, VitT-CD-Tw/Sp (1:2) 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:4)는 약 70 wt.-% 포접 효율을 보였는데, 이는 VitE-CD 보다 약 3배 더 높았다. 상기와 같은 결과는 혼합 과정 중 유화제의 첨가가 알파-토코페롤 및 β-CD의 전체 분산율을 개선시키고, 유화제를 함유한 샘플의 포접 효율이 증가되었음을 나타냈다.
<
실시예
3> 알파-토코페롤(
VitE
)/베타-
사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체에서
알파-토코페롤(VitE)의
in-vitro
방출 분석
위 및 소장과 유사한 환경에서 실험하기 위해서, 방출 분석은 각각 SGF (pH 1.2) 및 SIF (pH 7.4)를 이용하여 분석하였다(도 8). SGF 방출 분석에서, VitE-CD는 4시간 동안 10 wt.-% 이하로 가장 낮은 방출율을 나타냈다. SGF에서 VitE-CD-Tw/Sp (1:1) 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:2)는 약 20 wt.-%로 비슷한 방출율을 나타냈다. SGF에서 VitE-CD-Tw/Sp (1:4)는 약 40 wt.-%로 가장 높은 방출율을 나타냈다. SIF 방출 분석에서, VitE-CD 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:1)은 상대적으로 낮은 방출율을 나타낸 반면, VitE-CD-Tw/Sp (1:2) 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:4)는 상대적으로 높은 방출율을 나타냈다.
<
실시예
4> 알파-토코페롤(
VitE
)/
베타-사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체에서
알파-토코페롤(VitE)의 열 안정성 분석
포접체 내의 알파-토코페롤이 고온에서 안정한지 확인하기 위해서, 열 안정성 분석을 수행하였다(도 9). 알파-토코페롤과 여러 형태의 분말 (β-CD, 덱스트로스, 말토스, 수크로스, 스타치 및 아마종실)의 물리적 혼합물을 대조군으로서 사용하였다. 대조군은 분말 형태 사이에 다양한 열 안정성을 나타냈으나, 알파-토코페롤 및 수크로스 혼합물을 제외하고는, 80℃에서 30분 동안 반응시켜도 일반적으로 안정적인 것으로 나타났다. 모든 VitE-CD 샘플은 적어도 80% 이상의 열 안정성을 나타냈다.
<
실시예
5> 알파-토코페롤(
VitE
)/베타-
사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체에서
알파-토코페롤(VitE)의 UV 안정성 분석
알파-토코페롤은 UV 하에서는 대부분 불안정하므로, 포접체 형성에 의한 보호 효율을 확인하기 위해서 UV 안정성 분석을 수행하였다(도 10). 샘플은 클린 벤치(clean bench) 내 살균성 UV 램프 하에서 24, 48 및 72 h 동안 반응시켰다. 알파-토코페롤 및 다양한 분말들의 물리적 혼합물을 대조군으로 사용하였다. 물리적 혼합물로 제조된 대조군과 비교시, VitE-CD 샘플을 제외하고는 유화제를 포함한 모든 VitE-CD 샘플에서 입자 내에 포함된 알파-토코페롤을 보호하는 능력을 나타냈다. 대조군 중에서, 알파-토코페롤과 혼합된 분말의 형태에 따라 보호 효율은 달라졌다.
<
실시예
6> 알파-토코페롤(
VitE
)/베타-
사이클로덱스트린
(β-CD)
포접체에서
알파-토코페롤(VitE)의
Caco
-2 투과성 분석
Caco-2 투과성 분석은 알파-토코페롤/베타-사이클로덱스트린 포접체의 상피 흡수율이 프리 알파-토코페롤에 비해 개선되었는지 확인하기 위해 수행되었다(도 11). 우선, TEER 인덱스를 통해 밀착연접(tight junction)의 형성을 확인한 후, 세포 간의 투과성을 확인하기 위해 FITC-덱스트란을 처리하였다. 최종적으로, 밀착연접 특이 단백질 ZO-1을 면역염색법으로 염색하였다(도 12). 이러한 결과는 Caco-2 투과성 분석에 있어서, 삽입체에 접종되고 배양된 Caco-2가 충분한 밀착연접을 형성했다는 것을 나타냈다.
프리 VitE 및 VitE-/CD 혼합물은 유사한 투과성을 나타낸 반면, β-CD 자체는 Caco-2 층의 투과성에 영향을 미치지 않았다. 포접된 알파-토코페롤 샘플 중에서, VitE-CD-Tw/Sp (1:2) 및 VitE-CD-Tw/Sp (1:4)는 프리 VitE 처리된 군과 비교시 2배 높은 투과성을 나타낸 반면, VitE-CD-Tw/Sp (1:1)는 투과성에 있어 큰 차이를 나타내지 않았다(도 13).
<
실시예
7> ALA 및 알파-토코페롤/베타-
사이클로덱스트린
포접체
첨가물의
In
vivo
분석
알파-토코페롤/베타-사이클로덱스트린 포접체가 계란 노른자에 알파-토코페롤의 축적을 향상시킬 수 있는지와, ALA/알파-토코페롤 혼합물의 첨가가 ALA 및 알파-토코페롤 모두 축적되는데 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위해서 In vivo 분석을 수행하였다. 실험군은 표 2에 나타냈다. 사료에 포함된 ALA 함량은 가공된 아마종실(flaxseed) 20g 및 아마유(flaxseed oil) 2g으로 구성되어 있고, ALA-첨가 사료를 기본 사료로서 사용하였다. 기본 사료 내 알파-토코페롤 함량은 20mg/kg이었고, 추가되는 알파-토코페롤은 실험군 조성에 따라 첨가하였다.
|
테스트 그룹
(그룹 당 산란계 10수) |
ALA
(g/사료 kg) |
알파-토코페롤
(mg/사료 kg) |
베타-사이클로덱스트린
(mg/사료 kg) |
유화제
(mg/사료 kg) |
|
| Control | Control | 3.25 | 20 | ||
| T1 | VitE (1X) | 3.25 | 120 | ||
| T2 | VitE (2X) | 3.25 | 220 | ||
| T3 | VitE+CD mix (1X) | 3.25 | 120 | 439 | |
| T4 | VitE+CD mix (2X) | 3.25 | 220 | 878 | |
| T5 | VitE-CD-Sur (1X) | 3.25 | 120 | 439 | 32 |
| T6 | VitE-CD-Sur (2X) | 3.25 | 220 | 878 | 64 |
Sur: 혼합 유화제 Tween 80:Span 80=1:2
실험 4주 후, 계란 노른자 내 알파-토코페롤의 양을 처음으로 측정하였다. 첫 주부터 각 군은 다른 알파-토코페롤 함량을 나타냈다. VitE-1X 군 중에서, VitE-CD-Sur 군은 2주째 약 1.2 배 높은 알파-토코페롤 함량을 나타냈다. VitE-2X 군 중에서, VitE-CD-Sur 군은 2주째 약 1.5 배 높은 알파-토코페롤 함량을 나타냈다. 상기와 같은 결과는, 비록 VitE+CD 혼합물 군이 프리 VitE-군에 비해 거의 차이가 없는 것으로 나타나기는 하지만, 이는 알파-토코페롤 및 β-CD의 물리적 혼합물이 노른자 내 알파-토코페롤의 축적을 향상시킬 수 없다는 것을 나타내는 것이고, β-CD 및 유화제를 이용한 알파-토코페롤 포접은 노른자 내 알파-토코페롤 축적을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있다. VitE (2X) 군은 VitE (1X) 군보다 1.6 배 높은 알파-토코페롤 축적을 나타낸 반면, VitE-CD-Sur (2X) 군은 VitE-CD-Sur (1X) 군보다 2배 높은 축적을 나타냈다. 이는 알파-토코페롤 농도가 증가할수록 포접 효과가 강력해진다는 것을 명백히 나타낸다(도 14).
실험적으로 사료를 준 닭의 노른자에 포함된 전체 항산화 활성을 측정하기 위해서, DPPH 프리 라디컬 소거 분석을 수행하였다(도 15). 흥미롭게도, 오직 VitE-CD-Sur를 첨가한 군만이 전체 항산화 활성에 있어 상당한 증가를 나타냈다. VitE-CD-Sur (2X)는 VitE-CD-Sur (1X) 보다 라디컬 소거 능력이 더 높게 나타났는데, 이러한 효과는 노른자 내 알파-토코페롤의 양과 크게 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 즉, 체내에서 알파-토코페롤 및 다른 산화제 사이에는 몇몇 상호작용이 있을 수 있는데, 체내 상호작용에 있어서 프리 알파-토코페롤과 알파-토코페롤/베타-사이클로덱스트린 포접체는 차이가 있다는 것을 나타낸다.
다음으로, 노른자의 콜레스테롤 수준을 분석하였다. 예측한 바와 같이, 대조군과 비교시 알파-토코페롤 또는 β-CD의 첨가가 어떤 차이를 나타내지는 않았다(도 16). 혈청 콜레스테롤 수준 및 혈청 글루탐옥살초산 아미노전이효소(glutamic-oxaloacetic transaminase; GOT) 인덱스를 분석하였다(도 17). 실험군 사이에 혈청 콜레스테롤 수준에 차이는 없었다. 실험 기간 동안, 실험군 사이에 혈청 내 GOT 수준의 차이는 없었는데, 이는 첨가된 알파-토코페롤 또는 β-CD가 적어도 4주 동안은 간 손상 또는 간의 부담을 유발하지는 않는다는 것을 나타낸다.
실험기간 4주 동안, 실험 사료가 암탉의 산란에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해서, 산란 정도를 기록하였다(도 18). 모든 실험군에 있어서, 계란 생산율은 큰 변화 없이 70 % 내지 100 %이었다. 또한, 산란의 다른 파라미터인 평균 계란 무게도 실험군 간에 유사했다. 따라서, 실험 사료가 4주 동안 암탉의 일반적인 산란에는 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
Claims (9)
- 알파-토코페롤(α-Tocopherol)을 코어에 포함하며, 상기 코어 주위를 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 및 유화제로 둘러싸고, 상기 유화제는 Tween 80 및 Span 80 혼합 유화제인 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체.
- 제1항에 있어서, 상기 혼합 유화제는 Tween 80 및 Span 80을 1 : 1 ~ 4의 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 포접체.
- (1) 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD) 용액 및 알파-토코페롤(α-Tocopherol) 용액을 혼합하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 혼합물에 Tween 80 및 Span 80 혼합 유화제를 첨가하여 혼합하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계의 혼합물을 건조시키는 단계를 포함하는 알파-토코페롤 포접체 생산방법. - 삭제
- 제3항에 있어서, 상기 혼합 유화제는 Tween 80 및 Span 80을 1 : 1 ~ 4의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤 포접체 생산방법.
- 제3항에 있어서, 상기 건조는 스프레이 건조하는 것을 특징으로 하는 알파-토코페롤 포접체 생산방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 알파-토코페롤 포접체와, 아마유, 아마종실 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 아마유 또는 아마종실은 알파-리놀렌산(α-linolenic acid; ALA)을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 사료는 산란계용 사료인 것을 특징으로 하는 사료첨가제 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220127017A (ko) | 2021-03-10 | 2022-09-19 | 주식회사 톡시온 | 화장품 및 의약품 원료로 사용하기 위한 뱀 기름 특유의 냄새를 제거 정제하는 제조 방법 |
Families Citing this family (1)
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| KR102195259B1 (ko) | 2019-12-17 | 2020-12-28 | 주식회사 내츄럴스푸드 | 토코페롤을 포함하는 혼합 분말 제형 |
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-
2015
- 2015-09-04 KR KR1020150125231A patent/KR101775998B1/ko active IP Right Grant
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| John L. Koontz et al. Cyclodextrin Inclusion Complex Formation and Solid-State Characterization of the Natural Antioxidants α-Tocopherol and Quercetin. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 1162-1171.* |
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