KR101775401B1 - 재조합 단일사슬 항체를 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 중쇄(heavy chain), 링커 및 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 경쇄(light chain)를 포함하며, 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 재조합 단일사슬 항체(single chain variable fragment)를 유효성분으로 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명은 2종 이상의 미생물을 동시에 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통하여 상기 식중독을 일으키는 병원성균을 보다 효과적으로 빠르게 검출할 수 있다. 본 발명에서 포함하는 단일사슬 항체는 전 항체(whole antibody)에 비해 분자량이 작고 안정성이 낮으나, 형질전환 미생물에서 저비용으로 반복해서 대량으로 생산이 가능한 경제적 우수성을 가진다. 또한, 본 발명은 병원성 미생물(식중독균) 및 일반 대장균 검출 특이성 및 감도를 측정함으로써 균 회수 및 분석용 시료 전처리 과정에 활용이 가능하다.

Description

재조합 단일사슬 항체를 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물{Composition for Detecting Multi―Microorganism Comprising Recombinant Single Chain Variable Fragment}

본 발명은 재조합 단일사슬 항체를 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물에 관한 것이다.

식중독은 병원성 세균, 병원성 세균에서 발현되는 독소, 바이러스 및 자연계에 존재하는 독소에 의해 발병하는 질병으로서, 식중독의 원인균으로 알려진 병원균도 많지만 불명의 원인도 다수 존재하는 질병이다. 식중독균에는 대표적으로 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 속 균(Salmonella spp.), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli O157:H7), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 쉬겔라 속 균(Shigella spp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 엔테리티스(Staphylococcal enteritis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 등이 있다.

전 세계적으로 식중독으로 인한 사고가 끊이지 않고 있으며, 우리나라의 경우에도 노로바이러스, 병원성대장균 등의 식중독 사고가 매년 발생하고 있다. 식약처에서는 황색포도상구균 및 살모넬라 등 총 11종의 식중독 유발 세균 및 바이러스를 지정하고 관리하고 있으며, 식중독균에 대한 신속하고 정확한 새로운 검출법 개발이 계속적으로 요구되고 있는 실정이다.

리스테리아(Listeria)의 균종들은 그람 양성의 통성 혐기성 간균으로서 자연계에 널리 분포하고 있다. 리스테리아 속(Listeria spp.) 균에는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 시일리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 웰쉬메리(Listeria welshimeri) 및 리스테리아 그라이(Listeria grayi) 등의 다수의 종들이 있으며, 이 중에서 리스테리아 모노사이토제네스만이 사람에게 병원성이 있으며, 동물에 병원성이 있는 균주는 리스테리아 모노사이토제네스와 리스테리아 이바노비이다. 특히, 리스테리아 모노사이토제네스는 냉장 보존을 요하는 식품에 오염되는 경우 저온 보존 과정에서 오랫동안 생존 및 증식이 가능하기 때문에 냉장보존 식품을 매개로한 식중독 발생의 중요한 원인균이 되고 있다. 따라서, 리스테리아증을 예방하기 위하여 리스테리아 모노사이토제네스에 의한 식품의 오염 여부를 신속하게 검출할 필요가 있다.

일반적으로 병원성 미생물체의 진단방법으로 증상을 관찰하는 방법, 현미경을 이용하여 관찰하는 방법, 병원성 미생물의 특정 항원을 검출하는 면역학적 방법, 그리고 PCR 기술을 이용하여 특이 유전자를 증폭하는 방법 등이 이용되고 있다. 그러나, PCR 방법은 매우 정밀하고 정확한 진단을 가능하게 하지만 반드시 유전자 증폭과정을 거쳐야 하기 때문에 여러 가지 요인에 의해서 크게 영향을 받는 단점이 있으며, 현미경적 방법을 적용하려면 병원체가 일반 현미경으로 관찰할 수 있을 정도로 커야 하고, 표본에서 쉽게 찾아볼 수 있을 정도로 밀도가 높아야 할 뿐만 아니라 그 형태가 다른 생물체와 뚜렷하게 구분되어야 한다는 불편함이 있다.

한편, 식중독균 검출법의 핵심 과정 중 하나는 식품 중 오염된 위해 미생물을 회수하는 과정이고 이를‘시료의 전처리 과정’이라 하여 항체나 앱타머 등을 적용시킨 다양한 연구가 행해지고 있으며 최근 이에 대한 연구 필요성이 더욱 증대되는 추세이다.

현재, 미생물 검출과 관련하여 혼성화 반응(hybridization reaction) 및 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용한 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 정량적으로 검출하는 방법(한국특허등록 제10-0760525호), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium) 미생물을 검출하는 방법(한국특허등록 제10-1445243호), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 이용하는 검출 방법(한국특허등록 제10-0504132호)이 공개되어 있으나, 2개 이상의 다중 미생물을 보다 정확하고 빠르게 검출 및 분리할 수 있는 항체에 대한 개발의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 중쇄(heavy chain) 영역과 경쇄(light chain) 영역의 아미노산 서열에 링커(linker)로 연결함으로써 재조합 단일사슬 항체(single chain variable fragment)를 제조하였다.

또한, 본 발명에서는 제조된 단일사슬 항체가 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물 중 2종 이상의 미생물과 동시에 특이적으로 결합하는 교차반응성(cross reactivity)이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 중쇄(heavy chain), 링커 및 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 경쇄(light chain)를 포함하며, 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 재조합 단일사슬 항체(single chain variable fragment)를 유효성분으로 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 다중 미생물 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물들을 다중으로 검출할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물들을 다중으로 분리할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 미생물을 동시에 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통하여 상기 식중독을 일으키는 병원성균을 보다 효과적으로 빠르게 검출할 수 있다.

본 발명에서 포함하는 단일사슬 항체는 전 항체(whole antibody)에 비해 분자량이 작고 안정성이 낮으나, 형질전환 미생물에서 저비용으로 반복해서 대량으로 생산이 가능한 경제적 우수성을 가진다.

또한, 본 발명은 병원성 미생물(식중독균) 및 일반 대장균 검출 특이성 및 감도를 측정함으로써 균 회수 및 분석용 시료 전처리 과정에 활용이 가능하다.

도 1a-1b는 본 발명에서 디자인된 항-리스테리아 모노사이토제네스(anti-Listeria monocytogenes(Lm)) 재조합 단일사슬 항체 유전자 발현을 위한 벡터 콘스트럭트(construct)를 나타낸 모식도이다. 도 1a에서의 콘스트럭트를 Lm-N-1이라고 명명하였으며, 도 1b에서의 콘스트럭트를 Cont1N로 명명하였다. 6xHis는 6개의 히스티딘(Histidine) 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
도 2a-2b는 항-Lm 재조합 단일사슬 항체를 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA affinity chromatography)를 이용하여 분리 정제한 후 SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 확인한 결과 이미지이다. 도 2a는 Lm-N-1이 발현된 재조합 단일사슬 항체에 대한 SDS-PAGE 결과이며, 도 2b는 Cont1N이 발현된 재조합 단일사슬 항체에 대한 SDS-PAGE 결과이다. 도 2a 및 도 2b에서 표시는 다음과 같은 의미를 가진다 : M은 분자량 마커; 1은 전체 용해물; 2는 상층액; 3은 펠렛(Pellet); 4는 통과 용액; 5는 제1 용출액; 6은 제2 용출액; 7은 투석시킨 용액
도 3은 본 발명에 의해 제조된 항-Lm 재조합 단일사슬 항체인 Lm-N-1 및 Cont1N과 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes : L. mono), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium : S. thyph), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella. enteritidis : S. enter), 에스케리시아 콜라이 O157:H7(Escherichia coli O157:H7 : E. coli O157), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus : V. para), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus : V. vul), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus : B. cer) 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a(Escherichia coli DH5a : DH5a)를 포함하는 8개 항원 및 대조군(항원을 포함하고 있지 않은 군 : Cont)과의 결합친화력을 간접 ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 확인한 결과이다. A-1 및 A-2는 항-Lm 재조합 단일사슬 항체와 생균(Living cells) 항원과의 결합친화력을 나타낸 결과이며, B-1 및 B-2는 항-Lm 재조합 단일사슬 항체와 열처리 균(Heat-inactivated cells) 항원과의 결합친화력을 나타낸 결과이다. LN1은 Lm-N-1을 의미하며, C1N은 Cont1N을 의미한다.
도 4는 본 발명에 의해 제조된 항-Lm 재조합 단일사슬 항체인 Lm-N-1 및 Cont1N과 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes : L. mono), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium : S. thyph), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella. enteritidis : S. enter), 에스케리시아 콜라이 O157:H7(Escherichia coli O157:H7 : E. coli O157), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus : V. para), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus : V. vul), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus : B. cer) 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a(Escherichia coli DH5a : DH5a)를 포함하는 8개 항원 및 대조군(항원을 포함하고 있지 않은 군 : Cont)과의 결합친화력을 샌드위치 ELISA(Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 확인한 결과이다. A-1 및 A-2는 항-Lm 재조합 단일사슬 항체와 생균(Living cells) 항원과의 결합친화력을 나타낸 결과이며, B-1 및 B-2는 항-Lm 재조합 단일사슬 항체와 열처리 균(Heat-inactivated cells) 항원과의 결합친화력을 나타낸 결과이다. LN1은 Lm-N-1을 의미하며, C1N은 Cont1N을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 중쇄(heavy chain), 링커 및 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 경쇄(light chain)를 포함하며, 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 재조합 단일사슬 항체(single chain variable fragment)를 유효성분으로 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물에 대하여 특이적인 결합을 할 수 있는 단일사슬 항체를 포함하며, 특히 상기 2종 이상의 미생물과 교차반응성을 가지는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 미생물 검출 및 분리를 위한 균 회수 및 분석용 시료 전처리 과정에 활용될 수 있는 장점을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출이 가능한 살모넬라 속 미생물은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출이 가능한 비브리오 속 미생물은 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출이 가능한 바실러스 속 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물을 포함하며, 보다 바람직하게는 바실러스 세레우스 및 바실러스 서브틸리스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물을 포함하고, 가장 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출이 가능한 에스케리시아 속 미생물은 에스케리시아 콜라이 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 및 에스케리시아 콜라이 DH5a(Escherichia coli DH5a)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출이 가능한 리스테리아 속 미생물은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 '단일사슬 항체(single chain variable fragment: svFv)'는 재조합 항체로 항체의 가변 부위(variable region)의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 링커(linker)로 연결된 구조의 항체 단편이며, 단일사슬 항체는 중쇄-링커-경쇄 또는 경쇄-링커-중쇄의 구조를 포함한다. 보다 구체적으로 단일사슬 항체는 중쇄 아미노산 서열 N-말단(terminal)에 링커가 결합되고 경쇄 C-말단에 링커가 결합되어 있거나 경쇄 아미노산 서열 N-말단(terminal)에 링커가 결합되고 중쇄 C-말단에 링커가 결합되어 있는 구조를 포함한다.

본 발명에서 중쇄 아미노산 서열은 항-리스테리아 모노사이토제네스 항체 중쇄 아미노산 서열을 포함하나, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 경쇄 아미노산 서열은 항-리스테리아 모노사이토제네스 항체 경쇄 아미노산 서열을 포함하나, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 '링커'는 중쇄와 경쇄 또는 경쇄와 중쇄를 연결할 수 있는 모든 분자를 의미하며, 보다 구체적으로는 당업계에서 단백질과 단백질, 항체와 항체, 단일사슬 항체(scFv)와 단일사슬 항체와 결합에 이용될 수 있는 링커라면 제한없이 사용이 가능하다. 바람직하게는, 본 발명에서 링커는 단일사슬 항체를 연결할 수 있는 폴리펩타이드(polypeptide)를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 링커는 1개-50개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(polypeptide)를 포함하며, 보다 바람직하게는 5개-30개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 10개-20개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며, 가장 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명에서의 단일사슬 항체 구조는 중쇄, 링커 및 경쇄를 포함하는 구조로 미생물과 결합이 가능한 구조라면 어느 폴리펩타이드 분자 구조를 가질 수 있으나, 중쇄, 링커 및 경쇄 순서의 구조가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 단일사슬 항체 아미노산 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열이다.

본 발명에서 포함하는 단일사슬 항체는 전 항체(whole antibody)에 비해 분자량이 작고 안정성이 낮으나, 형질전환 미생물에서 저비용, 반복적으로 대량 생산이 가능한 경제적 우수성을 가진다.

본 발명은 또한, 상기 다중 미생물 검출용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 미생물-단일사슬 항체 복합체의 존재여부 또는 양의 측정은, 미생물에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시된다. 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 상기 미생물 존재 여부를 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 미생물을 검출하는데 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 제공하는 키트는 면역분석용 키트이며, 상기 면역분석용 키트는 직접-ELISA(direct-enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 간접-ELISA, 샌드위치-ELISA, 단백질 마이크로어레이, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 제공하는 키트는 ELISA 또는 단백질 마이크로어레이이며, 보다 더 바람직하게는 간접-ELISA 또는 샌드위치-ELISA이다.

간접 ELISA 방법 및 샌드위치(sandwich)-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 단일사슬 항체의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다.

본 발명은 또한,

(a) 미생물을 함유하는 생물학적 시료와 본 발명의 조성물을 혼합하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 혼합물에서 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체를 검출하는 단계를 포함하는 다중 미생물 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다중 미생물 검출 방법에서, 상기 단계(a)에서의 미생물은 리스테리아 속 미생물, 살모넬라 속 미생물, 비브리오 속 미생물, 바실러스 속 미생물 및 에스케리시아 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물이 포함된다.

본 발명의 명세서에서, 용어 '생물학적 시료'는 음식물, 물, 특정 또는 불특정 미생물을 포함하는 용액, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 단계(a)에서, 미생물은 바람직하게는 생균 및 열처리균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균인 것을 포함한다.

본 발명에서의 단계(b)는 (ⅰ) 단계(a)에서의 다른 미생물이 포함된 생물학적 시료에서 상기 리스테리아 속 미생물, 살모넬라 속 미생물, 비브리오 속 미생물, 바실러스 속 미생물 및 에스케리시아 속 미생물로 구성된 군으로부터 하나 이상의 미생물을 검출하는 단계 또는 (ⅱ) 단계(a)에서의 다른 미생물이 불포함된 생물학적 시료에서 상기 리스테리아 속 미생물, 살모넬라 속 미생물, 비브리오 속 미생물, 바실러스 속 미생물 및 에스케리시아 속 미생물로 구성된 군으로부터 하나 이상의 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 단계(b)는 미생물과 단일사슬 항체와의 결합체를 검출하는 단계로서, 상기 결합체는 항원-항체 반응을 통하여 결합된 결합체를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계(b)에서 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체 검출은 간접(indirect) ELISA 또는 샌드위치 ELISA 방법을 통해 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 다중 미생물 검출용 조성물을 이용하여 키트와 동일한 원리로 미생물을 검출하는 단계를 포함함에 따라, 명세서의 과도한 내용 기재를 회피하기 위하여 중복된 내용은 생략한다.

본 발명은 또한,

(a) 미생물을 함유하는 생물학적 시료와 본 발명의 조성물을 혼합하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 혼합물에서 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체를 형성하는 단계; 및

(c) 상기 결합체로부터 미생물을 분리하는 단계를 포함하는 다중 미생물 분리 방법을 제공한다.

본 발명은 리스테리아 속 미생물, 살모넬라 속 미생물, 비브리오 속 미생물, 바실러스 속 미생물 및 에스케리시아 속 미생물을 생물학적 시료로부터 분리하는 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 단계(c)는 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체에서 미생물을 분리하는 단계로서, 결합된 미생물과 재조합 단일사슬 항체를 분리할 수 있는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 상기 다중 미생물 검출용 조성물을 이용하여 키트 및 검출방법과 동일한 원리로 미생물을 분리하는 단계를 포함함에 따라, 명세서의 과도한 내용 기재를 회피하기 위하여 중복된 내용은 생략한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험방법

항체생산용 발현 벡터 디자인 및 유전자 클로닝

마우스에서 생산한 항-리스테리아 모노사이토제네스(anti-Listeria monocytogenes : Lm) 항체의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 유전자 정보를 미국 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보하고 링커(linker)로 연결하여 전체 서열(full sequence)을 디자인 한 다음 유전자 합성을 의뢰하여 항-리스테리아 모노사이토젠 단일사슬 항체 유전자를 제조하였다. 제조된 유전자를 형질전환된 대장균에서 발현시키기 위해, 다음과 같은 두 종류의 발현 벡터 콘스트럭트(vector construct)를 디자인하였다. 즉, 재조합 단일사슬 항체 전체 서열의 양쪽 말단 (N-term 및 C-term)에 제한효소 절단부위(Lm-N-1: NheI 및 HindIII, Cont1N: NdeI 및 SalI)를 삽입하고 N-term과 C-term 모두 (Lm-N-1) 또는 C-term (Cont1N)에 여섯 개의 히스티딘 서열을 첨가하였다(Lm-N-1 및 Cont1N, 도 1a 및 1b 참조)

항-리스테리아 모노사이토제네스 단일사슬 항체 유전자를 중합효소 연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction : PCR)으로 증폭시켰으며(Denaturation: 94℃. 30s, Annealing: 55℃, 30s, Extension: 72℃, 1 min, 34 cycles), 이를 각각의 발현 벡터(Lm-N-1: pET-28a, Cont1N: pET-22b)로 클로닝(cloning)하였다.

재조합 단일사슬 항체의 발현 및 분리 정제

클로닝이 완료된 두 종류의 항체 유전자를 에스케리시아 콜라이(Escherichia Coli)Rosetta (DE3)에 형질전환하고 발현이 유도된 항체 단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA affinity chromatography)를 통해 분리 정제한 후 SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)를 통하여 확인하였다.

면역분석법을 이용한 활성 측정

(1) 간접 ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbent assay)

위해미생물 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella. enteritidis), 에스케리시아 콜라이 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a(Escherichia coli DH5a)를 대상으로 재조합 항체의 항원 친화력, 즉 검출 여부를 비색법(colorimetric analysis, Greenan, N. S., et al, (1995), Commun. Soil Sci . Plant Anal . 26:2519-2529; Ray Sarkar and Chauhan, (1967) Anal. Biochem. 20:155 참조)으로 조사하기 위해, 96-웰 플레이트(96-well plate)에 항원으로 7개 식중독 유발균 및 일반 대장균 E. coli DH5a를 코팅하였다.

그 다음, 두 가지 농도의 재조합 항체를 반응시킨 다음 2차 항체 콘쥬게이트(conjugate)를 반응시켜 효소의 발색 반응을 통한 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.

(2) 샌드위치 ELISA(Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)

제조된 재조합 단일사슬 항체를 4℃ 온도에서 96-웰 플레이트에 코팅한 후 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 타이피무리움, 살모넬라 엔테리티디스, 에스케리시아 콜라이 O157:H7, 비브리오 파라헤모리티쿠스, 비브리오 불니피쿠스, 바실러스 세레우스 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a와 식중독 유발균을 포함하고 있지 않은 대조군을 항원과 반응시켰다. 그 다음, HRP 콘쥬게이트 키트(HRP Conjugation Kit, Abcam사, UK)를 이용하여 제조된 재조합 항체-HRP 콘쥬게이트와 반응시킨 후 효소 반응을 통해 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

실시예 1: 항체 생산용 발현 벡터 디자인 및 유전자 클로닝

항-리스테리아 모노사이토제네스 재조합 항체 유전자를 PCR법으로 증폭시켜 DNA 전기영동으로 820 bp (Lm-N-1) 및 810 bp (Cont1N)의 타겟 유전자 밴드를 확인하였다. 증폭된 항-리스테리아 모노사이토제네스 재조합 항체 유전자를 발현 벡터에 클로닝을 한 후, 염기서열 분석(sequencing)을 통해 클로닝 여부를 최종 확인하였으며, 이 클론을 항체 발현에 이용하였다 (도 1).

실시예 2: 재조합 단일사슬 항체의 발현 및 분리 정제

시퀀싱이 완료된 클론을 대장균 발현 시스템을 이용하여 발현을 유도하였고 최적 발현 조건을 선정하여 항-리스테리아 모노사이토제네스 단일사슬 항체(scFv)인 Lm-N-1 및 Cont1N을 제조하였으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하였다. 그 결과 최종적으로 얻은 수용성 항체의 수율은 각각 6.71 ㎎/ℓ과 7.17 ㎎/ℓ로 나타났다 (도 2).

실시예 3: 면역분석법을 이용한 활성 측정

(1) 간접 ELISA

모든 균(7개 식중독 유발균 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a)에 대해서 항원을 처리하지 않은 대조군(control)에 비해 110-220%의 결합 친화력을 나타내었다. 2종의 비브리오균에 대한 결합 친화력이 가장 높았던 반면, 살모넬라 타이피무리움과 바실러스 세레우스에 대한 결합 친화력이 상대적으로 낮은 경향을 나타내었다. 또한 항원을 생균 상태로 처리하였을 때와 열처리했을 때의 수치를 비교하면 전자가 전반적으로 약간 더 높은 경향을 나타내었다 (도 3).

(2) 샌드위치 ELISA

모든 균(7개 식중독 유발균 및 일반 대장균인 에스케리시아 콜라이 DH5a)에 대해서 항원을 처리하지 않은 대조군 (control)보다 110-300% (비브리오 불니피쿠스는 510%)의 높은 결합 친화력을 나타내었다. 특히, 생균 상태로 처리한 경우에는 비브리오 불니피쿠스에 대해서 두 가지 항체 모두에서 가장 높은 결합 친화력을 보였고, 리스테리아 모노사이토제네스, 에스케리시아 콜라이 O157:H7 및 비브리오 파라헤모리티쿠스에 대하여 상대적으로 높은 결합 친화력을 나타내었다.

열처리균의 경우에는 살모넬라 엔테리티디스를 제외한 모든 균에서 상대적으로 높은 결합 친화력을 나타내었고, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 타이피무리움, 에스케리시아 콜라이 O157:H7 및 비브리오 파라헤모리티쿠스의 경우, 열처리시켰을 때가 생균에 대해서보다 Lm-N-1 항체의 결합 친화력이 상대적으로 높은 수치를 나타내었다 (도 4).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Composition for Detecting Multi Microorganism Comprising Recombinant Single Chain Variable Fragment <130> PN14428 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 137 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 1 Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Asp Thr Lys Tyr Phe Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 3 Ala Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 35 40 45 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 85 90 95 Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala 100 105 110 <210> 4 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Single Chain Variable Fragment <400> 4 Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ala Asp Thr Lys Tyr Phe Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro 145 150 155 160 Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly 165 170 175 Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 180 185 190 Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly 195 200 205 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu 210 215 220 Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn 225 230 235 240 Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 245 250 255 Val Leu Gly Ala Ala Ala 260

Claims (15)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 중쇄(heavy chain), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 링커 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 항-리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 항체의 경쇄(light chain)를 포함하며, 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 미생물과 특이적으로 결합하는 재조합 단일사슬 항체(single chain variable fragment)를 유효성분으로 포함하는 다중 미생물 검출용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 속 미생물은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella thyphimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 비브리오 속 미생물은 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 에스케리시아 속 미생물은 에스케리시아 콜라이 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 및 에스케리시아 콜라이 DH5a(Escherichia coli DH5a)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 리스테리아 속 미생물은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단일사슬 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출용 조성물.
9. 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 다중 미생물 검출용 키트.
10. 제9항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
11. 제10항에 있어서, 상기 키트는 ELISA 키트 또는 단백질 마이크로어레이 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
12. (a) 미생물을 함유하는 생물학적 시료와 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 혼합물에서 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체를 검출하는 단계를 포함하는 다중 미생물 검출 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 미생물은 생균 및 열처리균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체 검출은 간접(indirect) ELISA 또는 샌드위치 ELISA 방법을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 미생물 검출 방법.
15. (a) 미생물을 함유하는 생물학적 시료와 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 하나의 조성물을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 혼합물에서 리스테리아 속(Listeria sp.) 미생물, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 미생물, 비브리오 속(Vibrio sp.) 미생물, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 에스케리시아 속(Escherichia sp.) 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 미생물과 재조합 단일사슬 항체와의 결합체를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 결합체로부터 미생물을 분리하는 단계를 포함하는 다중 미생물 분리 방법.

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