KR101773342B1 - 항진균 활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 dh1 및 이의 용도 - Google Patents

항진균 활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 dh1 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 후자리움(Fusarium) 속 진균에 대한 생장 억제 및 포자 발아 억제 활성을 가진 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주 및 이러한 균주를 이용하여 농산물 등에서 후자리움 속 진균의 생장 및 포자 발아를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주 및 이를 포함하는 유해 진균 억제용 조성물은 후자리움 속에 대한 생장 및 포자 발아 억제 효과가 현저하게 우수하다.

Description

항진균 활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 DH1 및 이의 용도{Bacillus amyloliquefaciens DH1 having antifungal activity and its use}
본 발명은 신규 균주 및 이의 용도에 관한 것이며, 특히 독소를 생산하는 후자리움 속 진균에 대한 생장 억제 및 대한 포자 발아 억제 활성을 가진 신규 균주 및 이러한 균주를 이용하여 농산물 등에서 후자리움 속 진균의 생장 및 포자 발아를 억제하는 방법에 관한 것이다.
곰팡이독소(mycotoxin)는 작물의 생육·저장·유통과정에서 오염된 곰팡이에 의해 생성되는 2차대사산물(secondary metabolites)로서 사람이나 가축에 급성적, 만성적 중독증(mycotoxicoses)을 일으킨다(Marasas, 1984; Desjardins, 2006). 독소생성 곰팡이에 의한 작물병해와 독소오염 농산물·식품의 섭취로 인한 인축의 중독증 피해는 매년 전 세계적으로 꾸준히 발생되기 때문에 WHO, FAO 등과 선진국에서는 곰팡이독소를 농산물·식품 내 위험물질로 간주하여 오염 허용치 설정 등을 통해 발생과 전파를 규제하고 있다.
현재 우리나라 뿐 아니라 전 세계적으로 심각한 문제를 일으키는 곰팡이독소는 아스퍼질러스/페니실리움 속 곰팡이와 후자리움 속 곰팡이가 각각 생성하는 독소들이 대표적이다. 아스퍼질러스/페니실리움 속 곰팡이가 생성하는 곰팡이독소로는 아플라톡신(Aflatoxin), 오크라톡신(Ochratoxin), 패툴린(Patulin) 등이 대표적이며 이들 독소는 주로 고온 다습한 열대 또는 아열대 지방의 곡물에서 발생한다. 반면 후자리움 곰팡이독소는 우리나라와 같은 온대지방에서 생산되는 곡물에서 흔히 발생하기 때문에 국내 농식품 산업 및 국민보건위생의 관점에서 후자리움 곰팡이와 독소 오염의 중요성이 대두되고 있다(Lee et al., 2010; Lee et al,. 2011; Lee et al., 2012). 독소 생성 후자리움 곰팡이에 의한 식물병 피해의 관점에서, 후자리움 속 곰팡이(완전세대: Gibberella 속)는 전 세계적으로 분포하며 벼, 보리, 밀, 옥수수 등 많은 작물의 생육 중에 붉은곰팡이병, 이삭마름병, 이삭·줄기썩음병, 뿌리썩음병 등의 병을 일으켜 작물의 수량감소와 품질의 저하를 가져올 뿐 아니라 곰팡이독소를 생성하여 중독증을 일으킨다. 병 발생 당해 연도의 피해 뿐 만 아니라 환경조건에 따라 여러 해에 걸쳐 병이 되풀이 발생하는 경향 때문에 후자리움 병에 의한 피해의 심각성은 전 세계적으로 더 해지고 있다.
후자리움 곰팡이의 독소는 아스퍼질러스/페니실리움 독소와 달리 작물의 생육 중에 발생하며 주요 후자리움 독소로는 트리코테센(Trichothecene)계와 푸모니신(Fumonisin)계가 주종을 이루고 있다. 트리코테센계 독소는 F. graminearum , F. culmorum , F. poae , F. crookwellense , F. sporotrichioides 등의 후자리움 종에 의해 각종 맥류, 옥수수 등에서 주로 생성되며, 사람과 가축에 피부독성, 소화기관 및 순환기관에서의 출혈, 설사, 구토, 신경장애, 사료섭취 거부 등을 일으킨다(Marasas, 1984; Desjardins, 2006). 우리나라의 경우, 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol)과 니발레놀(Nivalenol) 독소가 대표적인 트리코테센계 곰팡이독소로서 벼, 보리, 옥수수 등에서 검출되고 있으며, 이들 독소는 주로 F. graminearum (완전세대: Gibberella zeae) 종복합체에 속하는 F. asiaticum 또는 F. graminearum 등에 의해 생성된다 (Desjardins, 2006, Lee 등, 2010). 푸모니신계 곰팡이독소는 Gibberella fujikuroi 종복합체에 속하는 F. verticillioides, F. fujikuroi, F. proliferatum, F. nygami 또는 F. oxysporum 등에 의해 주로 옥수수 등에서 생성되며, 말, 노새, 당나귀 등에서 뇌백질 연화증, 돼지에서 폐부종(pulmonary edema) 증후군, 실험동물 흰쥐에서 간암, 간독성 및 신장독성을 일으킨다. 또한 사람에서는 식도암 발생과 깊은 관계가 있는 것으로 추정된다(Marasas, 2001).
상기와 같이 우리나라에서는 독성 후자리움 곰팡이에 의해 벼와 옥수수 등에 병해가 꾸준히 발생할 뿐 아니라 후자리움 곰팡이독소에 오염된 이병식물의 섭취로 인한 인축의 중독증 피해 가능성이 높다.
이러한 피해를 최소화하기 위하여 곡류에 우점하는 후자리움 곰팡이가 생산하는 독소를 저감시키며 친환경적인 기술의 개발이 필요하나 아직까지 미흡한 실정이다.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 독소를 생성하는 유해 진균, 특히 후자리움(Fusarium) 속 진균의 생장 및 포자의 발아를 효과적이고 환경 친화적인 방법으로 억제할 수 있는 신규 균주 및 이러한 균주를 이용해 농산물, 식품 등에서 유해 진균의 생장 및 포자의 발아를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 독소를 생성하는 유해 진균, 특히 후자리움(Fusarium) 속 진균의 생장을 효과적으로 억제하는 신규 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P)을 제공한다.
본 발명자들은 곡류 재배 토양에서 300여 종의 미생물을 분리한 후 배지에서 독성 후자리움 등 진균 9종(후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) PH-1, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H-11, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-4, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-11, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) SCK04, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) R308, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum), 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides) 및 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum))과 대치배양한 결과, 후자리움 속 진균에 길항력을 가지는 균주를 선발하였으며(도 1), 선발된 DH1 균주는 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었다(도 2).
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주는 통상적인 바실러스 속 균주의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB(nutrient broth), TSB(tryptic soy broth) 액체 배지 또는 TSA(tryptic soy agar) 고체배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 37℃에서 약 10-72시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P)균주는 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연 변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P)균주는 상기 후자리움 속 독성 진균 9종에 대해 특이적으로 항진균 활성을 나타낸다.
본 발명은 또한 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주를 포함하는 항진균 활성을 갖는 생균제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주를 포함하는 유해 진균 억제용 조성물을 제공한다.
상기 생균제 또는 조성물에서 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P)은 균주 그 자체에 한정되는 것이 아니라, DH1 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균, 또는 이의 배양물 또는 배양액, 침전물 또는 원심분리 결과물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 독소를 생산하는 후자리움 속에 대한 길항 물질일 수 있다. 또한, 상기 생균제 또는 조성물은 적합한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양액은 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 생균제 또는 조성물은 고체배지 배양물, 또는 상기 배양액의 건조물 또는 추출물 등의 배양물을 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주가 특이적으로 길항 효과를 보이는 유해 진균은 벼, 보리, 밀, 옥수수 등 많은 작물의 생육 중에 붉은곰팡이병, 이삭마름병, 이삭·줄기썩음병, 뿌리썩음병 등의 병을 일으켜 작물의 수량감소와 품질의 저하를 가져오거나 곰팡이독소를 생성하여 중독증을 일으키는 진균을 의미하며, 바람직하게 상기 유해 진균은 후자리움 속 진균일 수 있다.
바람직하게, 상기 후자리움 속 진균은 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) PH-1, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H-11, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-4, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-11, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) SCK04, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) R308, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum), 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides) 및 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주로 처리하는 단계를 포함하는 유해 진균을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유해 진균을 억제하는 방법은 후자리움(Fusarium) 속 진균의 생장 및 포자 발아 억제에 효과적으로 사용될 수 있다. 상기 방법은 배양액 또는 배양물로부터 분리된 후자리움(Fusarium) 속에 대한 길항 물질을 처리하는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P), 이의 배양액 또는 배양물, 또는 이의 배양액 또는 배양물로부터 분리된 길항물질을 포함하는 유해 진균 억제용 조성물은 식품, 사료 첨가제, 또는 세제 첨가제 등으로 이용될 수 있다.
본 발명의 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 또는 이를 포함하는 유해 진균 억제용 조성물은 독소를 생산하는 후자리움(Fusarium) 속 진균에 대한 생장 억제 및 포자 발아 억제 효과가 현저하게 우수하다.
도 1은 후자리움(Fusarium) 속 진균 9종을 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주와 대치 배양할 때 후자리움 속 진균의 생장 저해 효과가 나타난 사진이다.
도 2는 DH1 균주의 16S rRNA 유전자의 최대 절감(maximum parsimony) 계통수(1077bp)를 나타내는 계통도이다.
도 3은 DH1 균주를 NB(nutrient broth) 배지에서 3일간 배양한 후 배양여액만 여과하여, 각각의 후자리움 곰팡이 포자현탁액(104/ml)과 혼합(배양여액 900ul + 포자현탁액 100ul)하고, 혼합액을 25℃에서 배양하여 포자의 발아 여부를 8일째 관찰한 결과이다.
도 4는 DH1 균주를 NB 배지에서 3일간 배양한 후 배양여액만 걸러 옥수수(품종:대학찰)에 후자리움 곰팡이 3종과 혼합 처리한 후 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: Bacillus amyloliquefaciens DH1 균주의 선별
곡류 재배 토양에서 분리한 300여종의 미생물을 후자리움 속 진균 9종(후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) PH-1, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H-11, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-4, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7-11, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) SCK04, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) R308, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum), 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides), 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum))과 25℃에서 5일간 대치 배양하여 항진균 활성을 갖는 균주를 선발하였다. 상기 후자리움 속 진균들은 국립농업과학원에서 보유(자체 분리 또는 오래전 분양)하고 있는 균주를 사용하였다.
실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 후자리움 속 진균에 대한 생장 억제능을 가지는 균주를 선발하였다.
후술하는 16s rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통해 해당 균주가 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)임을 확인하고 이 균주를 DH1으로 명명하였으며, 2015년 8월 13일자로 농업미생물은행(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC92092P를 부여받았다.
실시예 2: 선별된 Bacillus amyloliquefaciens DH1 균주의 동정
선별된 DH1 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 염기서열분석을 하였으며, DH1 균주의 유전적 계통도를 확인하기 위해 EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/)과 Mega 프로그램(ver. 5.2)를 이용하여 16S rRNA 염기서열을 비교 분석하였다.
본 발명의 선별 균주인 DH1 균주의 16S rRNA 염기서열은 도 2에 나타나는 바와 같이 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)와 상당한 상동성을 보여 DH1 균주는 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 종으로 동정되었다.
실시예 3: Bacillus amyloliquefaciens DH1 균주의 후자리움 포자 발아 억제 활성 평가
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 균주가 후자리움(Fusarium) 속 진균의 포자에 대하여 발아 억제 활성이 있는지 여부를 조사하였다. DH1 균주를 영양배지에서 3일간 배양한 후 배양여액만 걸러 후자리움 속 진균 포자 현탁액(104/ml)을 혼합(배양여액 900 ul + 포자현탁액 100 ul)하여 25℃에서 배양하며 포자의 발아 여부를 관찰하였다.
관찰 8일째, 도 3에 나타난 바와 같이, 후자리움 진균 포자만을 배양한 경우에는 포자가 발아되어 균사체가 형성된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 진균 포자와 함께 DH1 균주의 배양여액을 혼합한 경우에는, 후자리움 속 진균 5종(후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) PH-1, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H-11, 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H7, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides)) 모두의 포자 발아가 억제됨을 확인하였다.
실시예 4: 옥수수에서 Bacillus amyloliquefaciens DH1 균주의 후자리움 속에 대한 발병 억제 평가
옥수수에서 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 균주의 생장 억제 활성을 평가하기 위하여, 상기 균주를 NB(nutrient broth) 배지에서 3일간 배양한 후 배양여액만 걸러 후자리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) H-11, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 또는 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides)와 각각 혼합한 후 옥수수(품종:대학찰)에 처리하여, 상기 곰팡이 3종의 생육 억제를 관찰하였다. 곰팡이 3종을 처리하지 않고 배지만(medium only) 처리한 대조군 및 곰팡이 균주만(-DH1) 처리한 비교예를 함께 실험하였다.
도 4에 나타난 결과를 볼 때, 곰팡이 균주만 처리한 비교예(-DH1)는 옥수수 표면에 곰팡이가 현저하게 증식한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 곰팡이 균주와 함께 DH1을 함께 혼합하여 처리한 군(+DH1)에서는 곰팡이의 증식이 억제된 것을 확인하여, 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 균주의 후자리움 속 진균에 대한 항진균 활성을 확인할 수 있었다.
농업미생물은행 KACC92092P 20150813

Claims (6)

  1. 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주.
  2. 제1항의 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 (KACC92092P) 균주를 포함하는,
    후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) SCK04, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) R308, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 독소 생성 후자리움 속 진균 억제용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) DH1 균주를 옥수수에 처리하는 단계를 포함하는,
    후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) SCK04, 후자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum) R308, 후자리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 후자리움 버티실리오이드(Fusarium verticillioides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 독소 생성 후자리움 속 진균을 억제하는 방법.
  6. 삭제
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