KR101769239B1 - A molecular beacon with reverse-hairpin type and method for detecting target materials by using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 역헤어핀 구조의 분자 비컨 및 이를 이용한 표적 분자 탐지 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a molecular beacon having an inverted hairpin structure and a method for detecting a target molecule using the molecular beacon.
핵산, 펩타이드, 단백질 등의 서열을 가지는 물질의 선택적 검지를 위해 분자 비컨을 활용하고 있다. 일반적으로 분자 비컨은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 물질과 신호물질, 신호조절물질로 구성되어 있다. 기존의 분자 비컨은 헤어핀, 선형, Tap-man 프로브 형태를 가지며, 표적과 혼성화 시 더 안정한 구조를 취하거나 절단됨으로써 분자 비컨의 신호물질이 신호조절물질로부터 충분한 물리적 거리를 획득해 신호를 내는 메커니즘을 가진다. 그러나, 표적과의 혼성화로 신호물질과 신호조절물질 사이의 물리적 분리가 유도되기 때문에, 표적이 존재할 때 신호가 발생하도록 설계하기 위해 주로 형광물질과 소광물질을 신호물질과 신호조절물질로 이용한. 이때 민감도와 선택성을 높이기 위해 증광/변광물질을 신호조절물질로 활용하는 데에는 한계를 가진다. 또한, 기존의 분자 비컨은 표적과 혼성화 시 가장 안정한 구조를 이루도록 설계되기 때문에 사용 이후 분자 비컨과 표적을 분리하여 재사용하는 것이 용이하지 않다.Molecular beacons are used for selective detection of a substance having a sequence such as a nucleic acid, a peptide, and a protein. In general, molecular beacons are composed of a substance containing a sequence complementary to a target sequence, a signal substance, and a signal control substance. Conventional molecular beacons have the form of hairpin, linear, Tap-man probes, and have a more stable structure when hybridized with the target, so that the molecular beacon signal material acquires a sufficient physical distance from the signal control material to generate a signal. I have. However, since hybridization with the target induces a physical separation between the signaling material and the signal conditioning material, the use of fluorescent materials and minerals as signaling materials and signal conditioning materials is primarily designed to generate signals when the target is present. At this time, there is a limit to utilize a light modifying substance as a signal modulating substance to increase the sensitivity and selectivity. In addition, since existing molecular beacons are designed to have the most stable structure when hybridizing with target, it is not easy to separate and reuse molecular beacons and targets after use.
분자 비컨과 관련된 선행기술로, 국내 등록특허 제10-117732호(2012)에는 Y형 프로브 및 이것의 변형형, 및 이를 이용한 DNA 마이크로어레이, 키트 및 유전자 분석방법이 개시되어 있고, 국내 등록특허 제10-0346953호(2002)에는 효율적인 핵산 서열화를 위한 조성물 및 방법이 개시되어 있으며, 국내 등록특허 제10-0562355호(2006)에는 호흡기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 및 DNA칩이, 국내 공개특허 제10-1457409호(2014)에는 포티바이러스 속 바이러스를 진단 또는 검출하기 위한 프로브 세트 및 이의 용도가 개시되어 있다.As a prior art related to molecular beacons, Korean Patent No. 10-117732 (2012) discloses a Y-type probe and a modification thereof, and a DNA microarray, a kit and a gene analysis method using the same, 10-0346953 (2002) discloses a composition and a method for efficient nucleic acid sequencing. In Korean Patent No. 10-0562355 (2006), oligonucleotides and DNA chips for respiratory virus detection are disclosed in Korean Patent Laid- 1457409 (2014) discloses a set of probes and their uses for diagnosing or detecting potyviruses.
따라서, 본 발명자들은 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥으로 이루어진 분자 비컨을 설계하고, 표적과 표적 인식 가닥의 혼성화가 이루어질 때 신호 발생 가닥의 신호물질이 신호조절물질에 물리적으로 가까워지도록 신호 발생 가닥의 서열을 설계함으로써 기존 분자 비컨의 단점을 해소하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors designed a molecular beacon composed of a target recognition strand and a signal generating strand, and designed a sequence of signal generating strands so that the signal material of the signal generating strand becomes physically close to the signal control material when the hybridization of the target and the target recognition strand is performed. To solve the disadvantages of existing molecular beacons, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 선택적이고 민감하게 표적 분자를 검출할 수 있고, 표적 검출 후 재사용이 가능한 역헤어핀 구조의 분자 비컨 및 이의 용도를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a molecular beacon having an inverted hairpin structure capable of selectively and sensitively detecting a target molecule and capable of being reused after detection of a target, and its use.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object,
표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 표적 인식 가닥; 및A target recognition strand comprising a region capable of hybridizing with a target molecule; And
상기 표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 일 말단에는 신호물질, 다른 말단에는 신호조절물질이 결합되어 있는 신호 발생 가닥을 포함하며,A signal generating strand comprising a region capable of being hybridized with the target recognition strand, wherein a signal substance at one end and a signal control substance are bonded at the other end,
상기 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥은 혼성화를 통해 이중가닥 역헤어핀 구조(reverse-hairpin type)를 형성하고 있는, 분자 비컨을 제공한다.The target recognition strand and the signal generating strand form a double-stranded reverse-hairpin type through hybridization.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨을 포함하는 표적 분자 탐지용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting a target molecule comprising the molecular beacon.
본 발명은 또한 The present invention also
상기 분자 비컨과 표적 분자를 접촉시켜 상기 분자 비컨의 표적 인식 가닥과 표적 분자를 혼성화시키고, Contacting the molecular beacon with the target molecule to hybridize the target recognition strand of the molecular beacon with the target molecule,
상기 혼성화에 의해 표적 인식 가닥에서 분리된 신호 발생 가닥이 헤어핀 구조 형성에 따른 신호 변화를 감지하거나 형광 강도 변화를 검출하는 것을 포함하는, 표적 분자의 탐지 방법을 제공한다.Wherein the signal generating strand separated from the target recognition strand by the hybridization detects a signal change due to formation of a hairpin structure or detects a change in fluorescence intensity.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨을 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for simultaneous diagnosis or treatment comprising said molecular beacon.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨; 및The present invention also relates to the aforementioned molecular beacon; And
T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.Multiple diagnostic probes comprising one or more diagnostic probes selected from the group consisting of T1 or T2 magnetic resonance imaging probes, optical diagnostic probes, CT diagnostic probes, and radioactive isotopes.
본 발명의 분자 비컨은 표적 분자가 존재하지 않을 때에는 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥이 역헤어핀 구조를 형성하면서 혼성화를 이루고 있고, 표적 분자가 존재할 때에는 표적 분자와 표적 인식 가닥이 혼성화되면서 신호 발생 가닥이 표적 인식 가닥에서 분리되어 스스로 헤어핀 구조를 형성함으로써 신호 발생 가닥에 결합된 신호물질의 형광 소거 효과 및 신호 발생 가닥의 구조 변화에 따른 신호 변화를 검출하여 표적 분자를 탐지할 수 있으며, 상기 헤어핀 구조를 형성한 신호 발생 가닥은 새로운 표적 인식 가닥과 혼성화에 의해 역헤어핀 구조를 형성함으로써 표적 분자 탐지를 위해 재사용이 가능하다.When the target molecule is not present, the target recognition strand and the signal generating strand hybridize with each other while forming an inverted hairpin structure. When the target molecule is present, the target molecule and the target recognition strand are hybridized, It is possible to detect target molecules by detecting the fluorescence cancellation effect of the signal substance bound to the signal generating strand and the signal change due to the structural change of the signal generating strand by forming the hairpin structure by separating from the target recognizing strand, The formed signal generating strand can be reused for target molecule detection by forming a reverse hairpin structure by hybridization with a new target recognition strand.
또한, 본 발명의 분자 비컨은 신호조절물질의 개질이 가능하여 다양한 검출법을 통해 표적 분자를 탐지할 수 있다.In addition, the molecular beacon of the present invention is capable of modifying a signal modulating substance and can detect a target molecule through various detection methods.
도 1은 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨 및 표적 분자 검출 원리를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨과 헤어핀 구조의 신호 발생 가닥의 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨을 이용하여 30분 및 1시간 동안 농도에 따른 SARS 바이러스를 모방한 표적 분자의 검출능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨을 이용하여 (A)는 농도 및 시간(B)에 따른 PEDV 핵산의 검출능을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨을 이용하여 SARS 및 PEDV RNA 농도에 따른 핵산 검출능을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 역헤어핀 구조의 분자 비컨과 표적 분자의 혼성화 후 표적 인식 가닥에서 분리된 신호 발생 가닥에 표적 인식 가닥을 새롭게 부가한 후 역헤어핀 구조의 형성 여부를 확인한 결과이다.FIG. 1 shows the principle of molecular beacon and target molecule detection in the inverted hairpin structure according to the present invention.
FIG. 2 shows fluorescence changes of signal generating strands of the molecular beacon and hairpin structure of the inverted hairpin structure according to the present invention.
FIG. 3 shows the detection ability of a target molecule mimicking SARS virus according to concentration for 30 minutes and 1 hour using a molecular beacon having a inverted hairpin structure according to the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the detection ability of PEDV nucleic acid according to concentration and time (B) using molecular beacons of the inverted hairpin structure according to the present invention.
FIG. 5 shows nucleic acid detection ability according to SARS and PEDV RNA concentration using a molecular beacon having the inverted hairpin structure according to the present invention.
FIG. 6 is a result of confirming whether or not an inverted hairpin structure is formed after a target recognition strand is newly added to a signal generation strand separated from a target recognition strand after hybridization of a molecular beacon and a target molecule according to the present invention.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
본 발명은The present invention
표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 표적 인식 가닥; 및A target recognition strand comprising a region capable of hybridizing with a target molecule; And
상기 표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 일 말단에는 신호물질, 다른 말단에는 신호조절물질이 결합되어 있는 신호 발생 가닥을 포함하며,A signal generating strand comprising a region capable of being hybridized with the target recognition strand, wherein a signal substance at one end and a signal control substance are bonded at the other end,
상기 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥은 혼성화를 통해 이중가닥 역헤어핀 구조(reverse-hairpin type)를 형성하고 있는, 분자 비컨에 관한 것이다.Wherein said target recognition strand and signal generating strand form a double-stranded reverse-hairpin type through hybridization.
본 발명의 분자 비컨은 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥이 혼성화되어 이중가닥 역헤어핀 구조를 형성하는 일명 형광 선형 분자 비컨인 것을 특징으로 한다. The molecular beacon of the present invention is characterized by being a fluorescent linear beacon which hybridizes with a target recognition strand and a signal generating strand to form a double stranded hairpin structure.
상기 분자 비컨은 표적 분자가 존재하지 않을 때에는 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥이 역헤어핀 구조를 형성하면서 혼성화를 이루고 있고, 표적 분자가 존재할 때에는 표적 분자와 표적 인식 가닥이 혼성화되면서 신호 발생 가닥이 표적 인식 가닥에서 분리되어 스스로 헤어핀 구조를 형성함으로써 신호 발생 가닥에 결합된 신호물질의 형광 소거 효과 및 신호 발생 가닥의 구조 변화에 따른 신호 변화를 검출하여 표적 분자를 탐지할 수 있는 것을 특징으로 한다.When the target molecule is absent, the target recognition strand and the signal generation strand are hybridized while forming an inverted hairpin structure. When the target molecule is present, the target molecule and the target recognition strand are hybridized, A hairpin structure is formed by separating from the strand to detect a target molecule by detecting a fluorescence erasing effect of a signal substance bound to the signal generating strand and a signal change due to a change in the structure of the signal generating strand.
또한, 상기 헤어핀 구조를 형성한 신호 발생 가닥은 새로운 표적 인식 가닥과 혼성화에 의해 역헤어핀 구조를 형성함으로써 표적 분자 탐지를 위해 재사용이 가능하다.In addition, the signal generating strand formed with the hairpin structure can be reused for target molecule detection by forming an inverted hairpin structure by hybridization with a new target recognition strand.
또한, 상기 분자 비컨은 신호조절물질의 개질이 가능하여 다양한 검출법을 통해 표적 분자를 탐지할 수 있다.In addition, the molecular beacon is capable of modifying a signal modulating substance and can detect a target molecule through various detection methods.
상기 표적 인식 가닥은 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」을 포함한다. 상기 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 표적 분자의 일부분과 상보적인 서열을 가져 표적 분자와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 예컨대, 상기 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 표적 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 표적 분자가 단백질인 경우, 상기 표적 인식 가닥은 앱타머일 수 있고, 상기 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 앱타머 내 단백질과 혼성화될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 표적 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있고, 특정 길이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 표적 분자가 miRNA인 경우, 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 22개 내외의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있으나, 표적 분자가 mRNA나 단백질인 경우, 「표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 그보다 짧거나 더 길 수 있다.The target recognition strand includes a " region capable of hybridizing with a target molecule ". The " region capable of hybridizing with the target molecule " means a sequence having a sequence complementary to a part of the target molecule and capable of hybridizing with the target molecule. For example, the " region capable of hybridizing with the target molecule " may have a sequence complementary to at least 90%, preferably 95% or more, of a portion of the target molecule. If the target molecule is a protein, the target recognition strand may be an aptamer, and the " region capable of hybridization with a target molecule " means a region capable of hybridizing with a protein in an aptamer. The " region capable of hybridizing with the target molecule " can appropriately adjust its length according to the target molecule, and is not limited to a specific length. For example, when the target molecule is miRNA, the " region capable of hybridizing with the target molecule " may be composed of about 22 or more nucleotides, but when the target molecule is mRNA or protein, Region " may be shorter or longer.
이러한 표적 분자로는 microRNA, mRNA, RNA, DNA, 펩타이드 또는 단백질을 예로 들 수 있다.Such target molecules include microRNA, mRNA, RNA, DNA, peptides or proteins.
상기 신호 발생 가닥은 상기 표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 일 말단에는 신호물질, 다른 말단에는 신호조절물질이 결합되어 있다. 더 구체적으로, 표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 스템 및 루프 서열로 이루어진 올리고머이고, 분자 비컨이 표적 분자와 혼성화될 때 신호 발생 가닥은 표적 인식 가닥에서 분리되어 헤어핀 구조로 자기-조립되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 신호 발생 가닥은 역헤어핀 구조에서는 형광을 나타내나 헤어핀 구조를 형성하는 경우에는 신호조절물질에 의해 형광 소거 변화를 겪게 된다. 따라서, 신호 발생 가닥의 구조 변화 및 형광 소거 변화는 표적 분자 탐지를 가능케 한다.The signal generating strand includes a region capable of hybridizing with the target recognition strand, and a signal substance is bonded to one end and a signal control substance is coupled to the other end. More specifically, it is an oligomer consisting of a stem and a loop sequence capable of forming a hairpin structure including an area capable of hybridizing with a target recognition strand. When the molecular beacon hybridizes with the target molecule, the signal generating strand is separated from the target recognition strand Assembled into a hairpin structure. Therefore, the signal generating strand exhibits fluorescence in the inverted hairpin structure, whereas in the case of forming the hairpin structure, the signal generating material undergoes fluorescence erasure change. Thus, structural changes and fluorescence clearing changes of signal generating strands enable target molecule detection.
아울러, 상기 신호 발생 가닥은 표적 인식 가닥과 혼성화를 이룰 수 있으므로 서열 내에 「표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역」을 포함하며, 상기 「표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역」은 스템 및/또는 루프에 해당하는 서열 내에 존재할 수 있다. In addition, the signal generating strand may hybridize to a target recognition strand, and therefore includes a region that can be hybridized with a target recognition strand within the sequence, and the region capable of hybridization with the target recognition strand may be a stem and / May be present in the sequence corresponding to the loop.
본 발명의 분자 비컨은 상기 표적 인식 가닥과 표적 분자의 혼성화가 상기 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥의 혼성화에 비해 보다 잘 이루어지도록 설계할 수 있다. 표적 인식 가닥과 표적 분자의 혼성화가 잘 이루어져야만 신호 발생 가닥이 표적 인식 가닥으로부터 쉽게 분리될 수 있기 때문이다. 따라서, 신호 발생 가닥 내 상기 「표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역」은 표적 인식 가닥에 포함되어 있는 표적 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산 서열 길이의 20% 내지 25%일 수 있다.The molecular beacon of the present invention can be designed so that the hybridization of the target recognition strand and the target molecule is better performed than the hybridization of the target recognition strand and the signal generating strand. This is because the signal generating strand can be easily separated from the target recognition strand only if the hybridization of the target recognition strand and the target molecule is well performed. Thus, the " region capable of hybridization with the target recognition strand " in the signal generation strand may be 20% to 25% of the nucleic acid sequence length of the region capable of hybridizing with the target molecule contained in the target recognition strand.
또한, 표적 분자가 존재하지 안을 시 표적 인식 가닥과 혼성화되어 있는 신호 발생 가닥이 스스로 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥 간의 혼성화는 적어도 40℃에서는 안정화되도록 설계할 수 있다.In addition, hybridization between the target recognition strand and the signal generation strand can be designed to be stabilized at least at 40 ° C to prevent the signal generating strand hybridized with the target recognition strand from falling off by itself when the target molecule is not present.
또한, 신호 발생 가닥은 표적 인식 가닥에서 분리되어 나오면서 스템 및 루프 서열로 인해 헤어핀 구조를 형성하면서 안정성을 유지할 수 있도록 용융온도(melting temperature)와 깁스 자유에너지를 이론적으로 계산하여 스템 및 루프 염기서열을 설계할 수 있다. 더 구체적으로 스템의 염기 개수를 조절하여 구현할 수 있다. 보다 구체적으로, 스템 서열은 9 내지 11개의 염기 개수를 가질 수 있다.The signal generation strand is separated from the target recognition strand, and the melting temperature and the Gibbs free energy are theoretically calculated so as to maintain the stability while forming the hair pin structure due to the stem and the loop sequence, Can be designed. More specifically, the number of bases of the stem can be adjusted. More specifically, the stem sequence may have 9 to 11 base numbers.
가장 구체적으로, 신호 발생 가닥은 SEQ ID NO: 1 내지 6에 기재된 염기서열 중 어느 하나로 표현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Most specifically, the signal generating strand may be represented by any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to 6, but is not limited thereto.
상기 신호 발생 가닥에 결합되는 신호물질은 형광물질일 수 있다.The signal material that is coupled to the signal generating strand may be a fluorescent material.
상기 형광물질은 특별히 제한되지는 않으나, Dylight 488 NHE-ester dye, VybrantTM DiI, VybrantTM DiO, 양자점(quantum dots) 나노입자, 플루오로세인, 로다민, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-소티토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘트, 크리딘 오렌지 9-이(소티(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드 사디아졸, 스틸벤, 파이렌, 이벤도체, 형광 물질을 포함한 실리카, Ⅱ/Ⅳ족 반도체 양자점, Ⅲ/Ⅴ족 반도체 양자점, Ⅳ족 반도체 양자점, 또는 이다성분 혼성 구조체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 형광물질은 양자점(quantum dots) 나노입자, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG(indocyanine green), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, Rhodamine800, 란탄나이드 계열 및 Texas Red로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 상기 양자점(quantum dots) 나노입자인 경우에는 Ⅱ-Ⅵ 또는 Ⅲ-Ⅴ족 화합을 사용할 수 있다. 이 경우 상기 양자점 나노입자는 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe,PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.Examples of the fluorescent material include, but are not limited to, Dylight 488 NHE-ester dye, Vybrant TM DiI, Vybrant TM DiO, quantum dots nanoparticles, fluorocaine, rhodamine, Lucifer yellow, B- L, 4'-isothio-cyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid, 7-diethylamino-3- (4'-iso 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid derivatives, LC ™ -Red 640 , LC ™ -Red 705, Cy5, Cy5.5, lysamine, isothiocyanate, erythrosine isothiocyanate, diethylene triamine pentaacetate, 1-dimethylaminonaphthyl- Naphthalene sulfonate, 3-phenyl-7-isocyanatocoumarin, 9-isothiocyanatoacrylate, 3-phenyl- Silica, II / IV semiconductor quantum dots, III / IV quadrivalent quinone dyes, quinacridone orange 9- (soti (2-benzoxazoyl) phenyl) melemide sidiazole, stilbene, pyrene, V group semiconductor quantum dots, a Group IV semiconductor quantum dots, or a dopa component hybrid structure. Preferably, the fluorescent material includes quantum dots nanoparticles, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG indocyanine green), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, Rhodamine800, lanthanide series and Texas Red. In the case of the quantum dots nanoparticles, II-VI or III-V compounding may be used. In this case, the quantum dot nanoparticles may be selected from the group consisting of CdSe, CdSe / ZnS, CdTe / CdS, CdTe / CdTe, ZnSe / ZnS, ZnTe / ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP / ZnS and HgTe More than one can be used.
또한, 신호 발생 가닥에 결합되는 신호조절물질은 증광물질, 변광물질 또는 소광물질 중에서 선택될 수 있다.In addition, the signal conditioning material that is coupled to the signal generating strand may be selected from a photoluminescent material, a variable material, or a minerals material.
상기 변광물질은 7-methoxycoumarin, Amino methyl coumarin, blue florescent protein, carboxyfluorescein succinimidyl ester, DAPCYL, Cy3, Cy5, Cy5.5 FITC, fluorescein, Rhodamine 6G, ROX, 또는 AEDANS 등일 수 있다.The mutant may be 7-methoxycoumarin, Amino methyl coumarin, blue florescent protein, carboxyfluorescein succinimidyl ester, DAPCYL, Cy3, Cy5, Cy5.5 FITC, fluorescein, Rhodamine 6G, ROX or AEDANS.
변광물질의 경우, 신호물질의 에너지방출 파장과 에너지여기 파장이 같은 형광물질을 이용하면 신호발생가닥의 구조에 따라 서로 다른 파장대의 형광이 방출되는 변광이 일어나게 된다. 즉, 신호발생가닥과 표적인식가닥이 결합이 되어 있는 상태에서는 신호물질의 형광이 방출되지만, 표적인식가닥이 표적분자와 결합을 하고 신호발생 가닥이 헤어핀 형태를 띠게 될 때에는 신호물질의 형광이 아닌 신호조절물질의 형광이 방출이 되고 이 변광된 신호를 검출하여 반응의 정도를 알 수 있다.In the case of a variable material, when a fluorescent material having the same energy-emitting wavelength and energy-exciting wavelength as the signal material is used, a variation occurs in which fluorescence of different wavelengths is emitted depending on the structure of the signal generating strand. That is, when the signal generating strand and the target recognizing strand are combined, the fluorescence of the signal substance is released. However, when the target recognizing strand binds to the target molecule and the signal generating strand becomes a hairpin, Fluorescence of the signal modulating substance is released and the signal can be detected to determine the extent of the reaction.
상기 소광물질은 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등의 BHQ(Biosearch Technologies, Inc(제)) 또는 Eclipse(Amersham Bioscience(제)) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The minerals are BHQ (Biosearch Technologies, Inc.) such as 4- (dimethylamino) azobenzene-4-carboxylic acid (DABCYL), 4- (dimethylamino) azobenzenesulfonic acid (DABSYL), BHQ-1, BHQ- Inc.) Or Eclipse (Amersham Bioscience), but are not limited thereto.
본 발명의 분자 비컨은 표적지향성을 제공하기 위해 조직 특이적 결합성분이 도입될 수 있다. 상기 조직 특이적 결합성분은 분자 비컨이 원하는 표적 분자가 존재하는 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있도록 유도해 주는 역할을 할 수 있다. 상기 조직 특이적 결합성분은 특별히 제한하지는 않으나, 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분, 또는 종양 마커 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 조직 특이적 결합성분 및 이를 분자 비컨에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.Molecular beacons of the present invention can be introduced with tissue specific binding components to provide target orientation. The tissue-specific binding component may serve to induce a molecular beacon to be introduced into a tissue or cell in which a desired target molecule exists. The tissue specific binding component may be selected from the group consisting of antigen, antibody, RNA, DNA, hapten, avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, lectin, selectin, radioactive isotope labeling components, or tumor markers may be used alone or in combination. The tissue-specific binding component of the invention and methods for introducing it into molecular beacons are well known in the art.
또한, 추가로 세포 내 전달 리간드가 분자 비컨에 결합되어 있을 수 있다. 상기 세포 내 전달 리간드는 분자 비컨이 세포막 또는 추가적인 세포 내 기관 막을 쉽게 통과할 수 있도록 도와주는 물질을 말한다. 예컨대, 상기 「세포 내 전달 리간드」의 구체적인 종류로는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain), 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide), 앱타머(aptamer), 양친매성 고분자(amphiphilic polymer) 및 생체적합성 공중합체(biocompatible copolymer)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 상기 세포 내 전달 리간드 및 이를 분자 비컨에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In addition, an intracellular delivery ligand may be attached to the molecular beacon. The intracellular delivery ligand refers to a substance that facilitates the passage of a molecular beacon through a cell membrane or an additional intracellular organ membrane. For example, specific examples of the " intracellular delivery ligand " include a protein transduction domain, a transmembrane domain, a cell penetrating peptide, an aptamer, an amphipathic polymer amphiphilic polymers, and biocompatible copolymers. Such intracellular delivery ligands of the invention and methods for introducing them into molecular beacons are well known in the art.
또한, 본 발명의 분자 비컨은 약제학적 활성성분이 추가로 도입되어 질환 치료에 사용할 수 있다.Further, the molecular beacon of the present invention can be used for treating diseases by further introducing a pharmaceutically active ingredient.
상기 약제학적 활성성분은 특별히 제한하지는 않으나, siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 또는 신경계 약물 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.The pharmaceutically active ingredient may be selected from the group consisting of siRNA, antisense, anticancer, antibiotic, hormone, hormone antagonist, interleukin, interferon, growth factor, tumor necrosis factor, endotoxin, lymphotoxin, urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator , A protease inhibitor, an alkylphosphocholine, a radioactive isotope labeled component, a cardiovascular drug, a gastrointestinal drug, or a nervous system drug may be used alone or in combination of two or more.
상기 항암제로는 이에 특별히 제한하는 것은 아니나, 예를 들어, 에피루비신(Epirubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 젬시타빈(Gemcitabine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 택솔(taxol), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen) 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin), 또는 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 사용할 수 있다.Examples of the anticancer agent include, but are not limited to, Epirubicin, Docetaxel, Gemcitabine, Paclitaxel, cisplatin, carboplatin, But are not limited to, taxol, procarbazine, cyclophosphamide, dactinomycin, daunorubicin, etoposide, tamoxifen doxorubicin, doxorubicin, ), Mitomycin, bleomycin, plicomycin, transplatinum, vinblastin, or methotrexate can be used.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨을 포함하는 표적 분자 탐지용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for detecting a target molecule containing the molecular beacon.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨과 표적 분자를 접촉시켜 상기 분자 비컨의 표적 인식 가닥과 표적 분자를 혼성화시키고,The present invention also relates to a method of hybridizing a target beacon with a target molecule by contacting the molecular beacon with a target molecule,
상기 혼성화에 의해 표적 인식 가닥에서 분리된 신호 발생 가닥이 헤어핀 구조 형성에 따른 신호 변화를 감지하거나 형광 강도 변화를 검출하는 것을 포함하는, 표적 분자의 탐지 방법을 제공한다.Wherein the signal generating strand separated from the target recognition strand by the hybridization detects a signal change due to formation of a hairpin structure or detects a change in fluorescence intensity.
상술한 바와 같이, 본 발명의 분자 비컨은 인 비보 또는 인 비트로에서 세포 내 표적 분자를 탐지하는데 사용될 수 있다.As described above, the molecular beacons of the present invention can be used to detect intracellular target molecules in in vivo or in vitro.
본 발명의 분자 비컨에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다. In order to detect the signal emitted by the molecular beacon of the present invention, it is preferable to use a magnetic resonance imaging apparatus (MRI) and optical imaging.
상기 자기 공명 영상 장치의 종류는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The type of the magnetic resonance imaging apparatus is not particularly limited and may be, for example, a T2 spin-spin relaxation magnetic resonance imaging apparatus, but is not limited thereto.
상기 광학 이미징을 위해서는 공초점현미경, 형광현미경 또는 생체용광학장비 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For the optical imaging, a confocal microscope, a fluorescence microscope, a living optical device, or the like can be used, but the present invention is not limited thereto.
본 발명에 따른 표적 분자 탐지용 조성물은, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적 분자 탐지용 조성물은, 예를 들면, 구체적으로 이온 교환수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민 등), 완충 물질(예를 들어, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물 등), 물, 염 또는 전해질(예를 들어, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염 등), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The composition for detecting target molecules according to the present invention may comprise a carrier and a vehicle commonly used in the medical field. The target molecule detection composition of the present invention can be specifically exemplified by ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (for example, human serum albumin, etc.), buffer substances (for example, various phosphates , Water, salts or electrolytes (such as protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts, etc.), glycerin But are not limited to, colloidal silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrates, polyethylene glycol, sodium carboxymethylcellulose, polyarylate, wax, polyethylene glycol or wool.
본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. The composition of the present invention may further include, in addition to the above components, a lubricant, a wetting agent, an emulsifying agent, a suspending agent, or a preservative.
본 발명에 따른 표적 분자 탐지용 조성물은, 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충용액 등을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.The composition for detecting a target molecule according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution or physically buffered saline solution Etc. may be used. Water-soluble injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
본 발명의 표적 분자 탐지용 조성물의 다른 바람직한 양태는, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들어, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 이 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액 등이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것이라도 사용할 수 있다.Another preferred embodiment of the composition for detecting target molecules of the present invention may be in the form of a sterile injectable preparation of a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension. In the present invention, the suspension may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (e. G., Tween 80) and suspending agents. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent (for example, a solution in 1,3-butanediol). Vehicles and solvents that may be used in the present invention include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally used as a solvent or suspending medium. For this purpose, any non-volatile oil including synthetic mono or diglycerides and less irritant may be used.
본 발명은 또한 상기 분자 비컨을 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for simultaneous diagnosis or treatment comprising said molecular beacon.
본 발명의 분자 비컨이 질환 유발물질인 표적 분자와 혼성화되는 경우 표적 분자의 탐지를 위해 이용될 뿐만 아니라, 질환 유발물질인 표적 분자의 활성을 억제함으로써 해당 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.When the molecular beacon of the present invention is hybridized with a target molecule which is a disease-causing substance, it can be used not only for the detection of a target molecule but also for the treatment of the disease by inhibiting the activity of a target molecule as a disease-causing substance.
이러한 질환의 예로 위암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 유방암 및 난소암 등의 각종 암 질환; 파킨슨병, 알츠하이머병 등의 신경 질환; 심혈관 질환; 당뇨병 등의 대사 질환; 또는 바이러스 질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.Examples of such diseases include gastric cancer, blood cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer and ovarian cancer; Parkinson's disease, neurological diseases such as Alzheimer's disease; Cardiovascular disease; Metabolic diseases such as diabetes; Or viral disease, but are not limited thereto.
또한, 본 발명의 분자 비컨이 약제학적 활성성분의 추가적인 도입을 통해 표적 분자를 인식한 후 약제학적 활성성분을 이용하여 해당 질환을 치료함으로써 진단과 치료를 동시에 구현할 수 있다.In addition, the molecular beacon of the present invention recognizes a target molecule through the additional introduction of a pharmaceutically active ingredient, and then treats the disease by using a pharmaceutically active ingredient, so that diagnosis and treatment can be simultaneously realized.
또한, 본 발명은 상기 분자 비컨; 및The present invention also relates to the aforementioned molecular beacon; And
T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.Multiple diagnostic probes comprising one or more diagnostic probes selected from the group consisting of T1 or T2 magnetic resonance imaging probes, optical diagnostic probes, CT diagnostic probes, and radioactive isotopes.
본 발명의 분자 비컨에 다른 진단 프로브를 도입할 경우 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예컨대, 분자 비컨에 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면, T1 자기공명영상 또는 T2 자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 형광물질 외에도 추가의 광학 진단 프로브를 결합시키면, 자기공명 영상과 형광물질에 의한 광학 이미징 이외에도 다른 방식의 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상, PET 및 SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.When introducing another diagnostic probe into the molecular beacon of the present invention, it can be used as multiple diagnostic probes. For example, by attaching a T1 or T2 magnetic resonance imaging probe to a molecular beacon, T1 magnetic resonance imaging or T2 magnetic resonance imaging can be carried out at the same time. In addition to the fluorescent substance, an additional optical diagnostic probe can be combined with magnetic resonance imaging In addition to optical imaging by material, other types of optical imaging can be performed at the same time. Combining a CT diagnostic probe can simultaneously perform magnetic resonance imaging and CT diagnosis. Also, when combined with radioisotope, magnetic resonance imaging, PET and SPECT diagnosis can be performed at the same time.
이러한 진단 프로브는 작용기나 소수성/친수성 특징에 따라 분자 비컨에 결합되어 사용될 수 있다. Such diagnostic probes can be used in combination with molecular beacons depending on their functionalities and hydrophobic / hydrophilic characteristics.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.The T1 magnetic resonance imaging probe includes a Gd compound or a Mn compound and the optical diagnostic probe includes an organic fluorescent dye, a quantum dot, or a dye-labeled inorganic support such as SiO 2 , Al 2 O 3 )), and CT diagnostic probes include I (iodine) compounds or gold nanoparticles, and the radioisotopes include In, Tc, or F and the like.
예컨대, 본 발명의 분자 비컨의 신호조절물질 쪽 말단을 개질하여 금 나노물질/금 기판에 결합시켜 SERS 신호를 이용한 표적 분자 탐지에 응용할 수 있다.For example, the signal modulating end of the molecular beacon of the present invention may be modified to bind to a gold nanomaterial / gold substrate and used for target molecule detection using a SERS signal.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 분자 비컨의 제작≪ Example 1 > Production of molecular beacon
신호 발생 가닥과 표적 인식 가닥을 열순환기에 넣고 95℃에서 4분, 70℃에서 5℃씩 온도를 떨어뜨리며 각 10분씩 반응시킨다. 결과적으로, 두 가닥이 혼성화 되어 역헤어핀비컨 한 세트가 제조될 수 있다.The signal generation strand and the target recognition strand are placed in a thermocycler and reacted at 95 ° C for 4 minutes and 70 ° C at 5 ° C for 10 minutes each. As a result, the two strands can be hybridized to produce a set of inverse hairpin beacons.
표적 분자가 존재하지 않을 때에는 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥이 부분 혼성화를 이루고 표적이 존재할 때 표적 인식 가닥과 표적 분자가 혼성화를 이루면 신호 발생 가닥이 스스로 접히도록, 깁스 자유 에너지를 고려하여 서열을 설계하였다.When the target molecule is not present, the target recognition strand and the signal generating strand are partially hybridized. When the target recognition strand and the target molecule hybridize, when the target molecule is hybridized, the signal generating strand is folded by itself. Respectively.
이를 위해, 신호 발생 가닥과 표적 인식 가닥이 분리되었을 때 헤어핀 구조의 분자 비컨이 안정성을 유지할 수 있도록 용융온도(melting temperature)와 깁스 자유에너지를 이론적으로 계산하여 염기 서열을 설계하였다. 비컨의 스템 개수를 조절하여 최적화 실험 진행하였다. 이때 반응 조건은 NaCl 12 mM, MgCl2 0.8 mM, Tris 10 mM인 용액조건을 기준으로 하여 용융온도와 깁스 자유 에너지를 측정하였다.For this purpose, the melting temperature and Gibbs free energy were calculated theoretically to design the nucleotide sequence so that the molecular beacon of the hairpin structure could be stable when the signal generating strand and the target recognition strand were separated. Optimization experiments were conducted by adjusting the number of beacons. The reaction conditions were NaCl 12 mM, MgCl 2 0.8 mM and 10 mM Tris, respectively, and the melting temperature and the Gibbs free energy were measured.
표적 분자로, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)과 PEDV의 일부 염기서열을 사용하였고, 신호 발생 가닥은 상기 SARS의 일부 염기서열을 포함하며, 신호물질로, CY3을, 신호조절물질로 BHQ-2를 선택하여 신호 발생 가닥의 양 말단에 도입하였다(표 1). 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)의 일부 염기 서열은 NCBI Reference sequence NC_004718.3을 참고하였고 그 중 염기번호 18153부터 18176까지의 염기서열을 이용하였다. PEDV의 일부 염기 서열은 GenBank KR873437.1을 참고 하였고 그 중 염기번호 6054부터 6074의 염기 서열을 이용하였다. As a target molecule, Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) and some base sequences of PEDV were used. The signal generation strand contained a part of the base sequence of SARS, CY3 as a signal substance, BHQ-2 as a signal regulator And introduced at both ends of the signal generating strand (Table 1). Some of the sequences of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) were referenced to NCBI Reference sequence NC_004718.3, and the nucleotide sequences from nucleotide numbers 18153 to 18176 were used. Some base sequences of PEDV were referenced to GenBank KR873437.1, and base sequences of base numbers 6054 to 6074 were used.
도 2는 표 2의 SARS 표적 인식 가닥과 SARS 신호 발생 가닥으로 이루어진 역 헤어핀 구조를 사용한 결과로, 헤어핀 구조에서는 신호물질과 소광물질이 잘 결합되어 형광 신호가 미약하고 역헤어핀 구조에서는 구조가 변형이 되어 신호물질과 소광물질의 거리가 짧아져 형광 신호가 강하게 나오는 것을 확인할 수 있었다. 즉 구조가 유연하게 잘 변형이 되는 것을 알 수 있었다.FIG. 2 shows the result of using the inverted hairpin structure composed of the SARS target recognition strand and the SARS signal generating strand shown in Table 2. In the hairpin structure, the signal material and the minerals are well combined and the fluorescence signal is weak. And the distance between the signal material and the minerals was shortened, so that it was confirmed that the fluorescence signal was strong. That is, the structure is flexible and well deformed.
<실시예 2> 역헤어핀 분자 비컨을 이용한 SARS 탐지Example 2 SARS Detection Using Inverse Hairpin Molecular Beacons
SARS 바이러스를 모방한 표적 분자와 역헤어핀 분자 비컨을 30분 및 1시간 동안 반응시킨 후 표적 분자의 농도에 따른 검출 능력을 확인하였다.The target molecule mimicking the SARS virus was reacted with the inverted hairpin molecular beacon for 30 minutes and 1 hour, and the detection ability was confirmed according to the concentration of the target molecule.
이 실험에 사용한 분자 비컨으로는 표 2에 기재된 것과 같은 SARS 신호 발생 가닥과, SARS 표적 인식 가닥이 혼성결합된 역헤어핀비컨 50 nM을 이용하였다. 역헤어핀 비컨이 담지된 튜브에 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 nM의 SARS 표적 분자 가닥을 넣어주고 그 후 30분 경과했을 때의 형광신호 변화와 1시간이 경과 했을 때의 형광 신호 변화를 측정하였다. 반응물의 총 부피는 100 ㎕이고 반응은 37℃가 유지되는 인큐베이터 안에서 진행되었다. As the molecular beacons used in this experiment, 50 nM of inverse hairpin beacon hybridized with SARS signal recognition strand and SARS target recognition strand as shown in Table 2 was used. The SARS target molecule strands of 0, 10, 20, 40, 60, 80, and 100 nM were added to the tube containing the inverse hairpin beacon, and the fluorescence signal change after 30 minutes and the fluorescence Signal changes were measured. The total volume of the reaction was 100 [mu] l and the reaction proceeded in an incubator maintained at 37 [deg.] C.
도 3에 나타난 바와 같이, 30분과 1시간 차이에 따른 형광 변화는 차이가 거의 나지 않음을 확인하여 30분이라는 시간 안에 표적분자를 측정할 수 있는 능력을 확인하였다. 또한, 농도에 따른 형광 신호 변화가 확연히 차이가 나는 것으로 보아 역헤어핀분자비컨을 이용하여 정량분석의 가능성을 확인하였다.As shown in FIG. 3, fluorescence changes of 30 minutes and 1 hour were confirmed to have almost no difference, and the ability to measure the target molecule within 30 minutes was confirmed. In addition, the fluorescence signal changes according to the concentration are significantly different, and the possibility of quantitative analysis using the inverted hairpin molecular beacon was confirmed.
<실시예 3> 역헤어핀 분자 비컨을 이용한 PEDV 탐지 실험Example 3 PEDV Detection Experiment Using Inverse Hairpin Molecular Beacon
타겟 분자로 PEDV 바이러스의 핵산을 용출시킨 뒤 PEDV 상보적 서열로 설계된 역헤어핀 비컨을 이용하여 표적 분자의 농도와 반응 시간에 따른 검출 능력을 확인하였다.After the nucleic acid of the PEDV virus was eluted with the target molecule, the detection ability of the target molecule according to the concentration of the target molecule and the reaction time was confirmed using the inverse hairpin beacon designed with the PEDV complementary sequence.
이 실험은 실제 PEDV 바이러스가 담지 되어 있던 용액을 0.5 M Tris [pH 8.0], 0.1 M NaCl, 2% SDS, 0.1M EDTA, 8 mg skim milk/g sediment로 이루어진 용해액에 반응시켜 바이러스를 용해시켜 그 안에 담지된 RNA를 검출하는 실험이다. 이 실험에 사용한 분자 비컨으로는 표 2에 기재된 것과 같은 PEDV 신호 발생 가닥과, PEDV 표적 인식 가닥이 혼성결합된 역헤어핀비컨 50 nM을 이용하였다. 바이러스 용해액을 원액, 2배, 4배, 8배 희석시킨 용액 50 ㎕를 사용하고, 총 반응물의 부피를 100 ㎕로 맞춰준 뒤 37℃ 인큐베이터에 넣어주어 반응을 진행시켰다. 반응시간도 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 4, 6시간으로 하여 형광 신호 변화를 측정하였다.This experiment was performed by dissolving the virus in which the actual PEDV virus-bearing solution was reacted with a solution consisting of 0.5 M Tris [pH 8.0], 0.1 M NaCl, 2% SDS, 0.1 M EDTA and 8 mg skim milk / It is an experiment to detect the RNA carried in it. As the molecular beacons used in this experiment, 50 nM of inverted hairpin beacon hybridized with a PEDV signal recognition strand and a PEDV target recognition strand as shown in Table 2 was used. The volume of the reaction solution was adjusted to 100 ㎕ by using 50 ㎕ of a solution obtained by diluting the virus solution with the stock solution, 2 times, 4 times, and 8 times, and the reaction was allowed to proceed at 37 째 C in an incubator. Fluorescence signal changes were measured at reaction times of 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 4, and 6 hours.
도 4에 나타난 바와 같이, 30분과 1시간, 6시간의 형광 변화 차이가 거의 나지 않음을 확인하여 30분이라는 시간 안에 실제 바이러스 안에 담지 되어있는 표적분자를 측정할 수 있는 능력을 확인하였다. 또한, 농도에 따른 형광 신호 변화가 확연히 차이가 나는 것으로 보아 역헤어핀분자비컨을 이용하여 실제 정량분석의 가능성을 확인하였다.As shown in FIG. 4, it was confirmed that there was almost no difference in fluorescence change between 30 minutes, 1 hour, and 6 hours, and the ability to measure the target molecule carried in the actual virus within 30 minutes was confirmed. In addition, the fluorescence signal changes according to the concentration are significantly different, and the possibility of the actual quantitative analysis using the inverted hairpin molecular beacon was confirmed.
<실시예 4> 역헤어핀 분자 비컨을 이용한 PEDV 선택적 탐지 실험<Example 4> Selective detection of PEDV using reverse hairpin molecular beacon
역헤어핀 비컨이 표적 분자를 선택적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해 대조군으로 SARS 분자 비컨을 사용하고, 표적 분자로 PEDV를 사용하였다.A SARS molecular beacon was used as a control and PEDV was used as a target molecule to confirm whether the inverse hairpin beacon can selectively detect the target molecule.
이 실험은 실제 PEDV 바이러스가 담지 되어 있던 용액을 0.5 M Tris [pH 8.0], 0.1 M NaCl, 2% SDS, 0.1M EDTA, 8 mg skim milk/g sediment 로 이루어진 용해액에 반응시켜 바이러스를 용해시켜 그 안에 담지된 RNA를 검출하는 실험이다. 이 실험에 사용한 분자 비컨으로는 표 2의 2가지의 역헤어핀비컨이 사용되었으며 PEDV 신호 발생 가닥과, PEDV 표적 인식 가닥이 혼성결합된 역헤어핀비컨, SARS 신호 발생 가닥과, SARS 표적 인식 가닥이 혼성결합된 역헤어핀비컨을 각각 50 nM을 이용하였다. 바이러스 용해액을 원액, 2배, 4배, 8배 희석시킨 용액 50 ㎕를 사용하고, 총 반응물의 부피를 100 ㎕로 맞춰준 뒤 37℃ 인큐베이터에 넣어주고 30분간 반응을 진행시켰다. 또한, 농도에 따른 형광 신호 변화가 확연히 차이가 나는 것으로 보아 역헤어핀분자비컨을 이용하여 실제 정량분석의 가능성을 확인하였다.This experiment was performed by dissolving the virus in which the actual PEDV virus-bearing solution was reacted with a solution consisting of 0.5 M Tris [pH 8.0], 0.1 M NaCl, 2% SDS, 0.1 M EDTA and 8 mg skim milk / It is an experiment to detect the RNA carried in it. As the molecular beacons used in this experiment, two inverse hairpin beacons were used as shown in Table 2. The reverse hairpin beacon, SARS signaling strand hybridized with the PEDV signaling strand and the PEDV target recognition strand, and the SARS target recognition strand were mixed 50 nM each of the coupled reverse hairpin beacon was used. The volume of the total reaction product was adjusted to 100 μl, and the reaction solution was placed in an incubator at 37 ° C for 30 minutes, after which 50 μl of a solution obtained by diluting the viral solution with the original solution, 2 times, 4 times and 8 times was used. In addition, the fluorescence signal changes according to the concentration are significantly different, and the possibility of the actual quantitative analysis using the inverted hairpin molecular beacon was confirmed.
도 5에 나타난 바와 같이, PEDV에서 용출한 핵산 희석액과 PEDV에 상보적인 염기서열로 제작된 역헤어핀 분자 비컨과 SARS에 상보적인 염기서열로 제작된 역헤어핀 분자 비컨을 넣어줬을 때 PEDV 역헤어핀 분자 비컨과의 반응에서만 형광 강도가 감소됨을 확인하여 역헤어핀 분자 비컨의 선택적 바이러스 탐지를 알 수 있었다. As shown in FIG. 5, when the inverted hairpin molecular beacon prepared by base sequence complementary to PEDV and the nucleic acid dilution solution eluted from PEDV and the inverted hairpin molecular beacon constructed by the nucleotide sequence complementary to SARS were added, the PEDV inverted hairpin molecular beacon And the fluorescence intensity was decreased only in response to the reaction with the hairpin.
<실시예 5> 역헤어핀 분자 비컨의 활용 가능성 실험<Example 5> Possibility of use of inverse hairpin molecular beacon
표적 분자 존재 시 표적 인식 가닥에서 분리된 신호 발생 가닥에 표적 인식 가닥을 추가로 넣어주어 역헤어핀 구조를 형성하는지를 확인하였다. 이 실험에서는 SARS 신호 발생 가닥과, SARS 표적 인식 가닥이 혼성결합된 역헤어핀비컨을 각각 50 nM을 이용하였다(표 2). In the presence of the target molecule, a target recognition strand was added to the signal generating strand separated from the target recognition strand to confirm that it forms an inverted hairpin structure. In this experiment, 50 nM of reverse hairpin beacon hybridized with SARS signaling strand and SARS target recognition strand were used respectively (Table 2).
도 6에서, a->b 표적인식가닥-표적 분자 혼성화 (헤어핀구조화 됨)가 일어나서 형광 신호가 감소한다. 이때 반응물의 총 부피는 98㎕이다. b->c는 추가된 표적 인식 가닥-신호 발생 가닥 혼성화(역헤어핀구조화 됨)를 의미하며 표적 인식 가닥이 추가가 형광 신호가 증가하는 양상을 볼 수 있고, 총 반응물의 부피는 99 ㎕이다. c->d도 표적 인식 가닥과 표적 분자가 결합을 함으로써 신호 발생 가닥이 헤어핀구조를 만들어 다시 형광 신호가 감소하는 양상을 보인다. 이때 표적 분자가 추가가 되었기 때문에 총 반응물의 부피는 100 ㎕이다. d->e도 표적 인식 가닥이 추가되어 형광 신호가 증가하고 총 반응물의 부피는 101 ㎕가 된다. 모든 준위에서의 반응물의 부피를 약 100 ㎕로 맞추어 부피변화가 형광 신호에 변화를 주는 것을 방지하였다. In Fig. 6, a- > b target recognition strand-target molecule hybridization (hairpin structured) occurs and the fluorescence signal decreases. The total volume of the reaction is 98 l. b-> c means hybridization (structuring inverted hairpin) of the added target recognition strand-signal generation strand, and the fluorescence signal increases in addition to the target recognition strand, and the total reactant volume is 99 μl. c-> d, the signal-generating strand forms a hairpin structure by the combination of the target recognition strand and the target molecule, and the fluorescence signal decreases again. Since the target molecule is added, the volume of the total reactant is 100 μl. d-> e, the target recognition strand is added to increase the fluorescence signal and the total reaction volume to 101 μl. The volume of the reactants at all levels was adjusted to about 100 μl to prevent the volume change from changing the fluorescence signal.
도 6에 나타난 바와 같이, 표적 분자와 분자 비컨을 반응시킨 후 여기에 표적 인식 가닥을 넣어주면 분리된 신호 발생 가닥은 새롭게 넣어 준 표적 인식 가닥과 역헤어핀 구조를 형성함을 확인하였다. 여기에 다시 표적 분자를 제공하면 신호 발생 가닥은 헤어핀 구조를 형성하였다. 따라서, 표적 검출 후 반응 용액에 남아있던 헤어핀 구조의 신호 발생 가닥은 역헤어핀 구조 형성에 재사용 가능함을 알 수 있었다.As shown in FIG. 6, when the target molecule was reacted with the molecular beacon and the target recognition strand was inserted therein, it was confirmed that the separated signal generating strand formed an inverted hairpin structure with the newly introduced target recognition strand. When the target molecule was again provided, the signal generating strand formed a hairpin structure. Therefore, it was found that the signal generation strands of the hairpin structure remaining in the reaction solution after the detection of the target can be reused for the formation of the inverted hairpin structure.
<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> A molecular beacon with reverse-hairpin type and method for detecting target materials by using the same <130> P15U16C1505 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.1 <400> 1 caagtcaatg gaaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.2 <400> 2 caagtcaatg aaaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.3 <400> 3 caagtcaata caaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.1 <400> 4 tgaacccact ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.2 <400> 5 tgaacccaca ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.3 <400> 6 tgaacccaaa ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38 <110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> A molecular beacon with reverse-hairpin type and method for detecting target materials by using the same <130> P15U16C1505 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.1 <400> 1 caagtcaatg gaaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.2 <400> 2 caagtcaatg aaaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS_signal strand_no.3 <400> 3 caagtcaata caaccccccc gtaaccattg acttgaaa 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.1 <400> 4 tgaacccact ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.2 <400> 5 tgaacccaca ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_signal strand_no.3 <400> 6 tgaacccaaa ccaccccccc aaattagtgg gttcaaaa 38
Claims (13)
상기 표적 인식 가닥과 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 스템; 및 루프 서열로 이루어진 올리고머로서, 상기 올리고머는 SEQ ID NOS: 1 내지 6에 기재된 염기서열 중에서 선택되며, 상기 올리고머의 일 말단에는 신호물질, 다른 말단에는 신호조절물질이 결합되어 있는, 신호 발생 가닥을 포함하며,
상기 표적 인식 가닥과 신호 발생 가닥이 상보적으로 결합된 선형 구조를 갖는, 분자 비컨.
A target recognition strand comprising a region capable of hybridizing with the target molecule and a region capable of hybridizing with the signal generating strand; And
A stem comprising a region capable of hybridizing with the target recognition strand; And a loop sequence, wherein the oligomer is selected from the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOS: 1 to 6, wherein the oligomer has a signaling substance at one end and a signal regulating substance at the other end, ≪ / RTI &
Wherein the target recognition strand and the signal generating strand have a linear structure complementarily combined.
표적 분자는 microRNA, mRNA, RNA, DNA, 펩타이드 또는 단백질인, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
Target molecules are microRNA, mRNA, RNA, DNA, peptides or proteins, molecular beacons.
상기 신호 발생 가닥은 분자 비컨이 표적 분자와 혼성화될 때 표적 인식 가닥에서 분리되어 헤어핀 구조로 자기-조립되는 것인, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
Wherein the signal generating strand is self-assembled into a hairpin structure separated from the target recognition strand when the molecular beacon hybridizes with the target molecule.
신호물질은 형광물질을 포함하는, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
The signal material comprises a fluorescent material, a molecular beacon.
신호조절물질은 증광물질, 변광물질 또는 소광물질 중에서 선택되는, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
A signal modulating material is selected from a light emitting material, a variable material, or a minerals material.
분자 비컨은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 특이적 결합성분을 더 포함하는, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
The molecular beacon may be an antigen, an antibody, an RNA, a DNA, a hapten, an avidin, a streptavidin, a neutravidin, a protein A, a protein G, a lectin, Wherein the molecular beacon further comprises at least one tissue specific binding component selected from the group consisting of a radioisotope labeling component and a substance capable of specifically binding to a tumor marker.
분자 비컨은 siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약제학적 활성성분을 더 포함하는, 분자 비컨.
The method according to claim 1,
The molecular beacon may be selected from siRNA, antisense, anticancer, antibiotic, hormone, hormone antagonist, interleukin, interferon, growth factor, tumor necrosis factor, endotoxin, lymphotoxin, urokinase, , A radioactive isotope labeled component, a cardiovascular drug, a gastrointestinal drug, and a nervous system drug.
9. A composition for detecting a target molecule comprising a molecular beacon according to any one of claims 1 to 3 and 6 to 9.
상기 혼성화에 의해 표적 인식 가닥에서 분리된 신호 발생 가닥이 헤어핀 구조 형성에 따른 신호 변화를 감지하거나 형광 강도 변화를 검출하는 것을 포함하는, 표적 분자의 탐지 방법.
Contacting a molecular beacon according to any one of claims 1 to 3 and a target molecule with a target molecule to hybridize the target recognition strand of the molecular beacon with the target molecule,
Wherein the signal generating strand separated from the target recognition strand by the hybridization detects a signal change due to formation of a hairpin structure or detects a change in fluorescence intensity.
A composition for simultaneous diagnosis and treatment comprising a molecular beacon according to any one of claims 1 to 3 and 6 to 9.
T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브.
A molecular beacon according to any one of claims 1 to 3 and 6 to 9; And
Multiple diagnostic probes comprising one or more diagnostic probes selected from the group consisting of T1 or T2 magnetic resonance imaging probes, optical diagnostic probes, CT diagnostic probes and radioactive isotopes.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190143663A (en) * | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | One-step isothermal detection method of gene mutation using hairpins formed on a gold nanoshell |
| CN113046419A (en) * | 2021-03-30 | 2021-06-29 | 湖北师范大学 | Fluorescent molecular beacon based on double-stranded DNA template fluorescent nano-copper and preparation method and application thereof |
Citations (1)
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| KR101249493B1 (en) * | 2010-11-23 | 2013-04-01 | 한국과학기술원 | Method for Detecting Nucleic Acid Using DNAzyme-Molecular Beacon |
-
2016
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