KR101764388B1 - 피하주사용 인슐린 함유 리포솜 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨병 치료제로 사용하고 있는 인슐린의 생체이용률 증가와 음식 섭취 후 급격히 증가하는 혈당의 효율적 조절을 달성할 수 있는, 환자 맞춤형 투여가 가능한 제제 및 이러한 제제의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인슐린을 함유하고 있는 리포솜이며, 이러한 리포솜들이 히야론산으로 연결되어 클러스터를 형성하고 있고, 상기 리포솜 또는 클러스터는 금 이온이 이온결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 금 코팅 인슐린 리포솜 클러스터를 유효 성분으로 함유하고 있으며, 근적외선을 조사하여 인슐린의 방출이 유도되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물과 이러한 약학 조성물의 제조방법을 제공한다. 리포솜에 로딩된 인슐린이 외부의 근적외선 레이저에 의하여 쉽게 방출 유도됨으로써 기존의 일일 1-2회 투여하는 인슐린 주사제의 공복 시 저혈당의 문제점과 빈번한 주사의 불편함을 해결할 수 있다.

Description

피하주사용 인슐린 함유 리포솜 조성물{Liposome composition containing insulin for subcutaneous injection}
본 발명은 당뇨병 치료제로서 사용되고 있는 인슐린의 생체 이용률을 개선할 수 있고, 음식 섭취 후 급격히 증가하는 혈당을 용이하게 조절할 수 있으며, 환자 맞춤형 투여가 가능한 인슐린 주사형 제제 및 이러한 인슐린 주사 제제의 제조방법에 관한 것이다.
가장 많이 사용되는 당뇨병 치료용 인슐린 제제는 인슐린 주사제이다. 이러한 인슐린 주사제는 현재 당뇨병 환자에게 일일 1-2회 주사하는 방식으로 투여되고 있으며, 이러한 환자의 빈번한 주사로 인해 환자의 삶의 질이 저하되고 빈번한 통증 등 다양한 불편들이 인슐린 주사제의 가장 큰 문제점이다.
또한 이러한 투여 방식은 혈액 내에 계속적인 인슐린 부하로 공복 시 저혈당을 유발하는 문제점도 야기한다.
최근 리포솜(liposome)에 의한 효과적인 약물전달을 위하여 특정 병소에서 특이적인 외부 자극(예를 들어, 광선, pH, 온도, 초음파 등)에 의해 약물이 방출 및 제어되는 리포솜이 널리 연구되고 있다. 특히 현재 병원에서 비침습성 항암 치료를 위해 사용 중인 High Intensity Focused Ultrasound (HIFU)를 이용하거나 피부 미용에 사용되는 근적외선을 이용하는 외부자극 감응성 리포솜은 효과적이고 편리하게 응용 가능하다는 점에서 매우 큰 장점이 있다.
또한 리포솜의 표면을 개질하거나 봉입되는 물질을 다양화하여 단순한 약물전달 이외의 조영 작용이나 2차 치료효과를 나타내는 리포솜의 개발이 널리 연구되고 있다.
예를 들어, 미국 특허출원공개공보 제2006-0002994호의 경우 리포솜의 표면에 폴리에틸렌글리콜과 같은 친수성 고분자를 도입하여 초음파에 의한 방출을 유도하고자 하였다. 하지만 상기 특허 기술로 제조된 리포솜의 경우 체온인 37℃ 부근에서 봉입된 약물의 방출이 일부 일어나 약물을 방출을 효율적으로 제어하기 어렵고, 이러한 의도하지 않은 약물의 방출로 인해 여러 부작용이 나타날 수 있다.
또, 미국 특허출원공개공보 제2006-0127467호의 경우 리포솜의 구성성분인 인지질로 무극성 지질만을 사용하여 초음파 감응성 리포솜을 제조하였다. 하지만 상기 특허 기술로 제조된 리포솜의 경우 지질의 유리전이온도(Tg)에만 의존하여 약물을 방출하는 단점을 가지기 때문에 초음파의 공동화 효과에 의한 방출보단 열 효과에 의한 방출이 될 수밖에 없고, 이로 인해 높은 초음파 Hz에서만 제한적인 방출을 보인다는 단점을 갖는다.
미국 특허출원공개공보 제2006-0002994호 (2006. 1. 5. 공개) 미국 특허출원공개공보 제2006-0127467호 (2006. 6. 15. 공개)
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 인슐린의 방출을 효율적으로 제어할 수 있어서, 빈번한 주사와 인슐린 부하로 발생하는 공복 시 저혈당 문제를 효과적으로 해결할 수 있는 인슐린 함유 제제 및 이러한 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인슐린을 함유하고 있는 리포솜이며, 이러한 리포솜들이 히야론산으로 연결되어 클러스터를 형성하고 있고, 상기 리포솜 또는 클러스터는 금 입자가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 금 코팅 인슐린 리포솜 클러스터를 유효 성분으로 함유하고 있으며, 근적외선을 조사하여 인슐린의 방출이 유도되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 이용된 기술사상들 중 일부를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1 및 2에서 보는 바와 같이, 리포솜(직경이 약 100-400 nm) 표면에 접합된 금 입자(직경이 약 5-40 nm)는 일정 강도의 근적외선(NIR)을 받으면 약 70℃ 이상으로 온도가 상승하는 플라즈몬 효과를 일으키게 된다. 리포솜 표면에 접합되어 있는 나노 골드는 가열이 되고 나노 골드가 있는 리포솜 표면의 지질이 국소적으로 용융되면서 인지질 이중막에 미세 구멍이 생기는 것으로 추측된다. 이곳을 핫 스폿(hot spot)이라고 하고 이 핫 스폿을 통하여 로딩되어 있던 인슐린이 방출되게 된다. 어느정도 방출이 되고 나서 근적외선을 제거하게 되면 나노 골드가 식으면서 리포솜의 핫 스폿이 닫히게 되고 결과적으로 인슐린의 방출이 멈추게 된다. 즉, 환자의 진피층에 일정양의 인슐린 리포솜 클러스터(직경이 약 5-50 μm)를 주사하고 피부에 근적외선을 일정 시간 조사하고 난 후, 인슐린의 방출이 이루어지면 근적외선을 제거하여 방출을 멈추게 하고 필요에 따라 반복적으로 재사용이 가능하다. 다만, 본 발명은 상기 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 기재된 수치 대비 ±10%의 범위를 가질 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 리포솜은 인지질을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 수첨 레시틴 등의 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜콜린 등이 1종 이상 이용될 수 있다. 리포솜을 구성하는 기본적인 지질로서 인지질은 리포솜 같은 층상 구조(lamellar structure)의 제조에 필수적으로 사용되어 온 물질이며, 이는 입자 형성에 안정화를 부여하는 이중막, 다중막을 구성하는 필수적인 역할을 하게 된다.
본 발명에 따른 인슐린 함유 리포솜은 본 발명의 목적을 위해서 아민기를 함유한 지질 및 열 민감성 지질을 포함하고 있다. 아민기 함유 지질은 본 발명에서 사용된 히야론산과 결합하여 클러스터를 형성하는 역할을 하며, 열 민감성 지질은 금 입자의 가열 시 용융되어 지질 이중막에 구멍(pore)를 형성하는 역할을 한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 아민기를 함유한 지질로는 1차 아민(primary amine)을 가지는 인지질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 아미노 PEG-포스파티딜에탄올아민이 사용될 수 있다. 본 발명의 여러 목적상 더욱 바람직하게, 본 발명에서 사용될 수 있는 아민기를 함유한 지질로는 DSPE-PEG 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino(polyethylene glycol))(예를 들어, 바람직하게는 DSPE-PEG(2000) Amine)이 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 사용될 수 있는 열 민감성 지질로는 모노팔미토일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 모노스테아로일포스파티딜콜린(1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 열 민감성 지질로는 소수성기의 탄소수가 16-18인 알킬 사슬을 가지는 것이 바람직하다. 탄소수가 16 미만인 경우에는 상전이 온도가 체온 이하로 떨어져 지질 나노 입자의 체내 안정성이 저하될 우려가 있고, 탄소수가 18을 초과하는 경우에는 리포솜 입자의 상전이온도가 45℃ 이상으로 증가하기 때문에 근적외선에 민감도가 저하되어 본 발명의 여러 목적상 또한 약물이 인슐린이라는 특성상 바람직하지 못하다.
상기 열 민감성 지질(예를 들어, 바람직하게는 MSPC 및/또는 MPPC)은 리포솜을 형성하는 전체 지질의 총 중량 대비 5-20 중량%를 함유하는 것이 바람직하며, 5-15 중량%를 함유하는 것이 더욱 바람직하고, 5-10 중량%를 함유하는 것이 더욱더 바람직하다.
이와 관련하여, 본 발명의 리포솜에 있어 구조 내에 포스파티딜콜린(PC)을 함유한 지질은 리포솜 입자의 열민감성을 부여해 줄 수 있는 특성이 있으며 전체 지질 조성에 대하여 40-95 중량% 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 중성 지질(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 중성 지질로는 포스파티딜콜린; 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine); EPC(egg phosphatidylcholine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 포스파티딜콜린(예를 들어, DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DL(linoleoyl)PC(dilinoleoyl phosphatidylcholine), DL(lauryloyl)PC(dilauryloyl phosphatidylcholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), PLPC(1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MPPC(l-myristoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine), PMPC(l-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine), SPPC(l-stearoyi-2-palmitoyl phosphatidylcholine), DBPC(l,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphochohne), POPC(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DOPC(dioleoyl phosphatidylcholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine)); PE(phosphatidylethanolamine); 라이소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 포스파티딜에탄올아민(예를 들어, DSPE(distearoyl phophatidylethanolamine), DMPE(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), POPE(palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(dioleyl phosphatidylethanolamine), DSPE(distearoyl phophatidylethanolamine), POPE(palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(dioleyl phosphatidylethanolamine)); PEG-PE(polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 알콕시 PEG-PE(예를 들어, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[알콕시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG)(예를 들어, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)), MPEG-DSPE(carbonyl methoxypolyethylene glycol-distearoyl phosphatidylethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DSPE-MPEG-750, DSPE-MPEG-2000 및 DSPE-MPEG-5000), MPEG-DPPE(carbonyl methoxypolyethylene glycol-dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DPPE-MPEG-2000 및 DPPE-MPEG-5000), DMPE-MPEG(carbonyl methoxypolyethylene glycol-dimyristoyl phosphatidylethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DMPE-MPEG-2000 및 DMPE-MPEG-5000); 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 목적상 또 약물이 인슐린이라는 특성상 중성 지질로 디아스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-hosphocholine; DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), PLPC(1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PE(phosphatidylethanolamine), EPC(egg phosphatidylcholine) DLPC(dilauryloyl phosphatidylcboline), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), MPPC(l-myristoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine), PMPC(l-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine), SPPC(l-stearoyi-2-palmitoyl phosphatidylcholine), DBPC(l,2-diarachidoyl-snglycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphochohne), POPC(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DSPE(lysophosphatidylcholine), 또는 이들의 혼합물이 바람직하며, DPPC, DSPE 또는 이들의 혼합물을 이용하는 것이 더욱더 바람직하다.
본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 양이온성 지질 및/또는 음이온성 지질을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 양이온성 지질로 사용되는 것은 디알킬디메틸암모늄, 디오레오일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일디알킬트리메틸암모늄프로판 또는 디오레오일디알킬디메틸암모늄프로판을 포함하나, 이외에 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 다른 다양한 양이온성 지질이 사용될 수 있다.
상기 음이온성 지질에는 디미리스틸글리세로포스페이트, 디팔미토일글리세로포스페이트 디미리스틸글리세로포스페이트, 디스테로일글리세로포스페이트, 디스테로일글리세로포스포글리세롤, 디팔미토일글리세로포스포라글리세롤, 디미리스틸글리세로포스포세린, 디팔미토일글리세로포스포세린 또는 디스테로일글리세로포스포세린을 포함하나, 이외에 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 다른 다양한 음이온성 지질이 사용될 수 있다.
본 발명의 여러 목적상 바람직하게, 본 발명에 따른 인슐린 함유 리포솜에 있어 아민기를 함유한 지질은 DSPE-PEG 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino(polyethylene glycol))이고, 열 민감성 지질은 모노팔미토일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 모노스테아로일포스파티딜콜린(1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 여러 목적상 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 인슐린 함유 리포솜에 있어 리포솜을 형성하는 중성 지질로는 DPPC와 같은 타입의 포스파티딜콜린류 지질 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[알콕시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG)(예를 들어, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)]이 사용되고, 아민기 함유 지질로는 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)이 사용된다. 이와 같은 지질은 클러스터 형성을 위한 히야론산과의 반응에 필요한 아민기를 공여하는 역할을 하게 되고, PEG 고분자는 리포솜을 안정하게 하는 역할을 한다.
본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 여러 가지 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 리포솜의 제조에 있어 유화안정보조제로 폴리올을 포함할 수 있으며, 이러한 폴리올로는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨, 솔비톨 등이 사용될 수 있고, 이러한 폴리올로는 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜등이 더욱 바람직하다. 본 발명은 또한 리포솜 제조에 세라마이드를 추가로 이용할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 리포솜에 올리고당을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 올리고당으로 푸코이단, 글루코사민, 팩틴질, 헤파린등이 사용될 수 있으며, 푸코이단이 가장 바람직하다.
본 발명의 리포솜을 클러스터를 만들기 위해 사용되는 히야론산 고분자는 분자량이 증가할수록 리포솜과의 결합을 할 수 있는 카르복실기를 많이 함유하고 있고 주사제의 적절한 점도 유지에 도움이 된다. 본 발명의 목적상 이러한 히야론산의 분자량은 중량평균 분자량이 약 10만 내지 100만인 것이 바람직하며, 중량평균 분자량이 약 30만 내지 50만인 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 분자량을 가진 히야론산이 사용될 경우 주사 후 리포솜의 이동을 방지하여 적용 부위가 3일 이상 동일한 위치에 있을 수 있게 하는 역할을 할 수 있을 것이며 적절한 점도유지로 주사하기에 편리하다.
본 발명의 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터에 있어, 리포솜은 본 발명의 목적상 직경이 약 10-400 nm인 것이 바람직하며, 약 50-300 nm인 것이 더욱 바람직하고, 50-200 nm인 것이 더욱더 바람직하며, 100-150 nm의 입자 지름을 갖는 것이 가장 바람직하다. 금 코팅 리포솜 나노 입자의 평균 입경이 상기 범위를 초과할 경우 리포솜의 안정성이 저하되거나 인슐린의 로딩이 감소하게 된다.
본 발명의 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터에 있어, 클러스터는 본 발명의 목적상 (특히 피하주사 후 주사 부위에 고정한다는 목적상) 직경이 약 1-50 μm인 것이 바람직하다. 작은 주사바늘을 사용이 가능하고 주사 후 통증이 적다는 측면도 고려하면 클러스터 입경은 10-30 μm인 것이 더욱 바람직하다. 다만, 10 μm 보다 적을 경우 입자의 체내에서 이행될 가능성이 증가한다.
본 발명에 있어 리포솜과 클러스터의 입경은 전기영동 광산란 분광광도기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)를 이용해 측정된 값으로, 입도 분포에서 누적 체적이 50 부피%에 해당하는 입자의 직경인 평균 입경(D50)을 의미한다.
본 발명은 또한 (a) 아민기를 함유한 지질 및 열 민감성 지질을 이용하여 인슐린을 유효성분으로 함유하는 리포솜을 제조하는 단계, 및 (b) 상기 리포솜과 환원된 금 이온을 반응시켜 리포솜의 표면에 금 이온을 이온결합시키는 단계를 포함하며, (c) 상기 (a)단계 또는 (b)단계 후에 인슐린 함유 리포솜과 히야론산 고분자의 반응을 통해 리포솜 클러스터를 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는, 인슐린의 피하주사에 적합한 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터를 제조하는 방법을 제공한다.
다만, 제조 용이성상 히야론산을 이용한 클러스터 형성은 금 입자 결합 후 수행하는 것이 바람직하다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에서 상기 (a) 단계의 리포솜을 제조하는 단계는 중성 지질을 추가적으로 이용할 수 있으며, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 양이온성 지질 및/또는 음이온성 지질을 추가적으로 더 이용할 수 있다.
본 발명의 리포솜은 곧은 통로 또는 굴곡 통로를 가진 필터를 통해 압출하거나, 호모게나이저를 이용하여 균질화함으로써 축소된 균일한 크기분포를 가지도록 할 수 있으며, 제조된 용액을 탈수법 또는 동결건조법으로 건조시킬 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어 인슐린의 리포솜 내 로딩은 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 알려진 여러 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 열 민감성의 리포솜을 제조하면서 인슐린을 통상적인 수화방법으로 로딩할 수 있다.
히야론산을 이용한 리포솜 클러스터의 제조는 본 발명이 속한 분야에서 알려진 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 바람직하게는, Carbodiimide 커플링 반응을 이용할 수 있다. 예를 들어, 히야론산과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)(또는 DCC(dicyclohexylcarbodiimide))와 NHS(N-hydroxysuccinimide esters)을 혼합하여 카복시기를 활성화시킨 다음 아민기를 함유한 리포솜을 첨가하여 상온에서 2시간 이상 반응을 유도하여 히야론산과 리포솜이 결합된 클러스터를 얻을 수 있다.
히야론산-리포솜 클러스터를 만든 다음, 금 코팅은 리포솜 수용액에 금을 넣어준 후 금을 환원시켜서 리포솜 표면에 코팅시키는 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 구체적으로, 제조된 히야론산-리포솜 클러스터 용액에 염화금(HAuCl4) 수용액과 약산(예를 들어, 바람직하게는 아스코르브산) 수용액을 교반하면서 천천히 넣어주고, 10분 이상 리포솜 색깔이 변할 때까지 반응시켜 금 코팅 리포솜(gold-coated liposome; GCL) 클러스터를 제조하였다. 이후 반응이 되지 않은 염화금과 약산을 제거하기 위하여, 투석막(예를 들어, MWCO 12,000-14,000)을 이용하여 약 4℃에서 약 24시간 이상 투석하거나 컬럼을 통하여 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 앞서 언급한 인슐림 함유 금 코팅 리포솜 클러스터 이외에, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사용 생리식염수, 등장화제, pH조절제, 안정화제, 계면활성제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터는 인슐린의 생체이용률을 증가시킬 수 있으며, 음식 섭취 후 급격히 증가하는 혈당을 조절할 수 있는 환자 맞춤형 투여가 가능한 제제이다. 본 발명의 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터는 환자가 필요한 때 즉, 음식을 섭취한 후 근적외선을 조사함으로써 이에 따라 인슐린의 간헐적 방출 제어가 가능하며 특히 주사 부위에 투여 약물이 고정되어 있어 근적외선의 적절한 조사가 가능하다. 본 발명의 금 코팅 리포솜 클러스터는 또한 생분해성의 리포솜으로 제조되어 몸에 축적되지 않고 분해될 수 있으며, 표면에 접합된 금은 면역반응을 일으키지 않고, 독성이 없어 안전하다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 여러 기술사상들 중 일부를 보여주는 개념도이다. 리포솜 표면에 접합된 금 입자는 일정 강도의 근적외선(NIR)을 받아 약 70℃ 이상으로 핫 스폿(hot spot)이 형성되어 인슐린의 방출하게 되고 근적외선을 제거하면 방출이 중지된다.
도 2는 본 발명의 여러 기술사상들 중 일부를 보여주는 개념도이다. 도 2는 히야론산으로 결합되고 약물인 인슐린이 로딩된 리포솜(직경이 대략 100-400 nm)과 리포솜 표면에 환원반응으로 접합된 금 입자(직경이 대략 5-40 nm) 글러스터의 구성 예를 보여준다. 주사 후 클러스터의 크기로 인해 체내 이동 없이 주사된 부위에 클러스터가 머물게 되며, 이 클러스터는 일정 강도의 근적외선(NIR)을 받아 약 70℃ 이상으로 핫 스폿이 형성되고 인슐린의 방출이 나타난다.
도 3은 본 발명의 실시예들인 금 코팅 리포솜 클러스터에 근적외선을 조사할 경우 조사 시간에 따른 인슐린 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 근적외선에 의한 간헐적 방출 제어가 가능함을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 4는 실시예 3-3에서 제조된 인슐린 함유 금 접합 리포솜 클러스터에서 근적외선을 조사(화살표)함으로써 주기적으로 방출되는 인슐린의 시간별 방출양의 변화도를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 인슐린 함유 리포솜 제조
리포솜을 제조하기 위하여, 지질 성분인 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidyl choline, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)], 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)(DSPE-mPEG-2000amine), 및 모노스테아로일포스파티딜콜린(1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine) (MSPC)을 다양한 비율의 질량비로 사용하였다. 각 지질을 클로로포름에 용해시킨 후, 회전 증발기를 사용하여 40℃에서 감압하여 둥근 플라스크 벽면에 얇은 지질 막을 형성시켰다. 형성된 지질 막에 인슐린 4mg(100 IU) 구연산 용액 (pH 4)을 첨가하여 지질막이 완전히 분산될 때까지 수화하여 인슐린 함유 리포솜을 제조하였다. 제조된 리포솜은 크기를 조절하기 위하여 가압압출기로 각각 200 nm, 100 nm 및 80 nm의 폴리카보네 이트 분리막(Whatman, USA)을 이용하여 4-5회 이상씩 가압 압출하였다. 투석막(MWCO 12,000-14,000)을 이용하여 리포솜 수용액을 4℃에서 24시간 이상 투석하여 리포솜 안에 들어가지 않은 인슐린 용액을 제거하였다.
실시예 1의 인지질 배합조건 중량비를 하기 표 1에 나타내었다.
DPPC DSPE-mPEG-2000 DSPE-mPEG-2000amine MSPC
실시예1-1 80 4 4 12
실시예1-2 80 10 4 6
실시예1-3 80 4 10 6
실시예1-4 80 0 14 6
실시예1-5 80 14 0 6
비교예1 70 0 30 0
실시예 2: 인슐린함유 리포솜과 히야론산 고분자 반응을 통한 클러스터 형성
0.5 중량% 히야론산 고분자(MW 350,000) 1ml를 1% EDC와 1% NHS 수용액에 첨가하여 카르복시기의 활성화를 유도하였다. 인슐린함유 리포솜과 히야론산 반응 용액은 상온에서 2시간 이상 서서히 교반하면서 반응을 유도하였다. 반응이 종료된 후 미반응물의 제거를 위하여 4000 rpm이상에서 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물을 생리식염수로 재분산시켰다. 이와 같은 조작을 3회 이상 반복하였다.
실시예 3: 리포솜 클러스터 표면에 금 코팅
금 코팅은 리포솜 수용액에 금을 넣어준 후 금을 환원시켜서 리포솜 표면에 코팅시키는 방법을 이용하였다. 비교예 2를 제외하고, 실시예 2에서 제조한 리소폼 클러스터들을 금 코팅하였다. 실시예 2에서 제조된 1 ㎖ 리포솜 클러스터 용액에 각각 100mM 염화금(HAuCl4) 수용액 30 ㎕와 500 mM 아스코르브산 수용액 40 ㎕를 교반하면서 천천히 넣어주고, 10분 이상 리포솜 색깔이 변할 때까지 반응시켜 금 코팅 리포솜(GCL)을 제조하였다. 이후 반응이 되지 않은 염화금과 아스코르브산을 제거하기 위하여, 투석막(MWCO 12,000-14,000)을 이용하여 4℃에서 24시간 이상 투석하였다.
시험예 1: 제조된 리포솜의 입자크기와 표면 전하 측정
각각 실시예에서 제조한 인슐린 함유 리포솜, 클러스트 리포솜 및 금 코팅 리포솜(GCL)의 입자크기 및 표면 전하를 전기영동 광산란 분광광도기(ELS-Z, Otuska, 일본)를 이용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 2에 나타내었다.
시험예 2: 금-코팅 리포솜 표면의 Au 정량 분석
리포솜의 금 코팅 여부를 확인하기 위하여, 유도결합 플라즈마 분석(ICP)과 에너지 분산형 엑스레이 측정기(EDS)를 이용하여 리포솜 표면의 Au를 정량 및 분석하였다.
각 실시예에 따른 리포솜의 단계별 물성 특성을 하기 표 2에 종합하여 나타내었다.
입자크기(μm) 표면전하(mV) 인슐린농도(IU/ml) AU함량(mg/g)
실시예1-1 0.13 -5 40 -
실시예1-2 0.15 -15 73 -
실시예1-3 0.18 -11 97 -
실시예1-4 0.24 -23 102 -
실시예1-5 0.20 -25 113 -
비교예1 0.15 -17 102 -
실시예2-1 11.1 - - -
실시예2-2 12.4 - - -
실시예2-3 15.8 - - -
실시예2-4 17.2 - - -
실시예2-5 0.3 - - -
비교예2 8.8 - - -
실시예3-1 - - - 11
실시예3-2 - - - 15
실시예3-3 - - - 17/15*
실시예3-4 - - - 10
실시예3-5 - - - 18/0*
비교예3 - - - 0 (금코팅 안함)
*가 표시된 값은 마우스 피부 주사 1일 후 피부 내의 금 함량 변화 측정 값임.
상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 인슐린 함유 리포솜의 물리적 특성을 확인한 결과 입자크기는 100-250 nm 정도로 큰 차이를 보이지 않았으나, DSPE-mPEG-2000와 DSPE-mPEG-2000amine의 질량비가 커질수록 표면전하가 점점 증가하였다.
또한, 인슐린의 로딩율은 열 민감성 지질인 MSPC가 증가하면 리포솜의 안정성이 감소하여 로딩이 잘되지 않았다.
실시예 2의 평가 결과에 나타나는 바와 같이, DSPE-mPEG-2000만 사용하고 DSPE-mPEG-2000amine를 사용하지 않은 경우 히야론산 고분자의 카복시기와 결합할 수 있는 아민가가 없어서 입자의 크기가 증가하지 않아서 주사 후 피부조직에서 다른 곳으로 쉽게 이행될 수 있는 아주 작은 크기를 보였다. 적어도 10마이크로 근처의 클러스터를 형성해야 주사 후 고정이 되어 근적외선 조사에서 약물을 방출하는 효과를 볼 수 있다.
실시예 3의 평가 결과에 나타나는 바와 같이, 금-코팅 리포솜의 표면 AU함량 이 10-20 mg/g 정도를 유지하고 있으나, 비교예 3의 금코팅을 하지 않은 리포솜 클러스터에서는 금의 함량이 검출되지 않았다.
시험예 3: 형성된 클러스터의 고정성 평가
실시예 3-3 및 3-5를 마우스에 피하 주사하고, 1일 후 주사부위를 적출하여 적출된 부위에 남아있는 금의 함량을 측정하였다. 그 결과를 상기 표 2에 나타내었다.
표 3의 결과(* 표시됨)에 나타나는 바와 같이, 실시예 3-3 리포솜 클러스터와 실시예 3-5의 리포솜을 비교해보면 마우스를 대상으로 0.1 ml를 피하 주사한 후 1일 후 피부를 절제하여 피부에 남아 있는 금의 함량을 측정한 결과 리포솜 상태에서는 피부의 체액에 의하여 유실되어 금 리포솜이 관찰되지 않았지만, 리포솜 클러스터의 경우는 그대로 유지됨을 알 수 있었다.
시험예 4: 근적외선 조사에 따른 인슐린 방출 평가
본 발명에 따른 실시예들인 금 코팅 리포솜 클러스터에 근적외선을 조사할 경우 조사 시간에 따른 인슐린 방출 정도를 도 3에 나타내었다. 도 3은 금 코팅 리포솜 클러스터(실시예 3-1 내지 3-4 및 비교예 3)에 근적외선(808 nm)을 1W/cm2의 강도로 조사하였을 때 시간에 따른 인슐린의 방출양을 표시한 그래프이다. 비교예 3인 나노골드가 접합되지 않은 리포솜 클러스터의 경우 인슐린의 방출이 거의 이루어지지 않았다. 인슐린의 로딩 정도에 따라 실시예 별로 방출 속도에 다소 차이는 있으나 전반적으로 3분 이내에 80% 이상의 방출 효과를 보였다.
이러한 결과는 앞에서 설명한대로 리포솜 표면에 부착된 나노 골드(10-20nm)가 근적외선을 흡수하여 플라즈몬 효과에 의하여 발열이 되고 70℃ 정도로 국소적 핫 스폿(hot spot)을 만들고 리포솜을 구성하고 있는 인지질이 용융되어 구조가 일시적으로 와해되면서 그 틈으로 약물의 방출이 이루어지는 것으로 추측되나, 본 발명은 이러한 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.
또한, 근적외선을 필요할 때마다 주기적으로 조사하여 간헐적 방출 제어가 가능한지 여부를 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 근적외선에 의한 간헐적 방출 제어가 가능함을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 4는 실시예 3-3에서 제조된 인슐린 함유 금 접합 리포솜 클러스터에서 근적외선을 조사(화살표)함으로써 주기적으로 방출되는 인슐린의 시간별 방출량의 변화도를 나타낸다.
도 4에서 보는 바와 같이, 이러한 근적외선 조사에 의한 의도적인 방출 특성을 나타내는 인슐린 함유 금 접합 리포솜 클러스터는 당뇨 환자의 인슐린 투여법에 적용할 경우 커다란 가치를 창출할 수 있다.
일반적으로 당뇨환자는 일일 1-2회 인슐린을 주사 투여하고 있으며, 이에 따른 저혈당, 쇼크, 혈당의 불규칙한 변화 등으로 인해 체내 전해질 농도 변화, 산성화 등으로 여러 가지 부작용을 야기하고 있으며, 특히 족부궤양, 백내장 등과 같은 합병증의 위험에 노출되기 쉽다. 본 발명은 근적외선 조사를 적절히 조절함으로써 이러한 체내 인슐린의 변화를 환자특성에 맞게 맞춤형으로 개별 치료하는 것이 가능하다.
도 4에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 인슐림 함유 금 접합 리포솜 클러스터를 1회 피하주사한 후에 (예를 들어, 당뇨 환자의 식사 후) 혈당이 올라가면 리포솜 클러스터가 주사된 부위에 근적외선을 일정시간(예를 들어, 0.5 내지 5분 정도, 바람직하게는 약 1분 정도) 조사하면 일정량의 인슐린이 방출되고 근적외선이 꺼지면 인슐린 방출이 멈추게 된다. 동일한 과정을 반복적으로 식사 후 on/off하여 환자의 혈당을 일정하게 유지할 수 있다. 즉, 의사의 혈당 조절 프로그램에 따라 외부에서 조절되는 인공 췌장의 역할을 할 수 있게 된다.

Claims (10)

  1. 인슐린을 함유하고 있는 리포솜이며,
    리포솜은 탄소수 12 내지 20인 포화 지질 및 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 아미노 폴리에틸렌글리콜(PEG)-포스파티딜에탄올아민인 아민기를 함유한 지질, 및 모노팔미토일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 모노스테아로일포스파티딜콜린(1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 또는 이들의 혼합물인 열 민감성 지질을 포함하고 있고,
    이러한 리포솜들이 아민기를 함유한 지질과 히야론산으로 연결되어 직경이 10-50 μm인 클러스터를 형성하고 있고, 상기 리포솜은 금 입자가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 금 코팅 인슐린 리포솜 클러스터를 유효 성분으로 함유하고 있으며,
    근적외선을 조사하여 인슐린의 방출이 유도되는 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 아민기를 함유한 지질은 약물이 DSPE-PEG 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino(polyethylene glycol))인 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 리포솜은 디아스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-hosphocholine; DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), PLPC(1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PE(phosphatidylethanolamine), EPC(egg phosphatidylcholine) DLPC(dilauryloyl phosphatidylcboline), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), MPPC(l-myristoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine), PMPC(l-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine), SPPC(l-stearoyi-2-palmitoyl phosphatidylcholine), DBPC(l,2-diarachidoyl-snglycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphochohne), POPC(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DSPE(lysophosphatidylcholine), 또는 이들의 혼합물인 중성 지질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 히야론산의 분자량은 30 내지 50만인 것을 특징으로 하는 인슐린의 피하주사용 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. (a) 탄소수 12 내지 20인 포화 지질 및 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 아미노 폴리에틸렌글리콜(PEG)-포스파티딜에탄올아민인 아민기를 함유한 지질 및 모노팔미토일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 모노스테아로일포스파티딜콜린(1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), 또는 이들의 혼합물인 열 민감성 지질을 이용하여 인슐린을 유효성분으로 함유하는 리포솜을 제조하는 단계, 및
    (b) 상기 리포솜과 환원된 금 이온을 반응시켜 리포솜의 표면에 금 이온을 이온결합시키는 단계를 포함하며,
    (c) 상기 (a)단계 또는 (b)단계 후에 인슐린 함유 리포솜과 히야론산 고분자의 반응을 통해 직경이 10-50 μm인 리포솜 클러스터를 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는,
    인슐린의 피하주사에 적합한 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아민기를 함유한 지질은 DSPE-PEG 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino(polyethylene glycol))인 것을 특징으로 하는, 인슐린의 피하주사에 적합한 인슐린 함유 금 코팅 리포솜 클러스터를 제조하는 방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040033256A1 (en) * 2001-10-09 2004-02-19 Rimona Margalit Liposome-encapsulated insulin formulations
KR101513558B1 (ko) * 2013-07-29 2015-04-20 한국화학연구원 금-코팅 리포솜 및 이의 제조방법

Patent Citations (2)

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