KR101761607B1 - 반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물 - Google Patents

반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 DPPH 법과 xanthine/xanthine oxidase 법에 의해 항산화 활성이 확인하고 원판 확산법에 의하여 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphyococcus epidermidis)에 대한 항균 활성이 확인된 반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물을 개시한다.

Description

반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물{Antioxidant Composition and Antibacterial Composition Using an Extract of Zonaria diesingiana}
본 발명은 반주름말(Zonaria diesingiana) 추출물을 이용한 항산화용 조성물 및 항균용 조성물에 관한 것이다.
세포 내 정상적인 세포대사과정에서 생성되거나 여러 환경오염 및 화학물질의 노출 등에 의해 생성되는 과산화 라디칼(superoxide radical, O2ㆍ), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, OHㆍ), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 단일체 산소(singlet oxygen, 1O2) 등의 산소화합물을 총칭하여 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이라 한다(Free Radic Biol Med 26: 202-226, 1999).
이들 활성 산소는 반응성 매우 커서 생체 분자들과 빠르게 반응하여 세포 체내에서 세포막 손상, DNA 변성, 지질 산화, 단백질 분해 등을 초래하여, 뇌혈관 질환, 암, 심장질환, 자가면역질환, 소화기질환, 동맥경화와 같은 만성 질환들의 발생을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Chem . Res . 14: 393 (1981); Arch . Biophys . 247: 1-11 (1986); Science 221: 1256-1264 (1983)).
이러한 질병을 초래하는 위험 요소인 체내 활성산소를 효과적으로 제거할 수 있는 방법 중의 하나는 항산화제의 섭취이다(Food Chem Toxicol 39: 1205-1210, 2001). 항산화제는 활성 산소와 반응함으로써 활성 산소에 의한 생체 손상을 억제하거나 최소화하는 것으로, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT, Butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트(PG, Propyl galate), 터셔리부틸 하이드로퀴논(TBHQ, Teritiarybutyl hydroquinone) 등의 합성 항산화제와 엽록소, 녹차 추출물, 프로롤리스, 토코페롤(tocopherol), 아스코베이트(ascorbate), 카로테노이드 (carotenoid), 글루타티온(glutathione) 등의 천연물 유래 항산화제로 구분될 수 있는데, 합성 항산화제의 경우 발암 및 심혈관 계열에 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 천연물로부터 유래하는 보다 안전하고 뛰어난 효과를 가지는 항산화제에 관한 연구가 활발하게 수행되고 있다(Korean J. Food Sci . Technol . 34:889-892 (2002)).
최근 항산화 활성을 보이는 물질을 탐색하기 위한 항산화 활성 측정 기법으로서 TRAP 법(Anal Biochem ., 28, pp300-306. 1989), DPPH 법(Nature 181:1198-1200 (1958)), xanthine/xanthine oxidase 법(Biochemical and Biophysical Research Communications, 63(2):463-468, 1975), ABTS 법(Methods Enzymol . 234: 279-293 (1994); Clin . Sci . 84: 407-412 (1993); Free Rad . Biol . Med . 20: 933-956 (1996)), ORAC 법(Free Rad . Biol . Med. 18:29-36 (1995)), TOSC 법(Free Rad . Biol. Med . 24(3):480-493 (1998); Toxicol . Appl . Pharmacol . 156(2):96-105 (1999)) 등 다양한 방법이 개발되어 있다.
한편, 인간의 피부는 주위환경과 직접 접촉하는 기관으로서 각종 피부 질환에 관여하는 세균, 곰팡이 등의 감염이 쉽게 일어난다. 예컨대 피부에 화농을 일으키는 황색포도상구균인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)을 비롯하여 피부 상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 등이 피부에 존재하며, 이 균들은 피부상에 분비된 피지나 땀을 분해시켜 냄새를 발생시키며, 이와 더불어 그 분해 산물들은 피부에 자극을 주고 염증을 발생시킨다. 특히 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)는 지방산 분해효소인 리파아제(lipase)를 이용하여 피지를 분해시켜서 유리지방산을 생성시킨다. 이들 유리지방산은 피부에 자극을 줄 뿐만 아니라 여드름에서 볼 수 있는 붉은 발진인 구진, 농포, 결절 등의 염증성 병변을 유발시킨다.
이러한 세균들에 대한 항균성 물질로서 트리클로카반(triclocarban), 트리클로산(triclosan) 등 항균성 화합물이 사용되어 왔으나 장기간 사용시 피부 작열감, 화끈거림, 피부 발적 등의 피부 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다.
따라서 최근 피부 부작용이 적은 천연 추출물에 대한 연구가 진행되어 왔으며, 예컨대 녹차 카테킨, 유칼립투스 잎 오일, 레몬 껍질 오일, 조릿대 엑기스, 알로에 베라 껍질 추출물 등이 보고되어 있다(한국 공개특허 제2010-0088878호, 한국 공개특허 제2005-0010914호, 한국 공개특허 제2010-0088296호).
본 발명은 DPPH 법, xanthine/xanthine oxidase 법에 의해 확인된 항산화 활성을 가지며, 스타필로코쿠스 아우레우스 등에 대해 항균 활성을 보이는 반주름말 추출물을 개시한다.
본 발명의 목적은 반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 반주름말 추출물을 이용한 항균용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 반주름말 80% 에탄올 추출물을 제조함과 아울러 그것을 증류수에 현탁시켜 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획한 분획물을 제조한 후 이들 추출물과 분획물의 항산화 활성을 DPPH 법, xanthine/xanthine oxidase 법에 의해 확인하고 그 항균 활성을 원판 확산법(Disc diffusion assay, Food . Chem . Toxicol. 40(4): 535-543) 등에 의해 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 일 측면에 있어서 본 발명은 반주름말 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물로 파악할 수 있으며, 다른 측면에 있어서는 반주름말 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "반주름말 추출물"이란 추출 대상인 반주름말을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 조추출물과 그 조추출물을 상기 열거한 용매 중 하나 이상으로 분획하여 얻어진 분획물을 말한다. 추출 방법은 유효성분의 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식을 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 일부 또는 전부 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물(특히 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물)과 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 물에 현탁하고 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 의미하고, 더 바람직하게는 뚜렷하게 높은 항산화 활성과 항균 활성을 보이는 에틸아세테이트 분획물을 의미한다. 여기서 "순차적으로 분획한다"는 것은 분획에 사용된 물층의 분획물을 다음 단계의 분획 용매에 의한 분획시에도 계속적으로 사용하여 분획한다는 의미이며, 상기 에틸아세테이트 분획물은 반주름말 에탄올과 물의 혼합 용매 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산, 디클로메탄 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트층의 분획물 이외에도 반주름말 에탄올과 물의 혼합용매 추출물에서 추출용매를 제거하여 얻은 고형상의 반주름말 에탄올과 물의 혼합용매 추출물을 물에 현탁한 후 이를 에틸아세테이트와 혼합·정치시켜 얻어진 분획물을 포함하는 의미이다.
또한 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 항산화용 및 항균용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 그 유효성분을 항산화 활성 또는 항균 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항산화 효과 또는 항균 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
구체적인 양태에 있어서, 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 파악될 경우, 식품의 형태는 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 산제, 정제, 캡슐제 등의 건강식품 제제류 등이 될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.
미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.
상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산 등을 들 수 있으며 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 적합한 담체와 제제에 대해서는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 추가로 포함할 수 있다.
부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성을 보이는 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성 또는 항균 활성을 나타내는 반주름말 추출물을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 항산화용 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서 식품, 화장품, 의약품 또는 사료의 첨가제 조성물로 파악할 수 있다.
식품, 화장품, 의약품, 사료 등에는 공기와의 접촉시 쉽게 산패할 수 있는 불포화 지방산이 포함되는 경우가 많다. 이러한 불포화 지방산의 산패는 식품, 화장품, 의약품, 사료 등의 향, 맛 등을 저하시켜 소비자의 기호도, 선호도 등에 직접적인 영향을 미친다. 종래부터 이러한 제품 등에 항산화제를 첨가하여 산패를 억제하려는 시도가 있어 왔다.
산패 방지의 목적으로 대표적으로 사용되어 온 항산화제는 합성 항산화제로서 부틸화 하이드록시아니솔(BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT, Butylated hydroxytoluene) 등을 들 수 있는데, 전술한 바와 같이 이들 합성 항산화제는 과도하게 사용될 경우 발암 등의 부작용을 초래할 수 있다. 이러한 이유로 천연 항산화제에 대한 관심이 지속되어 왔다.
본 발명의 항산화용 조성물은 천연물 유래의 반주름말 추출물을 유효성분으로 이용함으로써 합성 항산화제가 갖는 부작용이 없이 불포화 지방산 등의 산패 방지 목적으로 식품, 화장품, 의약품에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명의 항산화용 조성물이 첨가제 조성물로 파악될 경우 항산화 활성을 보이는 유효성분인 반주름말 추출물의 유효량은 식품, 화장품, 의약품, 사료 등에 포함되는 불포화 지방산의 종류, 불포화 지방산의 함량, 이중결합의 정도 등을 고려하여 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 결정될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 반주름말 추출물을 이용한 항산화용 조성물과 항균용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 항산화용 조성물과 항균용 조성물은 천연물 유래의 항산화 물질 또는 항균 물질을 이용함으로써 합성 항산화제 또는 합성 항균제가 가질 수 있는 부작용 없이 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있으며, 특히 본 발명의 항산화용 조성물은 식품, 화장품, 약품 등의 제품에 포함된 불포화 지방산의 산패 방지 목적으로 첨가되어 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 반주름말 추출물 및 분획물의 제조
제주특별자치도 제주시 한림읍 귀덕리 해역에서 2013년 7월 10일에 채집한 반주름말(Zonaria diesingiana J. Agardh)을 담수로 부착생물을 제거한 후, 시료를 음건한 다음 마쇄기로 분쇄하였다. 각각의 미세말 시료를 80 % 에탄올에 상온에서 48시간 침출하고 3회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하고 감압 농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 그리고 에탄올 추출물 4 g을 증류수 400 ㎖에 현탁시킨 후, n-Hexane(400㎖ × 3), Methylene Chloride(400㎖ × 3), Ethyl acetate(400㎖ × 3), Buthanol(400㎖ × 3)로 순차적으로 분획하고 각각의 분획물을 진공 건조하여 n-Heaxane, Methylene Chloride, Ethyl acetate 및 Buthanol 그리고 잔사물(잔여 물층의 분획물)를 얻었다. 각 분획물은 해당 용매로 용해시켜 0.2 ㎛ membrane filter(Advantec MFS Inc. USA)로 제균하여 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
< 실험예 > 항산화 활성 및 항균 활성 실험
< 실험예 1> 항산화 활성 실험
<실험예 1-1> DPPH radical 소거활성에 의한 항산화 활성 평가
전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blois 방법(Blois, 1958)에 의한 DPPH 자유 라디컬(free radical) 소거법에 따라 측정하였다. 즉 메탄올에 녹인 시료(1,000 ㎍/㎖) 를 각각 6 단계의 농도구배로 만들어 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 ascorbic acid(5 ㎍/㎖), butylated hydroxy anisole(BHA, 5 ㎍/㎖), trolox(5 ㎍/㎖)를 사용하였다. DPPH radical 소거활성은 시료 무처리군 대비 시료 처리군의 DPPH radical 소거 정도를 백분율로 산출하고, 결과값은 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 아래의 [표 1]에 나타내었다. 실험은 각 시료에 대해서 3회 반복하여 실시하였으며 결과값은 평균값을 기초로 산출하였다.
DPPH radical 소거활성 (%) = (AControl-ASample)/AControl × 100
ASample=시료를 첨가한 반응액의 흡광도
AControl=시료 대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도
결과를 아래의 [표 1]에 나타내었다.
Figure 112015036566758-pat00001
상기 [표 1]의 결과를 참조하여 보면, 반주름말 추출물과 그 분획물 모두 DPPH radical 소거활성을 보이지만 특히 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 가장 높은 보임을 알 수 있다.
<실시예 1-2> Xanthine oxidase 억제 활성 측정
Xanthine/Xanthine oxidase에 의한 uric acid 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 대조군으로는 allopurinol(Sigma, 5 ㎍/㎖)을 사용하였다. 반응액으로는 각 농도별 시료(15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 ㎍/㎖)와 0.5 mM xanthine과 1mM EDTA를 200 mM phosphate buffer(pH7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/㎖ xanthine oxidase를 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다. 생성된 uric acid 함량을 분광분석기로 290 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후 Xanthine oxidase 억제 활성을 시료 무처리군 대비 시료 처리군의 Xanthine oxidase 억제 정도를 백분율로 산출하고, 결과값은 uric acid의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 상기 [표 1]에 DPPH 소거 활성과 함께 나타내었다. 모든 실험은 각 시료에 대해서 3회 반복하여 실시하였으며, 결과값은 3회 반복 실험의 평균값을 기초로 산출하였다.
상기 [표 1]을 참조하여 보면, 80% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 활성을 보였으며 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 특히 높은 활성을 보였음을 알 수 있다.
< 실험예 2> 항균 활성 실험
<실험예 2-1> 원판 확산법에 의한 실험
본 실험에 사용한 균주는 피부에서 흔히 검출되는 3종의 균주인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidi), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acne), 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 사용하였으며, 배지는 Tryptic soy agar/broth(TSA, TSB)는 Difco(USA)사, gifu anaerobic medium agar/broth(GMA Agar/Broth)는 Nissui(Japan)사, yeast mold agar/broth(YM agar/broth)는 Difco(USA)사 배지를 사용하였고, 혐기성균인 Propionibacterium acnes는 anaerobic Jar(Oxoid, USA)에서 배양하였다.
아래의 [표 2]에 사용 균주, 배지 등을 정리하였다.
Figure 112015036566758-pat00002
항균력 측정은 원판 확산법(Disc diffusion assay)을 사용하였으며(Food . Chem. Toxicol . 40(4): 535-543), 각 균주는 10 mL의 액체배지에 접종하고, 각각의 배양온도에서 24시간씩 3회 계대배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였으며, 항균성 시험용 평판 배지 조제는 각가의 시험균 농도를 650 nm에서 OD값 0.4(106 cfu/㎖)가 되게 한후 pour-plate 방법에 따라 배지가 분주된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고시켜 균접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 각 시료의 농도는 50 ㎍/㎖로 사용하였으며, 각각의 시료는 멸균된 Paper disc에 20 ㎕씩 천천히 흡수 시킨 후, 용매를 완전히 증발시켰다. 시험용 평판배지 표면에 disc를 밀착시키고 각각의 배양온도에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생선된 생육 저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균활성을 분석하였다. 양성대조군으로는 상기 [표 2]의 각각의 균주에 따른 항생제를 사용하였으며, 음성대조군으로는 추출물 희석시 사용한 100 % EtOH를 사용하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
결과를 아래의 [표 3]에 나타내었다.
Figure 112015036566758-pat00003
상기 [표 3]의 결과는 80% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 활성을 보였으며 에틸아세테이트(EtOAC) 분획물이 보다 높은 활성을 보였음을 보여준다.
<실험예 2-2> 최소저해농도( Minimum inhibitory concentration , MIC )의 측정
최소저해농도(MIC)는 항균력 측정과 같은 Disk diffusion 방법으로 측정하였다. 항균성 시험용 평판 배지 조제는 시험균 농도를 650 nm에서 OD값 0.4(106 cfu/㎖)가 되게 한 후 pour-plate 방법에 따라 배지가 분주된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고시켜 균접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 시료(EtOAC 분획물임, 50 ㎍/㎖)는 100 %(v/v), 50 %(v/v), 25 %(v/v), 12.5 %(v/v), 6.25 %(v/v), 3.12 %(v/v), 1.56 %(v/v), 0.78 %(v/v)의 농도로 사용하였으며, 각각의 시료는 멸균된 Paper disc에 20 ㎕씩 천천히 흡수시킨 후, 용매를 완전히 증발시켰다. 시험용 평판배지 표면에 disc를 밀착시키고 각각의 배양온도에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생선된 생육 저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 최소저해농도를 분석하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
결과를 아래의 [표 4]에 나타내었다.
Figure 112015036566758-pat00004
반주름말의 분획물 중 가장 활성이 좋은 EEtOAC 분획물의 MIC를 측정하였더니, Staphylococcus aureus에 대해서는 25 %(v/v), Staphylococcus epidermidis에 대해서는 50 %(v/v)로 나타났다.

Claims (10)

  1. 반주름말 추출물을 유효성분으로 포함하는, 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 항균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 반주름말 추출물은 반주름말을 물, 에탄올 또는 이들 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 반주름말 추출물은 반주름말을 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 반주름말 추출물은 반주름말을 80% 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 반주름말 추출물은 반주름말의 80% 에탄올 추출물을 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.




  9. 삭제
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