KR101759424B1

KR101759424B1 - 신경교모세포종에 대한 저분자 화합물의 치료 용도

Info

Publication number: KR101759424B1
Application number: KR1020160020760A
Authority: KR
Inventors: 하윤; 오진수; 김용보; 차려화
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2017-07-20
Also published as: KR20170080541A; KR101889716B1; KR20170080390A

Abstract

본 발명은 신경교모세포종에 대한 저분자 화합물의 치료 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 저분자 화합물인 CHIR99021 및 Forskolin만을 사용하여 신경조직 내에서 선택적으로 신경교모세포종의 증식을 억제하고, 신경교모세포종을 신경세포로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 신경조직에 발생하는 종양에 대한 기존의 치료 원칙과 달리 악성 신경교모세포종의 운명을 양성의 신경세포로 직접 전환시키는 새로운 패러다임의 차세대 치료법을 제시하고 있다.
본 발명에 따른 화합물은 신경교모세포종에 대한 맞춤형 치료용 조성물로서 기존의 항암제 치료 및 외과적 수술에 의한 방법과 달리 내성 변이주의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등 부작용 없이 신경조직 내 교모세포종에 대한 선택적인 증식 억제 또는 신경세포로의 전환 효과를 나타냄으로써 신경교모세포종을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

신경교모세포종에 대한 저분자 화합물의 치료 용도{Therapeutic use of low-molecular weight compounds for glioblastoma}

본 발명은 신경교모세포종에 대한 저분자 화합물의 치료 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 저분자 화합물인 CHIR99021 및 Forskolin만을 사용하여 신경조직 내에서 선택적으로 신경교모세포종의 증식을 억제하고, 신경교모세포종을 신경세포로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

2006년도에, 유도만능줄기세포의 탄생을 시작으로 2010년도에는 3가지 신경세포 특이적 전사인자들을 강제로 발현시키는 전략을 통해 마우스 피부세포에서 신경세포로 직접 분화 유도가 가능하다는 것을 확인하였다. 그 이후로, 인간의 세포는 시험관 조건(in vitro) 뿐만 아니라 생체 내(in vivo)에서도 신경세포 직접 분화가 가능할 만큼 세포 운명을 전환할 수 있는 리프로그래밍(re-programming) 기술은 빠르게 진보하여 재생의학 연구의 새로운 영역을 차지하고 있다. 하지만, 한 개가 아닌 다수의 전사인자를 전환시키고자 하는 세포로 도입할 때 발생할 수 있는 문제점들(예를 들어, 비바이러스성 전달체를 이용할 경우 낮은 유전자 전달 효율의 문제, 바이러스 전달체 사용 시 안전성 문제)은 세포 운명 전환 기술의 가장 큰 장벽으로 생각되고 있다. 이를 극복하기 위한 방법으로 전사인자의 사용 개수를 줄이거나 혹은 대체할 수 있는 방법들이 발표되기 시작하였다. 3개의 전사인자를 사용하여 세포의 운명 전환을 시도하던 2010년을 시작으로 2012년에는 2개의 전사인자와 저분자 화합물을 혼합 사용하여 전사인자의 개수를 줄이는 방향의 연구 결과가 발표되었고, Ascl 1이라는 하나의 주요 전사인자만으로 세포의 운명이 전환되는 결과가 보고되었다(비특허문헌 1). 2015년에는 4개 또는 7개의 저분자 화합물만으로도 피부세포의 운명을 신경세포로 전환하는데 성공함으로써 신경세포 특이적 전사인자의 역할을 대신할 수 있는 저분자 화합물의 조합을 찾게 되었다.

상기에 기재된 바와 같이, 4개 혹은 7개의 저분자화합물만으로 피부세포의 운명을 신경세포로 전환 하는데 성공함으로써 유전자 전달 효율 및 방법에 대한 문제점은 해결 되었다. 또한, Liu 박사 연구팀 및 다른 연구팀은 ‘신경세포 특이적 전사인자가 도입된 피부세포가 수일 이내에 증식이 완전히 멈춘 신경세포로 전환 되었듯이’, 증식이 왕성한 악성 신경교모세포종의 운명 역시 분열이 종료된 신경세포로 전환 될 수 있다고 보고함으로써, 세포 운명 전환 기술이 새로운 개념의 뇌종양 치료 전략으로 사용될 수 있다는 가능성이 제시하였다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4). 하지만, 아직까지도 1) 오직 저분자화합물만으로 신경교모세포종의 운명 역시 분열이 종료된 신경 세포로 전환될 수 있는지, 2) 신경세포로의 직접전환을 유도한 4개 혹은 7개의 저분자화합물 중 가장 중요한 역할을 하는 최소한의 저분자화합물의 조합은 어느 것인지, 3) 전환 효율이 얼마나 되는지, 4) 신경교모세포의 증식을 억제할 수 있는지, 및 5) 항암제로서의 개발 가능성 여부에 대하여 보고된 바 없는 상태이다.

이에, 본 연구자들은 최근 각광 받고 있는 세포 운명 전환 개념을 기반으로 오직 두 개의 저분자 화합물만을 사용하여 악성 신경교모세포의 운명이 양성의 신경세포로 직접 전환될 수 있는지를 검증하기 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 두 개의 저분자 화합물만을 사용하여 악성 신경교모세포의 증식을 억제하고, 신경교모세포를 양성의 신경 세포로 직접 전환시키는 효과를 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

Channda S 외, 2014, Stem Cell Reports, 12(3): 282. Junli Zhao 외, 2012, Plos One, 7(7): e41506. Pierre-olivier guichet 외, 2013, GLIA, 61:225. Z Su 외, 2014, Cell Death, 5:e1463. Newlands E.S. et al., 1996, Eur. J. Cancer, 32A:2236. H.S. Philips H.S. et al., 2006, Cancer Cell, 9:1571.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,본 발명의 목적은 뇌종양 특히, 악성 신경교모세포종의 운명을 양성의 신경세포로 직접 전환시키는 화합물을 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 이용한 뇌종양의 치료 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 뇌종양 특히, 악성 신경교모세포종의 증식을 억제하는 화합물을 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 이용한 뇌종양의 치료 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 뇌종양 특히, 신경교모세포종을 포함하는 암의 예방 또는 치료에 사용되는 화합물을 포함하는 조성물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 신경조직에서 신경교모세포종에 대해서만 선택적으로 증식 억제 또는 신경세포로 전환시키는 효과를 갖는 저분자 화합물의 조합을 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 신경교모세포종의 치료 방법을 제공한다.

신경세포에 영양을 공급하는 신경교세포에 생긴 종양을 신경교종이라 한다. 이러한 신경교종을 핵의 비정형성, 세포괴사, 혈관내피세포 증식도, 유사분열성 등을 기준으로 조직학적으로 분류하여 가장 악성인 4등급으로 분류되면 이를 교모세포종(GBM, glioblastoma multiform)으로 진단하게 된다(비특허 문헌 5). 다형성 신경교모세포종(GM: glioblastoma multiforme)은 인간에서 발생하는 가장 보편적이며 가장 공격적인 악성 원발성 종양으로 여러 종류의 뇌종양 중 가장 악성 종양이며, 신경교세포와 관련되며 모든 두개 내 종양 중 가장 많은 부분을 차지한다. GM의 매년 발병률은 유럽 및 북아메리카에서 십만명 중 2~3명에서 발병한다. 다형성 교모세포종(GM)은 중추 신경계 암의 가장 보편적이고 치명적인 형태로 인식되고 있다. 대략 1년의 평균 생존율로 예후가 매우 좋지 못하고, 단지 약 3%만이 3년 넘게 생존하기 때문에 질병은 거의 예외 없이 치명적이다. 진단 후 평균 생존 기간은 치료가 없다면 3개월이며, 현재 이용되는 완전한 요법으로 약 1년이다. 연령이 증가할수록(60세 이상) 더 심각한 예후의 위험을 보인다. 사망 원인은 대개 대뇌 부종 및/또는 두개 내 압의 증가이며, 추가적으로 혈액 순환을 손상시키고 뇌 탈출증을 일으키는 종괴 효과이다.

최근에 교모세포종에 대한 방대한 유전자 발현 연구를 통하여 4가지 종류의 교모세포종 아류형이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 4가지 종류의 교모세포종 아형태는 각각 전신경 아류형(proneural subtype), 간엽성 아류형(mesenchymal subtype), 고전적 아류형(classical subtype) 및 신경형 아류형(neural subtype)이며, 아류형에 따라 환자의 생존기간, 환자의 평균 나이, 기존 치료제에 대한 반응도 등이 달라지는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 6). 교모세포종 아류형은 중요 유전자의 과발현이나 돌연변이 양상에서 큰 차이가 있다. 고전적 아류형에서는 EGFR(Epidermal growth factor receptor)이 비정상적으로 과발현되며, 다른 3가지 아류형과는 달리 암억제 유전자 ‘p53’에 돌연변이가 일어나지 않는다. 고전적 아류형 환자는 상대적으로 다른 아류형에 비해 치료 경과가 우수한 것으로 알려져 있다. 고전적 아류형과는 달리 전신경 아류형에서는 ‘p53’ 유전자의 돌연변이의 비율이 높으며 IDH1(Isocitrate dehydrogenase) 유전자와 PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor-α) 유전자의 돌연변이 비율도 높게 나타난다. 이들 유전자의 돌연변이는 암세포의 증식에 매우 중요하며, PDGFRA 유전자의 돌연변이는 전신경 아류형에서만 나타나고 있다. 전신경 아류형 환자는 다른 아류형에 비해서 환자의 나이가 젊지만 현재 사용하는 치료법으로 생존기간이 늘어나지는 않는다. 간엽성 아류형에서는 ‘p53’유전자의 돌연변이뿐만 아니라 NF1, PTEN 암억제 유전자의 돌연변이 비율도 높다. 신경성 아류형은 다른 아류형에서 발견되는 유전자의 돌연변이가 관찰되지만 특징적으로 높거나 낮은 돌연변이 비율을 보이지는 않는다.

현재까지 사용되는 뇌종양 치료 전략으로서 외과적 수술 방법과 방사선 요법 그리고 항암제 요법을 사용하여 교모세포종을 치료하고 있는데 GM으로 진단받은 환자의 예상 수명을 거의 연장하지 못하였고, GM은 고유한 복잡성 및 약물 내성의 복잡한 기전으로 인해 치료에 어려움을 겪고 있다. 동시 또는 순차적인 화학요법, 방사선요법, 항혈관형성 요법, 면역요법, 감마 나이프 방사선 수술, 및 코르티코스테로이드를 이용한 대증 치료와 함께 가능한 많은 종양의 수술적 절제술로 이루어진 다병합(multimodality) 치료에도 불구하고, 교모세포종은 중추 신경계(CNS) 악성 종양 중 최악의 예후를 보인다. 교모세포종이 발병된 환자를 치료하기 위해서는 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 고려하여야 할 뿐만 아니라, 교모세포종의 진행수준에 맞추어 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 등의 다양한 치료방법을 적용하여야 한다.

외과적 수술의 경우, 뇌종양을 수술로 직접 제거하는 방법으로 뇌종양에 대한 1차적 치료법이 되고 있으나, 신경계 조직의 특성상 정상조직의 손상을 주지 않는 가운데 완벽히 종양 세포를 제거하는 것이 불가능하므로 재발될 가능성이 높은 편이다. 항암약물 치료의 경우, 뇌종양의 치료에 광범위하게 사용되고 있으나, 독성이 강하고, 종양에 대한 선택성이 없으며, 뇌종양 세포가 항암제에 대한 내성을 지니게 되어 장기간 완벽한 제거가 어렵고, 뇌혈관 장벽의 존재로 인한 효과적인 약물 전달의 한계가 있다. 따라서, 이러한 한계점을 극복할 수 있는 새로운 패러다임의 뇌종양 치료 전략이 필요한 실정이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, GSK-3β(Glycogen synthetase kinase-3β) 억제제 및 고리형 AMP 증강제를 포함하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 신경교모세포종의 아형태는 전신경 아류형(proneural subtype), 간엽성 아류형(mesenchymal subtype), 고전적 아류형(classical subtype) 또는 신경형 아류형(neural subtype)이고, 상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하며, 상기 조성물은 뇌종양의 신경세포로의 전환을 향상시키며, 상기 GSK-3β(Glycogen synthetase kinase-3β) 억제제는 저분자 화합물 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴, 3F8, AR-A 014418, 10Z-히메니알디신(Hymenialdisine), 인디루빈-3’-옥심(indirubin-3’-oxime), 켄파울론(Kenpaullone), TC-G 24, TCS 2002, 및 TWS 119로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 1 내지 50 μM이고 바람직하게는 10 내지 20 μM이며, 상기 고리형 AMP 증강제는 저분자 화합물 포스콜린(Forskolin), NKH477, PACAP 1-27, PACAP 1-38, 6-Bzn-cAMP 나트륨 염, 8-브로모(Bromo)-cAMP, 및 디부티릴(dibutyryl)-cAMP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 포스콜린의 농도는 5 내지 200 μM이고 바람직하게는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다.

본 발명에 따른 다른 구체예에서, 인간을 제외한 포유동물 피험체에 GSK-3β(Glycogen synthetase kinase-3β) 억제제 및 고리형 AMP 증강제의 치료학적 유효량을 투여하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 신경교모세포종의 아형태는 전신경 아류형(proneural subtype), 간엽성 아류형(mesenchymal subtype), 고전적 아류형(classical subtype) 또는 신경형 아류형(neural subtype)이며, 상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하며, 상기 조성물은 신경교모세포종의 신경세포로의 전환을 향상시키며, 상기 GSK-3β(Glycogen synthetase kinase-3β) 억제제는 저분자 화합물 6-(2-(4-(-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴이며, 상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 1 내지 50 μM이고 바람직하게는 10 내지 20 μM이며, 상기 고리형 AMP 증강제는 저분자 화합물 포스콜린(Forskolin)이며, 상기 포스콜린의 농도는 5 내지 200 μM이고 바람직하게는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법을 제공하였다.

본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 고리형 AMP(cyclic AMP) 증강제를 유효성분으로 포함하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하고, 상기 조성물은 신경교모세포종의 신경세포로의 전환을 향상시키며, 상기 고리형 AMP 증강제는 저분자 화합물 포스콜린(Forskolin)이며, 상기 포스콜린의 농도는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하였다.

본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 인간을 제외한 포유동물 피험체에 고리형 AMP 증강제의 치료학적 유효량을 투여하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하고, 상기 조성물은 신경교모세포종의 신경세포로의 전환을 향상시키며, 상기 고리형 AMP 증강제는 저분자 화합물 포스콜린(Forskolin)이며, 상기 포스콜린의 농도는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법을 제공하였다.

본 명세서 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 용어 “교모세포종(glioblastoma, GBM)”은 정상적으로 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 기원한 종양을 의미한다. 구체적으로 상기 교모세포종은 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하고, 뇌 교종의 50~60%를 차지하는 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 많이 발생하는 종양이다.

본 발명에서 용어 “CHIR99021” 또는 “CHIR” 또는 “아미노피리미딘” 또는 “3-[3-(2-카르복시에틸)-4-메틸피롤-2-메틸리데닐]-2-인돌리논”이라는 용어는 IUPAC 명칭 “6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴”을 나타낸다. CHIR99021, 3F8, AR-A 014418, 10Z-히메니알디신(Hymenialdisine), 인디루빈-3’-옥심(indirubin-3’-oxime), 켄파울론(Kenpaullone), TC-G 24, TCS 2002, 또는 TWS 119는 WNT 신호전달 경로를 활성화하는 글리코겐 합성효소 키나아제 3β(GSK3 β)의 소분자 화학 억제제의 한 예이며 매우 선택적이어서 인간 GSK3 β에 대해 IC₅₀=6.7 nM 및 설치류 GSK3-β 상동체에 대해 나노몰 수준의 IC50 값을 가지며 관련 및 미관련 키나아제 패널에 대해 거의 1000배의 선택성을 나타낸다. CHIR99021은 CDK에 대한 교차-반응성을 나타내지 않는다. 또한, 인간 및 마우스 배아 줄기세포의 자기-재생을 강화시키는데, 체세포의 줄기세포로의 전환(reprogramming, 리프로그래밍)을 향상시키는 효과도 나타내고 있다.

본 발명에서 “포르스콜린(forskolin: IUPAC 명칭; 3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-trihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-1-oxo-3-vinyldodecahydro-1H-benzo[f]chromen-5-yl acetate)”은 생리적 특성조절물질로서 cAMP 신호를 활성화시키는 물질(cAMP 시그널링 액티베이터)로 알려져 있는데, 상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 화합물 외에도 8-br-cAMP 및 dbcAMP 을 포함한 모든 cAMP 시그널링 액티베이터(NKH477, PACAP 1-27, PACAP 1-38, 6-Bzn-cAMP 나트륨 염, 8-브로모(Bromo)-cAMP, 또는 디부티릴(dibutyryl)-Camp)가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 신호전달 분자 또는 신호전달 분자 경조의 억제에 대해 나타내는 “억제제” 또는 “신호전달억제제”라는 용어, 예컨대 SMAD 신호전달의 억제제, 글리코겐 합성효소 키나아제 3-β(GSK3-β)의 억제제는 분자 또는 경로의 신호전달 기능을 방해하는(즉 감소시키거나 억제하거나 제거하거나 차단하는) 화합물 또는 분자(예로, 소분자 펩티드, 펩티드 모사체, 천연화합물, 단백질, SIRNA, 안티센스 핵산, 앱타머, 또는 항체)를 나타낸다. 억제제에는 또한 상류 신호전달 분자를 방해하여 표적 분자의 생물학적 활성을 간접적으로 조절하는 분자가 포함된다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(Calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witelsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 신경조직에 발생하는 종양에 대한 기존의 치료 원칙과 달리 악성 신경교모세포종의 운명을 양성의 신경세포로 직접 전환시키는 새로운 패러다임의 차세대 치료법을 제시하고 있다.

본 발명에 따른 화합물은 신경교모세포종에 대한 맞춤형 치료용 조성물로서 기존의 항암제 치료 및 외과적 수술에 의한 방법과 달리 내성 변이주의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등 부작용 없이 신경조직 내 교모세포종에 대한 선택적인 증식 억제 또는 신경세포로의 전환 효과를 나타냄으로써 신경교모세포종을 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 저분자 화합물에 의한 인간 신경교모세포(U87MG)의 신경세포 전환 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 저분자 화합물에 의한 설치류 신경교모세포(F98)의 신경세포 전환 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합을 이용한 신경교모세포종의 신경세포로의 전환을 나타낸 결과이다.
도 4는 도 3의 결과에서 신경가닥의 면적과 길이에 대하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합을 이용한 피부세포의 신경세포로의 전환을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합에 의한 신경교모세포 증식의 억제 효과를 나타내는 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합과 표준치료약물의 신경교모세포에 대한 증식 억제를 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 저분자 화합물의 농도를 증량하여 신경교모세포의 증식에 미치는 효과를 나타내는 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 농도별 저분자 화합물의 조합에 의한 신경교모세포의 증식 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 고농도의 저분자 화합물 단독 또는 이의 조합을 처리한 후 7일 후 신경교모세포의 증식 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 고농도의 저분자 화합물을 각각 처리하거나 공동 처리하고 14일 지난 후의 신경교모세포의 증식에 대한 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합에 의한 유방암 세포의 증식 억제 효과를 나타내는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

신경교모세포 배양

인간신경교모세포(U87MG, ATCC HTB-14) 및 설치류 C6 (ATCC CCL-107) 혹은 F98 (ATCC CRL-2397)를 1% 항생제 (Gibco, 15140-122)와 10% FBS(Fetal bovine serum, gibco)이 포함된 DMEM (Thermo, cat# 11965-092) 배지에서 배양하였다. 신경교모세포는 2~3일에 한번씩 계대배양을 실시하였다.

신경교모세포의 분화 유도

2.1 신경세포로의 전환 유도

저분자 화합물이 신경세포 특이적 전사인자의 역할을 대신할 수 있다는 근거로부터, 신경교모세포와 다양한 저분자 화합물의 조합을 통하여 신경세포와 유사한 형태로의 형질전환을 확인하였다.

실험 시작 전에, DMEM/F12 (Gibco, 12634-010) 와 Neurobasal (Gibco, 21103-049)이 1:1로 혼합된 배지에 1% Glutamax (Gibco, 35050), 1% N2 supplement (Gibco, 17502-048), 2% B27 (Gibco, 17504-044), 0.05% 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, Gibco, 11020-021), 베타-머캡토에탄올(β-mergacptoethanol, Gibco, 21985), 1% 항생제 (Gibco, 15140-122)가 포함되도록 신경 유도 배지를 준비하였다. 설치류 C6 신경교모세포 4 x 10³개를 24 well plate에 분주하여 하루 동안 배양하였다. 상기 제조된 신경 유도 배지에 A83-01(Tocris, Cat# 2939, 최종 농도 0.5 μM, ALK5 억제제), GSK3-beta 억제제로서 CHIR99021(Tocris, Cat#4423, 최종농도 2 μM), 3F8 (tocris, cat.4083), AR-A 014418 (tocris, cat.3966), 10Z-Hymenialdisine (tocris, cat.1532), indirubin-3’-oxime (tocris, cat.1813), Kenpaullone (tocris, cat.1398), TC-G 24 (tocris, cat.4353), TCS 2002 (tocris, 3869) 또는 TWS 119 (tocris, cat.3835)를 각각 2 μM 처리하였고, 고리형 AMP(cyclic AMP)증강제로서 dbcAMP(sigma, Cat# D0627, 최종 농도 10 μM, AMP 증가제), Forskolin dbcAMP(tocris, Cat# 1099, 최종 농도 10 μM, AMP 증가제), NKH477 (tocris, cat.1603), PACAP 1-27 (tocris, cat.1183), PACAP 1-38 (tocris, cat.1186), 6-Bzn-cAMP sodium salt (tocris, cat.5255), 8-Bromo-cAMP (tocris, cat.1140) 또는 Dibutyryl-cAMP (tocris, cat.1141)를 각각 10 μM 처리하거나 혹은 GSP-beta 억제제와 고리형 AMP 증강제를 혼합하여 신경교모세포종에 처리한 후 약 7일간 배양하여 신경교모세포가 신경세포 형태로 전환될 수 있는지의 여부를 확인하였다. 배지는 2~3일에 한 번씩 교환하였다. 저분자 화합물을 처리한 그룹이 대조군과는 달리 신경세포로의 형질전환이 진행됨을 확인하였다(도 1; 인간신경교모세포 U87MG, 도 2; 설치류 신경교모세포 F98).

2.2 신경세포 분화 여부

신경 유도 배지에서 7일간 배양한 후, 신경세포 특이적 마커인 tuj1 항체 (abcam, ab18207)를 사용하여 면역형광염색을 실시하였다. 1 x PBS로 간단히 세척한 후 4% 파라포름알데히드 (Merck, cat# 104005)를 처리하여 상온에서 10분간 반응시켜 세포 고정을 실시하였다. 0.3% 트리톤 X 100 (Sigma, cat# X100) 및 10% 일반 당나귀 혈청(normal donkey serum, Jackson ImmunoResearch, cat# 017-000-121)을 포함하는 1 x PBS를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.3% 트리톤 X 100 및 10% 일반 당나귀 혈청을 포함하는 1 x PBS에 신경세포 특이적 항체인 Tuj1을 약 2000배 희석하여 세포에 처리한 후 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후, 형광물질이 함유된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, cat# 711-165-152, 1:500배 희석)를 30분간 암실에서 반응한다. 이후, 1 x PBS를 사용하여 세포를 3회 세척한 후 형광현미경을 통해 신경세포 전환 여부를 분석하였다. A83-01과 CHIR99021을 각각 처리한 그룹에서도 신경세포 특이적 마커인 Tuj1에 양성반응을 보이는 몇몇 세포를 확인하였으나, dbcAMP를 단독으로 처리한 경우, A83-01 또는 CHIR99021과 혼합하여 처리할 때 신경세포 특이적 마커인 Tuj1에 양성반응을 보이는 세포의 개수가 증가하였고 신경세포에 더 유사한 형태를 나타내었다(도 3).

도 3의 결과로부터, 신경가닥의 면적(도 4 좌측) 및 신경가닥의 길이(도 4 우측)를 정량하였을 때, AMP 유발인자인 dbcAMP(10 μM)이 포함된 4 종류의 조건(적색 표시)에서 신경가닥의 면적과 길이가 유사하고 이는 다른 조건에 비해 더 크다는 것을 확인하였다(도 4).

본 발명에 따른 저분자 화합물 조합의 일반 피부세포에 대한 신경세포로의 분화 효과를 검증하여 신경교모세포종에 대한 분화 효과와 비교하였다. 다양하게 조합된 저분자 화합물(A83-01 O.5μM, CHIR99021 2μM, Forskolin 10μM)을 포함하는 신경분화배지에서 마우스 피부 세포를 약 7일간 배양한 후 신경세포마커인 Tuj1에 대한 면역형광염색을 실시하였다. 신경교모세포종에 대한 결과와는 달리, 마우스피부세포에서는 본 발명에 따른 저분자 화합물의 조합에 의해 신경세포로의 분화가 발생하지 않았다(도 5).

세포 증식 억제 효과

3.1 저분자 화합물의 조합

신경교모세포에 대하여 다양한 저분자 화합물의 조합에 의한 세포 증식 억제 효과를 확인하였다. C6 신경교모세포 4 x 10³개를 24 well plate에 분주하여 하루 동안 배양하였다. 신경교모세포를 각각의 저분자 화합물이 처리된 신경 유도 배지에서 7 일간 배양한 후, 세포 증식능을 분석하였다. 24 well plate에 배양 중인 세포에 MTT 용액(Sigma, cat# M5655, 최종농도 5mg/ml) 50 ㎕를 직접 처리하고 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 배양 배지를 제거하여 보라색 결정체가 형성됨을 확인하였다. 1 ㎖의 DMSO (Sigma, cat# D8418)를 사용하여 37℃에서 10분간 반응시켜 보라색 결정체를 용해시켰다. 용해된 결정체를 포함하는 DMSO 용액 100 ㎕를 96 well plate로 옮겼고, 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 세포 증식을 측정하였다.

항암제 개발을 목적으로 하는 신경교모세포의 증식 억제 효과를 고려할 때, 4가지 조건(도 4 내 적색 표시) 중에서 CHIR99021(2 μM) 및 dbcAMP (10 μM)를 혼합하여 사용하는 것이 다른 조건에 비해 신경교모세포에 대한 증식 억제 효과가 가장 큰 것으로 확인하였다(도 6). 저분자 화합물을 처리한 신경교모세포의 신경세포 분화 효과(도 4) 및 신경교모세포의 증식 억제 효과(도 6)로부터 CHIR99021(2 μM)과 dbcAMP(10 μM)의 혼합 조건이 CHIR99021 (2 μM) 혹은 dbcAMP (10 μM)를 각각 단독으로 처리한 조건에 비해 1) 신경세포 전환 효율을 증가시키거나, 혹은 2) 신경교모세포종의 증식을 억제하는데 가장 효과적인 조합인 것으로 확인하였다.

본 발명에 다른 저분자 화합물 CHIR99021 및 Forskolin의 조합(CF=C+F, CHIR99021 20μM + Forskolin 100μM)과 표준치료약물로 사용되는 테모졸로마이드(Temozolomide)의 신경교모세포에 대한 증식 억제 효과와 비교하였다. 일반적인 세포에 대한 실험에서 테모졸로마이드는 1~10 ㎍/㎖ 농도로 사용되므로 본 실험에서는 10 ㎍/㎖ 농도의 테모졸로마이드를 사용하였다. 각 화합물을 처리한 후 6일째에 MTT 시험을 통해 신경교모세포종의 증식 억제효과를 확인하였다. 본 발명에 따른 화합물의 조합(CF)은 표준치료약물인 10 ㎍/㎖ 농도의 테모졸로마이드에 비해 신경교모세포의 증식 억제효과가 더 크다는 것을 확인하였다(도 7).

3.2 저분자 화합물의 농도

신경교모세포의 증식을 억제하기 위한 두 가지 저분자 화합물(CHIR99021 및 dbcAMP)의 최적 농도를 조사하기 위해서 각각의 저분자 화합물을 2 내지 10배 증강하여 신경교모세포에 처리하여 배양한 후 신경교모세포 증식 억제 효과를 관찰하였다. CHIR99021과 Forskolin의 농도를 기존 농도의 2 내지 10배 증량한 후 처리할 때 기존 CHIR99021 농도(2 μM) 및 Forskolin 농도(10 μM)에 비해 C6 신경교모세포의 증식이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 8). GSK-3β 억제제로서 3F8 (tocris, cat.4083), AR-A 014418 (tocris, cat.3966), 10Z-Hymenialdisine (tocris, cat.1532), indirubin-3’-oxime (tocris, cat.1813), Kenpaullone (tocris, cat.1398), TC-G 24 (tocris, cat.4353), TCS 2002 (tocris, 3869) 또는 TWS 119 (tocris, cat.3835) 및 고리형 AMP(cyclic AMP) 증강제로서 NKH477 (tocris, cat.1603), PACAP 1-27 (tocris, cat.1183), PACAP 1-38 (tocris, cat.1186), 6-Bzn-cAMP sodium salt (tocris, cat.5255), 8-Bromo-cAMP (tocris, cat.1140), 또는 Dibutyryl-cAMP (tocris, cat.1141)에 대해서도 유사한 결과를 확인하였다.

추가적으로, 저분자 화합물의 조합을 증량하여 신경교모세포에 대한 증식 억제 효과를 확인하였다. CHIR99021과 Forskolin의 농도를 기존 농도의 2 내지 10배까지 다양하여 증량 및 조합하여 처리하였을 때, 신경교모세포의 증식 억제에 대한 효과를 확인하였다(도 9). 도 9에서 신경교모세포의 증식 효과가 가장 우수한 CHIR99021(20 μM) 및 Forskolin(100 μM)을 각각, 또는 조합 처리하여 단독 처리에 비해 조합하여 처리한 경우 C6 신경교모세포에 대한 증식 감소 효과가 더 커지는 것을 확인하였다(도 10). 또한, 7일에서 14일로 배양기간을 연장한 후 신경교모세포의 밀도를 조사한 결과, CHIR99021(20 μM) 및 Forskolin(100 μM)을 고농도로 각각 처리한 경우는 신경교모세포의 증식을 완전히 억제하지 못하고 배양기간이 증가함에 따라 세포 증식이 계속되는 경향을 보였다 (도 11). 하지만, 고농도의 두 저분자화합물을 조합하여 처리한 경우에는 배양기간이 증가함에도 불구하고 신경교모세포의 세포밀도가 크게 변하지 않는다는 것을 확인하였다 (도 11). 두 저분자 화합물을 조합하여 처리한 경우, 신경교모세포를 분주한 후 세포의 재부착 없이 5주 이상 배양이 가능할 정도로 왕성한 신경교모세포의 증식을 억제하였다.

본 발명에 따른 화합물의 조합인 CHIR99021 및 Forskolin 조합(CF=C+F, CHIR99021 20μM + Forskolin 100 μM)과 표준치료약물로 사용되는 테모졸로마이드(Temozolomide)의 유방암세포에 대한 증식 억제 효과를 비교하였다. 테모졸로마이드는 유방암세포의 증식을 억제하지 못하지만 CHIR99021 및 Forskolin 조합(CF)은 유방암세포에 대한 증식 억제 효과가 나타남을 확인하였다(도 12).

본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.

Claims

6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴 및 포스콜린(Forskolin)을 포함하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 신경교모세포종의 아형태는 전신경 아류형(proneural subtype), 간엽성 아류형(mesenchymal subtype), 고전적 아류형(classical subtype) 및 신경형 아류형(neural subtype)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
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제 1항에 있어서,
상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 1 내지 50 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 10 내지 20 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 포스콜린의 농도는 5 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 포스콜린의 농도는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 신경교모세포종의 예방 또는 치료용 조성물.
인간을 제외한 포유동물 피험체에 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴 및 포스콜린(Forskolin)의 치료학적 유효량을 투여하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
제 11항에 있어서,
상기 신경교모세포종의 아형태는 전신경 아류형(proneural subtype), 간엽성 아류형(mesenchymal subtype), 고전적 아류형(classical subtype) 및 신경형 아류형(neural subtype)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
제 11항에 있어서,
상기 조성물은 신경교모세포종의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
삭제
삭제
제 11항에 있어서,
상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 1 내지 50 μM인 것을 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
제 16항에 있어서,
상기 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코니노니트릴의 농도는 10 내지 20 μM인 것을 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
삭제
제 11항에 있어서,
상기 포스콜린의 농도는 5 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
제 19항에 있어서,
상기 포스콜린의 농도는 50 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 피험체 내 신경교모세포종의 치료 방법.
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