KR101753797B1 - 생인공 폐 - Google Patents

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Abstract

기도 기관 생물반응기 장치, 및 이의 사용 방법뿐만 아니라 상기 방법을 사용하여 생성된 생인공 기도 기관, 및 생인공 기도 기관을 사용하여 피검체를 치료하는 방법이 제시된다.

Description

생인공 폐{Bioartificial Lung}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2009년 6월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/184,170호, 및 2009년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/256,281호의 우선권을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본원에서 참조로 통합된다.
기술 분야
본원은 조직 생성과 관련된 장치 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원은 인간 또는 동물 피검체의 이식가능한 폐 조직을 생성하기 위한 방법을 제공한다.
폐 이식(lung transplant)은 폐 부전, 예를 들어, 다른 것들 중에서, 만성 폐색성 폐질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD) COPD, 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis), 폐암, 및 선천성 폐 질병으로 대표되는 질환을 앓고 있는 다수의 환자들에게 마지막 희망을 나타난다. 폐 이식을 위한 전형적인 대기 시간은 2년 이상이 될 수 있어서, 대기 목록 상의 환자들에 대하여 30%의 사망률을 초래한다.
기도 기관 생물반응기(bioreactor) 장치가 제시된다. 이 장치는 세포 배지(media)가 관류되어 기관을 성장시키는 기관 기질 스캐폴드(scaffold)를 유지시키도록 구성된 기관 챔버를 구비한다. 상기 장치는 또한 커넥터(connector)의 제 1 브랜치(branch)를 통해 기관에 습식 환기(wet ventilation)를 공급하도록 구성된 습식 호흡기 시스템을 구비한다. 상기 장치는 또한 커넥터의 제 1 브랜치를 통해 기관에 건식 환기(dry ventilation)를 공급하도록 구성된 건식 호흡기 시스템을 구비한다. 상기 장치는 또한 습식 환기의 전달 또는 건식 환기의 전달을 제어하도록 구성된 제어기를 구비한다.
상기 장치는 또한 기관에 연결된 제 1 브랜치, 제 2 브랜치, 및 제 3 브랜치를 포함하는 커넥터를 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 커넥터의 제 1 브랜치 및 커넥터의 제 2 브랜치가 커넥터의 제 3 브랜치와 연결되는 제 1 삼-방향 접합부(3-way junction)를 구비한다. 스위치(switch)를 포함하는 삼-방향 접합부는 제 1 브랜치와 제 2 브랜치 사이에서 전환(toggle)되도록 구성될 수 있다. 상기 장치는 또한 커넥터의 제 1 브랜치를 통해 기관에 습식 환기를 공급하도록 구성된 습식 호흡기 시스템을 구비한다. 상기 장치는 또한 커넥터의 제 2 브랜치를 통해 기관에 건식 환기를 공급하도록 구성된 건식 호흡기 시스템을 구비한다. 상기 장치는 또한 제 1 삼-방향 접합부의 스위치를 제어하여, 이로 인해 습식 환기의 전달 또는 건식 환기의 전달을 제어하도록 구성된 제어기를 구비한다.
상기 장치는 또한 유입 라인을 거쳐 기관에 세포 배지를 공급하고, 제 1 브랜치, 제 2 브랜치, 및 제 3 브랜치를 포함하는 유출 라인을 거쳐 기관으로부터 폐배지를 배출하도록 구성된 저장소 시스템 및 유출 라인의 제 1 브랜치 및 유출 라인의 제 2 브랜치가 유출 라인의 제 3 브랜치와 연결되는 제 2 삼-방향 접합부를 포함한다. 습식 호흡기 시스템은 습식 환기 라인을 통해 기관 챔버에 연결된 습식 호흡기; 및 커넥터의 제 1 브랜치를 통해 기관에 연결된 컴플라이언스(compliance) 챔버를 포함할 수 있다. 습식 호기말 양압(wet positive and expiratory pressure; wPEEP)은 컴플라이언스 챔버의 상승을 통해 기관 챔버에 제공될 수 있다. 상기 장치는 또한 유출 라인의 제 2 브랜치를 통해 기관 챔버에 연결되고, 유출 회송 라인을 통해 저장소 시스템에 연결된 후부하 챔버를 포함할 수 있다. 저장소 시스템은 유입 라인을 통해 기관 챔버에 연결된 제 1 저장소; 및 기관 챔버의 배출부를 통해 기관 챔버에 연결되고, 유출 회송 라인을 통해 후부하 챔버에 연결된 제 2 저장소를 포함할 수 있고, 제 1 저장소 및 제 2 저장소는 저장소 공급 라인 및 저장소 배출부를 거쳐 배지를 순환시킨다. 건식 호흡기 시스템은 커넥터의 제 2 브랜치를 통해 기관에 연결된, 네블라이저(nebulizer)를 포함하는 건식 환기 챔버; 및 기관 챔버에 건식 호기말 양압(dPEEP)을 제공하도록 구성되고, dPEEP 라인을 통해 건식 환기 챔버에 연결된 제 1 건식 호흡기를 포함할 수 있다. 건식 호흡기 시스템은 또한 건식 호흡기 라인을 통해 기관 챔버에 연결된 제 2 건식 호흡기를 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 기관 챔버, 건식 환기 챔버, 및 저장소 시스템에 가스성 배지를 공급하도록 구성된 가스 탱크를 포함할 수 있다. 제어기는 컴퓨터에 의해 작동될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 생인공 기도 기관을 제공하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 폐 조직 기질 및 실질적인 맥관(vasculature)을 포함하는 폐 조직 기질을 제공하고; 폐 조직 기질을 세포로 시딩(seeding)하고; 기관에 제 1의 요망되는 기관 성숙도가 일어나기에 충분한 시간 동안 습식 환기를 제공하고; 습식-성숙된(wet-matured) 기관에 제 2의 요망되는 기관 성숙도가 일어나기에 충분한 시간 동안 건식 환기를 제공하고, 이로 인해 생인공 폐(bioartificial Lung)를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 기관의 맥관을 거쳐 내피 세포로 폐 조직 기질을 시딩하고; 기관의 기도를 거쳐 상피 세포로 기도 폐 조직 기질을 시딩하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 기관의 맥관을 거쳐 줄기 세포로 폐 조직 기질을 시딩하는 것을 포함할 수 있다. 줄기 세포는 골수 유래 간엽 줄기 세포(bone marrow derived mesenchymal stem cell) 또는 유도 만능 줄기(induced pluripotent stem; iPS) 세포일 수 있다. 줄기 세포는 30cc의 유체 당 약 100 × 106 개의 세포 농도로 유체 중에 현탁될 수 있다. 내피 세포는 10cc의 유체 당 약 100 × 106 개의 세포 농도로 유체 중에 현탁될 수 있다. 상피 세포는 5cc의 유체 당 약 100 × 106 개의 세포 농도로 유체 중에 현탁될 수 있다. 상기 방법은 또한 제 1의 요망되는 기관 성숙도가 일어날 때까지 기관 성숙도를 모니터링하고; 기관에 습식 환기를 제공하는 것을 중지하고; 기관에 인공 계면활성제를 적용하고; 기관에 건식 환기의 제공을 개시하는 것을 포함할 수 있다. 폐 조직 기질에 습식 환기를 제공하는 것은 습식 호흡기 라인을 통해 습식 호흡기에 기도를 연결하고; 습식 환기 라인을 통해 컴플라이언스 챔버에 기관을 연결하고; 습식 환기 라인을 거쳐 습식 기도 압력을 증가시키고; 컴플라이언스 챔버를 상승시킴으로써 기관에 습식 호기말 양압(wPEEP)을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 습식 환기는 생리적 1회 호흡량(tidal volume)으로 제공된다. 습식-성숙된 기관에 건식 환기를 제공하는 것은 건식 환기 라인을 통해 건식 환기 챔버에 기도를 연결하고; 건식 호기말 양압(dPEEP) 라인을 거쳐 제 1 건식 호흡기에 건식 환기 챔버를 연결하고; 건식 환기 라인을 거쳐 건식 기도 압력을 증가시키고; 습식 환기 라인의 연결을 중단시키고; 건식 호흡기 라인을 통해 제 2 건식 호흡기에 기관을 연결하는 것을 포함할 수 있다. 폐 조직 기질은 탈세포화된(decellularized) 인간의 폐 조직 또는 인공 폐 기질을 포함할 수 있다. 생인공 폐는 완전한 폐 기능 또는 이의 단편을 제공하기에 충분한 수의 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 생인공 폐를 특징으로 한다. 생인공 폐는 완전한 폐 또는 이의 일부일 수 있다.
추가의 측면에서, 본원은 손상되거나 감소된 폐 성능을 지닌 피검체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 피검체에 생인공 폐를 이식하는 것을 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명을 실행하기 위해 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 그 밖의 참고 문헌은 이의 전체 내용이 참조로 통합된다. 상충의 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서는 조절될 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에 대한 세부 사항은 첨부된 도면과 하기 상세한 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 예시적인 폐 생물반응기의 개략도이다.
도 2a, 2b, 2c, 및 2d는 폐 생물반응기에서 폐 조직을 성장시키기 위한 예시적인 방법의 순서도이다.
도 3은 예시적인 폐 탈세포화 유닛의 개략도이다.
도 4는 세포 시딩 방식에서의 예시적인 폐 생물반응기의 개략도이다.
도 5는 관류 방식에서의 예시적인 폐 생물반응기의 개략도이다.
도 6은 예시적인 폐 생물반응기의 개략도이다.
본원은 기관 생성에 관여하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로 인간 및 다른 동물로의 이식이 준비된 기능성 기도 기관의 성장을 위해 보다 실현가능한 환경을 제공하는데 사용될 수 있는 기능성 폐 조직을 생성하도록 구성된 생물반응기의 발견을 기초로 한다. 폐 조직은 주어진 기질, 예를 들어, 인공 또는 탈세포화된 폐 조직 기질 상에 생성된다.
본원에서 사용된 "기능성(functional)" 폐 조직은, 예를 들어, 산소를 공기에서 혈류로 운반하고, 이산화탄소를 혈류에서 공기로 방출시키는 대부분의 또는 모든 정상적인 건강한 폐의 기능을 수행한다. 폐는 흡입된 공기를 가습시키고, 계면 활성제를 생성하여 폐포에서 표면 장력을 감소시키고, 점액(mucus)을 생성하고 운반하여 원위 기도로부터 근위 기도까지 흡입한 미립 물질을 제거한다.
본원에서 사용된 용어 "탈세포화(decellularized)" 및 "무세포(acellular)"는 교환가능하게 사용되고, 표준 조직학적 염색 절차를 이용한 검출가능한 세포내, 내피 세포, 상피세포, 및 조직학적 절편에서의 핵의 완전하거나 거의 완전한 부재로서 정의된다. 바람직하게는, 필수적이지는 않지만, 잔여 세포 파편은 또한 탈세포화된 기관 또는 조직으로부터 제거된다.
탈세포화된 조직/기관의 기질
탈세포화된 폐 조직 기질을 제조하기 위한 방법 및 물질은 당해 공지되어 있다. 임의의 적절한 물질이 이러한 기질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조직 기질은 탈세포화된 폐 조직으로부터 발생된 무세포 조직 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, 조직, 예컨대, 인간의 폐, 또는 이의 일부는 형태학적 무결성(morphological integrity) 및 세포 또는 세포 일부의 맥관을 유지하고, 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 단백질을 보존하면서 조직으로부터 네이티브(native) 세포를 제거하기 위한 적절한 방법에 의해 탈세포화 될 수 있다. 일부 경우에, 사체의 폐, 또는 이의 일부가 사용될 수 있다. 탈세포화 방법은 액체 질소를 사용한 반복된 동결-융해(freeze-thaw) 주기로 조직(예를 들어, 폐 조직)을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 조직은 비이온성 또는 이온성 세포 분열(cellular disruption) 배지, 예컨대, 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG), 또는 트리톤X-100로 처리될 수 있다. 조직은 또한 누클레아제 용액(예를 들어, 리보누클레아제, 데옥시리보누클레아제)으로 처리되고, 약하게 교반하면서 멸균 인산 완충 식염수로 세척될 수 있다. 일부 경우에, 탈세포화는 당해 공지된 방법 및 물질을 이용하여 기관 또는 조직의 용기, 덕트(duct), 및/또는 캐비티(cavity)를 캐뉼레이팅(cannulate)함으로써 수행될 수 있다. 캐뉼레이팅 단계에 따라, 기관 또는 조직은 상기 기재된 바와 같이 세포 분열 배지로 캐뉼라를 통해 관류될 수 있다. 조직을 통과한 관류는 제방향(antegrate) 또는 역방향(retrograde)으로 될 수 있고, 방향성은 관류 효율을 향상시키기 위해 교대될 수 있다. 기관 또는 조직의 크기 및 중량 및 특정 비이온성 또는 이온성 세정제 및 세포 분열 배지에서의 비이온성 또는 이온성 세정제의 농도에 의존하여, 조직은 일반적으로 세포 분열 배지에 의해 조직 그램 당 약 2 내지 약 12 시간으로 관류된다. 세척을 포함하여, 기관은 조직의 그램 당 약 12 내지 약 72 시간 이하 동안 관류될 수 있다. 관류는 일반적으로 유속 및 유압을 포함하는 생리적 조건으로 조절된다.
탈세포화된 조직은 맥관 계의 ECM 성분을 포함하는, 모든 또는 대부분의 조직 영역의 세포외 기질(ECM) 성분을 필수적으로 포함할 수 있다. ECM 성분은 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 훼밀리의 일원(예를 들어, 콜라겐 I, III 및 IV), 글리코사미노글리칸, 세포간 물질(ground substance), 세망 섬유(reticular fiber) 및 트롬보스폰딘 중 임의의 또는 모든 물질을 포함할 수 있으며, 이는 규정된 구조, 예컨대, 기저판(basal lamina)으로서 조직화되어 있을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 탈세포화된 폐 조직 기질은 실질적으로 무손상 맥관을 보유한다. 실질적으로 무손상 맥관을 보존하는 것은 이식 시, 조직 기질을 피검체의 맥관 시스템에 연결가능하게 한다. 게다가, 탈세포화된 조직 기질은 추가로 예를 들어, 조사(예를 들어, UV, 감마)로 처리되어 탈세포화된 조직 기질 상에 또는 탈세포화된 조직 기질에 남아 있는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소시키거나 제거할 수 있다.
물리적, 화학적 및 효소적 수단을 이용하여 탈세포화된 조직 기질을 얻기 위한 방법은 당해 공지되어 있다[참조: Liao et al, Biomaterials 29(8):1065-74 (2008); Gilbert et al., Biomaterials 27(9):3675-83 (2006); Teebken et al., Eur. J. Vasc. Endovasc . Surg. 19:381-86 (2000)] 및 [미국 특허공보번호 제 2009/0142836호; 제 2005/0256588호; 제 2007/0244568호; 및 2003/0087428호].
인공 기관의 기질
인공 기관의 기질을 제조하기 위한 방법 및 물질은 당해 공지되어 있다. 임의의 적절한 물질이 이러한 기질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인공 기관의 기질은 예를 들어, 폴리글리콜산, Pluronic F-127(PF-127), 겔폼 스폰지(Gelfoam sponge), 콜라겐-글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan; GAG), 피브리노겐-피브로넥틴-비트로넥틴 하이드로젤(fibrinogen-fibronectin-vitronectin hydrogel; FFVH), 및 엘라스틴과 같은 다공성 물질로부터 개발된 스캐폴드일 수 있다[참조: Ingenito et al., J Tissue Eng Regen Med. 2009 Dec 17; Hoganson et al., Pediatric Research, May 2008, 63(5):520-526; Chen et al., Tissue Eng. 2005 Sep-Oct;11(9-10):1436-48]. 일부 경우에, 인공 기관 기질은 폐포 유닛과 유사한 다공성 구조를 가질 수 있다[참조: Andrade et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol . 2007 Feb;292(2):L510-8]. 일부 경우에, 이식된 인공 기관의 기질은 기관-특이적 마아커(예를 들어, 클라라 세포, 폐세포, 및 호흡 상피에 대한 폐-특이적 마아커)를 발현시킬 수 있다. 일부 경우에, 이식된 인공 기관 기질은 식별가능한 구조(예를 들어, 인공 폐의 기질에서 폐포 및 말단 기관지와 유사한 구조)로 조직화될 수 있다. 예를 들어, FFVH를 사용하여 제조된 이식된 인공 폐의 기질은 주변 조직에 대한 영양 효과의 증거로 세포 부착, 확산 및 생체외 세포외의 기질 발현 및 생체 내 뚜렷한 생착(engraftment)을 촉진할 수 있다[참조: Ingenito et al., supra] 및 [참조: 미국특허번호 제 7,662,409호 및 제 6,087,552호; 미국특허공보번호 제 2010/0034791호; 제 2009/0075282호; 제 2009/0035855호; 제 2008/0292677호; 제 2008/0131473호; 제 2007/0059293호; 제 2005/0196423호; 제 2003/0166274호; 제 2003/0129751호; 제 2002/0182261호; 제 2002/0182241호; 및 제 2002/0172705호].
세포 시딩
본원에 기재된 방법에서, 폐 조직 기질, 예를 들어, 탈세포화된 폐 조직 기질 또는 생인공 폐의 기질은 세포, 예를 들어, 분화 또는 재생 세포로 시딩된다.
임의의 적절한 재생 세포의 유형, 예컨대, 미접촉(naive) 또는 미분화 세포 유형이 폐 조직 기질을 시딩하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 재생 세포는 비제한적으로, 간세포(progenitor cell), 전구 세포(precursor cell), 및 탯줄의 제대(umbilical cord) 세포(예를 들어, 인간의 탯줄 정맥(umbilical vein) 내피 세포) 및 태아 줄기 세포를 포함하는 "성체(adult)"-유래 줄기 세포를 포함할 수 있다. 재생 세포는 또한 분화 세포 또는 위탁 세포 유형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 물질에 대한 적절한 줄기 세포는 인간의 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPSC), 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell), 인간의 탯줄 정맥 내피 세포, 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cells ;MAPC), 또는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다른 조직으로부터 유래된 재생 섬유가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부, 뼈, 근육, 골수, 활막(synovium), 또는 지방 조직으로부터 유래된 재생 세포가 줄기 세포-시딩된 조직 기질을 발달시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 폐 조직 기질은 또한 분화 세포 유형, 예컨대, 인간의 상피 세포 및 내피 세포로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 폐 기질은 맥관을 통해 내피 세포, 및 관류 시딩을 통해 상피 세포 및 간엽 세포, 및 인간의 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)로 시딩될 수 있다.
시딩을 위해 세포를 분리하고 수집하기 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포는 일반적으로 전사 인자, 예컨대, Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC, Nanog, 및 Lin28의 이소성(ectopic) 발현에 의해 "역분화된(reprogrammed)" 체세포로부터 만능 상태로 얻어질 수 있다[문헌 참조: Takahashi et al., Cell 131:861-72 (2007); Park et al., Nature 451:141-146 (2008); Yu et al., Science 318:1917-20(2007)]. 제대혈 줄기 세포는 신선하거나 냉동된 탯줄의 제대혈로부터 분리될 수 있다. 간엽 줄기 세포는 예를 들어, 미가공의 비정제된 골수 또는 피콜(ficoll)-정제된 골수로부터 분리될 수 있다. 당해 공지된 방법에 따라, 상피 세포 및 내피 세포는 생체 또는 사체 공여자로부터 예를 들어, 생인공 폐를 받을 피검체로부터 분리 또는 수집될 수 있다. 예를 들어, 상피 세포는 피부 조직 샘플로부터 얻어질 수 있고, 내피 세포는 맥관 조직 샘플로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해 효소(proteolytic emzyme)는 맥관에 위치한 카테테르(catheter)를 지나 조직 샘플로 관류된다. 효소적으로 처리된 조직의 일부는 또한 효소적 파괴 및 기계적 파괴에 적용될 수 있다. 이러한 방식으로 얻어진 세포의 혼합물은 분리되어 상피 세포 및 내피 세포를 정제할 수 있다. 일부 경우에, 유세포 분석기(flow cytometry)-기반 방법(예를 들어, 형광-이용 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorting))는 특이적 세포 표면 마아커의 존재 또는 부재를 기초로 하여 세포를 분류하기 위해 사용될 수 있다. 비-자가 세포가 사용되는 경우에, 면역 유형-매칭 세포의 선택, 피검체에 이식될 경우에 기관 또는 조직이 거부 반응을 보이지 않도록 고려되어야 한다.
분리된 세포는 완충 용액(예를 들어, 인산 완충 식염수)으로 세정되고 세포 배양 배지에서 재현탁될 수 있다. 표준 세포 배양 방법이 사용되어 세포군을 배양하거나 확장할 수 있다. 일단 얻어지면, 세포는 조직 기질과 접촉하여 기질을 시딩할 수 있다. 예를 들어, 조직 기질은 임의의 적절한 세포 밀도로 생체 외에서 하나 이상의 세포 유형으로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 기질을 시딩하기 위한 세포 밀도는 적어도 1x103 세포/그램 기질일 수 있다. 세포 밀도는 약 1x105 내지 약 1x1010 세포/그램 기질(예를 들어, 적어도 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000,000,000, 또는 10,000,000,000 세포/그램 기질)의 범위로 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 탈세포화된 또는 인공 폐 조직 기질은 관류 시딩에 의해 상기 기재된 세포 유형 및 세포 밀도로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 유동 관류 시스템은 사용되어 조직 기질에 보존된 맥관 시스템을 통해 탈세포화된 폐 조직 기질을 시딩될 수 있다. 일부 경우에, 자동화된 유동 관류 시스템은 적절한 조건 하에서 사용될 수 있다. 이러한 관류 시딩 방법은 시딩 효율성을 향상시키고, 조성물 전체에 보다 균일한 분포의 세포를 제공할 수 있다. 생화학 및 화상 정량 분석 기술(Quantitative biochemical and image analysis technique)은 정지 또는 관류 시딩 방법에 따라 시딩된 세포의 분포를 평가하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 조직 기질은 시딩된 재생 세포의 분화를 자극하기 위해 하나 이상의 성장 인자로 침투될 수 있다. 예를 들어, 조직 기질은 본원에 제공된 방법 및 물질에 대한 적절한 성장 인자, 예를 들어, 맥관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), TGF-β 성장 인자, 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-4), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor; PDGF), 기본 섬유모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor ;b-FGF), 예를 들어, FGF-10, 인슐린형 성장 인자(insulin-like growth factor; IGF), 상피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 또는 성장 분화 인자-5(growth differentiation factor-5; GDF-5)로 침투될 수 있다[참조: Desai and Cardoso, Respir. Res. 3:2 (2002)].
시딩된 조직 기질은 시딩 후 소정 시간 동안(예를 들어, 몇 시간 내지 약 14일 이상) 인큐배이팅되어 조직 기질에서의 유지 및 침투를 향상시킬 수 있다. 시딩된 조직 기질은 재생 세포의 적어도 일부가 무세포 조직 기질 내에 및 무세포 조직 기질 상에 증식 및/또는 분화될 수 있는 조건 하에 유지될 수 있다. 이러한 조건은 비제한적으로, 적절한 온도 및/또는 압력, 전기적 및/또는 기계적 활성(예를 들어, 환기), 힘, 적절한 양의 O2 및/또는 CO2, 적절한 양의 습도, 및 멸균 또는 근(near)-멸균 조건을 포함할 수 있다. 이러한 조건은 또한 습식 환기, 습식 내지 건식 환기 및 건식 환기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 영양 보충물(예를 들어, 영양제 및/또는 탄소원, 예컨대, 글루코오스), 외인성 호르몬, 또는 성장 인자가 시딩된 조직 기질에 첨가될 수 있다. 조직학 및 세포 염색이 시딩된 세포 증식에 대해 검정하기 위해 수행될 수 있다. 임의의 적절한 방법은 시딩된 세포 분화에 대해 검정하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 기도 기관 생물반응기 장치로 수행될 것이다.
따라서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 인간 피검체에 이식하기 위한 이식가능한 생인공 폐 조직을 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는, 이식가능한 조직은 환자의 맥관 시스템에 연결될 수 있는 충분히 무손상된 맥관을 보유할 것이다.
본원에 기재된 생인공 폐 조직은 제조 제품 또는 키트(kit)를 만들기 위해 포장 물질과 결합될 수 있다. 제조 제품을 생산하기 위한 성분 및 방법은 잘 알려져 있다. 생인공 조직 외에, 제조 제품 또는 키트는, 또한, 예를 들어, 하나 이상의 항-접착제, 멸균수, 약제학적 캐리어, 완충액, 및/또는 생체외 기능성 폐 조직의 발달 및/ 또는 후속의 이식을 촉진하기 위한 다른 시약을 포함할 수 있다. 또한, 이에 함유된 조성물을 사용할 수 있는 방법을 기재하는 인쇄된 지시 사항은 이러한 제조 제품에 포함될 수 있다. 제조 제품 또는 키트의 성분은 다양한 적합한 용기로 포장될 수 있다.
생인공 폐를 사용하는 방법
본원은 또한 생인공 폐 조직을 사용하고, 일부 경우에, 폐 기능을 증진시키기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 폐 성능을 손상시키거나 감소시키는 질병(예를 들어, 낭포성 섬유증, COPD, 폐기종(emphysema), 폐암, 천식(asthma), 폐 외상, 또는 다른 유전적 또는 선천적 폐 기형, 예를 들어, 기관지원성 낭포(bronchogenic cyst), 폐 부전 및 폐 형성 저하증, 다폐포엽(polyalveolar lobe), 폐포모세혈관 이형성증(alveolocapillary dysplasia), 동정맥기형(arteriovenous malformation; AVM) 및 시미타 증후군(scimitar syndrome), 폐 림프절 확장증(pulmonary lymphangiectasis), 선천성 엽성 폐기종(congenital lobar emphysema)을 포함하는 격절(sequestration), 및 낭성 선종양 기형(cystic adenomatoid malformation; CAM) 및 다른 폐 낭포)을 갖는 환자에서 일부 폐 기능을 복구하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 피검체가, 특정 언급된 치료, 예를 들어, 증가된 폐 기능, 또는 증가되거나 향상된 폐 성능이 필요한 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다.
생인공 폐 조직(예를 들어, 전체 기관 또는 이의 일부)은 본원에 제공된 방법에 따라 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이들을 필요로 하는 피검체(예를 들어, 인간 환자)에 본원에 제공된 생인공 폐 조직을 이식하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생인공 폐 조직은 병든 또는 손상된 조직의 부위에 이식된다. 예를 들어, 생인공 폐 조직은 비기능성 또는 약한-기능성 폐를 대신하여(또는 결합하여) 피검체의 흉강 내에 이식될 수 있으며, 폐 이식을 수행하기 위한 방법은 당해 공지되어 있다[참조: Boasquevisque et al., Surgical Techniques: Lung Transplant and Lung Volume Reduction, Proceedings of the American Thoracic Society 6:66-78 (2009); Camargo et al., Surgical maneuvers for the management of bronchial complications in lung transplantation, Eur J Cardiothorac Surg 2008;34:1206-1209 (2008); Yoshida et al., "Surgical Technique of Experimental Lung Transplantation in Rabbits," Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11(1):7-11 (2005); Venuta et al., Evolving Techniques and Perspectives in Lung Transplantation, Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683 (2005); Yang and Conte, Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522 (2000); Gaissert and Patterson, Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs, 2d ed. Springer Netherlands (1996)].
상기 방법은 피검체의 폐를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 외과적 절차 동안 및/또는 폐 절제술 동안 본원에 제공된 생인공 폐 또는 이의 일부를 이식하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 피검체, 예를 들어, 인간 또는 동물 피검체의 폐 조직 및 기능을 대체하거나 보완하는데 사용될 수 있다.
임의의 적절한 방법(들)이 이식 전 또는 후에 폐 기능을 검정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 조직 치유를 평가하고, 기능성을 평가하고, 세포내-성장을 평가하는 방법들이 수행될 수 있다. 일부 경우에, 조직의 일부는 수거되고, 예를 들어, 중성 완충 포르말린과 같이 고정액(fixative)으로 처리될 수 있다. 이러한 조직의 일부는 탈수되고, 파라핀에 담지되고, 그리고 조직학 분석을 위해 마이크로톰으로 절편될 수 있다. 절편은 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색된 후, 형태학 및 세포 충실성(cellularity)의 현미경 평가를 위해 슬라이드 글라스 상에 놓일 수 있다. 예를 들어, 조직학 및 세포 염색이 시딩된 세포 증식을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 검정은 이식된 조직 기질 또는 영상 기술(예를 들어, 컴퓨터 단층 촬영법(computed tomography; CT), 초음파, 또는 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging)(예를 들어, 조영-증강(contrast-enhanced) MRI))의 기능성 평가를 포함할 수 있다. 검정은 또한 레스트(rest) 및 생리적 응력 하의 기능성 시험(예를 들어, 체플레티스모그래피(body pletysmography), 폐 기능 시험)을 포함할 수 있다. 세포로 시딩된 기질의 기능성은 당해 공지된 방법, 예를 들어, 조직학, 전자 현미경, 및 기계적 시험(예를 들어, 용적 및 컴플라이언스)을 이용하여 검정될 수 있다. 가스 교환은 또 다른 기능성 검정으로서 측정될 수 있다. 세포 증식을 검정하기 위하여, 티미딘 키나아제 활성이, 예를 들어, 티미딘 포함을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 경우에, 혈액 시험이 혈액의 산소 농도에 기초한 폐 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
일부 경우에, 분자 생물 기술, 예컨대, RT-PCR은 대사의 발현 및 분화 표지자를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 RT-PCR 프로토콜이 사용될 수 있다. 요약하면, 총 RNA는 생물학적 샘플(예를 들어, 텐돈(tendon) 샘플)을 균질화하고, 클로로포름 추출을 수행하고, 그리고, 스핀 컬럼(예를 들어, RNeasy® 미니스핀 컬럼(QIAGEN, Valencia, CA) 또는 다른 핵산-결합 기판을 사용하여 총 RNA를 추출함으로써 수집될 수 있다. 다른 경우에, 폐 세포 유형과 관련된 마아커 및 이러한 세포 유형에 대한 상이한 단계의 분화는 항체 및 표준 면역검정법을 이용하여 검출 될 수 있다.
기도 기관 생물반응기 장치
예시적인 기도 기관 생물반응기 장치는 도 1에 나타난다. 명세서 전체에 걸쳐, 폐는 기도 기관의 일례로서 제공될 것이다. 다른 예로는, 예를 들어, 기관(trachea)을 포함할 수 있다.
도 1을 참조하면, 생물반응기의 성분은 폐 챔버(102); 기관 라인(124), 습식 환기 라인(150), 및 건식 환기 라인(134)을 포함하는 기도 커넥터; 습식 호흡기 시스템(120), 건식 호흡기 시스템(116 및 118); 기관 라인(124), 습식 환기 라인(150), 및 건식 환기 라인(134) 사이의 접합부에서의 삼-방향 커넥터(148); 및 제어기(미도시)를 포함한다. 제어기는 컴퓨터로 작동될 뿐만 아니라 수동으로 작동된다. 생물반응기는 또한 폐 동맥 라인(122), 폐 정맥 라인(126), 저장소 시스템(104 및 106), 롤러 펌프(114), 가스 탱크(122) 및 이에 수반되는 가스 라인, 후부하 챔버(110), 폐 정맥 회송 라인(136), 및 폐 챔버 가압 라인(128)을 포함할 수 있다. 생물반응기는 또한 컴플라이언스 챔버(109) 및 컴플라이언스 챔버 배출부(146)를 포함한다. 생물반응기는 또한 관류 배지 용액(미도시)의 산소화 및 탄산화를 제공하는 것 외에 또는 대신에 막형 산소공급기(membrane oxygenator)를 포함할 수 있다.
폐 챔버(102)는 탈세포화된 폐 기질 스캐폴드를 유지한다. 폐 챔버(102)는 멸균의 폐 배양 환경을 제공하기 위해 밀폐된다. 각각 맥관 캐뉼라를 통해, 폐 기질의 폐 동맥은 폐 동맥 라인(122)에 연결되고, 폐 기질의 폐 정맥은 폐 동맥 라인(126)에 연결된다. 폐 기질의 기관은 기관 라인(124)을 통해 기도 커넥터에 연결된다.
폐 챔버(102) 내에서, 세포 기질은 세포의 시딩이 폐를 성장시키도록 세포 배지로 제방향으로 관류된다. 관류는 폐 동맥에 대한 폐 동맥 라인(122)을 거쳐 일어난다. 이로부터, 배지는 폐 맥관을 통해 흘러 저장소 시스템(104 및 106)으로 흘러 나간다.
저장소 시스템은 제 1 저장소(104) 및 제 2 저장소(106) 뿐만 아니라 저장소 공급 라인(140) 및 저장소 배출부(140)를 포함한다. 세포 배지는 저장소 공급 라인(138) 및 저장소 배출부(140)를 통과하여 저장소(104)와 저장소(106) 사이에서 순환한다. 마이크로필터는 멸균 여과를 위해 임의로 공급 라인(140)에 위치될 수 있다. 세포 배지는 또한 저장소(104 및 106)에서 산소화된다. 관류를 위하여, 세포 배지는 저장소(104)로부터 폐 동맥에 대한 롤러 펌프(114)를 통해 또는 중력을 통해 폐 동맥 라인(122)을 지나 공급된다.
저장소(106)로 흘러나가는 배지는 폐 챔버(102) 내에 일정한 유체 농도를 유지하기 위해 폐 챔버 배출부(4)를 통해 폐 챔버(102)로부터 직접 흡입된다. 제 3 커넥터(126)를 통해 폐로부터 유출되는 배지는 중력을 통해 후부하 챔버(110)로 배출되고 후부하 챔버 배출부(136)를 통해 저장소(106)로 흡입된다. 후부하 챔버(110)는 폐 챔버 압력 라인(130)을 통해 폐 챔버(102) 및 폐 정맥 회송 라인(136)을 통해 저장소(106)에 연결된다. 폐 챔버 압력 라인은 폐 챔버(102) 및 후부하 챔버(110)에서 압력을 평형시킨다. 후부하 챔버(110)는 또한 기관 및 습식 환기 라인을 거쳐 삼-방향 접합부(156)를 통해 폐 챔버(102)에 연결된다.
기질 내의 세포를 강화시키는 한가지 예시적인 방법은 하기와 같다. 폐 기질의 관류 시, 기질의 세포화가 시작된다. 약 30cc의 배지 중에 현탁된 약 100 × 106 개의 간엽 세포는 폐 동맥 라인(122)을 통해 시딩된다. 간엽 세포는 골수 유래 배아 줄기 세포이지만, 또한, 예를 들어, "내이 세포의 생성(Generation of Inner Ear Cells)"으로, 본원에 이의 전체 내용이 참조로 통합되는, U.S.S.N. 제 12/233,017호에 기재된 iPS 또는 조혈 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 시딩이 완료되면, 관류는 세포 부착이 가능하도록, 예를 들어, 약 60분 동안 정지된다. 관류의 정지 동안, 세포 배지는 기관 및 폐 정맥으로부터 배출되고, 배출된 세포 배지는 이후 저장소(106)로 유동된다. 60분의 정지 후, 배지 단독의 관류는, 예를 들어, 약 24 시간 동안 계속된다. 컴플라이언스 챔버(109)에서 일정한 배지 농도를 유지하기 위하여, 컴플라이언스 챔버(109)는 추가의 라인(미도시)을 통해 저장소(104)에 연결될 수 있다.
다음으로, 내피 세포의 시딩을 위한 조건이 착수된다. 기관 라인(124)은 삼-방향 접합부(148) 및 이의 제어기를 통해 습식 환기 라인(150)에 연결된다. 삼-방향 접합부(156)는 제어기를 이용하여 전환되어 습식 환기 라인(150)을 컴플라이언스 챔버(109)에 연결한다. 컴플라이언스 챔버(109)는 생리적 범위로 기도 압력을 제한하면서 세포간 공간과 기관을 통과하는 순수한 배지 흐름을 제한하기 위해 습식 기도 양압(wet airway pressure; wAP)을 제공한다. wAP는 챔버(109)의 조절을 통해 조절된다. 그 결과, 세포 배지의 일부는 폐 정맥 라인(3)을 통해 저장소(106)로 배출되는 반면, 보다 작은 부분의 세포 배지가 림프관을 통해 폐 챔버 배출 라인(128)을 지나 저장소(106)로 배출된다.
약 15cc의 배지 중에 현탁된 약 100 × 106 개의 내피 세포는 약 10분의 중력 공급을 통해 폐 동맥 라인(122)을 지나 시딩된다. 시딩이 완료되면, 관류는 세포 부착이 가능하도록, 예를 들어, 약 60분 동안 정지된다. 정지 후, 관류는 예를 들어, 약 3 내지 5일 동안 계속되어 내피 세포의 단일층의 형성을 가능하게 한다.
내피 세포가 시딩되고, 내피 세포의 단일층이 형성된 후, 상피 세포가 시딩될 것이다. 상피 세포 시딩을 위해, 삼-방향 접합부(156)는 제어기를 이용하여 전환되어 습식 환기 라인(150)을 막는다. 약 15cc의 배지 중에 현탁된 약 200 × 106 개의 상피 세포가 기관 라인(124)을 통해 기관으로 시딩된다. 일부 구체예에서, 상피 세포는 폐포 세포이다. 시딩이 완료되면, 폐 동맥을 통해 관류는, 예를 들어, 약 60분 동안 정지된다.
또한, 폐의 세포 시딩이 완료되면, 말초 기도 내에 세포 현탁액을 제공하기 위해 습식 환기가 필요하다. 습식 호흡기 시스템(120)은 습식 환기 라인(150)을 거쳐 폐에 습식 환기를 제공한다.
삼-방향 접합부(156)는 제어기를 이용하여 전환되어 습식 환기 라인(150)을 컴플라이언스 챔버(109)에 연결한다. wAP는 증가되어 세포간 공간 내에 작은 유동을 제공하고, 세포 부착을 증가시킨다. 습식 환기는 약 5분 동안 폐에 제공되고, 약 60분 동안 유지된 후, 추가의 약 5분 동안 폐에 제공되고, 이후 약 24시간 동안 유지된다. 습식 환기는 감소된 속도로 습식의 정점 흡기압 및 호기압을 낮게 유지하면서 생리적 1회 호흡량(인간에 대하여 약 500mL)으로 제공된다. 습식 호기말 양압은 컴플라이언스 챔버(109)의 상승을 통해 제공된다.
일단 관류가 재개되면, 제방향의 관류 및 습식 환기가 약 5일의 기간 동안 제공되어 조직 형성을 가능하게 한다.
습식 환기에서 건식 환기로의 변환은 약 5일의 기간 후에, 또는 모니터(미도시)가 폐가 충분한 성숙도에 도달한 것을 나타낸 후에 일어난다. 인공 계면활성제는 기관 라인(124)을 통해 수행된다. 이후, 삼-방향 접합부(148)는 제어기를 이용하여 전환되어, 기관 라인(124)이 건식 환기 라인(150) 및 건식 호흡기 시스템(116 및 118)에 연결되도록 한다. 건식 호흡기 시스템은 가습된 공기를 제공하기 위한 네블라이저(nebulizer)(미도시)를 갖는 건식 환기 챔버(112), 제 1 건식 호흡기(116), 및 제 2 건식 호흡기(118)를 포함한다. 건식 환기 챔버(112)는 건식 PEEP 라인(144)을 통해 제 1 건식 호흡기(116) 및 건식 환기 라인(150)을 통해 기관 라인에 연결된다. 이로 인해, 폐는 환기되어 유체보다 오히려 가스로 폐의 기강을 서서히 채운다. 사용된 가스는 가스 라인을 통해 가스 탱크(122)에 의해 공급된 카보겐(carbogen)이다. 건식 호흡기(116)는 건식 환기 챔버(112)에 dPEEP를 제공하고 후속하여 폐 챔버(102)에서 유체 배출이 가능하도록 구성된다.
다음으로, 습식 호흡기 시스템(120)이 중단되고, 건식 호흡기(118)가 환기 속도를 생리적 속도로 증가시키기 위한 폐 챔버, 유체가 빈 폐 챔버(102), 및 폐 챔버(102) 내의 가습된 공기가 있는 주위 폐에 대해 개방된다. 약 3일의 조직 성숙 후, 기능성 폐의 형성과 폐가 생물반응기로부터 제거될 수 있음을 확인하기 위해 관류 가스 분석이 수행된다.
습식 환기 및 건식 환기 간의 전환에서, 폐는 폐가 자연적으로 발달하는 조건을 시뮬레이팅하는 조건 하에 발달된다. 이는 이러한 환경이 폐 발달을 위해 필요하고, 기재된 생물반응기가 이식을 위한 조직 공학적 폐를 생성하기 위해 필요한 시스템 및 방법을 제공한다고 나타내었다.
폐 기질을 세포화하는 예시적인 방법은 도 2a에 예시된다. 폐 기질을 폐 챔버 내에 위치시킨다(210). 이후, 폐 기질을 폐 동맥 라인을 거쳐 세포 배지로 관류시킨다(220). 이후, 폐 기질에 습식 환기를 제공한다(230). 마지막으로, 폐 기질에 건식 환기를 제공한다(240).
도 2b에 예시된 바와 같이, 폐 기질의 관류(220) 동안, 폐 기질을 폐의 맥관을 거쳐 간엽 또는 다른 줄기 세포로 시딩한다(222). 이후, 폐 기질을 폐의 맥관을 거쳐 내피 세포로 시딩한다(224). 이후, 폐 기질을 폐 기도를 거쳐 상피 세포로 시딩한다(226).
도 2c에 예시된 바와 같이, 습식 환기를 제공하기 위하여, 폐 기도를 습식 호흡기 라인을 거쳐 습식 호흡기에 연결한다(231). 이후, 폐를 습식 환기 라인을 통해 컴플라이언스 챔버에 연결한다(232). 컴플라이언스 챔버 내의 유체 높이를 조절함으로써, 이후, 습식 기도 압력을 습식 환기 라인을 거쳐 증가시킨다(233). 추가로, 컴플라이언스 챔버를 상승시킴으로써, 이후, 습식 PEEP(wPEEP)를 제공한다(234). 폐 기질 상에서 성장하는 폐의 성숙도를 모니터링한다(235). 성숙도를 허용가능한 것으로 결정되면(236), 이후 건식 환기로의 전환을 시작한다(237).
도 2d에 예시된 바와 같이, 건식 환기를 제공하기 위하여, 인공 계면활성제를 기관을 지나 적용시킨다(241). 이후, 기관을 건식 환기 라인을 통해 건식 환기 챔버에 연결한다(242). 건식 환기 챔버를 dPEEP 라인을 거쳐 제 1 건식 호흡기에 연결한다(243). 이후, 건식 기도 압력을 건식 환기 라인을 거쳐 증가시킨다(244). 습식 환기 라인을 중단시키고(245), 폐 챔버를 제 2 건식 호흡기에 연결한다(246).
완전한 래트(rat)의 폐는 총 약 200 내지 약 400 × 106 개의 세포가 필요할 수 있다. 인간에 대한 외삽으로 완전한 폐를 위해 약 20 내지 약 40 × 109 개의 세포가 추정된다. 이러한 다수의 세포를 생성하는 것은 환자가 가질 시간보다 더 많은 시간을 필요로 한다. 20%라고 하는 백분율의 폐기능을 필요로 하는 환자는 단지 상기 수의 약 20%를 필요로 할 것이고, 신규한 폐에 대해서는 비례적으로 보다 더 적은 시간을 기다려야할 것이다.
기관의 탈세포화에서 사용하기 위한 예시적인 기도 기관 생물반응기 장치가 도 3에 나타난다. 상기 기재된 바와 같이, 폐는 기도 기관의 일례로서 제공될 것이다. 도 3을 참조하면, 생물반응기의 성분은 폐 챔버(302), 밀봉된 중력 저장소(304), 및 큰 저장소(306)를 포함하고, 저장소(304 및 306)는 폐 챔버(302)에서 폐 내의 관류를 위해 탈세포화 용액을 함유한다. 탈세포화 용액은 저장소 공급 라인(314)를 지나 저장소(304 및 306) 사이에서 순환한다. 폐 기질의 폐 동맥은 탈세포화 용액이 저장소(304)로부터 중력 유동을 통해 폐 조직 내에 관류되는 폐 동맥 라인(308)에 연결된다. 탈세포화에 후속하여, 폐기물은 폐 챔버(302)로부터 제거된다. 일부 경우에, 폐 챔버(302)로부터 용액은 저장소(306) 내에 공급되는 펌프(312)를 통해 재순환된다.
세포 시딩에서 사용하기 위한 예시적인 기도 기관 생물반응기 장치는 도 4에 나타난다. 도 4를 참조하면, 생물반응기의 성분은 폐 챔버(402), 밀봉된 중력 저장소(404), 및 큰 저장소(406)를 포함하고, 여기서 저장소(404 및 406)는 폐 챔버(402)에서 폐 내의 관류를 위한 세포 배지를 함유하다. 세포 배지는 저장소 공급 라인(408)을 지나 저장소(404 및 406) 사이에서 순환한다. 맥관 캐뉼라를 통해 각각, 폐 기질의 폐 동맥은 폐 동맥 라인(410)에 연결되고, 폐 기질의 폐 정맥은 폐 정맥 라인(412)에 연결된다. 세포 시딩을 위하여, 세포 배지는 저장소(404)로부터 폐 동맥 라인(410)을 지나 폐 동맥에 대한 폐 펌프를 통해 또는 중력을 통해 공급된다. 제 3 커넥터(412)를 통해 폐로부터 유출되는 배지(정맥 유출)는 중력을 통해 컴플라이언스 챔버(420)로 배출되고, 컴플라이언스 챔버를 통해 흡입되어 저장소(406)에 배출된다. 컴플라이언스 챔버(420)는 폐 챔버 압력 라인을 통해 폐 챔버(402) 및 폐 정맥 회송 라인(412)을 통해 저장소(406)에 연결된다. 폐 챔버 압력 라인은 폐 챔버(402) 및 컴플라이언스 챔버(420)의 압력을 평형시킨다. 컴플라이언스 챔버(420)는 또한 기관 및 습식 환기 라인을 거쳐 삼-방향 접합부(414)를 통해 폐 챔버(402)에 연결된다.
기관 라인은 삼-방향 접합부(414) 및 이의 제어기를 통해 습식 환기 라인에 연결된다. 삼-방향 접합부(414)는 제어기를 이용하여 전환되어 습식 환기 라인을 컴플라이언스 챔버(420)에 연결한다. 컴플라이언스 챔버(420)는 기도 압력을 생리적 범위로 제한하면서 세포간 공간 및 기관을 통과하는 순수한 배지 흐름을 제한하기 위해 습식 기도 양압(wAP)을 제공한다. wAP는 컴플라이언스 챔버(420)의 조절을 통해 조절된다. 그 결과, 세포 배지의 일부는 폐 정맥 라인(412)를 지나 배출되는 반면, 보다 작은 부분의 세포 배지가 림프관을 통해 저장소(406)에 대한 폐 챔버 배출부 라인을 지나 배출된다.
기질 관류에서 사용하기 위한 예시적인 기도 기관 생물반응기 장치는 도 5에 나타난다. 도 5를 참조하면, 생물반응기의 성분은 폐 챔버(502), 밀봉된 중력 저장소(504), 및 큰 저장소(506)를 포함하고, 저장소(504 및 506)는 폐 챔버(502)에서 폐 내의 관류를 위해 관류 용액(예를 들어, 혈액)을 함유한다. 세포 배지는 저장소 공급 라인(508)을 지나 저장소(504 및 506) 사이에서 순환한다. 맥관 캐뉼라를 통해 각각, 폐 기질의 폐 동맥은 폐 동맥 라인(510)에 연결되고, 폐 기질의 폐 정맥은 폐 정맥 라인(512)에 연결된다. 세포 시딩에 후속하여, 습식 환기는 말초 기도 내에 세포 현탁액을 제공하기 위해 필요하다. 습식 호흡기 시스템(518)은 습식 환기 라인을 거쳐 폐에 습식 환기를 제공한다. 삼-방향 접합부(514)는 제어기를 이용하여 전환되어, 기관 라인이 건식 환기 라인 및 건식 호흡기 시스템(516)에 연결되도록 한다.
예시적인 기도 기관 생물반응기 장치는 도 6에 나타난다. 도 6을 참조하면, 생물반응기의 성분은 폐 챔버(602), 밀봉된 중력 저장소(616), 및 큰 저장소(606)를 포함하고, 저장소(616 및 606)는 폐 챔버(602)에서 폐 내의 관류를 위해 관류 용액을 함유한다. 용액은 저장소 공급 라인을 지나 저장소(616 및 606) 사이에서 순환한다. 맥관 캐뉼라를 통해 각각, 폐 기질의 폐 동맥은 폐 동맥 라인(626)에 연결되고, 폐 기질의 폐 정맥은 폐 정맥 라인(628)에 연결된다. 세포 시딩을 위해, 배지는 저장소(616)로부터 폐 동맥 라인(626)을 지나 펌프를 통해 또는 중력을 통해 폐 동맥에 공급된다. 제 3 커넥터(628)를 통해 폐로부터 유출되는 배지(정맥 유출)는 중력을 통해 컴플라이언스 챔버(604)로 배출되고, 후부하 챔버를 통해 흡입되어 저장소(606)에 배출된다. 컴플라이언스 챔버(604)에서 일정한 배지 농도를 유지하기 위하여, 컴플라이언스 챔버(604)는 추가의 라인(미도시)을 통해 저장소(606)에 연결될 수 있다. 습식 호흡기 시스템(624)은 습식 환기 라인을 거쳐 폐에 습식 환기를 제공한다. 삼-방향 접합부(620)는 제어기를 이용하여 전환되어, 컴플라이언스 챔버(604)에 습식 환기 라인이 연결되도록 한다.
습식 환기에서 건식 환기로의 변환은 약 5일의 기간 후에, 또는 모니터(미도시)가 폐가 충분한 성숙도에 도달한 것을 나타낸 후에 일어난다. 인공 계면활성제는 기관 라인(630)을 통해 수행된다. 이후, 삼-방향 접합부(620)는 제어기를 이용하여 전환되어, 기관 라인(630)이 건식 환기 라인 및 건식 호흡기 시스템(622)에 연결되도록 한다. 폐는 환기되어 유체보다 오히려 가스로 폐의 기강을 서서히 채운다.
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이다.
실시예
관류 탈세포화된 기질 스캐폴드를 기초로 한 폐 재생
폐를 헤파린처리된 성체 SD 래트(n=20)로부터 분리하고, 세정제 관류를 이용하여 탈세포화하였다. 얻어진 세포외 기질(ECM) 스캐폴드를 조직학, 전자 현미경 및 기계적 시험을 사용하여 분석하였다. 스캐폴드를 생물반응기에 놓고 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC, n=4); HUVEC 및 인간 폐포 기저 상피 세포(H-A549, n=4); 및 HUVEC 및 래트 태아 폐 세포(H-FLC, n=2)로 시딩하였다. 7일 이하로 배양을 유지하였다. 폐 기능을 기준(n=4)으로서 제공된 혈액 관류 및 환기, 정상 폐를 이용하여 분리된 폐 장치에서 분석하였다.
사체 폐의 관류 탈세포화로 인해 무손상 기도 및 맥관 구조(airway and vascular architecture)로 되어 있는 무세포 폐 ECM 스캐폴드를 얻었다. 폐 스캐폴드가 내피 세포 및 상피 세포로 재생되고(repopulated), 생물반응기에서 유지될 수 있었다. 가스 교환(PaO2/FiO2 비율)이 정상 폐(465.8mmHg)와 비교하여 H-A549 구조(103.6mmHg)에서 보다 낮아졌으며, H-FLC 구조(455.1mmHg)에서는 동등하였다. 컴플라이언스가 정상 폐(0.69ml/cmH2O/s)와 비교하여 탈세포화된 폐(0.27ml/cmH2O/s)에서는 감소되었으나, H-FLC 구조(0.67ml/cmH2O/s)에서는 동등하였다.
사체 폐의 관류 탈세포화로 인해 상피 세포 및 내피 세포로 시딩되어 정상 폐에 필적하는 환기, 관류 및 가스 교환을 갖는 생인공 폐를 형성할 수 있는 무손상의 전체 폐 ECM 스캐폴드가 얻어졌다.
기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 결합하여 기재되었고, 상기 명세서는 본 발명의 범위를 한정하여 설명하는 것으로 의도되지 않고, 첨부된 특허청구범위의 범위에 의해 규정됨이 이해된다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기의 특허청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (25)

  1. 세포 배지(media)가 관류되어 기도 기관(airway organ)을 성장시키는 기도 기관 기질 스캐폴드를 유지시키도록 구성된 기관 챔버;
    기도 기관에 습식 환기를 공급하도록 구성된 습식 환기 시스템으로서, 상기 습식 환기는 기도 기관의 기도에 유체를 제공하는 것인 습식 환기 시스템;
    기도 기관에 건식 환기를 공급하도록 구성된 건식 환기 시스템으로서, 상기 건식 환기는 기도 기관의 기도에 가스를 제공하는 것인 건식 환기 시스템; 및
    습식 환기의 전달 또는 건식 환기의 전달을 제어하도록 구성된 제어기를 포함하는 기도 기관 생물반응기(bioreactor) 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 브랜치(branch), 제 2 브랜치, 및 제 3 브랜치를 포함하며, 상기 기도 기관에 연결되는 커넥터(connector); 및
    커넥터의 제 1 브랜치 및 커넥터의 제 2 브랜치는 커넥터의 제 3 브랜치와 연결되어 있고, 제 1 브랜치와 제 2 브랜치 사이에 전환(toggle)되도록 구성된 스위치(switch)를 포함하는 제 1 삼-방향 접합부(three-way junction)를 추가로 포함하며;
    습식 환기 시스템은 커넥터의 제 1 브랜치를 통해 기도 기관에 습식 환기를 공급되도록 구성되고;
    건식 환기 시스템은 커넥터의 제 2 브랜치를 통해 기도 기관에 건식 환기를 공급하도록 구성되고;
    제어기가 제 1 삼-방향 접합부의 스위치를 제어하여, 이로 인해 습식 환기의 전달 또는 건식 환기의 전달을 제어하도록 구성된 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 유입 라인에 걸쳐 기도 기관에 세포 배지를 공급하고;
    제 1 브랜치, 제 2 브랜치, 및 제 3 브랜치를 포함하는 유출 라인에 걸쳐 기도 기관으로부터 폐배지를 배출시키도록 구성된, 저장소 시스템; 및,
    유출 라인의 제 1 브랜치 및 유출 라인의 제 2 브랜치가 유출 라인의 제 3 브랜치와 연결되는 제 2 삼-방향 접합부를 추가로 포함하는 장치.
  4. 제 2항에 있어서, 습식 환기 시스템이 습식 환기 라인을 통해 기관 챔버(organ chamber)에 연결되는 습식 호흡기; 및
    커넥터의 제 1 브랜치를 통해 기도 기관에 연결되는 컴플라이언스(compliance) 챔버를 포함하는 장치.
  5. 제 4항에 있어서, 습식 호기말 양압(wet positive and expiratory pressure; wPEEP)은 컴플라이언스 챔버의 상승을 통해 기관 챔버에 제공되는 장치.
  6. 제 4항에 있어서, 유출 라인의 제 2 브랜치를 통해 기관 챔버; 및 유출 회송 라인을 통해 저장소 시스템에 연결되는 후부하 챔버를 추가로 포함하는 장치.
  7. 제 6항에 있어서, 저장소 시스템이 유입 라인을 통해 기관 챔버에 연결되는 제 1 저장소; 및
    기관 챔버 배출 라인을 통해 기관 챔버; 및 유출 회송 라인을 통해 후부하 챔버에 연결되는 제 2 저장소를 포함하고,
    상기 제 1 저장소 및 제 2 저장소가 저장소 공급 라인 및 저장소 배출부를 거쳐 배지를 순환시키는 장치.
  8. 제 3항에 있어서, 건식 환기 시스템은 커넥터의 제 2 브랜치를 통해 기도 기관에 연결되는 네블라이저(nebulizer)를 포함하는 건식 환기 챔버; 및
    기관 챔버에 건식 호기말 양압(dry positive and expiratory pressure; dPEEP)을 제공하도록 구성되고, dPEEP 라인을 통해 건식 환기 챔버에 연결되는 제 1 건식 호흡기를 포함하는 장치.
  9. 제 8항에 있어서, 건식 환기 시스템은 건식 호흡기 라인을 통해 기관 챔버에 연결되는 제 2 건식 호흡기를 추가로 포함하는 장치.
  10. 제 8항에 있어서, 기관 챔버, 건식 환기 챔버, 및 저장소 시스템에 가스성 배지를 공급하도록 구성된 가스 탱크를 추가로 포함하는 장치.
  11. 제 1항에 있어서, 제어기는 컴퓨터에 의해 작동되는 장치.
  12. 생체외(ex vivo)에서 생인공 기도 기관(airway organ)을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    기도 구조(airway architecture) 및 맥관 구조(vascular architecture)를 포함하는 탈세포화된 폐 조직 기질을 제공하고;
    상기 맥관 구조를 거쳐 내피 세포를 관류함으로써 기도 구조의 공간을 시딩하고;
    습식 환기 라인을 통해 기도 구조를 거쳐 상피 세포로 폐 조직 기질을 시딩(seeding)하고;
    습식-성숙된 기관(wet-matured organ)을 생성하기에 충분한 시간 동안 기도 구조를 통해, 그리고 맥관 구조를 통해 관류로 폐 조직 기질에 습식 환기를 제공하고;
    상기 습식-성숙된 기관에 기도 구조를 통해 그리고 맥관 구조를 통해 관류로 건식 환기를 제공하고,
    산소 교환을 허용하는 생인공 폐(bioartificial lung)를 제공하는 것을 포함하며, 상기 습식 환기는 기도 기관의 기도에 유체를 제공하는 것이고, 상기 건식 환기는 기도 기관의 기도에 가스를 제공하는 것인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 내피 세포는 인간 폐포 기저 상피 세포인 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 12항에 있어서,
    내피 세포는 10cc의 유체 당 약 100 × 106 개의 세포 농도로 유체 중에 현탁되고;
    상피 세포는 5cc의 유체 당 약 100 × 106 개의 세포 농도로 유체 중에 현탁되는 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 습식-성숙된 기관을 생성하도록, 요망되는 기관 성숙도가 일어날 때까지 기관 성숙도를 모니터링하고;
    습식-성숙된 기관에 습식 환기를 정지하고;
    습식-성숙된 기관에 인공 계면활성제를 적용하고;
    습식-성숙된 기관에 건식 환기를 개시하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 폐 조직 기질에 습식 환기를 제공하는 것은
    기도 구조(airway architecture)를 습식 호흡기 라인을 통해 습식 호흡기에 연결하고;
    폐 조직 기질을 습식 환기 라인을 통해 컴플라이언스 챔버에 연결하고;
    습식 환기 라인을 거쳐 습식 기도 압력을 증가시키고;
    컴플라이언스 챔버를 상승시킴으로써 폐 조직 기질에 습식 양성 호기말 양압(wPEEP)을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 습식 환기는 생리적 1회 호흡량(tidal volume)으로 제공되는 방법.
  20. 제 12항에 있어서, 습식-성숙된 기관에 건식 환기를 제공하는 것은
    기도 구조(airway architecture)를 건식 환기 라인을 통해 건식 환기 챔버에 연결하고;
    건식 환기 챔버를 건식 호기말 양압(dPEEP) 라인을 거쳐 제 1 건식 호흡기에 연결하고;
    건식 환기 라인을 거쳐 건식 기도 압력을 증가시키고;
    습식 환기 라인을 중단하고;
    습식-성숙된 기관을 건식 호흡기 라인을 통해 제 2 건식 호흡기에 연결하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 12항에 있어서, 폐 조직 기질은 탈세포화된 인간 폐 조직 또는 인공 폐 기질을 포함하는 방법.
  22. 제 12항에 있어서, 생인공 폐는 완전한 폐 기능 또는 이의 단편을 제공하기 위해 충분한 수의 세포를 포함하는 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
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