KR101749670B1

KR101749670B1 - IkBα 및 RPS6KA2의 상호작용을 통한 암 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101749670B1
Application number: KR1020150104959A
Authority: KR
Inventors: 정영호; 한은희; 김남두; 김현경
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2017-06-21
Also published as: KR20160012958A

Abstract

본 발명은 IkBα 및 RPS6KA2의 상호작용을 통한 암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 IkBα와 RPS6KA2의 결합 억제제 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 암 치료제를 분자적 수준에서 스크리닝 할 수 있고 분자간의 상호작용을 통해 치료제의 작용을 알 수 있다는 점에서 효과적이다.

Description

IkBα 및 RPS6KA2의 상호작용을 통한 암 치료제 스크리닝 방법 {Method for screening anti-cancer agents comprising detecting interactions of IkBα and RPS6KA2}

본 발명은 IkBα 및 RPS6KA2의 상호작용을 통한 암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 IkBα와 RPS6KA2의 결합 억제제 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

IkBα(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha) 단백질은 NF-κB의 활성을 저해하는 제어소단위의 한 종류이다. IkBα는 NF-kB의 핵위치신호(NLS) 부위에 결합하여 핵위치신호 부위를 가림으로써 NF-kB가 세포질 내에서 불활성화 상태로 유지되도록 한다. 또한 IkBα는 NF-kB의 번역 인자가 NF-kB이 기능하기 위해 필요한 DNA에 결합하는 것을 막는다. IkBα 단백질은 몇몇 호킨스 림프종 세포에서 IkBα 단백질 돌연변이가 발견되었다. 이 돌연변이는 IkBα를 불활성화 하여 NF-kB가 만성적으로 활성화되도록 한다. 하여 림프종 종양이 악성 종양으로의 발병과 직접적 연관이 있는 것으로 보고되었다(Cabannes E et al, Oncogene 18 (20): 306370).

RPS6KA2 (Ribosomal protein S6 kinase alpha-2) 단백질은 인간 RPS6KA2 유전자에 코딩되는 효소이다. 이 유전자는 세린과 트레오닌 카이네이즈의 RPS6KA2(ribosomal S6 kinase)군의 한 종류이다. RPS6KA2는 2개의 서로 다른 효소적 도메인과 미토겐 활성 카이네이즈(MAPK) 신호 전달 경로를 포함하는 인산화 기질을 포함한다(Moller DE et al., Am J Physiol 266: C3519). 또한 RPS6KA2는 세포 성장 및 분화 조절 활성을 가진다. 함께 상호작용 하는 단백질로는 MAPK3, MAPK1이 알려져 있다(Roux, Philippe P et al., Mol. Cell. Biol. 23 (14): 4796804).

한편, 세포들의 성장, 분화, 이동, 죽음 등은 단백질-단백질, 단백질-핵산 등의 고분자 물질들간의 상호작용(interaction)에 의해 이루어진다. 세포 외부의 신호는 세포막의 수용체를 통과하여 세포질내에서 여러 생화학적 반응을 통해 세포의 핵 내로 전달되며, 거기서 특정 유전자들을 발현시킨다. 이러한 외부 신호의 세포내 전달과정은 여러 단계의 단백질간 상호작용에 의해 이루어진다. 예로써 성장조절인자(growth factor)나 사이토카인(cytokine) 등은 세포 표면의 해당 수용체(receptor)에 결합하고 이러한 결합은 수용체가 서로 뭉치도록(clustering) 유도한다. 이러한 수용체의 리간드에 의한 뭉침은 그 수용체의 세포질내 도메인끼리도 서로 뭉치도록 유도함으로써 세포내 신호전달과정에 관계된 여러 단백질들과의 상호작용을 유발한다. 이 신호전달체계는 단백질 키나제에 의한 단백질의 인산화, 단백질 포스파타제에 의한 탈인산화등을 통해 여러 단계의 신호를 전달 할 수 있는 중간체 단백질을 만들면서, 결국 그의 신호를 전사촉진 단백질(transcriptional activator)에 전달한다(Helden, C. H., Cell 80, 213-223(1995)). 활성화된 전사촉진 단백질은 DNA에 결합하고, mRNA 를 합성하는 RNA 중합효소 등 기본적인 전사 조절 단백질들(basal transcriptional apparatus)과 상호작용하여 특정 유전자들을 활성화시킨다. 따라서 이러한 상호작용은 특정 조직, 발생학적 과정 및 외부자극 등에 반응하여 특이적으로 전사가 일어나도록 조절하는 것이다. 이때 외부물질의 침입 또는 내부 활성 단백질의 유전적 변이 등에 의해 특정 단백질간의 상호작용이 변경, 억제, 촉진 등 비정상적으로 일어나게 된 것이 병(disorder)의 원인이라고 할 수 있다. 따라서 이러한 상호작용을 조절할 수 있는 물질은 곧 그에 기인된 병에 대한 치료의 방법을 제공할 수 있으므로 이에 관한 연구가 계속되어 왔다.

현재까지 알려진 생체고분자 물질들 간의 상호작용, 특히 결합특성을 분석하기 위한 방법으로 교차결합 (crosslinking), 친화크로마토그래피 (affinity chromatography), 면역침강법 (immunoprecipitation, IP) 등의 전통적인 in vitro 방법들이 사용되고 있으나 이들 방법들은 단백질의 생산과 분리/정제 과정이 요구되며 시험관내의 완충액의 조건과 추출된 단백질의 2차적인 변형 등의 문제점이 있어 생체내에서 일어나는 실제 상호작용과 상이한 정보를 제공할 수 있다는 단점을 가지고 있다.

이러한 in vitro 방법들의 단점을 보완하기 위해 세포내에서 직접 수행하는 이스트 투 하이브리드 (yeast twohybrid, Y2H), 형광공명에너지전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET), 분할 단백질의 재결합(bimolecular fluorescence complementation, Bi-FC) 방법들이 개발되어 사용되고 있다.

본 연구진은 단백질 인산화효소 C(protein kinase C) 이동모듈, 제1표지물질 및 목적물질이 포함된 제1구성물과 제2표지물질 및 표적물질이 포함된 제2구성물을 세포내에서 발현시켜 그 발현된 목적물질과 표적물질의 상호작용 여부를 확인할 수 있는 시스템을 개발하여 특허 등록을 받은 바 있다(등록번호 : 10-0948767). 이 시스템은 단백질 간의 상호작용을 확인할 수 있다는 점에서 유용한 실험 방법을 제시하였다. 하지만 본 시스템을 통해 치료제 후보물질을 스크리닝한 선행 연구는 아직 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들 상기 단백질과 단백질의 상호작용을 확인하는 시스템을 토대로 IkBα와 RPS6KA2를 이용한 암 치료제 스크리닝 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 IkBα와 RPS6KA2를 통한 암치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 암 치료제 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 스크리닝된 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 IkBα와 RPS6KA2를 통한 암치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 암 치료제 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 화합물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 스크리닝된 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) (ⅰ) 이동모듈, 제1표지물질, IkBα가 순차적으로 결합된 융합 단백질 및 제2표지물질, RPS6KA2가 순차적으로 결합된 융합 단백질을 발현하거나 (ⅱ) 이동모듈, 제 1표지물질, IkBα가 순차적으로 결합된 융합 단백질 및 이동모듈, 제2표지물질, RPS6KA2가 순차적으로 결합된 융합 단백질을 발현하는 세포를 제조하는 단계;

(b) 암 치료제 후보 물질을 첨가하는 단계;

(c) 암 치료제 후보 물질과 (a)단계의 융합 단백질 간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계;

(d) 신호물질을 처리하는 단계; 및

(e) 암 치료제 후보 물질과 세포 내 융합 단백질의 분포를 통해 상호작용을 확인하는 단계를 포함하며

암 치료제 후보물질이 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질의 결합을 억제할 경우 암 치료제로 판별하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 IkBα와 RPS6KA2간의 상호작용을 직접적으로, 그리고 실시간으로 분석할 수 있도록 하기 위하여, 외부자극 또는 내재적인 신호전달기작에 의해 발생되는 단백질의 세포내 위치이동을 이용하였다. 즉, 외부자극 또는 내재적인 신호전달기작에 의해 위치가 이동되는 이동모듈, 이를 추적할 수 있는 표지물질과 IkBα 또는 RPS6KA2가 순차적으로 결합된 제1구성물을 디자인하고, 표지물질과 RPS6KA2 또는 IkBα가 순차적으로 결합된 제2구성물을 디자인하였다. 제1표지물질과 제2표지물질은 각각 IkBα와 RPS6KA2 서로 다른 하나씩을 포함해야 한다. 예를 들어, 제1구성물이 이동모듈, 제1표지물질, IkBα라면 제2구성물은 제2표지물질, RPS6KA2로 구성되어야 하며 제1구성물이 이동모듈, 제1표지물질, RPS6KA2라면 제2구성물은 제2표지물질, IkBα로 구성되어야 한다.

본 발명은 제1구성물과 제2구성물이 결합하며, 암 치료제 후보물질의 제1구성물과 제2구성물의 결합을 방해하는지의 여부에 따라서 암 치료제인지 아닌지 구분된다. 만약 제1구성물과 제2구성물의 결합을 억제할 경우 암 치료제로 판별한다.

본 발명에서 이동모듈은 제1구성물을 세포내의 특정 영역으로 이동시키는 기능을 하는 부위이다. 상기에서 세포 내의 특정 영역으로의 이동은 외부 신호에 의해 또는 내재적으로 이동할 수 있으며, 세포내 특정 영역은 세포내 구조물로서 세포내에 존재하는 구분되고(separate), 구별되며(discreet), 증빙 가능한(identifiable) 요소를 나타낸다. 상기 세포내 특정 영역은 바람직하게는 세포막, 핵막 등의 막 구조물 또는 소포체, 골지체, 미토콘드리아, 리소좀 등의 세포내 소기관 및 그 외 세포내 특정 영역일 수 있다.

본 발명의 상기 “이동모듈”은 단백질 인산화 효소 C(protein kinase C, PKC), cPKC(classical PKC; PKC-alpha, PKC-beta, PKC-gamma), nPKC(novel PKC; PKC-delta, PKC-epsilon, PKC-eta, PKC-theta)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

이들은 모두 C1 도메인이라는 부분을 공통적으로 가지고 있으며, C1 도메인에 DAG(diacyl glycerol) 또는 TPA(phorbol ester, PMA)와 결합함으로써 세포막으로의 위치 이동이 유도된다. 본 발명의 이동모듈로 바람직하게는 PKC의 변이체를 사용할 수 있으며, 상기 변이체는 내재적인 신호전달기작으로 인한 교란현상을 최소화하기 위하여 PKC의 내재적인 인산화 활성을 제거한 변이체인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 상기 “제1표지물질”은 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 “제2표지물질”은 제1표지물질과 서로 다르며 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 용어 "융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 별개의 단백질로부터 유래된 아미노산 부분들 간의 아미노산의 연결성 영역을 포함할 수도 있다.

상기 세포는 동물, 식물, 효모 및 박테리아의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 외의 경우 외부로부터 도입되는 제1구성물 및 제2구성물을 잘 받아들일 수 있고, 세포질과 핵 등의 세포내 소기관의 경계가 뚜렷하게 구별되는 세포가 바람직하다. 더 바람직하게는 CHO-k1(ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, hamster, Chinese), HEK293(ATCCCRL-1573, Homo sapiens, human), HeLa(ATCC CCL-2, Homo sapiens, human), SH-SY5Y(ATCC CRL-2266, Homo sapiens, human), Swiss 3T3(ATCC CCL-92, Mus musculus, mouse), 3T3-L1(ATCC CL-173, Mus musculus, mouse), NIH/3T3(ATCC CRL-1658, Mus musculus, mouse), L-929(ATCC CCL-1, Mus musculus, mouse), Rat2(ATCCCRL-1764, Rattus norvegicus, rat), RBL-2H3(ATCC CRL-2256, Rattus norvegicus, rat), MDCK(ATCC CCL-34, Canis familiaris)일 수 있다. 또한 그 밖에 각종 줄기세포, 각종 조직에서 추출된 세포 및 인위적으로 만들어진 유사 세포막 구조물일 수 있다.

본 발명에서 제1구성물 및 제2구성물을 포함하는 세포는 당업계에서 공지된 분자생물학적 방법을 통해 제조될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 제1구성물 및 제2구성물을 발현할 수 있는 각각의 발현벡터 또는 제1구성물 및 제2구성물을 모두 발현할 수 있는 발현벡터로 세포를 형질전환한 뒤, 발현벡터에서 제1구성물 및 제2구성물이 발현되도록 하는 방법이 바람직하다.

세포로의 각각의 발현벡터의 형질전환은 당업계에 공지된 형질전환방법, 예를 들면, 인산칼슘법, 염화칼슘법, 염화루비듐법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), 입자 총 충격(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 자성나노입자 매개법(magnetic nanoparticle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명에 사용된 용어 "상호 작용"이란 특정 리간드 또는 화합물, 또는 그의 일부 또는 단편과, 관심있는 제2 분자의 일부 간의 근접한 상태를 지칭한다. 상호 작용은, 예를 들어 수소-결합, 반 데르 발스 (van der Waals) 상호 작용, 정전기 또는 소수성 상호 작용의 결과로서 비-공유적이거나, 또는 공유적일 수 있다.

본 발명의 상기 “신호물질”은 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester), TPA(12-otetradecanoylphorbol-13-acetate), PDBu(phorbol 12, 13-dibutyrate), ATP(Adenosine triphosphate), tridecanoic acid, arachidonic acid, linoleic acid, DiC8, 130C937로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 “신호물질의 처리”는 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester)를 50nM 내지 5uM의 농도로 처리하는 것임을 특징으로 한다. 더 바람직하게는 1uM로 처리할 수 있다. 상기 PMA의 처리농도가 50nM 미만의 경우 PKC를 사용한 이동모듈의 이동이 충분하지 않고, 5uM 초과의 경우 화학물질의 과다처리에 의한 비정상적인 현상들(세포사멸, 신호교란 등)이 발생하여 바람직하지 못하다.

상기 “상호작용을 확인하는 단계”는 제1표지물질과 제2표지물질의 분포를 검출하는 것으로, 예를 들어 확인하고자 하는 세포를 포함하는 커버슬립(coverslip)을 유체기(perfusion chamber)에 고정시켜 공초점 레이저형광 현미경(칼자이스 LSM710)의 제물대에 장착하고 외부 자극 전과 외부자극 후의 구성물 벡터들에 대한 영상을 획득하는 방법일 수 있다.

본 발명은 상기 암 치료제 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 화합물을 제공한다.

본 발명의 상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식1]

본 발명의 상기 화합물은 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질 결합을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 화함물이 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질의 결합을 억제하여 암 예방 및 치료 효과를 보이는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 “암”은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 건선 또는 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 IkBα와 RPS6KA2간의 상호작용 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 저해제는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식1]

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 “치료”란 특정 질병 또는 장애 증상을 개선시키는 것을 지칭하고, 이는 이러한 장애를 치유하거나, 장애 발병을 실질적으로 예방하거나, 또는 대상체의 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 환자를 고통스럽게 하는 소정의 장애에 대한 전 스펙트럼의 치료를 지칭하는데, 이에는 해당 장애로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 특정 장애를 치유하거나, 또는 장애 발병을 예방하는 것이 포함된다.

따라서 본 발명은 IkBα 및 RPS6KA2의 상호작용을 통한 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 더욱 상세하게는 IkBα와 RPS6KA2의 결합 억제제 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 IkBα와 RPS6KA2의 결합 억제 유무에 따라서 암 치료제를 쉽게 스크리닝할 수 있다는 점에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 TMD-mRFP-IkBα(제1구성물)과 EGFP-RPS6KA2(제2구성물)을 HEK293T 세포주에 과발현 시키고 세포 이미징을 이용한 방법(등록번호 : 10-0948767)으로 분석한 사진이다(왼쪽 패널 : 제 1 구성물, 가운데 패널 : 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 + 제 2구성물).
도 2는 pTMD-mRFP-C3 plasmid (제1구성물)와 EGFP-RPS6KA2(제2구성물)를 HEK293T 세포주에 과발현시킨 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리한 결과를 나타낸 사진이다(왼쪽 패널 : 제 1 구성물, 가운데 패널 : 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 + 제 2구성물).
도 3-가는 TMD-mRFP-RPS6KA2(제1구성물)와 EGFP-IkBα(제2구성물)를 HEK293T 세포 내 과발현시킨 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리하여 두 단백질의 결합을 실시간으로 나타낸 사진이다(왼쪽패널 : 제 1 구성물, 가운데 패널 : 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 ＋ 제 2구성물). 도 3-나는 pTMD-mRFP-C3 plasmid (제1구성물)와 EGFP-IkBα (제2구성물)를 HEK293T 세포에 과발현시킨 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리하여 두 단백질의 결합을 실시간으로 나타낸 사진이다(왼쪽패널: 제 1 구성물, 가운데 패널: 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 ＋ 제 2구성물).
도 4는 TMD-mRFP-IkBα (제1구성물)과 EGFP-RPS6KA2(제2구성물)을 CHO-K1 세포주에 과발현시킨 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리하여 두 단백질의 결합을 실시간으로 나타낸 사진이다(왼쪽패널 : 제 1 구성물, 가운데 패널 : 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 ＋ 제 2구성물).
도 5는 화학식1로 표시되는 화합물의 항암효능을 HEK293T 세포주와 CHO-K1 세포주, 유방암 세포주 MCF-7, 폐암 세포주 A549 그리고 간암 세포주 HepG2에서 측정한 그래프이다(가로축 : 화합물 농도(μM), 세로축 : 세포독성(대조군에 대한 %)).
도 6은 TMD-mRFP-IkBα(제1구성물)과 EGFP-RPS6KA2(제2구성물)을 HEK293T 세포(패널 가)와 CHO-K1 세포주(패널 나)에 동일한 방법으로 과발현 시키고 화합물 50 μM을 3시간 처리하였다. 그 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리하여 두 단백질의 결합 억제를 실시간으로 분석한 사진이다(왼쪽패널: 제 1 구성물, 가운데 패널: 제 2 구성물, 오른쪽 패널 : 제 1구성물 ＋ 제 2구성물).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

동물세포주 및 형질전환

<1-1> 동물세포주 및 이의 배양

본 발명에서의 실험은 CHO-K1(ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, hamster, Chinese), HEK293(ATCC CRL-1573, Homo sapiens, human), MDA-MB-231(ATCC HTB-26, Homo sapiens, human), A549 (ATCC CCL-185 Homo sapiens, human), HepG2 (ATCC HB-8065, HepG2, Homo sapiens, human) 세포주를 사용하였다. 본 발명에 사용된 동물세포주의 배양조건은 각 세포주의 분양기관인 ATCC(American Type Culture Collection)사의 세포주 배양방법을 이용하였다. 단, CHO-K1은 F-12 배양액을 사용하였고, HEK293, MDA-MB-231 세포주는 DMEM 배양액을 사용하였고, A549, HepG2 세포주는 RPMI 1640 배양액을 사용하였으며 기타 배양조건은 동일하게 사용하였다. 한편, 각 세포들의 공통적인 배양방법은 다음과 같다(당업자의 목적에 의해 세부적인 배양 조건은 달라질 수 있다.). 25 mM HEPES, 10% FBS(fetal bovine serum, v/v), 100 units/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신이 들어있는 pH7.4의 배양액(F-12 및 DMEM) 속에서 각 세포주를 온도 37℃, CO₂ 분압 5%가 유지되는 배양기에서 배양하였다.

<1-2> 세포주의 형질전환

본 발명의 실시예에서 사용된 세포내 유전자 도입방법은 일반적으로 사용되는 리포좀-기반 방법 중의 하나인 Fugene HD (Promega)을 사용하였으며, 유전자의 농도 등 유전자 도입을 위한 모든 조건은 제조사의 지침을 따라 수행하였다. 보다 구체적으로는 6-플레이트에 커버슬립을 넣고 세포를 하루 동안 배양한 후, 페니실린과 스트렙토마이신, FBS가 없는 2 ml의 신선한 배양액으로 교환하였다. 약 1 μg 정도의 형질전환 시료들을 0.1 ml의 페니실린과 스트렙토마이신, FBS가 없는 배양액에 첨가한 후 완전히 섞고 3 μl의 Fugene HD 시약을 첨가하여 섞어주었다. 이 용액을 상온에서 15분간 놓아둔 후 세포가 자라고 있는 커버슬립이 들어있는 6-플레이트의 각 웰(well)에 첨가하여 4시간 동안 배양 한 뒤 FBS를 200 μl 넣고 18시간 형질전환되도록 하였다.

<실시예 2>

제1구성물 및 제2구성물의 디자인 및 제작

<2-1> 제1구성물의 설계 및 제작

본 발명에서 제1구성물이란 세포질에서 고르게 발현되어 있는 단백질이 신호무질을 처리하였을 때 세포막으로 이동할 수 있는 모듈(이동모듈)을 포함하며, 이들 현미경을 이용하여 분석할 수 있는 적색형광단백질이 표지되어 결합되어 있고 마지막으로 목적물질이 결합될 수 있는 융합서열로 구성된다. 제1구성물은 TMD-mRFP-empty 벡터에 IkBα 및 RPS6KA2를 제한효소 EcoRI/KpnI (IkBα) 및 EcoRI/XmaI (RPS6KA22)를 이용하여 제작하였다. TMD-mRFP-empty 벡터는 서열번호 5로 표시되는 Protein Kinase C mutant,(TMD)와 서열번호 7으로 표시되는 mRFP를 포함하는 벡터이다.

IkBα는 주형으로 pcDNA3.1-IkBα 벡터 (NCBI Reference Sequence: NM_020529.2; purchased from Mediscov Inc)를 사용하고, 서열번호 1및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 제조하였다. 또한, RPS6KA22는 주형으로 pPTB7-RPS6KA22 벡터 (GenBank : BC002363)를 사용하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 후 수득물을 pTMD-mRFP-C3 벡터의 EcoRI/KpnI (IkBα) 및 EcoRI/XmaI (RPS6KA22)위치에 삽입하여 제작하였다.

<2-2> 제2구성물의 설계 및 제작

제2구성물이란 제1구성물에 결합된 목적물질과 결합하는 내재적인 특성을 가진 표적물질의 이동을 분석하기 위한 표지물을 포함한다. 제2구성물은 제1구성물에 포함된 표지와 다른 형광인 녹색형광단백질(EGFP)을 이용한다. 제2구성물은 기존에 등록된 특허 (등록번호: 10-1217718)의 EFRP-C3 벡터(clontech)에 IkBα 및 RPS6KA2를 제한효소 EcoRI/KpnI (IkBα) 및 EcoRI/XmaI (RPS6KA22)를 이용하여 제작하였다.

IkBα는 주형으로 pcDNA3.1-IkBα 벡터 (NCBI Reference Sequence: NM_020529.2; purchased from Mediscov Inc)를 사용하고, 서열번호 1및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 제조하였다. 또한, RPS6KA2는 주형으로 pPTB7-RPS6KA2 벡터 (GenBank : BC002363)를 사용하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 후 수득물을 pTMD-mRFP-C3 벡터의 EcoRI/KpnI (IkBα) 및 EcoRI/XmaI (RPS6KA2)위치에 삽입하여 제작하였다.

<실시예 3>

제1구성물 및 제2구성물의 세포 내 이동 확인

제1구성물과 제2구성물 벡터가 도입된 세포가 자라고 있는 커버슬립(coverslip)을 유체기(perfusion chamber)에 고정시켜 공초점 레이저형광현미경(칼자이스 LSM710)의 제물대에 장착하고 외부자극 전과 외부자극(1μM PMA(Phorbol ester) 처리) 후의 구성물 벡터들에 대한 영상을 획득하였다.

공초점 레이저현미경의 레이저는 488 nm Argon 레이저 (EGFP), 543 nm HeNe 레이저 (mRFP)를 사용하여 형광표지를 여기(excitation)시키고, 각 형광표지에서 발생하는 형광신호는 band path 필터 BP505-530 (EGFP), Long path 필터 LP560 또는 BP560-630 (mRFP)를 사용하였으며, 각 형광들 간의 간섭을 완전히 제거한 후 영상을 획득하였다.

그 결과 도 1, 도 3-가 및 도 4와 같이 공초점 레이저형광현미경을 이용하여 외부 자극 후 이동모듈(TMD)이 포함된 제1구성물 벡터에 의한 적색 형광은 세포막으로 이동되지만 이동모듈이 없는 표적물질용 제2구성물 벡터에 의한 녹색 형광은 자극전과 동일하게 세포질에 고루 분포하고 있다. 따라서 제2구성물 벡터는 외부자극에 반응하지 않으며, 제2구성물의 세포막으로의 이동은 반드시 목적물질과 표적물질의 결합을 전제로 한다.

<실시예 4>

제1구성물 및 제2구성물을 이용하여 IkBα과 RSS6KA2의 세포내 결합 분석

TNF-alpha에 의해 조절되는 IkBα 단백질의 상호작용은 세포 내에서 다양한 세포신호전달기작에 관여하는 것으로 알려져 있다. 다양한 기작 중 특히 주목되고 있는 것은 생체내에서 발생하는 각종 위해성 신호에 대응하는 염증유발과 밀접한 관련성을 가지고 있다는 것이다. IkBα와 상호작용하는 RPS6KA2 단백질의 결합여부를 살아있는 세포를 이용하여 실시간으로 실험을 실시하였다.

상기에서 제조한 제1구성물 및 제2구성물을 HEK293T와 CHO-K1 세포주에 형질전환하였고, 이를 0분과 3분째에 형광을 확인하였다.

그 결과, 도 1에서와 같이, 제1구성물(TMD-mRFP-IkBα)은 0분째에는 세포내에 고르게 분포하다가, 3분 후에 세포막으로 이동하였으며(도 1 왼쪽 패널), 제2구성물(EGFP-RPS6KA2)도 역시 0분째에는 세포내에 고르게 분포하다가 3분 후 제1구성물과 더불어 세포막으로 이동함을 알 수 있었다(도 1 가운데 패널). 이는 제1구성물과 제2구성물이 결합하였음을 의미한다.

반대로 제1구성물을 TMD-mFRP-RPS6KA2로 제2구성물을 EGRP-IkBα로 바꾸어 HEK293T와 CHO-K1 세포주에 형질전환 하였고, 이를 0분과 3분째에 형광을 확인하였다.

그 결과 도 3-가에서와 같이, 제1구성물(TMD-mRFP-RPS6KA2)은 0분째에는 세포내에 고르게 분포하다가, 3분 후에 세포막으로 이동하였으며(도 3-가 왼쪽 패널), 제2구성물(EGFP-IkBα)도 역시 0분째에는 세포내에 고르게 분포하다가 3분 후 제1구성물과 더불어 세포막으로 이동함을 알 수 있었다(도 3-가 가운데 패널). 이는 제1구성물과 제2구성물이 결합하였음을 의미한다.

<실시예 5>

IkBα과 RPS6KA2의 결합을 억제하는 화합물 스크리닝

상기 스크리닝 방법을 이용하여 상기에서 제조한 제1구성물 및 제2구성물을 6-플레이트 내에 HEK293T와 CHO-K1 세포가 자라고 있는 커버슬립(coverslip)에 형질전환 하였다. 그 후 IkBα 단백질과 RPS6KA22 단백질 결합 억제제 후보물질을 3시간동안 처리하였다. 커버슬립(coverslip)을 유체기(perfusion chamber)에 고정시켜 공초점 레이저형광 현미경(칼자이스 LSM710)의 제물대에 장착하고 외부 자극 전과 외부자극(1μM PMA(Phorbol ester)) 후의 구성물 벡터들에 대한 영상을 획득하였다.

그 결과, IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질의 상호작용을 억제하는 하기 화학식1로 표시되는 화합물을 스크리닝 하였다.

[화학식1]

도 7은 상기 화합물의 IkBα 단백질과 RPS6KA22 단백질의 결합 저해 효과를 분석한 것으로 TMD-mRFP-IkBα(제1구성물)과 EGFP-RPS6KA2(제2구성물)을 HEK293T 세포와 CHO-K1 세포주에 동일한 방법으로 과발현 시키고 화합물 50 μM을 3시간 처리하였다. 그 후 1 μM의 PMA (외부자극)를 3분간 처리하여 두 단백질의 결합 억제를 실시간으로 분석하였다. 위 화합물에 의해 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질이 결합하지 못하고 이동모듈 및 IkBα를 반영하는 적색형광은 세포막으로 이동하였으나 RPS6KA2 단백질을 반영하는 녹색형광은 그대로 세포질에 위치하였음을 확인하였다. 따라서 상기 화학식1로 표시되는 화합물이 IkBα와 RPS6KA2의 결합을 저해하는 저해제로 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

<실시예 6>

스크리닝된 화합물의 암세포에 대한 세포독성 측정

발명의 실시예에서 사용된 화합물의 세포독성은 일반적으로 사용되는 CCK8 키트 (Dojindo Molecular Technologies)를 사용하였으며 모든 조건은 제조사의 지침을 따라 수행하였다. 보다 구체적으로 96-플레이트에 세포를 하루 동안 배양한 후 10, 50, 100 μM의 화합물을 처리하고 24, 48 시간 배양한 뒤 CCK8 용액을 10 μl 넣고 한 시간 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 5 와 같이 위암 세포주 AGS와 SNU638 (도 5 가, 나) 및 대장암 세포주 HCT116과 SW620 (다, 라), 자궁암 세포주 Hela (마), 유방암 세포주 MCF-7(바), 폐암 세포주 A549 (사) 그리고 간암 세포주 HepG2 (아)에서 세포독성을 측정한 결과 IkBα와 RPS6KA2의 상호작용을 저해하는 화합물에 의해 이들 암세포의 세포사멸이 증가하였다.

<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Method for screening anti-cancer agents comprising detecting interactions of IkBa and RPS6KA2 <130> NP15-0074 <150> KR 10-2014-0094273 <151> 2014-07-24 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IkBa-Forward primer <400> 1 tggaattcat gttccaggcg gccgagcgcc cc 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IkBa-Reverse primer <400> 2 atggtacctc ataacgtcag acgctggcct cc 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSK2-Foward primer <400> 3 gctgaattct gatggacctg agcatgaaga ag 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSK2-Reverse primer <400> 4 gctcccgggc tacaaccgcg tggacgtgag 30 <210> 5 <211> 2028 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein kinase C mutant, TMD <400> 5 atggcgccgt tcctgcgcat cgccttcaac tcctatgagc tgggctccct gcaggccgag 60 gacgaggcga accagccctt ctgtgccgtg aagatgaagg aggcgctcag cacagagcgt 120 gggaaaacac tggtgcagaa gaagccgacc atgtatcctg agtggaagtc gacgttcgac 180 gcccacatct atgaggggcg cgtcatccag attgtgctaa tgcgggcagc agaggagcca 240 gtgtctgagg tgaccgtggg tgtgtcggtg ctggccgagc gctgcaagaa gaacaatggc 300 aaggctgagt tctggctgga cctgcagcct caggccaagg tgttgatgtc tgttcagtat 360 ttcctggagg acgtggattg caaacagtct atgcgcagtg aggacgaggc caagttccca 420 acgatgaacc gccgcggagc catcaaacag gccaaaatcc actacatcaa gaaccatgag 480 tttatcgcca ccttctttgg gcaacccacc ttctgttctg tgtgcaaaga ctttgtctgg 540 ggcctcaaca agcaaggcta caaatgcagg caatgtaacg ctgccatcca caagaaatgc 600 atcgacaaga tcatcggcag atgcactggc accgcggcca acagccggga cactatattc 660 cagaaagaac gcttcaacat cgacatgccg caccgcttca aggttcacaa ctacatgagc 720 cccaccttct gtgaccactg cggcagcctg ctctggggac tggtgaagca gggattaaag 780 tgtgaagact gcggcatgaa tgtgcaccat aaatgccggg agaaggtggc caacctctgc 840 ggcatcaacc agaagctttt ggctgaggcc ttgaaccaag tcacccagag agcctcccgg 900 agatcagact cagcctcctc agagcctgtt gggatatttc agggtttcga gaagaagacc 960 ggagttgctg gggaggacat gcaagacaac agtgggacct acggcaagat ctgggagggc 1020 agcagcaagt gcaacatcaa caacttcatc ttccacaagg tcctgggcaa aggcagcttc 1080 gggaaggtgc tgcttggaga gctgaagggc agaggagagt actttgccat cagggccctc 1140 aagaaggatg tggtcctgat cgacgacgac gtggagtgca ccatggttga gaagcgggtg 1200 ctgacacttg ccgcagagaa tccctttctc acccacctca tctgcacctt ccagaccaag 1260 gaccacctgt tctttgtgat ggagttcctc aacggggggg acctgatgta ccacatccag 1320 gacaaaggcc gctttgaact ctaccgtgcc acgttttatg ccgctgagat aatgtgtgga 1380 ctgcagtttc tacacagcaa gggcatcatt tacagggacc tcaaactgga caatgtgctg 1440 ttggaccggg atggccacat caagattgcc gactttggga tgtgcaaaga gaacatattc 1500 ggggagagcc gggccagcac cttctgcggc acccctgact atatcgcccc tgagatccta 1560 cagggcctga agtacacatt ctctgtggac tggtggtctt tcggggtcct tctgtacgag 1620 atgctcattg gccagtcccc cttccatggt gatgatgagg atgaactctt cgagtccatc 1680 cgtgtggaca cgccacatta tccccgctgg atcaccaagg agtccaagga catcctggag 1740 aagctctttg aaagggaacc aaccaagagg ctgggagtga cgggaaacat caaaatccac 1800 cccttcttca agaccataaa ctggactctg ctggaaaagc ggaggttgga gccacccttc 1860 aggcccaaag tgaagtcacc cagagactac agtaactttg accaggagtt cctgaacgag 1920 aaggcgcgcc tctcctacag cgacaagaac ctcatcgact ccatggacca gtctgcattc 1980 gctggcttct cctttgtgaa ccccaaattc gagcacctcc tggaagat 2028 <210> 6 <211> 676 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein kinase C mutant, TMD <400> 6 Met Ala Pro Phe Leu Arg Ile Ala Phe Asn Ser Tyr Glu Leu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Gln Pro Phe Cys Ala Val Lys Met 20 25 30 Lys Glu Ala Leu Ser Thr Glu Arg Gly Lys Thr Leu Val Gln Lys Lys 35 40 45 Pro Thr Met Tyr Pro Glu Trp Lys Ser Thr Phe Asp Ala His Ile Tyr 50 55 60 Glu Gly Arg Val Ile Gln Ile Val Leu Met Arg Ala Ala Glu Glu Pro 65 70 75 80 Val Ser Glu Val Thr Val Gly Val Ser Val Leu Ala Glu Arg Cys Lys 85 90 95 Lys Asn Asn Gly Lys Ala Glu Phe Trp Leu Asp Leu Gln Pro Gln Ala 100 105 110 Lys Val Leu Met Ser Val Gln Tyr Phe Leu Glu Asp Val Asp Cys Lys 115 120 125 Gln Ser Met Arg Ser Glu Asp Glu Ala Lys Phe Pro Thr Met Asn Arg 130 135 140 Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys Ile His Tyr Ile Lys Asn His Glu 145 150 155 160 Phe Ile Ala Thr Phe Phe Gly Gln Pro Thr Phe Cys Ser Val Cys Lys 165 170 175 Asp Phe Val Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Arg Gln Cys 180 185 190 Asn Ala Ala Ile His Lys Lys Cys Ile Asp Lys Ile Ile Gly Arg Cys 195 200 205 Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser Arg Asp Thr Ile Phe Gln Lys Glu Arg 210 215 220 Phe Asn Ile Asp Met Pro His Arg Phe Lys Val His Asn Tyr Met Ser 225 230 235 240 Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Trp Gly Leu Val Lys 245 250 255 Gln Gly Leu Lys Cys Glu Asp Cys Gly Met Asn Val His His Lys Cys 260 265 270 Arg Glu Lys Val Ala Asn Leu Cys Gly Ile Asn Gln Lys Leu Leu Ala 275 280 285 Glu Ala Leu Asn Gln Val Thr Gln Arg Ala Ser Arg Arg Ser Asp Ser 290 295 300 Ala Ser Ser Glu Pro Val Gly Ile Phe Gln Gly Phe Glu Lys Lys Thr 305 310 315 320 Gly Val Ala Gly Glu Asp Met Gln Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Gly Lys 325 330 335 Ile Trp Glu Gly Ser Ser Lys Cys Asn Ile Asn Asn Phe Ile Phe His 340 345 350 Lys Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Leu Leu Gly Glu Leu 355 360 365 Lys Gly Arg Gly Glu Tyr Phe Ala Ile Arg Ala Leu Lys Lys Asp Val 370 375 380 Val Leu Ile Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val 385 390 395 400 Leu Thr Leu Ala Ala Glu Asn Pro Phe Leu Thr His Leu Ile Cys Thr 405 410 415 Phe Gln Thr Lys Asp His Leu Phe Phe Val Met Glu Phe Leu Asn Gly 420 425 430 Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Asp Lys Gly Arg Phe Glu Leu Tyr 435 440 445 Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Met Cys Gly Leu Gln Phe Leu 450 455 460 His Ser Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Leu 465 470 475 480 Leu Asp Arg Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys 485 490 495 Glu Asn Ile Phe Gly Glu Ser Arg Ala Ser Thr Phe Cys Gly Thr Pro 500 505 510 Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gln Gly Leu Lys Tyr Thr Phe Ser 515 520 525 Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly 530 535 540 Gln Ser Pro Phe His Gly Asp Asp Glu Asp Glu Leu Phe Glu Ser Ile 545 550 555 560 Arg Val Asp Thr Pro His Tyr Pro Arg Trp Ile Thr Lys Glu Ser Lys 565 570 575 Asp Ile Leu Glu Lys Leu Phe Glu Arg Glu Pro Thr Lys Arg Leu Gly 580 585 590 Val Thr Gly Asn Ile Lys Ile His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asn Trp 595 600 605 Thr Leu Leu Glu Lys Arg Arg Leu Glu Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val 610 615 620 Lys Ser Pro Arg Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Gln Glu Phe Leu Asn Glu 625 630 635 640 Lys Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Asp Lys Asn Leu Ile Asp Ser Met Asp 645 650 655 Gln Ser Ala Phe Ala Gly Phe Ser Phe Val Asn Pro Lys Phe Glu His 660 665 670 Leu Leu Glu Asp 675 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP <400> 7 tggaattcat gttccaggcg gccgagcgcc cc 32 <210> 8 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP <400> 8 Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu 130 135 140 Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu 165 170 175 Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala 180 185 190 Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr 195 200 205 Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly 210 215 220 Ala 225

Claims

(a) (ⅰ) 이동모듈, 제1표지물질, IkBα가 순차적으로 결합된 융합 단백질 및 제2표지물질, RPS6KA2가 순차적으로 결합된 융합 단백질을 발현하거나 (ⅱ) 이동모듈, 제 1표지물질, IkBα가 순차적으로 결합된 융합 단백질 및 이동모듈, 제2표지물질, RPS6KA2가 순차적으로 결합된 융합 단백질을 발현하는 세포를 제조하는 단계;
(b) 암 치료제 후보 물질을 첨가하는 단계;
(c) 암 치료제 후보 물질과 (a)단계의 융합 단백질 간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계;
(d) 신호물질을 처리하는 단계; 및
(e) 암 치료제 후보 물질과 세포 내 융합 단백질의 분포를 통해 상호작용을 확인하는 단계를 포함하며
암 치료제 후보물질이 IkBα 단백질과 RPS6KA22 단백질의 결합을 억제할 경우 암 치료제로 판별하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 이동모듈은 단백질 인산화 효소 C(protein kinase C, PKC), cPKC(classical PKC; PKC-alpha, PKC-beta, PKC-gamma), nPKC(novel PKC; PKC-delta, PKC-epsilon, PKC-eta, PKC-theta)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1표지물질은 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2표지물질은 제1표지물질과 서로 다르며 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 신호물질은 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate,
Phorbol ester), TPA(12-otetradecanoylphorbol-13-acetate), PDBu(phorbol 12, 13-dibutyrate), ATP(Adenosine triphosphate), tridecanoic acid, arachidonic acid, linoleic acid, DiC8, 130C937로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 신호물질의 처리는 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester)를 50nM 내지 5uM의 농도로 처리하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항의 암 치료제 스크리닝 방법을 통해 스크리닝된 하기 화학식 1로 표시되는 화합물.
[화학식1]
삭제
제7항에 있어서, 상기 화합물은 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제7항에 있어서, 상기 화합물이 IkBα 단백질과 RPS6KA2 단백질의 결합을 억제하여 암 예방 및 치료 효과를 보이는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식1로 표시되는 IkBα와 RPS6KA2간의 상호작용 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물.
[화학식1]
삭제
제11항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종, 건선 또는 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.