KR101749627B1

KR101749627B1 - 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR101749627B1
Application number: KR1020160067593A
Authority: KR
Inventors: 신동진
Original assignee: (주)큐브바이오
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2017-06-28

Abstract

본 발명은 암의 존재 여부를 진단하는 시스템에 관한 것으로, 검체를 수용하기 위한 기준 흡수포와, 티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 조성물이 기 수용되며, 검체를 함께 수용하기 위한 검출 흡수포를 포함하는 카트리지와, 카트리지를 스캐닝하는 스캐너와, 스캐너로 촬상된 이미지에서 기준 흡수포의 평균 색상의 명도 대비 검출 흡수포의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 제어부와, 제어부가 산출한 명도 차이 값을 출력하는 출력부를 포함한다.

Description

티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템 및 방법{System and Method for Calculate the Color Change Amount of Enzyme Compositions for Tyrosine}

본 발명은 암의 존재 여부를 진단하는 시스템에 관한 것으로, 특히 검체의 티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌으로 전환시키는 티로신 반응에 의해 색상이 변화되면 색상의 변화 정도를 산출하여 객관적인 값으로 도출하고, 최종적으로 검체에 함유된 티로신의 양까지 추정할 수 있도록 한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템 및 방법에 관한 것이다.

암 마커는 악성 종양 세포 자체 내에서 생기거나 또는 암에 대한 정상조직의 반응으로 만들어져 혈액, 소변 또는 조직 내에서 비정상적으로 높은 농도를 나타내는 물질이며, 혈액, 소변 또는 조직 내의 암 마커 농도를 통해 암의 진행과 퇴화를 진단, 스크리닝, 추적할 수 있다.

일반적으로 암 마커의 농도 측정 또는 검출은 혈액을 통해 이루어지고 있으나, 혈액은 일반인이 스스로 채취하기 어렵다는 문제점이 있었다.

이에 채취하기 어려운 혈액, 조직 등의 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용하여 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 농도를 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 대한 개발이 이루어져 왔다.

한편, 일반인과 비교해볼 때 암 환자의 경우 소변 내에 존재하는 티로신(Tyrosine)의 농도가 높아 상기 티로신을 암 바이오마커로서 사용할 수 있음이 알려졌다.

한국 등록특허 제10-0033547호는 암환자의 소변 중에 공통적으로 존재하는 방향족 아민(Tyrosine)을 검출하여 암을 진단하는 혼합 시약에 관한 것으로서, 상기 혼합 시약은 수은과 니켈, 질산 및 증류수로 구성된 것으로 기재되어 있다.

그러나, 상기 혼합 시약은 수은을 포함하고 있어 환경 및 인체에 막대한 영향을 미치기 때문에 현재 사용 금지되어 있다.

따라서, 채취하기 어려운 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용함으로써, 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 친환경적으로 검출하여 암을 진단하기 위한 조성물에 대한 개발이 절실한 실정이다.

또한 한국 등록특허 제10-0942440호에는 시료 샘플을 색상 참조부와 함께 촬영하여 획득된 이미지를 분석하여 시료의 pH, O₂ 농도, CO₂ 농도 등의 정보를 얻을 수 있는 시료분석 장치를 개시하고 있다.

그러나 상기 등록특허의 시료분석 장치는 시료의 본래 색상이 고려되지 않는 절대적인 색상표를 기준으로 시료의 성분을 분석하기 때문에 서로 다른 피검자와, 심지어 동일 피검자라도 시시때때로 변화하는 소변의 색상을 고려하여 맞춤형 분석을 실시할 수 없는 문제가 있었다.

이러한 문제를 고려하지 않은 채 고정된 색상표를 이용하게 되면 본래 소변의 색상의 짙을 경우 고정된 색상표와 비교하게 되면 티로신 반응에 의한 변색의 정도가 많지 않더라도 최종 결과물의 색상이 짙게 나타나 소변 내 티로신의 함유량이 많은 것으로 오진할 수 있는 문제가 있었다.

등록특허공보 10-0942440 (2010.02.08)

본 발명은 이와 같은 종래 기술의 시료 진단 시스템의 문제를 해결하기 위한 것으로, 검체, 예를 들어 소변의 티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌으로 전환시키는 티로신 반응에 의해 색상이 변화되면 색상의 변화 정도를 산출하여 객관적인 값으로 도출하고, 최종적으로 검체에 함유된 티로신의 양까지 추정할 수 있도록 한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템 및 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 대비 기준으로 이용되기 위해 단순 검체를 흡수하는 기준 흡수포와, 티로신 검출용 효소 조성물이 포함되어 검체의 티로신과 반응이 발생하는 검출 흡수포를 나란히 배치하고 함께 스캐닝하는 것으로 정확한 색상변화를 비교 분석할 수 있는 환경을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 제어부가 스캐닝된 이미지 상에서 CIE 색도도상에 설정된 유효색구역에 포함된 색상만을 검출 기준으로 하기 때문에 흡수포 상에 발생한 이종의 오염이나, 스캐닝 이미지에 함께 포함된 흡수포 외의 색상은 자동으로 배제시킬 수 있는 시스템을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 제어부 내에 절대적 명도 구분 기준이 설정되어 기준 흡수포의 명도와 검출 흡수포의 명도의 값을 수치로 도출하여, 도출된 수치를 명도 차이를 산출하는 값으로 활용할 수 있는 시스템을 제공하는 것을 과제로 한다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템은, 검체를 수용하기 위한 기준 흡수포와, 티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 조성물이 기 수용되며, 상기 검체를 함께 수용하기 위한 검출 흡수포를 포함하는 카트리지와, 상기 카트리지를 스캐닝하는 스캐너와, 상기 스캐너로 촬상된 이미지에서 기 설정된 유효색구역 내에 포함된 색상을 유효색상으로 설정하고, 상기 기준 흡수포 내에서 상기 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상과 상기 검출 흡수포 내에서 상기 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상을 산출하여, 상기 기준 흡수포의 평균 색상의 명도 대비 상기 검출 흡수포의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 제어부와, 상기 제어부가 산출한 상기 명도 차이 값을 출력하는 출력부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 상기 검체 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 도파크롬 상호변이효소(DCT)를 0.5 내지 2 중량비 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 0.5 내지 2 중량비로 포함하며, L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜 티로신의 농도가 증가함에 따라 검체의 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 최종 농도가 0.1~0.5%인 Tween20, 및 증류수를 더 포함하고, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 인 액체로 되어 상기 검출 흡수포에 흡수된 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 기준 흡수포에는 상기 티로신 검출용 효소 조성물과 동일한 색상의 색소액이 흡수된 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 검체는 소변이고, 상기 유효색구역은 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 영역 내에 포함된 색상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 CIE 색도도는 CIE 1931 색도도이고, 상기 백색점의 x,y좌표는 0.333, 0.333이고, 상기 황녹색점의 x,y좌표는 0.3, 0.7이고, 상기 오렌지색점의 x,y좌표는 0.6, 0.4인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 제어부는 상기 명도 차이 값을 기준으로 상기 검체에 포함된 티로신량을 산출하고, 상기 출력부는 상기 티로신량을 함께 출력하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 방법은 스캐너가 검체가 수용된 기준 흡수포와, 티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 및 상기 검체가 혼합되어 수용된 검출 흡수포를 포함하는 카트리지를 스캐닝하는 단계, 영역인식부가 상기 스캐너를 통해 획득된 이미지에서 상기 기준 흡수포와 상기 검출 흡수포가 위치한 부위를 분리하여 인식하는 단계, 유효색상 추출부가 상기 이미지에서 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 유효색구역 내에 포함된 색상만을 유효영역으로 설정하는 단계, 색상 평균화부가 상기 기준 흡수포의 유효영역의 색상과 상기 검출 흡수포의 유효영역의 색상을 각각 평균화하여 상기 기준 흡수포의 평균 색상과 상기 검출 흡수포의 평균 색상을 산출하는 단계, 색차분석부가 상기 기준 흡수포의 평균 색상의 명도 대비 상기 검출 흡수포의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 단계, 출력부가 상기 명도 차이의 값을 출력하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 색차분석부가 명도 차이를 산출하는 단계에 이어서, 티로신량 산출부가 상기 색차분석부를 통해 산출된 상기 명도 차이의 값으로 상기 검체에 포함된 티로신량을 산출하는 단계를 더 포함하고, 상기 출력부는 상기 티로신량을 함께 출력하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템은

첫째, 검체 내에 존재하는 티로신의 농도를 친환경적으로 검출하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있는 암 바이오마커 검출용 효소 조성물을 이용한 암 진단 시스템을 제공할 수 있게 된다.

둘째, 검체의 티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌으로 전환시키는 티로신 반응에 의해 색상이 변화되면 색상의 변화 정도를 산출하여 객관적인 값으로 도출하게 되어 검체에 함유된 티로신의 양까지 추정할 수 있고, 색상의 변화 정도의 값을 통해 다양한 자동 진단시스템에 응용할 수 있게 되는 효과가 있다.

셋째, 대비 기준으로 이용되기 위해 단순 검체를 흡수하는 기준 흡수포와, 티로신 검출용 효소 조성물이 포함되어 검체의 티로신과 반응이 발생하는 검출 흡수포가 나란히 배치되어 함께 스캐닝되기 때문에 본래 검체의 색상에서 정확하게 색상의 변화 정도를 비교 분석할 수 있게 된다.

넷째, 제어부가 스캐닝된 이미지 상에서 CIE 색도도상에 설정된 유효색구역에 포함된 색상만을 검출 기준으로 하기 때문에 흡수포 상에 발생한 이종의 오염 또는 스캐닝 이미지에 함께 포함된 흡수포 외의 색상은 자동으로 배제시킬 수 있어 정확한 색 변화 정도를 산출할 수 있게 된다.

다섯째, 제어부 내에 절대적 명도 구분 기준이 설정되어 기준 흡수포의 명도와 검출 흡수포의 명도의 값을 수치화 할 수 있기 때문에 각 흡수포의 명도 차이를 수식을 통해 용이하게 산출할 수 있게 된다.

여섯째, 암 바이오마커 검출용 효소 조성물을 보유하고 있는 카트리지를 간단히 교체할 수 있도록 구성되어 반복적인 사용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템의 구성도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템이 포함된 암 진단 장치의 스캐너 및 카트리지가 전개된 상태의 사시도.
도 3은 스캐닝된 이미지에서 유효영역으로 설정되는 색상의 범위를 설명하기 위한 CIE 1931 색도도.
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 방법의 순서도.
도 5는 생성된 유멜라닌의 색상을 측정하기 위한 대조 색상표.
도 6은 생성된 멜라닌의 색상을 비교한 사진.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 포함하는 암 진단 장치의 사시도.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 포함하는 암 진단 장치에서 스캐너와 회전틀이 케이스 전면을 개방하고 있는 상태를 보여주는 참조사시도.
도 9는 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 포함하는 암 진단 장치에서 투입구의 구성을 설명하기 위한 부분 단면도.
도 10a내지 도 10d는 본 발명에 따른 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 포함하는 암 진단 장치에서 광학 필름의 구성을 설명하기 위한 단면도.

첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 일 실시예를 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하거나, 개략적인 구성을 이해하기 위하여 실제보다 축소하여 도시한 것이다.

또한, 제1 및 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 한편, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템은 검체의 색상과 검체와 반응하여 변색된 티로신 검출용 효소 조성물의 색상을 비교하는 것으로 변색 정도를 정확한 수치로 산출할 수 있기 때문에 단지 육안으로 확인하는 것보다 변색 정도를 정확하게 판단할 수 있고, 변색 정도를 통해 검체에 포함된 티로신의 양도 높은 정확도로 추정할 수 있게 된다.

이하, 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 대해 아래에서 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템은 검체를 수용하기 위한 기준 흡수포(126)와, 티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 조성물이 기 수용되며, 검체를 함께 수용하기 위한 검출 흡수포(125)를 포함하는 카트리지(120)와, 카트리지(120)를 스캐닝하는 스캐너(140)와, 스캐너(140)로 촬상된 이미지에서 기 설정된 유효색구역 내에 포함된 색상을 유효색상으로 설정하고, 기준 흡수포(126) 내에서 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상과 검출 흡수포(125) 내에서 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상을 산출하여, 기준 흡수포(126)의 평균 색상의 명도 대비 검출 흡수포(125)의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 제어부(160)와, 제어부(160)가 산출한 명도 차이 값을 출력하는 출력부(170)를 포함한다.

아래에서는 상기 주요 구성요소들을 중심으로 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 대해 상세히 설명하기로 한다.

이하의 설명에서는 검체를 소변인 것으로 가정하고 설명한다.

카트리지(120)에 포함되는 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)의 소재는 순백색의 색상을 갖는 일반적인 부직포나, 면, 마, 레이온 등이 적합하며 흡수성이 좋은 다층 종이로도 마련될 수 있다.

기준 흡수포(126)는 소변이 기존 색상에서 티로신 검출용 효소 조성물과 반응하여 변색되는 정도를 비교하기 위해 초기 소변 정보를 기억하는 기준 색상의 기능을 한다.

검출 흡수포(125)는 티로신 검출용 효소 조성물을 이미 흡수한 상태이며, 소변을 흡수하여 티로신 검출용 효소 조성물과 서로 혼합되도록 하는 매개체로서의 역할을 수행한다. 정상 상태의 사람도 소변에 소량의 티로신을 포함하기 때문에, 검출 흡수포(125)는 소변이 투입되면 반드시 변색되게 되므로 기준 흡수포(126)와 비교하는 것으로 색상의 변화 정도를 판단할 수 있게 된다.

소변이 투입되면 검출 흡수포(125) 및 기준 흡수포(126)에 소변이 함께 흡수된다.

일반적으로 우로빌린(urobilin)에 의해 황색을 띄게 되는 소변은 피검자에 따라서는 물론이고, 동일 피검자라도 소변을 채취할 때마다 소변의 성분 구성비가 상이하기 때문에 소변의 황색정도와 투명도 등의 색상 특징이 상이하다. 따라서 소변의 본래 색상이 짙을 경우, 티로신 검출용 효소 조성물과의 반응에 의한 색 변화가 적더라도 기존 소변 색은 고려되지 않는 절대적인 기준의 색상표와 대조 했을 때, 최종 변색된 소변에 티로신이 다량 함유된 것으로 오진하게 될 수 있다.

또한, 유체상태의 소변이 순백색의 흡수포에 흡수되면 색의 명도가 증가하는 등 색 변화가 발생하고, 티로신 검출용 효소 조성물과 혼합되면 조성물과 티로신의 반응이 발생하지 않더라도 부피대비 우로빌린의 양이 희석되면서 색 변화가 발생하게 된다. 특히, 티로신 검출용 효소 조성물이 투명하지 않은 유색일 경우 소변의 색상 변화에 더 큰 영향을 주게 된다.

상술된 바와 같은 색 변화의 원인을 고려하여 기준 흡수포(126)의 색상은 티로신 검출용 효소 조성물에서 반응이 발생하지 않은 검출 흡수포(125)의 색상과 동일한 상태일 필요가 있다. 따라서 기준 흡수포(126)에는 검출 흡수포(125)에서 소변과 티로신 검출용 효소 조성물의 혼합에 의해 우로빌린이 희석되는 것을 고려하여 티로신 검출용 효소 조성물과 동일한 색상의 색소액이 기 흡수된 상태인 것을 특징으로 할 수 있다. 이로써 소변의 색상이 다양하더라도 기준 흡수포(126)의 색상을 기준으로 변색된 검출 흡수포(125)의 색상 변화 정도를 정확히 산출하는 것이 가능해진다.

카트리지(120)의 경우 리필용 제품을 생산 및 판매하도록 하여 암 진단에 한번 사용하고 나면 폐기하고 새로운 것으로 교체할 수 있다.

티로신 검출용 효소 조성물은 피검수자의 소변과 혼합되어 소변에 포함된 암 마커를 검출하는 역할을 한다. 티로신 검출용 효소 조성물은 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질1(Tyrp1)을 포함하여 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 것으로서 소변 내에 존재하는 티로신의 농도를 친환경적으로 검출하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있도록 개발된 것이다. 티로신 검출용 효소 조성물은 L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜, 티로신의 농도가 증가함에 따라 소변 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되도록 함으로써 소변에 포함된 티로신을 보다 용이하게 검출하도록 한 것을 특징으로 한다.

이 같은 티로신 검출용 효소 조성물은 티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 티로시나아제 1중량비 대비 도파크롬 상호변이효소(DCT)를 0.5 내지 2 중량비 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 0.5 내지 2 중량비로 포함하며, 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 최종 농도가 0.1% 내지 0.5% Tween 20 및 증류수를 더 포함하고, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 인 액체로 되는 것이 바람직하다. 이 같은 티로신 검출용 효소 조성물에 대해서는 그 제조방법을 포함하여 차후에 더욱 상세히 설명하기로 한다.

스캐너(140)는 카트리지(120)의 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)를 함께 스캐닝하여 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)의 디지털 컬러 이미지를 생성하는 역할을 한다. 디지털 컬러 이미지는 컴퓨터장치가 처리할 수 있는 형태의 정보를 가리킨다.

스캐너(140)는 CCD(Charge Coupled Device) 또는 CID(Charge Injection Device)와 같은 촬상소자를 이용하여 스캐닝을 수행하게 되며, 그 형태는 일 방향으로 진행하며 마주보는 화상의 이미지를 순차적으로 획득하는 평판형 스캐너(140)로 실시되거나, 정면의 화상을 단번에 촬영하는 카메라로도 실시될 수 있다.

스캐너(140)가 균일한 색 구성(색상, 채도, 명도)을 가지는 이미지를 획득하기 위해, 스캐너(140)는 스캐닝하는 동안 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)를 비추는 광원(도시되지 않음)을 함께 포함할 수 있다.

제어부(160)는 스캐너(140)를 통해 획득된 이미지에서 기준 흡수포(126)의 색상과 검출 흡수포(125)의 색상 비교를 통해 검출 흡수포(125)에서의 색 변화량을 산출하게 된다.

본 발명은 일 실시예로서 제어부(160)와 스캐너(140)가 일체로 구성되는 전용 분석 장비로 실시되거나, 제어부(160)가 컴퓨터장치에 설치 및 실행되는 응용프로그램으로 실시되고, 스캐너(140)는 상기 컴퓨터장치에 전기적으로 연결되는 것으로 실시될 수 있다.

구체적으로, 제어부(160)는 스캐너(140)를 통해 획득된 이미지에서 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)를 분리하여 인식하는 영역인식부(161)와, 이미지에서 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 유효색구역 내에 포함된 색상만을 유효영역으로 설정하는 유효색상 추출부(163)와, 기준 흡수포(126)의 유효영역의 색상과 검출 흡수포(125)의 유효영역의 색상을 각각 평균화하여 기준 흡수포(126)의 평균 색상과 검출 흡수포(125)의 평균 색상을 산출하는 색상 평균화부(165)와, 기준 흡수포(126)의 평균 색상의 명도 대비 검출 흡수포(125)의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 색차분석부(167)를 포함할 수 있다.

영역인식부(161)는 스캐닝된 이미지를 분석하여 이미지 상에서 기준 흡수포(126)가 위치한 부위와 검출 흡수포(125)가 위치한 부위를 식별한다. 영역인식부(161)가 이미지 상에서 올바로 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)를 구분하여 인식할 수 있도록, 카트리지(120)에는 물리적으로 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)가 일정 간격 이상으로 이격되어 배치될 수 있으며, 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)의 사이에는 서로의 경계를 명확히 인식할 수 있는 경계라인(117)이 형성될 수 있다.

유효색상 추출부(163)는 영역인식부(161)를 통해 구분된 기준 흡수포(126) 부위와 검출 흡수포(125) 부위 내에서 유의미한 색상이 포함된 픽셀을 유효영역으로 설정하게 된다.

도 3을 참조하면, 유효영역의 범위는 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 유효색구역 내에 포함된 색상인 것으로 할 수 있는데, 구체적으로 CIE 색도도가 CIE 1931 색도도일 경우, 백색점의 x,y좌표는 0.333, 0.333이고, 황녹색점의 좌표는 0.3, 0.7이고, 오렌지색점의 좌표는 0.6, 0.4가 될 수 있다.

CIE 색도도는 국제조명위원회(CIE; Commission internationale de l'ㅹclairage)에서 제정한 표준 측색 시스템이다. CIE에서 제정한 색도도에는 CIE(L*a*b) 균등 색 공간을 기초로 하는 CIE 1931 색도도와, CIE(L*u*v) 균등 색 공간이라는 균등 색차 색도 시스템을 기초로 한 CIE 1960 색도도, CIE 1964 색도도, CIE 1976 색도도 및 CIE Lab 색도도 등을 포함한다.

이러한 CIE 색도도는 색상을 3차원으로 표현하는 RGB와는 달리, 색상을 2차원 좌표로 표현할 수 있기 때문에 평면상에 용이하게 유효 색 범위를 설정할 수 있는 장점이 있다.

이로써, 유효색상 추출부(163)는 이미지의 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)에서 색상이 CIE 색도도의 유효색구역에 포함되는 픽셀만을 유효영역으로 설정할 수 있게 된다.

또한, 유효색상 추출부(163)는 명도가 다양한 각 픽셀을 CIE 색도도와 비교할 수 있도록 자동으로 적정 명도로 조정한 후 유효영역인지 판단할 수 있다.

또한, 카트리지(120)는 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125) 외의 부위는 CIE 색도도의 유효색구역에 포함되지 않은 청색, 자색과 같은 색상을 취하여 유효색상 추출부(163)에서 유효영역을 설정할 때에 자동으로 제외되게 할 수 있다.

색상 평균화부(165)는 기준 흡수포(126)의 유효영역을 평균화하여 평균 색상을 산출하고, 검출 흡수포(125)의 유효영역을 평균화하여 평균 색상을 산출한다. 색상 평균화부(165)에서 평균화하는 색상은 실제의 명도 값도 함께 획득할 수 있도록 유효영역에 포함된 픽셀의 색상을 명도의 보정 없이 그대로 평균화 하는 것이 바람직하다.

일 실시예로서, 색상의 평균화는 적색(R), 녹색(G), 청색(B)을 각각 0 내지 255 사이의 숫자로 표현하는 RGB 색 모델을 이용하여 유효영역 내 모든 픽셀의 적색 평균값과, 녹색 평균값과, 청색 평균값을 산출하는 것으로 실시될 수 있다. 또한 이 밖에도 CMY 색 모델, CMYK 색 모델, HSB 색 모델이 이용될 수 있다.

색차분석부(167)는 기준 흡수포(126)의 평균 색상에서 명도 값을 추출하고, 검출 흡수포(125)의 평균 색상에서도 명도 값을 추출하여, 두 명도 값 사이의 차이를 산출하게 된다. 일 예로서, 먼셀표색계에서는 백색을 명도 10, 검정색을 명도 0으로 정의하고, 그 사이의 회색 단계를 10등분하여 차례로 번호를 매겨 절대 명도값을 구분한다. 색차분석부(167)는 이러한 기준을 참조하여 기 설정된 절대적 명도 구분 기준을 포함하고, 기준 흡수포(126)의 명도 값과, 검출 흡수포(125)의 명도 값을 절대적 명도 구분 기준과 대조하는 것으로 정의할 수 있게 된다. 예를 들어, 기준 흡수포(126)의 명도가 절대적 명도 구분 기준으로 8.8이고, 검출 흡수포(125)의 명도가 절대적 명도 구분 기준으로 3.2이면 색차분석부(167)에서 최종 산출하는 명도 차이의 값은 5.6이 된다.

티로신 검출용 효소 조성물은 소변에 포함된 티로신의 함량이 많아질수록 명도가 검정색에 더 가까워지게 되므로, 최종적으로 본 발명은 기준 흡수포(126)의 명도와 검출 흡수포(125)의 명도의 차이로 소변에 포함된 티로신의 양의 추정이 가능하게 된다.

따라서, 제어부(160)는 색차분석부(167)를 통해 산출된 명도 차이의 값으로 소변에 포함된 티로신량을 산출하는 티로신량 산출부(169)를 더 포함할 수 있다.

일 예로서, 티로신량 산출부(169)는 색차분석부(167)에서 산출된 명도 차이의 값이 5.6 인 경우, 소변 내에 티로신의 비중이 약 8%로서 상당히 높은 수치인 것으로 판단할 수 있다.

출력부(170)는 제어부(160)에서 산출한 명도 차이의 값, 및/또는 소변 내 예상 티로신의 비중, 및/또는 기준 흡수포(126) 및 산출 흡수포의 색상 값을 숫자와 같은 텍스트로 출력하게 된다.

또한, 제어부(160)는 기준 흡수포(126)의 색상 값을 이용하여 체내 수분 부족 여부(소변 명도의 진하기)와, 간질환 여부(소변이 갈색 또는 주황색), 담도 질환 여부(소변이 주황색), 신장질환, 신장 암, 요로감염, 전립선 질환(소변이 붉은색) 등도 개략적으로 진단할 수 있게 된다.

계속해서 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 이용하여 티로신 검출용 효소의 변색량을 산출하는 방법에 관하여 설명한다.

도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 방법은 스캐너(140)가 검체가 수용된 기준 흡수포(126)와, 티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 및 상기 검체가 혼합되어 수용된 검출 흡수포(125)를 포함하는 카트리지(120)를 스캐닝하는 단계(S100)를 포함한다.

또한, 영역인식부(161)가 스캐너(140)를 통해 획득된 이미지에서 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)를 분리하여 인식하는 단계(S200)와, 유효색상 추출부(163)가 이미지에서 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 유효색구역 내에 포함된 색상만을 유효영역으로 설정하는 단계(S300), 색상 평균화부(165)가 기준 흡수포(126)의 유효영역의 색상과 검출 흡수포(125)의 유효영역의 색상을 각각 평균화하여 기준 흡수포(126)의 평균 색상과 검출 흡수포(125)의 평균 색상을 산출하는 단계(S400)를 포함한다.

또한, 색차분석부(167)가 기준 흡수포(126)의 평균 색상의 명도 대비 검출 흡수포(125)의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 단계(S500)와, 출력부(170)가 명도 차이의 값을 출력하는 단계(S700)를 포함한다.

스캐너(140), 카트리지(120), CIE 색도도에 관한 설명은 전술된 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에서의 특징과 중복되므로 반복되는 설명은 생략한다.

또한, S500 단계에 이어서 티로신량 산출부(169)가 색차분석부(167)를 통해 산출된 명도 차이의 값으로 소변에 포함된 티로신량을 산출하는 단계(S600)를 더 포함할 수 있다. 이 때, 출력부(170)는 티로신량 산출부(169)에서 산출된 티로신량의 값을 함께 출력하는 것이 바람직하다.

계속해서 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 사용될 암 마커 검출용 시약으로 개발된 티로신 검출용 효소 조성물에 대해 설명하기로 한다.

전술된 바와 같이 상기 티로신 검출용 효소 조성물은 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여 이루어진다.

상기 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키고, 상기 멜라닌의 색상을 통해 농도를 측정함으로써 암을 진단할 수 있다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물을 이용하여 L-티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환하는데 있어서, 상기 멜라닌은 유멜라닌(Eumelanin)인 것을 특징으로 한다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물은 소변을 이용하여 암을 진단하기 위한 것이므로, 소변의 색상을 고려해볼 때 황갈색을 나타내는 페오멜라닌(Pheomelanin) 또는 갈색을 나타내는 혼합 멜라닌(Mixed melanins)을 통해 농도를 측정하는 경우, 소변의 색상과 비슷하여 농도 측정이 어려울 수 있다. 따라서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은 검정색을 나타내는 유멜라닌을 통해 농도를 측정하는 것이 바람직하다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물은 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소를 추가함으로써, 유멜라닌 생합성 경로를 가속시킬 뿐만 아니라, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도할 수 있다.

상기 티로신 검출 반응은 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액 및 최종 농도가 0.1% 내지 0.5%인 Tween 20, pH 7.0 내지 8.5 조건 하에서 측정하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 조성물에 포함되는 인산완충용액은 200mM이고, 효소 조성물 500 ㎕과 소변 샘플 500 ㎕의 총 부피가 1000 ㎕인 경우, 티로신 검출 반응의 인산완충용액 최종 농도는 50mM에서 수행될 수 있다. 단, 이 같은 각 성분의 비율을 참조하여 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 적용할 수 있다.

상기 소변 내에 존재하는 티로신의 농도는 상기 티로신 검출용 효소 조성물과 반응하여 생성되는 유멜라닌의 색상을 통해 측정될 수 있다. 여기서 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 검정색에 가까울 경우, 일정한 소변 양에 티로신의 농도가 높다는 것을 알 수 있다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물은 티로시나아제 40 unit을 1 중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 DCT를 0.5 내지 2 중량비 및 Tyrp1을 0.5 내지 2 중량비로 포함하도록 한다. 이 같은 함량을 만족하지 않는 경우, 생성되는 멜라닌의 색상이 황갈색계통 색상이 나타날 수 있어 소변 색과 혼합되므로 티로신의 농도를 측정하기 어려울 수 있다.

하기 반응식 1을 참조로, L-티로신은 티로시나아제에 의해 산화되어 L-도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 형성하고, 다시 티로시나아제에 의해 산화되어 DOPA 퀴논(Quinone)을 형성하며, 루코도파크롬(Leucodopachrome)을 거쳐 도파크롬(Dopachrome)을 형성한다.

[반응식 1]

상기 도파크롬은 멜라닌 전구체로서, DCT에 의해 토토머화(Tautomerization)되어 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산(5,6-Dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)을 형성한다.

상기 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산은 Tyrp 1에 의해 산화되어 인돌-5,6-퀴논 카르복실산을 형성하고 상기 인돌-5,6-퀴논 카르복실산은 중합되어 유멜라닌을 형성한다.

상기 티로시나아제(Tyrosinase)는 미생물 및 식물 및 유기체 조직에서 발견될 수 있는 티로시나아제 수산화효소 및 도파 산화효소 촉매적 활성을 갖는 구리-함유 효소이다. 특히, 상기 티로시나아제는 티로신과 같은 페놀의 산화에 의하여 멜라닌 및 다른 색소의 생성을 촉진한다.

상기 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT)는 티로시나아제-관련 단백질 2(Tyrp 2)로도 알려져 있으며, 티로시나아제 및 Tyrp 1과 결합하여 멜라닌 세포에서 L-티로신을 멜라닌으로 전환하는데 있어 특성화된 멜라닌세포 특이적 효소이다. 상기 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp 1)은 티로시나아제를 안정화시키는데 도움을 주는 역할을 한다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물은 상기 도파크롬이 티로시나아제에 의해 5,6-디히드록시인돌(5,6-dihydroxyindole)을 거쳐 인돌-5,6-퀴논(Indole-5,6-quinone)을 형성하여 갈색에 가까운 멜라닌을 형성하는 과정이 아닌(하기 반응식 2 참조), DCT에 의해 토토머화되고 Tyrp 1에 의해 산화되어 검은색에 가까운 멜라닌을 형성하도록 하여 시료인 소변의 색상과 구분되게 함으로써 농도 측정을 효과적으로 수행할 수 있도록 한다.

[반응식 2]

생성된 유멜라닌의 색상을 통해 소변 내에 존재하는 티로신의 농도 측정시, 육안으로는 도 5의 대조 색상표와 상기 생성된 유멜라닌의 색상을 비교하여 소변 내의 티로신 농도를 짐작 할 수 있다. 이를 통해, 암 및 대사질환의 발생 여부를 진단할 수 있다.

한편, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은 티로시나아제, DCT 및 Tyrp1을 포함하고, 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액과 Tween 20 및 증류수를 추가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 티로시나아제, DCt 및 Tyrp1은 전술한 바와 같이, 티로시나아제 40 unit을 1 중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 DCT를 0.5 내지 2 중량비 및 Tyrp1을 0.5 내지 2 중량비로 포함할 수 있다.

<제조예 1> 티로신 검출용 효소 조성물 각 구성요소의 제조

티로시나아제 효소는 Sigma사로부터 구매하여 사용하였다.

DCT와 Tyrp1은 아래 단계를 참조로 생쥐 혈액으로부터 유전자를 확보하고 대장균에서 단백질 발현 후 정제하여 실험에 사용하였다.

(i) 생쥐 혈액으로부터 RNA 추출하는 단계

RNA 추출은 상용화된 추출장치를 사용하였으며, RiboEx RNA extraction solution장치 (진올 바이오테크놀로지, 한국)를 사용하였다. 과정은 아래와 같다.

a. 생쥐혈액으로부터 생쥐 혈액 300 ㎕와 RiboEx RNA extraction solution (진올 바이오테크놀로지, 한국) 600 ㎕를 넣고 강하게 섞고 5 ~ 10분간 상온 방치하여 세포막을 녹였다.

b. 클로로포름 200 ㎕를 넣고 강하게 섞고 원심분리기를 이용해 13000 rpm, 4도, 10분간 원심분리하여 상하층으로 분리하였다.

c. 상층만 회수한 후 동일한 양의 컬럼 결합buffer를 넣고 잘 섞은 후 장치에서 제공하는 컬럼에 투입하고 원심분리 (spin down) 하여 RNA 만 컬럼에 결합시켰다.

d. 컬럼에 장치에서 제공하는 세척버퍼를 투입한 후 원심분리 (spin down) 하여 RNA 이외 물질을 제거하였다. 추가 1분 정도 원심분리하여 잔존하는 세척버퍼를 제거하였다.

e. 컬럼에 결합된 RNA를 회수하는 elution buffer를 투입한 후 5분 후 원심분리 (spin down)하여 최종적으로 RNA를 회수하였다.

(ii) 확보한 RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계

1 ㎍ RNA, Reverse transcriptase(역전사효소) 5 unit, oligo dT - 50 pmol, 0.1 M DTT- 2 ㎕, 10x 반응버퍼(reaction buffer)- 2 ㎕, 물- 약 20 ㎕; 위 조성으로 혼합물을 제조하고 PCR 기기에서 45℃에서 10분, 38℃에서 3시간 이상 반응시켰다.

(iii) cDNA로부터 유전자 (DCT, Tyrp1) 확보 단계

a. 위의 단계에서 생성된 cDNA로부터 유전자를 증폭해 내기 위해 아래와 같은 조성으로 혼합물을 제조한 후 아래 조건 하에서 유전자증폭반응(PCR)을 수행하였다.

혼합물 조성: cDNA액 - 2 ㎕, pfu DNA증폭효소- 5 unit, 10mM dNTP- 2 ㎕, 10x 반응버퍼 4 ㎕, 각 2 pmol- 프라이머 쌍, 물- 약 40 ㎕.

증폭반응조건: 95℃ 4분- 1회; 95℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 1분 50초- 35회; 72℃ 10분- 1회; 4℃ 계속.

상기 반응에 사용된 프라이머쌍의 정보는 하기 표 1과 같다.

구분		염기서열
DCT 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgggccttgtgggatggg (서열번호 1)
DCT 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	taggcttcctccgtgtatctcttgc (서열번호 2)
Tyrp1 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgaaatcttacaacgtcctccccct (서열번호 3)
Tyrp1 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	cagaccatggagtggttaggattcg (서열번호 4)

DCT와 Tyrp1 효소는 상기 방법으로 확보된 유전자를 pET28a 벡터에 삽입하여 6x His 가 N-말단에 부착된 융합단백질 형태로 제작하였고, BL21(DE3) 대장균에 형질전환시켜 단백질을 제조하였다. 그 과정은 아래와 같다.

(i) 형질전환 대장균 배양단계

a. pET28a 벡터의 NdeI, XhoI 제한효소 site에 DCT 또는 Tyrp1 유전자를 삽입함으로써 6x His ~단백질을 생산하는 재조합DNA를 완성하였다.

b. BL21(DE3)대장균에 heat shock 형질전환법을 이용해 형질전환 대장균을 제조하였다.

c. 해당 대장균주를 3 L Luria broth액에서 37℃, 200 rpm 하에서 OD600 ~ 0.7까지 배양 후 0.1M IPTG를 처리하여 단백질생산을 induction하였다.

d. 30℃, 4시간 추가배양 후 원심분리를 통해 대장균을 침전시켰다.

(ii) 대장균 파쇄 단계

a. 침전된 대장균을 1x PBS 200 ml을 투입하여 resuspend 시켰다가 원심분리기에서 침전시킴으로써 세척과정을 수행하였다.

b. 침전된 대장균을 40 ml- 0.5 M NaCl, 5mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9; 에 투입하였다.

c. 초음파 세포파쇄기에서 대장균을 Energy 38% max, total cell breaking time 4분(2초 sonic treatment/4초 pause) 조건 하에서 파쇄하였다. 대장균 샘플을 담은 병은 세포파쇄과정동안 얼음에 담긴 상태를 유지하였다.

d. 파쇄된 대장균은 13000 rpm, 30분, 4도 조건에서 원심분리하였다.

e. 상등액만 깨끗한 conical tube에 모아두었다.

(iii) Ni-NTA Agarose resin을 이용한 his tag-융합단백질 정제

a. 위의 단계에서 얻어진 수용성 단백질액을 Ni-NTA Agarose resin 과 혼합하고 30분간 4℃ 조건하에서 흔들어 주면서 his tag-융합단백질과 Ni-NTA Agarose resin이 서로 결합하도록 유도하였다.

b. 단백질액, resin 혼합액을 컬럼에 투입하고 컬럼 코크를 열어 액체를 뽑아내었다.

c. Washing buffer (0.5 M NaCl, 60mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 400 ml을 통과시켜 불순물과 융합단백질 이외의 단백질을 제거하였다.

d. Elution buffer (0.25 M NaCl, 500mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 3 ml을 투입하고 10분간 방치한 후 코크를 열어 단백질을 회수하였다.

e. d 과정을 2회 반복하였다.

(iv) FPLC-size exclusion법을 이용한 단백질 정제

a. 회수된 단백질을 superdex S200 (GE healthcare) 컬럼이 장착된 FPLC에 투입하고 단백질을 크기에 따라 분리하였다.

b. 얻어진 fraction샘플들 가운데 his tag 융합단백질에 해당하는 fraction을 polyacrylamide gel electrophoresis 법으로 확인하고 최종적으로 원하는 his tag 융합단백질을 확보하였다.

c. Abs 280값을 측정하고 얻어진 값으로부터 단백질 농도를 환산하여 하기 표 2에 기재하였다.

구분	단백질 농도(OD₂₈₀nm)
1 mg DCT/ml	1.65
1 mg Tyrp1/ml	1.42

<효소 조성물의 제조>

하기 표 3을 참조로, 활성이 1000 unit/ml인 티로시나아제 효소 40 ㎕에 상기 제조예 1에서 제조된 활성이 1000 unit/ml인 DCT 40㎕ 및 활성이 1000 unit/ml인 Tyrp1 40 ㎕, 200mM Tris buffer pH 8을 250 ㎕, 10% Tween 20 25 ㎕, 증류수(Distilled water) 105 ㎕를 넣어 효소 조성물(Stock solution)을 제조하였다.

Stock solution	Volumn(500 ㎕)
200 mM Tris buffer pH8	250 ㎕
10% Tween 20	25 ㎕
Tyrosinase(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
DCT(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
TYRP1(>=1000 unit/ml)	40 ㎕
D.W	105 ㎕

<소변 시료 채취>

정상인과 암환자의 소변 채취는 동일하며 다음과 같이 수행하였다.

아침 기상 후 첫 소변을 채취함에 있어 요도로부터 흘러나오는 처음 소변은 채취하지 않으며, 중간 소변에서 샘플을 30 ml 채취하였다.

<실험예 1> 소변 내에 존재하는 티로신 농도의 측정 1

일정량 내에 존재하는 티로신의 농도를 측정하기 위해 채취된 정상인과 암환자의 소변 각각 500 ㎕ 동일한 양을 티로신 검출용 효소 조성물과 반응시켰다(각각 총 1000 ㎕). 그런 다음, 생성된 각 유멜라닌에 의한 소변의 색상을 도 5의 대조 색상표와 비교하고 하기 표 4에 기재하였다.

	유멜라닌에 의한 소변의 색상
정상인의 소변	황색~황갈색
암환자의 소변	검정색

상기 표 4에서 보듯이, 정상인의 소변이 본 발명의 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변 색상은 황색에서 황갈색인 반면, 암환자의 소변이 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상은 검정색으로 나타났음을 확인하였다.

이를 통해, 암환자의 소변 내에 티로신이 다량으로 존재함을 알 수 있었다.

<실험예 2> 소변 내에 존재하는 티로신 농도의 측정 2

티로시나아제만을 포함하는 기존의 효소 조성물에 비해, 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1을 추가로 포함한 효소 조성물을 사용한 경우, 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 더욱 검정색으로 나타날 수 있음을 알아보기 위해, 아래와 같이 실험을 수행하였다.

상기 실험예 1에서와 같은 방식으로 채취된 정상인의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit, DCT 20 unit 및 Tyrp1 20 unit을 포함하는 본 발명의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (A), 암환자의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit만을 포함하는 기존의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (B), 및 암환자의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit, DCT 20 unit 및 Tyrp1 20 unit을 포함하는 본 발명의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (C)를 37℃에서 30분 동안 각각 반응시켰다.

도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 효소 조성물과 정상인의 소변을 반응시킨 혼합물 (A)는 황색을 나타내는데 비해, 암환자의 소변을 반응시킨 혼합물 (B) 및 (C)는 더욱 짙은 황갈색 또는 검은색을 나타내는 것을 확인하였다.

특히, 암환자의 소변 검출 결과, DCT 및 Tyrp 1을 더 포함한 혼합물 (C)의 색상이 티로시나아제만을 포함한 혼합물 (B)에 비해 더욱 검은색을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 효소 조성물이 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소를 추가함으로써, 유멜라닌 생합성 경로를 가속시킬 뿐만 아니라, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도할 수 있음을 확인하였다.

이와 같이 본 발명의 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템에 사용하기 위해 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 형태로 개발한 효소 조성물은 보다 정확하고 편리하게 암 및 대사질환의 발생을 확인할 수 있도록 해준다.

계속해서 본 발명의 다른 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템을 포함하는 암 진단 장치에 관하여 설명한다.

도 7 및 도 8을 참조하면, 이 실시예에 의한 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템이 포함된 암 진단 장치는 얇은 평판형으로 이루어져 휴대 및 보관이 용이하며, 티로신 검출용 효소 조성물의 티로신 반응에 의한 카트리지(120)의 색상 변화를 케이스(110)의 윈도우(112) 전면에서 스캐너(140)가 스캐닝하여 그 색상 및 변색 형태에 관한 스캔 정보를 획득할 수 있는 장치이다.

이하, 본 발명의 실시예에 의한 암 진단 장치에 대해 아래에서 상세히 설명하기로 한다.

도 2, 도 7 및 도 8를 참조하면, 이 실시예에 의한 암 진단 장치는 평판형 케이스(110)와, 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)로 구성된 흡수포(121)를 구비한 착탈식의 카트리지(120)와, 카트리지(120)의 검출 흡수포(125)에 흡수된 상태로 존재하며 검출 흡수포(125)에 소변이 흡수되었을 때 티로신 반응에 의한 색상 변화를 윈도우(112)를 통해 육안으로 관찰할 수 있도록 유도하는 티로신 검출용 효소 조성물과, 카트리지(120)의 흡수포(121)를 스캐닝하는 평판형 스캐너(140)와, 외부 광에 의한 색상 왜곡을 방지하기 위하여 회전틀(151)과 광학 필름(152)으로 이루어진 필름부재(150)와, 스캐너로 촬상된 이미지에서 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 영역 내에 포함된 색상을 가지는 부위에 대해서만 기준 흡수포(126)의 평균 색상과 검출 흡수포(125)의 평균 색상을 산출하여, 기준 흡수포(126)의 평균 색상의 명도 대비 검출 흡수포(125)의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 제어부(도 1 참조)를 포함한다.

아래에서는 주요 구성요소들을 중심으로 이 실시예에 의한 암 진단 장치에 대해 상세히 설명하기로 한다.

케이스(110)는 카트리지(120)의 흡수포(121) 및 방수시트(122)가 삽입되는 내부공간(110a, 도 9 참조)을 구비된다.

케이스(110)의 전면에는 투명 윈도우(112)가 설치되어 검출 흡수포(125)에 흡수된 상태로 있는 티로신 검출용 효소 조성물의 티로신 반응에 의하여 생성된 유멜라닌의 색상을 외부에서 육안으로 파악할 수 있도록 한다. 그리고 육안 확인시에는 대조 색상표(113)와 생성된 유멜라닌의 색상을 비교하여 소변 내의 티로신 농도를 확인 할 수 있다.

또한, 투명 윈도우(112)에는 카트리지(120) 상에 물리적으로 분리되어 배치된 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)의 경계(127, 도 2 참조)와 일치되는 부위에 제어부가 기준 흡수포(126)와 검출 흡수포(125)를 별개로 인식되게 하기 위한 경계라인(117)이 형성될 수 있다.

또한, 케이스(110)의 전면에는 소변이 투입되는 투입구(111)가 형성된다. 여기서 투입구(111)의 상단 입구에는 투입된 소변이 외부로 누설되는 것을 방지하기 위하여 탄성 재질의 차단막(130)이 설치된다. 도 9에서 볼 수 있는 것처럼 차단막(130)은 유연하면서도 탄성을 갖는 고무 혹은 그와 유사한 소재로 이루어지며, 스포이드에 의해 갈라지면서 개방 가능하도록 복수의 조각으로 구성된다.

또한, 도 9에서 볼 수 있는 것처럼 투입구(111) 내부에는 투입된 소변(L1)이 고여 있는 상태에서 점진적으로 낙하하도록 한 제1인입공(111b)을 갖는 상부 고임판(111a)과, 상부 고임판(111a)의 하측으로 이격 설치되고 제1인입공(111b)을 통해 인입된 액상의 소변(L1)이 고여 있는 상태에서 점진적으로 낙하하도록 제1인입공(111b)과 대각방향에 형성된 제2인입공(111d)을 갖는 하부 고임판(111c)이 더 형성된다. 나아가 제1인입공(111b)의 하측에는 가이드 스크루(111e)가 더 설치된다. 이로써 제1인입공(111b)을 통해 유입되는 소변이 가이드 스크루(111e)를 타고 나선형으로 흐르면서 더욱 감속된 상태로 흐르게 된다. 이 같은 구성에 따르면 소변(L1)이 최대한 감속된 속도로 흡수포(121)에 흡수되면서 티로신 검출용 효소 조성물과 과도한 속도로 혼합되지 않고 서서히 점진적으로 혼합된다. 이로써 티로신 검출용 효소 조성물에 의해 유멜라닌 색상이 더욱 원만하게 발현된다.

여기서 투입구(111)는 케이스(110)에 복수개 구비될 수 있다. 이로서 소변을 두 지점에서 동시에 투입하거나 한 곳은 소변을 투입하는 용도로 사용하고 다른 한 곳은 티로신 검출용 효소 조성물을 보충하기 위한 용도로 사용하는 등 보다 융통성 있는 운용이 가능해진다.

카트리지(120)는 도 2에서 볼 수 있는 것처럼 기준 흡수포(126) 및 검출 흡수포(125)로 구성된 흡수포(121)와, 흡수포(121)의 후면에 덧대어진 소수성 재질의 방수시트(122)와, 흡수포(121) 및 방수시트(122)를 케이스(110)에 입출하기 용이하도록 구비된 핸들바(123)로 이루어진다.

카트리지(120)에서 흡수포(121)의 소재는 순백색의 색상을 갖는 일반적인 부직포나, 면, 마, 레이온 등이 적합하며 흡수성이 좋은 다층 종이로도 마련될 수 있다. 이 같은 흡수포(121)는 티로신 검출용 효소 조성물을 이미 흡수한 상태에서 투입구(111)를 통해 투입되는 소변을 흡수하여 서로 혼합되도록 하는 매개체로서의 역할을 수행한다.

또한, 카트리지(120)에서 방수시트(122)는 소수성 재질의 소재로 마련된다. 이 같은 방수시트(122)는 폴리에스테르계 섬유, 폴리올레핀계 섬유, 아크릴 섬유, 나일론 섬유 등 소수성의 섬유나 플라스틱 시트 등으로 마련될 수 있다. 이로써 방수시트(122)는 흡수포(121)에 흡수된 소변 및 효소 조성물이 후측으로 유출되지 않도록 보존하는 역할을 한다.

여기서 카트리지(120)의 경우 리필용 제품을 생산 및 판매하도록 하여 암 진단에 한번 사용하고 나면 폐기하고 새로운 것으로 교체할 수 있다.

스캐너(140)는 카트리지(120)의 흡수포(121)를 스캐닝하여 변화된 색상 정보를 포함하는 이미지를 생성하는 역할을 한다. 이를 위해 스캐너(140)는 케이스(110)의 측단부에 여닫이 회전 가능하도록 결합되어 케이스(110) 전면에 선택적으로 위치할 수 있다. 스캐너(140)의 스캐닝을 위한 작동 스위치(115)는 케이스(110) 전면에 설치된다.

필름부재(150)는 케이스(110)의 측단부에 여닫이 회전 가능하도록 결합되어 케이스(110) 전면에 선택적으로 위치할 수 있도록 하며, 윈도우(112)에 대응하는 개구부(151a)를 구비한 회전틀(151)과, 회전틀(151)에 교체 가능하도록 착탈식으로 끼워져서 윈도우(112) 전면에서 외부 광에 의한 색상 왜곡을 방지하는 광학 필름(152)으로 이루어진다.

광학 필름(152)은 반사 방지 필름(anti-reflection film), 눈부심 방지 필름(anti-glare film) 및 편광 필름(polarizer) 중 어느 하나일 수 있으며 도 2에서 볼 수 있는 것처럼 이들을 복합적으로 적용한 다층구조일 수 있다. 이 실시예에서는 이 같은 광학 필름(152)을 케이스(110)의 윈도우(112) 전면에 위치시키기 위해 접착제를 사용하지 않고 케이스(110)에 대하여 여닫이 회전 가능한 회전틀(151)을 구비하여 끼우는 방식으로 구성함으로써 두 종류 이상의 광학 필름(152)을 복합적으로 적용할 수 있도록 하였다.

도 10a는 윈도우 표면 반사를 최소화하기 위한 반사 방지 필름(anti-reflection film)을 적용한 예시이다. 반사 방지 필름(152a)은, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethyleneterephtalate; PET)와 같은 기재 필름(152a-1) 상에 굴절률(Reflective index)이 다른 물질로 된 다층 박막(152a-2)을 증착법이나 코팅법에 의해서 필름의 표면에 형성함으로써 반사 방지 효과를 갖도록 한 것이 사용될 수 있다. 예를 들면, 실리콘 산화물(SiO₂)과 티타늄 산화물(TiO₂)을 교대로 적층할 수 있다.

도 10b는 외부 물체의 그림자가 윈도우 표면에 투영되는 것을 방지하기 위한 눈부심 방지 필름(anti-glare film)을 적용한 예시이다. 눈부심 방지 필름(152b)은, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethyleneterephtalate; PET)와 같은 기재 필름(152b-1)의 표면 상에 불규칙한 면(152b-2)을 포함하고 있어, 외부 빛을 난반사시킨다. 이와 같은 불규칙한 면(152b-2)은 실리콘 입자를 뿌려서 형성할 수 있다.

도 10c는 윈도우(112) 내측에 위치한 케이스(110) 내부 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer)을 적용한 예시이다. 선형 편광 필름(152c)은 입사광을 편광시키는 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol; PVA))과 같은 고분자 편광 매질(152c-2)을 중심으로 트리아세틸셀룰로오스(tri-acetyl-cellulose; TAC)와 같은 지지체(152c-1)(152c-3)가 양편에 위치할 수 있다.

도 10d는 윈도우(112) 내측에 위치한 케이스(110) 내부 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer)의 기능을 높이기 위하여 원형 편광 필름(circular polarizer)을 적용한 예시이다. 원형 편광 필름(152d)은 위상차를 보상하기 위한 보상 필름(retardation film)(152d-1)상에, 입사광을 편광시키는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA))과 같은 고분자 편광 매질(152d-3)을 중심으로 트리아세틸셀룰로오스(tri-acetyl-cellulose; TAC)와 같은 지지체(152d-2)(152d-4)가 양편에 위치할 수 있다.

이와 같이 본 발명에 적용되는 광학 필름(152)은 회전틀(151)에 의해 윈도우(112) 전면에 위치하면서 암 진단 장치를 육안에 의한 판정이 아니고, 별도의 분석 장치를 사용하는 경우에는 필요에 의해 회전틀(151)로부터 분리될 수도 있다. 특히 광학 필름(152)은 회전틀(151)에 의해 착탈이 용이하므로 접착제를 사용할 때와 같이 접착제의 박리력 제어를 염두에 두지 않아도 된다는 점에서 편리함이 있다.

이처럼 광학 필름(152)을 구비한 구성에 의하면 티로신 반응에 의해 생성된 유멜라닌의 색상을 스캐너가 스캐닝하거나, 케이스(110)에 인쇄된 대조 색상표(113)와 비교하여 음성, 양성을 판정할 때 외부 영향을 효과적으로 억제하여 정밀성을 높일 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

110 : 케이스 120 : 카트리지
125 : 검출 흡수포 126 : 기준 흡수포
130 : 차단막 140 : 스캐너
150 : 필름부재 160 : 제어부
170 : 출력부

<110> CubeBio <120> Enzyme Compositions for Detecting Cancer Biomarker Tyrosine <130> DP18030 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgggccttg tgggatggg 19 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctaggcttcc tccgtgtatc tcttgc 26 <210> 3 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaaatctt acaacgtcct ccccct 26 <210> 4 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcagaccatg gagtggttag gattcg 26 <210> 5 <211> 556 <212> PRT <213> Agaricus bisporus <400> 5 Met Ser Leu Ile Ala Thr Val Gly Pro Thr Gly Gly Val Lys Asn Arg 1 5 10 15 Leu Asn Ile Val Asp Phe Val Lys Asn Glu Lys Phe Phe Thr Leu Tyr 20 25 30 Val Arg Ser Leu Glu Leu Leu Gln Ala Lys Glu Gln His Asp Tyr Ser 35 40 45 Ser Phe Phe Gln Leu Ala Gly Ile His Gly Leu Pro Phe Thr Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Glu Arg Pro Ser Met Asn Leu Tyr Lys Ala Gly Tyr Cys Thr 65 70 75 80 His Gly Gln Val Leu Phe Pro Thr Trp His Arg Thr Tyr Leu Ser Val 85 90 95 Phe Glu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Ile Glu Val Ala Asn Lys Phe 100 105 110 Thr Ser Asn Gln Thr Asp Trp Ile Gln Ala Ala Gln Asp Leu Arg Gln 115 120 125 Pro Tyr Trp Asp Trp Gly Phe Glu Leu Met Pro Pro Asp Glu Val Ile 130 135 140 Lys Asn Glu Glu Val Asn Ile Thr Asn Tyr Asp Gly Lys Lys Ile Ser 145 150 155 160 Val Lys Asn Pro Ile Leu Arg Tyr His Phe His Pro Ile Asp Pro Ser 165 170 175 Phe Lys Pro Tyr Gly Asp Phe Ala Thr Trp Arg Thr Thr Val Arg Asn 180 185 190 Pro Asp Arg Asn Arg Arg Glu Asp Ile Pro Gly Leu Ile Lys Lys Met 195 200 205 Arg Leu Glu Glu Gly Gln Ile Arg Glu Lys Thr Tyr Asn Met Leu Lys 210 215 220 Phe Asn Asp Ala Trp Glu Arg Phe Ser Asn His Gly Ile Ser Asp Asp 225 230 235 240 Gln His Ala Asn Ser Leu Glu Ser Val His Asp Asp Ile His Val Met 245 250 255 Val Gly Tyr Gly Lys Ile Glu Gly His Met Asp His Pro Phe Phe Ala 260 265 270 Ala Phe Asp Pro Ile Phe Trp Leu His His Thr Asn Val Asp Arg Leu 275 280 285 Leu Ser Leu Trp Lys Ala Ile Asn Pro Asp Val Trp Val Thr Ser Gly 290 295 300 Arg Asn Arg Asp Gly Thr Met Gly Ile Ala Pro Asn Ala Gln Ile Asn 305 310 315 320 Asp Glu Thr Pro Leu Glu Pro Phe Tyr Gln Ser Glu Asp Lys Val Trp 325 330 335 Thr Ser Ala Ser Leu Ala Asp Thr Ala Arg Leu Gly Tyr Ser Tyr Pro 340 345 350 Asp Phe Asp Lys Leu Val Gly Gly Thr Lys Glu Leu Ile Arg Asp Ala 355 360 365 Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Arg Tyr Gly Ser Lys Pro Ser Ser Gly 370 375 380 Ala Arg Asn Thr Ala Phe Asp Leu Leu Ala Asp Phe Lys Gly Ile Thr 385 390 395 400 Lys Glu His Lys Glu Asp Leu Lys Met Tyr Asp Trp Thr Ile His Val 405 410 415 Ala Phe Lys Lys Phe Glu Leu Lys Glu Ser Phe Ser Leu Leu Phe Tyr 420 425 430 Phe Ala Ser Asp Gly Gly Asp Tyr Asp Gln Glu Asn Cys Phe Val Gly 435 440 445 Ser Ile Asn Ala Phe Arg Gly Thr Thr Pro Glu Thr Cys Ala Asn Cys 450 455 460 Gln Asp Asn Glu Asn Leu Ile Gln Glu Gly Phe Ile His Leu Asn His 465 470 475 480 Tyr Leu Ala Arg Asp Leu Glu Ser Phe Glu Pro Gln Asp Val His Lys 485 490 495 Phe Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ser Tyr Lys Leu Tyr Ser Arg Glu Asp 500 505 510 Lys Ser Leu Thr Ser Leu Ser Val Lys Ile Glu Gly Arg Pro Leu His 515 520 525 Leu Pro Pro Gly Glu His Arg Pro Lys Tyr Asp His Thr Gln Asp Arg 530 535 540 Val Val Phe Asp Asp Val Ala Val His Val Ile Asn 545 550 555 <210> 6 <211> 517 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Gly Leu Val Gly Trp Gly Leu Leu Leu Gly Cys Leu Gly Cys Gly 1 5 10 15 Ile Leu Leu Arg Ala Arg Ala Gln Phe Pro Arg Val Cys Met Thr Leu 20 25 30 Asp Gly Val Leu Asn Lys Glu Cys Cys Pro Pro Leu Gly Pro Glu Ala 35 40 45 Thr Asn Ile Cys Gly Phe Leu Glu Gly Arg Gly Gln Cys Ala Glu Val 50 55 60 Gln Thr Asp Thr Arg Pro Trp Ser Gly Pro Tyr Ile Leu Arg Asn Gln 65 70 75 80 Asp Asp Arg Glu Gln Trp Pro Arg Lys Phe Phe Asn Arg Thr Cys Lys 85 90 95 Cys Thr Gly Asn Phe Ala Gly Tyr Asn Cys Gly Gly Cys Lys Phe Gly 100 105 110 Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala Ile Leu Arg Arg 115 120 125 Asn Ile His Ser Leu Thr Ala Gln Glu Arg Glu Gln Phe Leu Gly Ala 130 135 140 Leu Asp Leu Ala Lys Lys Ser Ile His Pro Asp Tyr Val Ile Thr Thr 145 150 155 160 Gln His Trp Leu Gly Leu Leu Gly Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln Ile 165 170 175 Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr Ser 180 185 190 Val Arg Asp Thr Leu Leu Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Lys Ala Ile Asp 195 200 205 Phe Ser His Gln Gly Pro Ala Phe Val Thr Trp His Arg Tyr His Leu 210 215 220 Leu Trp Leu Glu Arg Glu Leu Gln Arg Leu Thr Gly Asn Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly Lys Asn Glu Cys Asp Val 245 250 255 Cys Thr Asp Glu Leu Leu Gly Ala Ala Arg Gln Asp Asp Pro Thr Leu 260 265 270 Ile Ser Arg Asn Ser Arg Phe Ser Thr Trp Glu Ile Val Cys Asp Ser 275 280 285 Leu Asp Asp Tyr Asn Arg Arg Val Thr Leu Cys Asn Gly Thr Tyr Glu 290 295 300 Gly Leu Leu Arg Arg Asn Lys Val Gly Arg Asn Asn Glu Lys Leu Pro 305 310 315 320 Thr Leu Lys Asn Val Gln Asp Cys Leu Ser Leu Gln Lys Phe Asp Ser 325 330 335 Pro Pro Phe Phe Gln Asn Ser Thr Phe Ser Phe Arg Asn Ala Leu Glu 340 345 350 Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Thr Leu Asp Ser Gln Val Met Asn Leu 355 360 365 His Asn Leu Ala His Ser Phe Leu Asn Gly Thr Asn Ala Leu Pro His 370 375 380 Ser Ala Ala Asn Asp Pro Val Phe Val Val Leu His Ser Phe Thr Asp 385 390 395 400 Ala Ile Phe Asp Glu Trp Leu Lys Arg Asn Asn Pro Ser Thr Asp Ala 405 410 415 Trp Pro Gln Glu Leu Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Met Tyr Asn Met 420 425 430 Val Pro Phe Phe Pro Pro Val Thr Asn Glu Glu Leu Phe Leu Thr Ala 435 440 445 Glu Gln Leu Gly Tyr Asn Tyr Ala Val Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala 450 455 460 Pro Val Trp Ser Thr Thr Leu Ser Val Val Ile Gly Ile Leu Gly Ala 465 470 475 480 Phe Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gln Tyr Arg Arg Leu 485 490 495 Arg Lys Gly Tyr Ala Pro Leu Met Glu Thr Gly Leu Ser Ser Lys Arg 500 505 510 Tyr Thr Glu Glu Ala 515 <210> 7 <211> 537 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Lys Ser Tyr Asn Val Leu Pro Leu Ala Tyr Ile Ser Leu Phe Leu 1 5 10 15 Met Leu Phe Tyr Gln Val Trp Ala Gln Phe Pro Arg Glu Cys Ala Asn 20 25 30 Ile Glu Ala Leu Arg Arg Gly Val Cys Cys Pro Asp Leu Leu Pro Ser 35 40 45 Ser Gly Pro Gly Thr Asp Pro Cys Gly Ser Ser Ser Gly Arg Gly Arg 50 55 60 Cys Val Ala Val Ile Ala Asp Ser Arg Pro His Ser Arg His Tyr Pro 65 70 75 80 His Asp Gly Lys Asp Asp Arg Glu Ala Trp Pro Leu Arg Phe Phe Asn 85 90 95 Arg Thr Cys Gln Cys Asn Asp Asn Phe Ser Gly His Asn Cys Gly Thr 100 105 110 Cys Arg Pro Gly Trp Arg Gly Ala Ala Cys Asn Gln Lys Ile Leu Thr 115 120 125 Val Arg Arg Asn Leu Leu Asp Leu Ser Pro Glu Glu Lys Ser His Phe 130 135 140 Val Arg Ala Leu Asp Met Ala Lys Arg Thr Thr His Pro Gln Phe Val 145 150 155 160 Ile Ala Thr Arg Arg Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn Thr 165 170 175 Pro Gln Phe Glu Asn Ile Ser Val Tyr Asn Tyr Phe Val Trp Thr His 180 185 190 Tyr Tyr Ser Val Lys Lys Thr Phe Leu Gly Thr Gly Gln Glu Ser Phe 195 200 205 Gly Asp Val Asp Phe Ser His Glu Gly Pro Ala Phe Leu Thr Trp His 210 215 220 Arg Tyr His Leu Leu Gln Leu Glu Arg Asp Met Gln Glu Met Leu Gln 225 230 235 240 Glu Pro Ser Phe Ser Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly Lys Asn 245 250 255 Val Cys Asp Val Cys Thr Asp Asp Leu Met Gly Ser Arg Ser Asn Phe 260 265 270 Asp Ser Thr Leu Ile Ser Pro Asn Ser Val Phe Ser Gln Trp Arg Val 275 280 285 Val Cys Glu Ser Leu Glu Glu Tyr Asp Thr Leu Gly Thr Leu Cys Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Gly Gly Pro Ile Arg Arg Asn Pro Ala Gly Asn Val Gly 305 310 315 320 Arg Pro Ala Val Gln Arg Leu Pro Glu Pro Gln Asp Val Thr Gln Cys 325 330 335 Leu Glu Val Arg Val Phe Asp Thr Pro Pro Phe Tyr Ser Asn Ser Thr 340 345 350 Asp Ser Phe Arg Asn Thr Val Glu Gly Tyr Ser Ala Pro Thr Gly Lys 355 360 365 Tyr Asp Pro Ala Val Arg Ser Leu His Asn Leu Ala His Leu Phe Leu 370 375 380 Asn Gly Thr Gly Gly Gln Thr His Leu Ser Pro Asn Asp Pro Ile Phe 385 390 395 400 Val Leu Leu His Thr Phe Thr Asp Ala Val Phe Asp Glu Trp Leu Arg 405 410 415 Arg Tyr Asn Ala Asp Ile Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Ala Pro Ile 420 425 430 Gly His Asn Arg Gln Tyr Asn Met Val Pro Phe Trp Pro Pro Val Thr 435 440 445 Asn Thr Glu Met Phe Val Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr Ala Tyr 450 455 460 Glu Val Gln Trp Pro Gly Gln Glu Phe Thr Val Ser Glu Ile Ile Thr 465 470 475 480 Ile Ala Val Val Ala Ala Leu Leu Leu Val Ala Ala Ile Phe Gly Val 485 490 495 Ala Ser Cys Leu Ile Arg Ser Arg Ser Thr Lys Asn Glu Ala Asn Gln 500 505 510 Pro Leu Leu Thr Asp His Tyr Gln Arg Tyr Ala Glu Asp Tyr Glu Glu 515 520 525 Leu Pro Asn Pro Asn His Ser Met Val 530 535

Claims

검체를 수용하기 위한 기준 흡수포와,
티로신과 혼합되면 변색되는 것으로 티로신의 포함 여부를 검출할 수 있는 티로신 검출용 효소 조성물이 기 수용되며, 상기 검체를 함께 수용하기 위한 검출 흡수포를 포함하는 카트리지와;
상기 카트리지를 스캐닝하는 스캐너와;
상기 스캐너로 촬상된 이미지에서 기 설정된 유효색구역 내에 포함된 색상을 유효색상으로 설정하고, 상기 기준 흡수포 내에서 상기 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상과 상기 검출 흡수포 내에서 상기 유효색상으로 설정된 부위의 평균 색상을 산출하여, 상기 기준 흡수포의 평균 색상의 명도 대비 상기 검출 흡수포의 평균 색상의 명도 차이를 산출하는 제어부와;
상기 제어부가 산출한 상기 명도 차이 값을 출력하는 출력부를 포함하고,
상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 상기 검체 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
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제 1 항에 있어서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은,
티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 도파크롬 상호변이효소(DCT)를 0.5 내지 2 중량비 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 0.5 내지 2 중량비로 포함하며, L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜 티로신의 농도가 증가함에 따라 검체의 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되는 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은,
최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 최종 농도가 0.1~0.5%인 Tween20, 및 증류수를 더 포함하고, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 인 액체로 되어 상기 검출 흡수포에 흡수된 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
제 1 항에 있어서,
상기 기준 흡수포에는 상기 티로신 검출용 효소 조성물과 동일한 색상의 색소액이 흡수된 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
제 1 항에 있어서,
상기 검체는 소변이고,
상기 유효색구역은 CIE 색도도 상에 3개의 점이 백색점, 황녹색점, 오렌지색점으로 구성된 삼각형의 영역 내에 포함된 색상인 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
제 6 항에 있어서,
상기 CIE 색도도는 CIE 1931 색도도이고, 상기 백색점의 x,y좌표는 0.333, 0.333이고, 상기 황녹색점의 x,y좌표는 0.3, 0.7이고, 상기 오렌지색점의 x,y좌표는 0.6, 0.4인 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
제 1 항에 있어서,
상기 제어부는 상기 명도 차이 값을 기준으로 상기 검체에 포함된 티로신량을 산출하고,
상기 출력부는 상기 티로신량을 함께 출력하는 것을 특징으로 하는 티로신 검출용 효소의 변색 정도 산출 시스템.
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