KR101743925B1 - 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법 - Google Patents

기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101743925B1
KR101743925B1 KR1020150104441A KR20150104441A KR101743925B1 KR 101743925 B1 KR101743925 B1 KR 101743925B1 KR 1020150104441 A KR1020150104441 A KR 1020150104441A KR 20150104441 A KR20150104441 A KR 20150104441A KR 101743925 B1 KR101743925 B1 KR 101743925B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polycyclic aromatic
aromatic hydrocarbons
gas chromatography
electrospray
benzo
Prior art date
Application number
KR1020150104441A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170011591A (ko
Inventor
이재익
차은주
김소희
이강미
김호준
권오승
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020150104441A priority Critical patent/KR101743925B1/ko
Publication of KR20170011591A publication Critical patent/KR20170011591A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101743925B1 publication Critical patent/KR101743925B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/30—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H01J49/34—Dynamic spectrometers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기(gas chromatography-electrospray/mass spectrometry, GC-ESI/MS)를 이용한 다환 방향족탄화수소에 대한 이온화 방법 및 검출 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 기체 상태의 다환 방향족탄화수소를 효율적으로 이온화시키고, 이를 기반으로 다환 방향족탄화수소를 검출하는 분석 방법에 관한 것이다.

Description

기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법{A METHOD OF IONIZATION AND ANALYSIS OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS BY GAS CHROMATOGRAPHY-ELECTROSPRAY/MASS SPECTROMETRY}
본 발명은 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기(gas chromatography-electrospray/mass spectrometry, GC-ESI/MS)를 이용한 다환 방향족탄화수소에 대한 이온화 방법 및 검출 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 기체 상태의 다환 방향족탄화수소를 효율적으로 이온화시키고, 이를 기반으로 다환 방향족탄화수소를 검출하는 분석 방법에 관한 것이다.
다환 방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAH)는 2가지 이상의 방향족 고리와 탄소와 수소로 이루어진 화합물이다.
상기 다환 방향족탄화수소는 나무, 담배, 쓰레기, 화석연료와 같은 유기물의 불완전 연소 또는 식품의 가열, 훈제 공정 중에서 주로 발생한다.
상기 다환 방향족탄화수소는 미량으로도 암을 유발할 수 있는 발암성 또는 돌연변이성이 있는 물질로서 토양, 대기, 식품 등에 광범위하게 존재한다.
이에 따라 미국 환경보호국(United States Environmental Protection Agency)은 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene), 벤조(a)안트라센(benzo(a)anthracene), 벤조(b)플로란센 (benzo(b)fluoranthene), 크리센(chrysene), 다이벤조(a,h)안트라센(dibenzo(a,h)anthracene), 인데노(1,2,3-cd)피렌(indeno(1,2,3-cd)pyrene) 등의 16종의 다환 방향족탄화수소를 발암성 및 유전독성을 이유로 우선 대상물질로 선정하여 관리하고 있다.
이와 같이 최근 다환 방향족탄화수소를 효율적으로 분석 및 검출할 수 있는 방법의 개발에 많은 관심이 기울어지고 있다.
종래에는 다환 방향족탄화수소를 기체크로마토그래피-전자충돌/질량분석기(Gas chromatography-electron impact/mass spectrometry, GC-MS)를 이용하여 분석하고 있었다.
그러나 상기 GC-MS는 다환 방향족탄화수소를 검출하는 과정에서 알켄(Alkane)류와 같은 보통의 탄화수소(Normal hydrocarbon)에 의한 간섭이 심하기 때문에 감도와 선택성이 낮다는 한계가 있었다.
이에 Guang-Wen Lien et al, Rapid communications in Mass Spectrometry, Vol 21, no. 22, (2007) 3694-3700, Lilla Molnarene et al, Journal of Mass Spectrometry, Vol 50, no. 3, (2015) 549-557과 같이 액체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 다환 방향족탄화수소를 검출하고자 하는 시도가 있어왔다.
그러나 액체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 검출 방법은 다환 방향족탄화수소를 이온화하기 매우 어렵다는 문제점이 있었다. 또한 이온화를 하여도 전자이동 반응(Electron transfer reaction)에 의해 양성화된 이온([M+H]+)뿐만 아니라 라디칼 이온(M+)도 함께 생성되기 때문에 이온화 효율이 낮았다.
따라서 여전히 다환 방향족탄화수소를 효율적으로 이온화할 수 있으면서 선택성 및 감도가 우수한 분석/검출 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
(종래기술1) Guang-Wen Lien et al, Rapid communications in Mass Spectrometry, Vol 21, no. 22, (2007) 3694-3700 (종래기술2) Lilla Molnarene et al, Journal of Mass Spectrometry, Vol 50, no. 3, (2015) 549-557
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 다음과 같은 목적이 있다.
본 발명은 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 다환 방향족탄화수소를 효율적으로 이온화할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 이온화한 다환 방향족탄화수소에 대한 선택성 및 감도가 우수하고, 여러 가지 다환 방향족탄화수소를 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 아래와 같은 구성을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 (a) 기체크로마토그래피, 질량분석기 및 전기분무이온화원을 포함하는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 준비하는 단계, (b) 분석시료를 상기 기체크로마토그래피에 주입하여 상기 분석시료로부터 다환 방향족탄화수소를 분리하는 단계, (c) 분리된 다환 방향족탄화수소가 상기 질량분석기로 유입될 때, 상기 다환 방향족탄화수소에 전기분무이온화원으로 양성자 또는 음성자를 분무하여 상기 다환 방향족탄화수소를 이온화하는 단계 및 (d) 이온화된 다환 방향족탄화수소를 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 상기 (b) 단계에서 상기 분석시료를 아세토나이트릴(Acetonitrile), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메테인(Dichloromethane)에 녹이고, 건조시킨 뒤 유기용매에 녹여 기체크로마토그래피에 주입하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계의 기체크로마토그래피는 0.8 ~ 2.0 ㎖/min의 운반기체 유속, 80 ℃에서 320 ℃까지 5 ~ 30 ℃/min으로 승온되는 오븐 온도의 조건으로 분석시료에서 다환 방향족탄화수소를 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 상기 (c) 단계에서 상기 전기분무이온화원에서 사용되는 분무 용매는 메틸알코올(Methyl alcohol), 50% 메틸알코올(Methyl alcohol), 아세토나이트릴(Acetonitrile), 증류수 및 아이소프로필알코올(Isopropylalcohol) 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 분무 용매는 0.1% 포름산(Formic acid) 및 0.1% 아세트산(Acetic acid) 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 산 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 분무 용매의 공급 유량은 0.1 ~ 1 ㎕/min으로 유지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 전기분무이온화원의 조건은 ⅰ) 양이온 모드에서 이온스프레이 전압(Spray voltage) 4.0 ~ 4.5 kV, ⅱ) 모세관 온도 300 ~ 350 ℃, ⅲ) 시쓰 가스(Sheath gas) 3 ~ 5 abr(arbitraty units)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서 상기 (c) 단계에서 다환 방향족탄화수소는 단일 형태의 양성화된 이온 형태로 이온화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서 상기 (d) 단계에서 상기 질량분석기는 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry) 또는 고분해능 질량분석기(High resolution mass spectrometry)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 상기 (d) 단계에서 상기 다환 방향족탄화수소를 상기 질량분석기의 다중반응탐색법(Selective Reaction Monitoring, SRM)으로 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 아세나프텐(acenaphthene), 아세나프틸렌(acenaphthylene), 안트라센(anthracene), 벤조(a)안트라센(benzo(a)anthracene), 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene), 벤조(b)플로란센 (benzo(b)fluoranthene), 벤조(e)피렌(benzo(e)pyrene), 벤조(g,h.i)퍼릴렌(benzo(g,h.i)perylene), 벤조(j)플로란센 (benzo(j)fluoranthene), 벤조(k)플로란센 (benzo(k)fluoranthene), 크리센(chrysene), 코로넨(coronene), 다이벤조(a,h)안트라센(dibenzo(a,h)anthracene), 플로란센(fluoranthene), 플루오렌(fluorene), 인데노(1,2,3-cd)피렌(indeno(1,2,3-cd)pyrene), 페난트렌(phenanthrene), 피렌(pyrene)을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 상기 구성을 포함하여 다음과 같은 효과가 있다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 다른 유기화합물에 의한 간섭을 최소화할 수 있어 효율적으로 상기 다환 방향족탄화수소를 이온화할 수 있다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 다환 방향족탄화수소에 대한 선택성 및 감도가 우수하고, 다수의 다환 방향족탄화수소를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 이온화의 어려움, 낮은 이온화 효율 및 선택성이라는 종래의 분석법의 한계를 극복하여 다환 방향족탄화수소의 분석/검출에 대한 정확성, 신뢰성을 부여한 것으로써 이에 따라 환경, 식품 등의 다양한 분야까지 응용범위를 확장하여 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 간략히 도시한 것이다.
도 2는 상기 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기에서 전기분무이온화원의 설치 위치를 설명하기 위한 것이다.
도 3은 실시예의 (b) 단계에서 수행된 분석시료에 대한 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예의 (d) 단계에서 수행된 선구이온에 대한 풀 스캔 스펙트라 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예의 (d) 단계에서 수행된 생성이온에 대한 스펙트라 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 (a) 기체크로마토그래피, 질량분석기 및 전기분무이온화원을 포함하는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 준비하는 단계, (b) 분석시료를 상기 기체크로마토그래피에 주입하여 상기 분석시료로부터 다환 방향족탄화수소를 분리하는 단계, (c) 분리된 다환 방향족탄화수소가 상기 질량분석기로 유입될 때, 상기 다환 방향족탄화수소에 전기분무이온화원으로 양성자 또는 음성자를 분무하여 상기 다환 방향족탄화수소를 이온화하는 단계 및 (d) 이온화된 다환 방향족탄화수소를 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로 유기화합물은 분리를 목적으로 하는 크로마토그래피와 구조의 규명을 목적으로 하는 질량분석기가 연계된 방법으로 분석 및 검출할 수 있다.
대표적인 기기 분석법으로는 기체크로마토그래피-질량분석기 (Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)와 액체크로마토그래피-질량분석기 (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)가 있다.
크로마토그래피는 다양한 매질 중에서 분석대상을 분리하고, 질량분석기는 이온화된 상기 분석대상을 질량 대 전하비(mass/charge ratio, m/z)에 따라 검출한다.
크로마토그래피와 질량분석기가 연계된 결합 기기에서 가장 중요한 연구 과제는 분석대상의 이온화 효율을 높이는데 있다. 이온화 효율은 다른 물질에 의한 간섭현상을 제거하거나, 라디칼 이온과 같은 부반응물을 제거하여 높일 수 있다.
기체크로마토그래피-질량분석기의 경우 이온화 방법으로 전자충격이온화법(Electron impact ionization, EI)과 화학이온화법(Chemical ionization, CI)을 주로 사용한다.
반면에 액체크로마토그래피-질량분석기의 경우 이온화 방법으로 전기분무이온화법(Electrospray ionization, ESI)과 대기압화학이온화법(Atmospheric pressure chemical ionization, APCI)을 주로 사용한다.
그러나 최근에는 상기와 같은 조합에 얽매이지 않고 이를 다양한 방법으로 조합하여 각각의 장점만을 취하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
본 발명은 기체크로마토그래피-질량분석기와 전기분무이온화원을 결합한 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 다환 방향족탄화수소를 이온화하고 검출하고자 한 것이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 상기 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기는 기체크로마토그래피(100), 질량분석기(200), 이들 사이에 위치하는 인터페이스(300) 및 상기 인터페이스(300)와 질량분석기(200) 사이에 위치하는 전기분무이온화원(500)을 포함할 수 있다.
상기 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기는 기체크로마토그래피(100)와 질량분석기(200) 사이에 인터페이스(300)을 설치한 결합구조로 구성할 수 있다. 구체적으로는 상기 인터페이스(300)의 일측은 기체크로마토그래피(100)과 연결되고, 타측은 질량분석기(200)와 일정 간격을 두고 위치할 수 있다. 또한 상기 전기분무이온화원(500)이 상기 간격에 전하를 띤 양성자 또는 음성자를 분무할 수 있는 소정의 특정한 위치에 올 수 있다.
상기 인터페이스(300)는 상기 기체크로마토그래피(100)를 통과한 다환 방향족탄화수소가 통과하는 모세관 컬럼(10), 상기 모세관 컬럼(10)을 감싸는 금속관(20), 상기 금속관의 외주면의 히팅코드(30) 및 상기 히팅코드(30)에 열을 공급 또는 차단하는 온도조절수단(40)을 포함할 수 있다. 상기 인터페이스(300)는 일정한 형상을 가질 수 있으나 바람직하게는 관 형태의 유로처럼 형성될 수 있다.
상기 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기는 고분리능의 기체크로마토그래피 모세관 컬럼(10)을 사용하므로 액체크로마토그래피-질량분석기를 사용하였을 때보다 다환 방향족탄화수소의 분리능이 높다.
기체상태의 다환 방향족탄화수소의 원활한 전기분무 이온화를 위해서는 상기 다환 방향족탄화수소를 고온으로 유지할 필요가 있다. 따라서 상기 인터페이스(300)는 상기 다환 방향족탄화수소가 상기 모세관 컬럼(10)을 통과할 때 온도를 일정하게 유지한다. 상기 온도조절수단(40)이 상기 히팅코드(30)에 열을 가하거나 차단하고, 상기 열은 히팅코드(30)와 금속관(20)을 차례로 거쳐 상기 모세관 컬럼(10)에 이르게 된다.
도 2를 참조하면, 상기 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기는 인터페이스(300)의 일측이 기체크로마토그래피(100)와 직접 연결되어 있고, 타측이 질량분석기(200)가 간격을 두고 인접하여 설치되어 있다. 상기 질량분석기(200)와 인터페이스(300)의 사이에는 전기분무이온화원(500)이 설치된다.
상기 전기분무이온화원(500)은 질량분석기(200)와 인터페이스(300) 사이에서 양성자 또는 음성자의 분무에 적합하도록 소정의 각도로 위치할 수 있다. 분무를 위한 각도는 50 ~ 80°, 바람직하게는 60 ~ 70°로 유지할 수 있다.
상기 전기분무이온화원(500)과 질량분석기(200)는 수평거리가 수십 ~ 수백 mm까지 조절될 수 있으나 1 ~ 15 mm를 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 거리가 너무 가까우면 분무 용매를 양성자 또는 음성자를 띤 작은 크기의 이온방울로 형성하기 어렵고, 너무 멀면 상기 이온방울의 손실이 너무 크기 때문에 이온화 효율이 감소할 수 있다.
또한 상기 전기분무이온화원(500)과 인터페이스(300)는 수평거리가 수십 ~ 수백 mm까지 조절될 수 있으나 0 ~ 5 mm를 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 수평거리를 유지해야 인터페이스를 통과한 다환 방향족탄화수소가 양성자 또는 음성자와 유효하게 반응하여 이온화될 수 있다.
본 발명에 따른 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법은 (a) 전술한 바와 같은 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 준비하는 것으로부터 시작한다.
상기 (b) 단계는 분석시료를 상기 기체크로마토그래피에 주입하여 상기 분석시료로부터 다환 방향족탄화수소를 분리하는 단계이다.
상기 분석시료를 아세토나이트릴(Acetonitrile), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메테인(Dichloromethane)에 녹이고, 건조시킨 뒤 유기용매에 녹임으로써 상기 분석시료를 기체크로마토그래피에 주입하기 적합한 상태로 제조할 수 있다.
상기 유기용매는 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 또는 헥세인(Haxane)을 사용할 수 있다.
상기 기체크로마토그래피에서 사용하는 운반기체의 유속은 0.8 ~ 2.0 ㎖/min일 수 있다. 유속이 0.8 ㎖/min 보다 낮으면 크로마토그램의 피크 띠가 넓어지고 낮은 이론단수를 갖는 등의 문제가 있고, 2.0 ㎖/min 보다 높으면 빠른 유속에 의해 이동상과 고정상 사이에 완전한 평형이 이루어지지 않으므로 분리능의 감소 및 효율 저하의 문제가 발생할 수 있기 때문이다.
상기 분석시료에서 상기 다환 방향족탄화수소를 기체상태로 분리하기 위해서는 상기 기체크로마토그래피의 온도를 높여줄 필요가 있다. 상기 기체크로마토그래피의 오븐 온도는 다환 방향족탄화수소의 끓는점을 고려하여 80 ~ 320 ℃가 바람직할 수 있다.
또한 짧은 분석시간 내 다환 방향족탄화수소를 분석하기 위해 오븐 온도는 5 ~ 30 ℃/min의 속도로 높이는 것이 바람직할 수 있다.
상기 분석시료는 비분할 주입 또는 분할 주입으로 상기 기체크로마토그래피에 주입될 수 있다.
상기 (c) 단계는 분리된 다환 방향족탄화수소가 상기 질량분석기로 유입될 때, 상기 다환 방향족탄화수소에 전기분무이온화원으로 양성자 또는 음성자를 분무하여 상기 다환 방향족탄화수소를 이온화하는 단계이다.
상기 전기분무이온화원은 분무 용매에 고전압을 인가하여 하전한 뒤 전하를 띤 이온방울 형태로 분사한다. 이 때 하전된 미세한 이온방울은 분무 용매가 증발함으로써 점차 크기가 줄어든다. 이에 따라 전하 밀도가 높아져 양성자 및 음성자가 생성되고 이들이 다환 방향족탄화수소를 이온화한다.
액체크로마토그래피에서 사용하는 전기분무이온화는 대상물질과 분무용액을 혼합한 액체를 분사하여 이온화를 진행한다. 따라서 양성화된 이온([M+H]+)뿐만 아니라 라디칼 이온(M+) 등의 부반응물이 생성된다.
본 발명과 같이 기체크로마토그래피를 이용하면 상이 다른 분무 용매와 다환 방향족탄화수소를 각각 분사하여 이온화할 수 있으므로 단일형태의 양성화된 이온을 얻을 수 있어 이온화 효율이 높아진다.
또한 액체크로마토그래피와 달리 다환 방향족탄화수소의 이온화 효율을 높이기 위해 은(silver), 트로필리움(tropylium), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 2,3-다이클로로-5,6-다이시아노-1,4-벤조퀴논(2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone, DDQ) 등을 첨가할 필요가 없다.
상기 분무 용매는 메틸알코올(Methyl alcohol), 50% 메틸알코올(Methyl alcohol), 아세토나이트릴(Acetonitrile), 증류수 및 아이소프로필알코올(Isopropylalcohol) 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.
또한 상기 분무 용매는 0.1% 포름산(Formic acid), 0.1% 아세트산(Acetic acid) 또는 이들의 혼합인 산 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 전기분무이온화원은 양이온 모드에서 이온스프레이 전압(Spray voltage)이 4.0 ~ 4.5 kV, 모세관 온도가 300 ~ 350 ℃, 시쓰 가스(Sheath gas) 3 ~ 5 abr(arbitraty units)의 조건으로 작동하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 분무 용매의 공급 유량은 0.1 ~ 1 ㎕/min으로 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 유량의 범위를 만족해야 분무 용매를 양성자 또는 음성자를 띤 작은 크기의 이온방울로 형성하는데 적합할 뿐만 아니라 향상된 이온화 효율을 제공할 수 있기 때문이다.
상기 (d) 단계는 이온화된 다환 방향족탄화수소를 질량분석기를 이용하여 검출하는 단계이다.
상기 질량분석기는 고분해능 질량분석기(High resolution mass spectrometry)를 사용할 수 있으나, 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 사중극자텐덤질량분석기는 상기 (c) 단계에서 이온화된 다환 방향족탄화수소의 양성화된 이온([M+H]+)을 선구이온(Precursor ion)으로 하여, 충돌유도해리(Collision-induced dissociation, CID)를 통해 최적의 충돌 에너지에서 생성이온(Product ion)을 생성하기 때문에 방해물질 등으로부터의 간섭을 최소화할 수 있다.
상기 사중극자텐덤질량분석기를 이용한 검출 방법의 구체적인 설명은 동일 발명자의 선출원인 국내등록특허 10-1195049호에 개시되어 있다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예를 제시한다. 다만 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것이며, 이로써 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
(a) 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기의 준비단계
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 준비하였다. 이 때 상기 전기분무이온화원의 분무 각도는 60 ~ 70°였고, 인터페이스와 전기분무이온화원의 수평거리는 4 mm, 인터페이스와 전기분무이온화원의 수직거리는 1 mm 였다.
(b) 분리단계
본 발명에 따른 방법으로 다양한 다환 방향족탄화수소를 이온화 및 검출할 수 있는지 확인하기 위해 분석시료로 다환 방향족탄화수소 표준품들을 사용하였다.
상기 표준품들을 아세토나이트릴, 클로로포름, 디클로로메테인에 녹이고, 증발건조기를 이용해 건조시킨 뒤, 헥세인에 녹여 기체크로마토그래피에 주입하였다.
기체크로마토그래피는 Agilent사의 GC(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA/모델명 6890N)를 사용하였다. 분리를 위해 DB-EUPAH 모세관 컬럼(20 m × 0.180 mm × 0.14 mm; J&W Scientific, Agilent Technologie)을 연결하였다.
기체크로마토그래피의 운반기체는 초고순도 헬륨을 사용하였으며, 유속은 1.8 mL/min의 속도로 흘려주었다. 오븐 온도 조건은 80℃ 에서 320℃ 까지 30℃/min으로 승온시켰으며, 2 μL의 시료를 비분할모드로 주입하였다.
상기 분석시료에 대한 크로마토그램은 도 3과 같다.
(c) 이온화단계
상기 (b) 단계를 통해 분리된 기체상태의 다환 방향족탄화수소가 상기 인터페이스를 통과하여 질량분석기로 유입될 때 상기 전기분무이온화원으로 양성자를 분무하여 상기 다환 방향족탄화수소를 이온화하였다.
상기 전기분무이온화원에 있어서, 이온스프레이 전압(spray voltage)은 양(positive) 이온 모드에서 4.2 kV, 모세관 온도(capillary temperature)는 320℃, 시쓰 가스(sheath gas)는 5 abr(arbitraty units)이었다.
분무 용매는 0.1% 포름산을 포함하는 메틸알코올을 사용하였으며, 유속은 0.1~1 μL/min를 사용하였다. 상기 분무 용매는 실린지 펌프를 통해 주입하였다.
(d) 검출단계
상기 (c) 단계에서 양성화된 이온([M+H]+) 형태로 이온화된 다환 방향족탄화수소를 Thermo Finnigan사의 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole tandem mass spectrometry)인 TSQ discovery(Thermo Finnigan, San jose, USA)를 사용하여 검출하였다. 데이터 수집 및 처리를 위해 Xcalibur software version 2.0를 사용하였다.
양성화된 이온([M+H]+) 형태로 이온화된 다환 방향족탄화수소를 질량분석기의 다중반응탐색법(Selective Reaction Monitoring, SRM)으로 정성 분석하였다. 상기 정성 분석을 통해 얻은 상기 다환 방향족탄화수소의 선구이온 및 생성이온 값과 최적 충돌에너지를 하기 표 1에 나타냈다.
상기 선구이온에 대한 풀 스캔 스펙트라와 생성이온에 대한 스펙트라는 각각 도 4 및 도 5와 같다.
다환 방향족
탄화수소*		 축약어 실제 분자량 SRM Transitions
(Q1/Q3)		 충돌에너지
(V)
아세나프텐 Ace 154.21 155/154
155/153		 25
25
아세나프틸렌 Acy 152.19 153/152
153/151		 30
45
안트라센 Ant 178.23 179/178
179/152		 30
45
벤조(a)안트라센 B(a)A 228.29 229/228
229/201		 30
55
벤조(a)피렌 B(a)P 252.31 253/252
253/250		 35
55
벤조(b)플로란센 B(b)F 252.31 253/253
253/252		 15
40
벤조(e)피렌 B(e)P 252.31 253/252
253/250		 35
55
벤조(g,h.i)퍼릴렌 B(g,h,i)P 276.33 277/276
277/275		 25
55
벤조(j)플로란센 B(j)F 252.31 253/252
253/250		 30
45
벤조(k)플로란센 B(k)F 252.3 253/253
253/252		 20
40
크리센 Chr 228.29 229/228
229/226		 30
55
코로넨 Cor 300.35 301/300
301/298		 40
50
다이벤조(a,h)안트라센 D(a,h)A 278.35 279/278
279/277		 35
30
플로란센 Fla 202.25 203/202
203/200		 35
50
플루오렌 Flu 166.22 167/165
167/152		 35
30
인데노(1,2,3-cd)피렌 IcP 276.33 277/276
277/274		 35
50
페난트렌 Phe 178.23 179/178
179/151		 25
50
피렌 Pyr 202.25 203/202
203/200		 35
55
*분석시료로 사용한 18종의 다환 방향족탄화수소 표준품이다.
상기 실시예에 따라 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 기체상태의 다환 방향족탄화수소들을 분석하는 경우 일반적인 조건에서도 이온화가 가능함을 확인하였다. 즉, 종래와 같이 이온화 효율을 강제적으로 높이기 위해 은(silver), 트로필리움(tropylium), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 2,3-다이클로로-5,6-다이시아노-1,4-벤조퀴논(2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone, DDQ) 등과 같은 시약을 첨가하지 않아도 다환 방향족탄화수소들을 이온화할 수 있었다.
또한 상기 실시예에 따라 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용하여 기체상태의 다환 방향족탄화수소들을 분석하는 경우 라디칼 이온(M+)의 영향 없이 단일 형태의 양성화된 이온([M+H]+)으로 효율적인 이온화가 가능함을 확인하였다. 즉, 종래와 같이 이온화 단계에서 양성화된 이온([M+H]+)뿐만 아니라 라디칼 이온(M+)도 함께 생성되어 이온화 효율이 떨어지거나, 두 개의 선구이온의 생성으로 인해 다환 방향족탄화수소의 검출이 어려워지는 등의 문제점을 해결한 것이다.
또한 표 1의 다중반응탐색법을 이용한 선구이온 및 생성이온 값을 참조하면, 분석시료에 포함되어 있던 아세나프텐(acenaphthene), 아세나프틸렌(acenaphthylene), 안트라센(anthracene), 벤조(a)안트라센(benzo(a)anthracene), 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene), 벤조(b)플로란센 (benzo(b)fluoranthene), 벤조(e)피렌(benzo(e)pyrene), 벤조(g,h.i)퍼릴렌(benzo(g,h.i)perylene), 벤조(j)플로란센 (benzo(j)fluoranthene), 벤조(k)플로란센 (benzo(k)fluoranthene), 크리센(chrysene), 코로넨(coronene), 다이벤조(a,h)안트라센(dibenzo(a,h)anthracene), 플로란센(fluoranthene), 플루오렌(fluorene), 인데노(1,2,3-cd)피렌(indeno(1,2,3-cd)pyrene), 페난트렌(phenanthrene), 피렌(pyrene)은 완벽하게 양성화되었고, 단일 선구이온 형태임을 확인할 수 있다. 따라서 다중반응탐색법을 위한 선택성 있는 선구이온과 생성이온을 선정할 수 있었고, 최적의 충돌유도해리 에너지를 갖는 조건들을 확립할 수 있었다.
또한 도 4 및 도 5의 분석시료에 대한 스텍트라 결과를 참조하면, 각 결과가 분석시료에 포함되어 있던 상기 18종의 다환 방향족탄화수소의 구조적 특징과 일치하게 나왔음을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 방법은 양성화된 이온([M+H]+) 형태의 단일 선구이온과 CID(collision-induced dissociation)로 생성된 생성이온들의 구조적 특징을 잘 대변할 수 있음을 의미한다.
따라서 본 발명은 다환 방향족탄화수소에 대한 선택성 및 감도가 우수하고, 다수의 다환 방향족탄화수소를 동시에 정확하게 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이에 따라 본 발명은 환경, 식품 등의 다양한 분야까지 응용범위를 확장하여 사용할 수 있을 것이라 기대할 수 있다.
이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.
100:기체크로마토그래피
200:질량분석기
300:인터페이스
500:전기분무이온화원
10:모세관 컬럼
20:금속관
30:히팅코드
40:온도조절수단

Claims (11)

  1. (a) 기체크로마토그래피, 질량분석기 및 전기분무이온화원을 포함하는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 준비하는 단계;
    (b) 하나 이상의 다환 방향족탄화수소를 포함하는 분석시료를 상기 기체크로마토그래피에 주입하여 상기 분석시료로부터 다환 방향족탄화수소를 분리하는 단계;
    (c) 분리된 다환 방향족탄화수소가 상기 기체크로마토그래피와 연결된 인터페이스를 통해 상기 질량분석기로 유입될 때, 상기 인터페이스와 일정 거리 이격되어 설치된 전기분무이온화원으로 상기 다환 방향족탄화수소에 양성자 또는 음성자를 분무하여 상기 다환 방향족탄화수소를 라디칼 이온의 방해 없이 단일 형태의 양성화된 이온([M+H]+) 형태로 이온화하는 단계; 및
    (d) 양성화된 다환 방향족탄화수소의 이온화 효율 및 감도의 향상을 위해 이온화된 다환 방향족탄화수소를 질량분석기의 다중반응탐색법(Selective Reaction Monitoring, SRM)으로 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 (b) 단계에서 상기 분석시료에 다환 방향족탄화수소의 이온화 효율을 높이기 위한 별도의 시약을 첨가하지 않으며,
    상기 (c) 단계에서 상기 전기분무이온화원의 조건을 ⅰ) 양이온 모드에서 이온스프레이 전압(Spray voltage) 4.0 ~ 4.5 kV, ⅱ) 모세관 온도 300 ~ 350 ℃, ⅲ) 시쓰 가스(Sheath gas) 3 ~ 5 abr(arbitraty units)로 하여,
    상기 분석시료에 포함된 하나 이상의 다환 방향족탄화수소를 분리 및 동시검출하는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 분석시료를 아세토나이트릴(Acetonitrile), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메테인(Dichloromethane)에 녹이고, 건조시킨 뒤 유기용매에 녹여 기체크로마토그래피에 주입하는 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 기체크로마토그래피는 0.8 ~ 2.0 ㎖/min의 운반기체 유속, 80 ℃에서 320 ℃까지 5 ~ 30 ℃/min으로 승온되는 오븐 온도의 조건으로 분석시료에서 다환 방향족탄화수소를 분리하는 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 전기분무이온화원에서 사용되는 분무 용매는 메틸알코올(Methyl alcohol), 50% 메틸알코올(Methyl alcohol), 아세토나이트릴(Acetonitrile), 증류수 및 아이소프로필알코올(Isopropylalcohol) 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 분무 용매는 0.1% 포름산(Formic acid) 및 0.1% 아세트산(Acetic acid) 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 산 첨가제를 더 포함하는 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 분무 용매의 공급 유량은 0.1 ~ 1 ㎕/min으로 유지하는 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 질량분석기는 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry) 또는 고분해능 질량분석기(High resolution mass spectrometry)인 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
  10. 삭제
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아세나프텐(acenaphthene), 아세나프틸렌(acenaphthylene), 안트라센(anthracene), 벤조(a)안트라센(benzo(a)anthracene), 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene), 벤조(b)플로란센 (benzo(b)fluoranthene), 벤조(e)피렌(benzo(e)pyrene), 벤조(g,h.i)퍼릴렌(benzo(g,h.i)perylene), 벤조(j)플로란센 (benzo(j)fluoranthene), 벤조(k)플로란센 (benzo(k)fluoranthene), 크리센(chrysene), 코로넨(coronene), 다이벤조(a,h)안트라센(dibenzo(a,h)anthracene), 플로란센(fluoranthene), 플루오렌(fluorene), 인데노(1,2,3-cd)피렌(indeno(1,2,3-cd)pyrene), 페난트렌(phenanthrene), 피렌(pyrene)을 동시에 검출할 수 있는 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법.
KR1020150104441A 2015-07-23 2015-07-23 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법 KR101743925B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150104441A KR101743925B1 (ko) 2015-07-23 2015-07-23 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150104441A KR101743925B1 (ko) 2015-07-23 2015-07-23 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170011591A KR20170011591A (ko) 2017-02-02
KR101743925B1 true KR101743925B1 (ko) 2017-06-08

Family

ID=58154252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150104441A KR101743925B1 (ko) 2015-07-23 2015-07-23 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101743925B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210050217A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 강원대학교산학협력단 가공육 내 다환방향족탄화수소류 동시분석방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220214283A1 (en) * 2019-04-24 2022-07-07 Shimadzu Corporation Method for identifying generation sources of fine particulates in atmosphere
KR102652654B1 (ko) * 2020-04-29 2024-04-01 한국기초과학지원연구원 지표수 내 유기물의 분석 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100613400B1 (ko) * 2004-11-10 2006-08-17 한국과학기술연구원 고체상 미량추출／기체 크로마토그래프／질량 분석기를이용한 시료 내 잔류 ＰＡＨｓ 및 ＰＣＢｓ의 동시 검출방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100613400B1 (ko) * 2004-11-10 2006-08-17 한국과학기술연구원 고체상 미량추출／기체 크로마토그래프／질량 분석기를이용한 시료 내 잔류 ＰＡＨｓ 및 ＰＣＢｓ의 동시 검출방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UFLC-MS/MS와 GC-ESI/HRMS를 이용한 221종 금지약물들의 다성분 동시분석방법, 충북대(2012.02)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210050217A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 강원대학교산학협력단 가공육 내 다환방향족탄화수소류 동시분석방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170011591A (ko) 2017-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10373814B2 (en) Soft ionization based on conditioned glow discharge for quantitative analysis
Shumate et al. Coronaspray nebulization and ionization of liquid samples for ion mobility spectrometry
Corr et al. Arsenic speciation by liquid chromatography coupled with ionspray tandem mass spectrometry
US7315020B2 (en) Ionization chamber for atmospheric pressure ionization mass spectrometry
US8604424B2 (en) Capillary separated vaporization chamber and nozzle device and method
US10312069B2 (en) Dual mode ionization device
Li et al. Supercritical fluid chromatography‐mass spectrometry for chemical analysis
US9305759B2 (en) Ionization at intermediate pressure for atmospheric pressure ionization mass spectrometers
Palma et al. Electron ionization in LC-MS: recent developments and applications of the direct-EI LC-MS interface
CN104008950B (zh) 离子产生装置以及离子产生方法
CA2603888A1 (en) Atmospheric pressure ion source for mass spectrometry
CN105470095A (zh) 一种热冲击气化电喷雾电离源及质谱分析系统
Bruins Liquid chromatography-mass spectrometry with ionspray and electrospray interfaces in pharmaceutical and biomedical research
KR101743925B1 (ko) 기체크로마토그래피-전기분무/질량분석기를 이용한 다환 방향족탄화수소의 이온화 및 검출 방법
CN105021718A (zh) 一种液相色谱与敞开式离子化质谱在线联用接口和检测方法
Chen et al. Monitoring of chemical transformations by mass spectrometry
KR101701998B1 (ko) 기체크로마토그래피-전기분무/고분해능 질량분석기와 이를 이용한 기체상태 유기화합물의 이온화 방법
US10217622B2 (en) Ambient ionisation with an impactor spray source
CN111448639A (zh) 离子源
Li et al. Recent advances in atmospheric ionization mass spectrometry: developments and applications
Naegele Making your LC method compatible with mass spectrometry
Mabrouki et al. Improving FAIMS sensitivity using a planar geometry with slit interfaces
CN102841127B (zh) 一种等压双电离源接口及液相色谱-质谱联用仪
US10141172B2 (en) Synchronised variation of source conditions of an atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometer coupled to a gas chromatograph to improve stability during analysis
Cramer et al. Applications of HPLC-MS techniques for the analysis of chemical contaminants and residues in food

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)