KR101736098B1

KR101736098B1 - 수용성 레스베라트롤 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101736098B1
Application number: KR1020150046236A
Authority: KR
Inventors: 조경현
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2017-05-17
Also published as: KR20160118443A

Abstract

본 발명은 인지질, 아포지단백질 변이체 V156K 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도 지단백질 및 레스베라트롤을 혼합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 레스베라트롤 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 수용성 레스베라트롤에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법에 따른 수용성 레스베라트롤은 기존의 레스베라트롤 보다 높은 용해도와 노화 및 동맥경화 억제에 효과를 나타내었으므로, 본 발명에 따른 수용성 레스베라트롤 및 이의 제조방법은 의학적 용도 및 화장품 제조에 사용될 수 있다.

Description

수용성 레스베라트롤 조성물 및 이의 제조방법{Composition for water-soluble resveratrol and method for preparing thereof}

본 발명은 수용성 레스베라트롤 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

화학식 C₁₄H₁₂O₃ 구조의 레스베라트롤은 스틸벤(stilbene)의 한 종류로서 식물에서 효소인 스틸벤 합성효소(stilbene synthase ; STS)에 의해 생성되며, 2개의 구조상 이성체로 존재하여 오디, 땅콩, 포도, 라스베리, 크렌베리 등의 베리류 등을 포함한 많은 식물에서 발견되고 있다. 레스베라트롤은 항암 및 강력한 항산화 작용을 하며, 혈청 콜레스테롤을 낮춰 주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 외에도 항바이러스(antiviral), 신경보호작용(neuroprotective), 항염증작용(anti-inflammatory), 항노화(anti-aging) 및 수명을 연장시키는 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 연구에 의하면 유방암, 전립선암, 대장암, 폐암 등을 포함한 많은 암세포에서 레스베라트롤은 세포 자살을 촉진하는 유전자들의 활성을 통하여 암세포의 증식을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 또한 레스베라트롤은 세포증식을 촉진하는 특정 유전자 신호전달계의 발현을 조절함으로써 손상을 입은 세포뿐만 아니라 빠르게 분열하는 각종 인체 암세포의 증식을 강력하게 차단할 수 있는 것으로 알려졌다. 또한, 레스베라트롤은 포유동물의 노화를 효과적으로 억제하는 것으로 보고되었는데, 2003년 영국의 과학전문지 <네이처>에 발표한 논문에 따르면 적포도주와 적포도 속의 레스베라트롤(resveratrol)이라는 세포 사멸을 억제하는 SIRT1 유전자를 활성화 하여 생명을 연장한다고 보고되어 졌다.

앞서 전술한 바와 같이 레스베라트롤의 우수한 항산화, 항염증 및 항노화 활성에도 불구하고 용해도가 낮고 생체 흡수도가 낮아 의약품, 화장품 등으로의 개발에 많은 문제가 따르고 있으며, 흡수율을 증가시키기 위해 레스베라트롤을 대량으로 장기 복용할 경우, ALT 및 AST의 간염증 수치가 복용 후 6주 만에 증가하는 (V.S.Chachary et al. Hepatol.12(2014) 2092-2103) 부작용이 발생할 수 있다.

한국공개특허 제10-2011-0118705호(2011.10.31)

본 발명은 레스베라트롤의 용해도 개선을 위하여, 아포지단백질 변이체 V156K를 포함한 재조합 고밀도지단백질을 이용하여 용해도가 개선된 레스베라트롤 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 인지질, 아포지단백질 변이체 V156K 및 콜레스테롤로 이루어진 재조합 고밀도 지단백질 100 중량부에 대하여, 레스베라트롤 0.1 내지 40 중량부를 포함하는 수용성 레스베라트롤 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 수용성 레스베라트롤 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 수용성 레스베라트롤 조성물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 수용성 레스베라트롤 조성물을 유효성분으로 함유하는 조직재생용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인지질, 아포지단백질 변이체 V156K 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도 지단백질 및 레스베라트롤을 혼합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 레스베라트롤 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 레스베라트롤과 인지질, 아포지단백질 변이체 V156K 및 콜레스테롤로 제조된 재조합 고밀도 지단백질이 혼합된 레스베라트롤 조성물은 낮은 레스베라트롤의 용해도를 개선시켰으며, 피부 노화 및 동맥경화 억제와 조직재생에 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 용해도가 개선된 레스베라트롤 조성물은 의학적 용도 및 화장품 제조에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤 및 기존의 레스베라트롤의 용해도를 확인한 결과이다.
도 2는 V156K-rHDL과 0, 0.1, 0.25 및 0.4 mg/mL 레스베라트롤로 제조된 수용성 레스베라트롤의 입자 크기를 확인한 전기영동 결과이다.
도 3은 V156K-rHDL과 0.1, 0.25 및 0.4 mg/mL 레스베라트롤로 제조된 수용성 레스베라트롤의 2차 구조를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤의 HDL₃ 항당화 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤의 HDL₃ 항당화 활성을 확인한 전기영동 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤의 HDL₂ 항당화 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤의 HDL₂ 항당화 활성을 확인한 전기영동 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤 및 기존의 레스베라트롤을 각각 피부섬유아세포에 처리하여 세포 증식 활성 및 세포 노화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤 및 기존의 레스베라트롤을 각각 꼬리가 절단된 제브라피쉬에 투입하여 꼬리 조직재생 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 구리 이온이 처리된 사람 LDL에 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤 10, 20, 40 및 80 μM을 처리하여 LDL 산화 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 V156K-rHDL-레스베라트롤의 철 이온 환원 능력을 확인한 결과이다.

이때, 레스베라트롤을 상기 함량범위를 벗어나 과량 함유하는 경우 용해도 부족 및 레스베라트롤 침전 문제가 야기될 수 있는 반면, 소량 함유하는 경우 레스베라트롤 함량 부족 및 효과 부족 등의 문제가 야기될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 재조합 고밀도 지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K 0.1 내지 10 : 인지질 90 내지 110 : 콜레스테롤 90 내지 100의 몰비로 포함될 수 있다.

상기 아포지단백질 변이체 V156K은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

상기 재조합 고밀도 지단백질에서 아포지단백질 변이체 V156K의 상기 함량범위를 벗어나 함유하게 되면 단백질 침전 문제가 야기될 수 있으며, 인지질과 콜레스테롤을 상기 함량범위를 벗어나 함유하게 되면 고밀도 지단백질의 형성 장애 문제가 야기될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1B와 같이 기존의 레스베라트롤을 등장액에 용해시킨 경우, 용해되지 않고 가라앉는 것이 확인된 반면, 본 발명에 따라 합성된 수용성 레스베라트롤은 도 1A과 같이 완전히 용해된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 수용성 레스베라트롤은 용해성이 개선된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 도 8과 같이 본 발명에 따라 제조된 레스베라트롤을 50 및 80 μM로 사람 피부섬유아세포에 처리한 경우, 기존 레스베라트롤을 처리한 세포군보다 세포독성이 감소하였으며 각각 25 및 37%의 세포증식 효과가 확인되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 수용성 레스베라트롤 조성물은 세포 노화를 예방하거나 개선하는데 효과적인 것을 확인하였다.

상기 화장료조성물은 유효성분인 수용성 레스베라트롤 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 수용성 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 도 4 내지 도 7과 같이 당화가 유도된 HDL 및 HDL 에 본 발명의 재조합 고밀도 지단백질과 혼합된 레스베라트롤을 처리한 경우, 농도의존적으로 당화산물이 억제되는 것이 확인되었다.

또한, 본 발명은 수용성 레스베라트롤 조성물을 유효성분으로 함유하는 조직재생용 약학조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 도 9와 같이 꼬리지느러미가 절단된 제브라피쉬에서 기존의 레스베라트롤을 주입한 대조군에서는 꼬리지느러미 재생율이 13%였으나, 본 발명의 수용성 레스베라트롤을 주입한 실험군의 경우, 꼬리지느러미 재생율이 81 내지 95%로 확인되었다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 수용성 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 수용성 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 수용성 레스베라트롤의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> V156K - rHDL 을 이용한 레스베라트롤 수용액 제조 방법

1. Wild apoA -Ⅰ 및 V156K - apoA -Ⅰ준비

pET30a(+) 발현벡터와 BL21(DE3) 숙주를 이용하여 대장균 발현시스템에서 Wild apoA-Ⅰ(서열번호 1) 및 V156K-apoA-Ⅰ(서열번호 2)을 발현시켰다.

그 후, 종래 알려진 방법(European Journal of Clinical Investigation, 36: 875-882, 2006)에 따라 순도가 95% 이상이 되도록 Ni-컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

2. 레스베라트롤 수용액 제조

V156K-apoA-Ⅰ, 인지질 및 콜레스테롤을 1:100:95 몰비로 혼합하여 합성한 V156K-rHDL 1 mg에 0.1, 0.25 및 0.4mg의 레스베라트롤을 각각 혼합하였다.

상기 합성된 각 레스베라트롤-V156K-rHDL을 등장액에 투석하여 용해 정도를 확인하였다.

그 결과, 레스베라트롤만을 등장액에 녹일 경우, 도 1B와 같이 레스베라트롤이 용해되지 않고 가라앉은 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 1A와 같이 V156K-rHDL과 혼합된 0.4 mg 레스베라트롤까지 완전히 용해되는 것을 확인할 수 있었으며, 레스베라트롤 0.4 mg에서 최적의 조성비를 나타내었다.

< 실시예 2> 레스베라트롤 - V156K - rHDL 특성 확인

1.전기영동 확인

상기 합성된 레스베라트롤-V156K-rHDL(RSV-HDL)을 본 발명자의 선행논문(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)에 따라 8-25 % 폴리아크릴아마이드 구배 겔 전기영동(PAGGE, Pharmacia Phast system)을 이용하여 입자 분포를 검토하였고, 이때 표준 구형 단백질과 비교하였다.

그 결과, 도 2와 같이 레스베라트롤-V156K-rHDL가 98 Å 및 115 Å의 입자크기를 나타내었으며, 레스베라트롤의 농도가 증가할수록 115 Å의 입자크기가 증가하는 것을 확인하였다.

2. 레스베라트롤 - V156K - rHDL 의 2차 구조 확인

상기 합성된 레스베라트롤-V156K-rHDL(RSV-HDL)를 선행논문(Cho KH. Synthesis of reconstituted high-density lipoprotein (rHDL) containing apoA-I and apoC-III: the functional role of apoC-III in rHDL. Mol. Cells. 2009; 27:291-297.)에 따라 2차 구조를 확인하였다.

그 결과, 도 3 및 표 1과 같이 대조군 rHDL은 71 %의 2차 구조 알파헬릭스를 나타낸 반면, 레스베라트롤 함량이 높아질수록 2차 구조에서 알파 헬릭스의 함량이 감소하였다. 또한, 0.1 mg/ml의 레스베라트롤이 함유된 rHDL의 2차 구조는 대조군과 큰 차이를 보이지 않았으나, 특히 0.4 mg/ml의 레스베라트롤이 함유된 rHDL은 46 %의 알파헬릭스로 대조군과 비교하여 25% 감소하였다.

lipid - free	lipid - bound
lipid - free	RSV - rHDL Conc .( 레스베라트롤 mg / mL )
V156K-apoA-Ι	0	0.1	0.25	0.4
35	71	72	70	46

< 실시예 3> 레스베라트롤 - V156K - rHDL 의 항당화 활성 확인

1. HDL ₃ 에 대한 항당화 활성 확인

레스베라트롤-V156K-rHDL의 항당화 활성을 확인하기 위해, 당화를 가장 잘 일으키는 과당(fructose)을 최종 100 mM으로 HDL₃에 처리한 후, 레스베라트롤-V156K-rHDL 1.8 및 3.6 μM과 레스베라트롤-Wild-rHDL 60 및 120 μM을 각각 처리하였다.

그 결과, 도 4와 같이 HDL₃에 과당을 처리하였을 때, 96시간 후 7배 이상의 당화 산물이 형성되었으나, 레스베라트롤이 포함된 rHDL을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 당화산물의 형성이 억제되었으며, wild-rHDL보다 V156K-rHDL이 더욱 우수한 항당화 활성을 보여 주었다.

또한, 당화산물억제효과를 단백질 수준에서 관찰하기 위해, 72시간 반응이 끝난 후 선행논문(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)에 따라 8-25% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 전기영동(PAGGE, Pharmacia Phast system)을 수행하였다.

그 결과, 도 5와 같이 당화되지 않은 단백질은 단일 밴드로 나타났으나, 당화가 일어난 단백질은 멀티머(multimer) 형성이 뚜렷하게 확인되었다. 반면, 레스베라트롤을 첨가한 경우, 멀티머 형성이 현저히 감소하였으며 특히, 레스베라트롤이 V156K-rHDL에 포집되어 있을 때, 당화가 현저히 감소하였다.

2. HDL ₂ 에 대한 항당화 활성 확인

앞선 실험과 동일한 방법으로 레스베라트롤-V156K-rHDL의 항당화 활성을 확인하였다. 먼저, 당화를 가장 잘 일으키는 과당(fructose)을 최종 100 mM으로 HDL₂에 처리한 후, 레스베라트롤-V156K-rHDL 1.8 및 3.6 μM과 레스베라트롤-Wild-rHDL 60 및 120 μM을 각각 처리하였다.

그 결과, 도 6과 같이 레스베라트롤이 포함된 rHDL을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 당화산물의 형성이 억제되었으며, 레스베라트롤-V156K-rHDL이 더욱 우수한 항당화 활성을 보여 주었다.

또한, 72시간 반응이 끝난 후 선행논문(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)에 따라 8-25% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 전기영동(PAGGE, Pharmacia Phast system)을 수행하였다.

그 결과, 도 7과 같이 당화가 일어날 경우, 다량체 밴드가 형성되고 apo A-Ι 밴드가 흐려지고 shift up 되는 현상이 확인되었으나, 레스베라트롤을 처리한 단백질에서는 apo A-I 밴드가 선명하게 나타났으며, 멀티머의 형성이 억제되었다.

< 실시예 4> 레스베라트롤 - V156K - rHDL 의 세포활성 및 세포노화 억제효과 확인

레스베라트롤-V156K-rHDL의 세포활성 및 세포노화 억제효과를 확인하기 위해서, 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 레스베라트롤-V156K-rHDL 20, 50 및 80 μM와 에탄올에 용해시킨 레스베라트롤 20, 50 및 80 μM을 각각 (2×10⁶ )사람피부섬유세포에 투여하여 24 내지 72시간 동안 배양하고 SA-β-gal 염색을 수행하여 세포노화 및 독성을 확인하였다.

그 결과, 도 8과 같이 사람피부섬유세포에 50 및 80 μM 레스베라트롤을 단독처리한 경우, 세포독성이 심하여 50% 이상의 세포가 사멸하였다. 반면, 50 및 80 μM 레스베라트롤-V156K-rHDL을 처리한 경우, 세포독성이 발견되지 않았으며, 오히려 25%와 37% 빠른 세포 증식효과를 나타내었다.

상기 결과로부터, 에탄올에 용해된 레스베라트롤을 처리했을 경우 심각한 세포독성이 유도되는 반면, 같은 농도의 레스베라트롤을 V156K-rHDL에 포집하여 처리하면 세포독성이 억제되고 피부세포의 증식이 활발해지는 것을 확인되었다.

< 실시예 5> 레스베라트롤 - V156K - rHDL 의 조직재생 효과 확인

레스베라트롤의 조직재생 효과를 확인하기 위하여, 제브라피쉬의 꼬리지느러미를 절단하고 꼬리 근육에 에탄올에 용해시킨 레스베라트롤과 실시예 1의 레스베라트롤-V156K-rHDL(RSV-V156K)을 각각 40 및 80 μM씩 이틀 간격으로 3회 주사하여 6일(144시간)까지 미세 주입한 후, 조직재생 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 9와 같이 레스베라트롤 단독 주입한 경우, 대조군보다 13% (RSV 최종농도 40 μM) 및 54% (RSV 최종농도 80 μM) 재생율을 나타내었다. 반면, RSV-V156K의 경우 81% (RSV 최종농도 40 μM) 및 95% (RSV 최종농도 80 μM)의 재생율을 나타내었다.

상기 결과로부터, 에탄올에 용해된 레스베라트롤보다 V156K-rHDL의 녹아 있는 레스베라트롤의 조직 재생 효과가 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 항산화 활성 확인

1. LDL 산화 억제 활성 확인

구리-매개 LDL 산화에 대하여 레스베라트롤을 함유한 아포지단백-리포솜의 항산화활성을 확인하기 위해, 레스베라트롤-V156K-rHDL(RSV-rHDL) 10, 20, 40 및 80μM을 CuSO₄ 존재하에 300㎍ 사람 LDL에 각각 처리하고 4 내지 16 시간 동안 반응시킨 후 LDL 산화 정도를 확인하기 위해, 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 10과 같이 사람 LDL에 구리 이온을 처리할 경우, 산화가 일어나 아가로스 겔 상에서 대조군에 비하여 이동성이 빨라지는 것이 확인된 반면, RSV-rHDL을 처리한 경우, 레스베라트롤의 농도 함량에 의존적으로 LDL의 이동성이 느려지는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 레스베라트롤의 농도가 증가할수록 RSV-rHDL의 항산화 활성이 증가함에 따라 항산화 활성이 우수한 RSV-rHDL을 주름 억제, 피부 기능 개선용 화장료조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

2. 철이온 환원 효과 확인

혈장(HDL₃)의 철 이온 환원 능력(FRAP)은 Benzie 및 Strain(Anal Biochem, 239: 70-6, 1996)에 의해 제안된 방법으로 결정되었다. 먼저, FRAP 시약을 0.2M 아세테이트 완충액(pH 3.6) 25mL, 10mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ) 2.5mL 및 20mM FeCl₃6H₂O 2.5mL를 혼합하여 준비하였다. RSV-rHDL의 항산화 활성은 생성되는 2가 철 이온에 의해 유도되는 흡광도의 증가를 측정함으로써 결정하였다. 준비된 FRAP 시약(300㎕)을 동량 희석된 RSV-rHDL(2mg/ml, 10㎕)과 혼합한 후, DU800 분광분석기(Beckman Coulter)를 이용하여 25℃에서 10분 간격으로 매 20초마다 593nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 이때, DU800 분광분석기는 MultiTemp III thermocirculator를 구비한 것을 사용하였다.

그 결과, 도 11과 같이 HDL₃ 내에 레스베라트롤의 농도가 증가할수록 3가 철 이온의 환원을 촉진하는 항산화 활성도가 비례하여 증가하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Composition for water-soluble resveratrol and method for preparing thereof <130> APD-2015-0050 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 2 <211> 243 <212> PRT <213> V156K-apoA-1 <400> 2 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Lys Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln

Claims

아포지단백질 변이체 V156K, 인지질 및 콜레스테롤이 1: 100 : 95 몰비로 이루어진 재조합 고밀도 지단백질 100 중량부에 대하여, 레스베라트롤 0.1 내지 40 중량부를 포함하는 수용성 레스베라트롤 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 아포지단백질 변이체 V156K은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 수용성 레스베라트롤 조성물.
삭제
청구항 1항에 있어서, 상기 수용성 레스베라트롤 조성물은 항당화 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 수용성 레스베라트롤 조성물.
청구항 1항의 수용성 레스베라트롤 조성물을 유효성분으로 함유하는 손상된 조직재생용 약학조성물.
아포지단백질 변이체 V156K, 인지질 및 콜레스테롤이 1: 100 : 95 몰비로 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및
상기 재조합 고밀도 지단백질 100 중량부에 대하여, 레스베라트롤 0.1 내지40 중량부를 혼합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 레스베라트롤 제조방법.