KR101723267B1 - Ｃｃｌ２ 또는 ｃｃｌ２ 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물 - Google Patents

Ｃｃｌ２ 또는 ｃｃｌ２ 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 CCL2는 뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하여 컨디셔닝 손상(CI)으로 인한 축삭 재생을 촉진하는 효과를 나타내므로, 뇌졸중이나 척수손상과 같은 중추신경계 손상 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며, CCL2 발현 또는 활성을 촉진시키는 후보약물을 선별하여 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약제를 스크리닝 할 수 있다.

Description

ＣＣＬ２ 또는 ＣＣＬ２ 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating CNS injury-related diseases comprising CCL2 or CCL2 agonist}
본 발명은 CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
성체 포유동물 중추신경계(CNS) 뉴런의 축삭(axon)은 손상 후 재생하는 능력이 매우 제한되는 반면, 말초신경계(PNS)의 축삭은 빠르게 재생하는 것으로 알려져 있다. CNS 뉴런의 제한된 재생 능력은 부분적으로는 CNS 축삭의 고유한 특성이지만, 또한 허용되지 않는 환경으로 인한 것이기도 하다. CNS 수초는 신경돌기 성장의 억제 기능의 유일한 원인은 아니지만, 축삭 성장을 활발하게 차단하고, 따라서 재생에 대한 중요한 장벽을 구성하는 수많은 억제성 분자를 함유한다.
뇌졸중은 뇌로의 정상적 혈류가 손상되고 뇌가 너무 많은 또는 너무 적은 혈액을 받아들인 경우 일어나는 뇌혈관 질환으로서, 뇌졸중 후 기능적인 회복은 뇌 혈관형성 및 신경형성을 포함하는, 손상된 뇌의 리모델링과 관련될 수 있다. 뇌 동맥의 갑작스런 폐색은 심각한 신경학적 장애를 유도하는 한편, 다발 경화증으로부터 축삭(axon)의 탈미엘린화(demyelination)는 신경학적 기능의 서서히 퍼지고 고통스러운 장애를 유발한다. 따라서, 뇌졸중 치료에 있어서 축삭 형성력 및 신경교세포 생성을 유도하고 신경 손상 후 기능적인 회복을 촉진하는 방법은 아주 중요하다.
척수손상은 주로 외상으로 인한 척추의 변위에 의하여 척수가 압박되면서 발생한다. 기계적인 일차적인 손상과 함께 손상 즉시 세포괴사(necrosis)가 일어나고 서행적으로 일어나는 세포자멸사(apoptosis)에 의해 회백질의 신경세포와 백질의 희돌기교세포의 세포사멸을 유발하게 되고 축삭의 미엘린제거(demyelination)를 일으켜 궁극적으로 영구적인 기능장애를 발생하게 된다. 그 병태생리학적 분석을 보면 척수 손상 이후 손상 부위에 초기 다량으로 유리되는 글루타메이트(glutamate)에 의한 흥분세포독성, 활성산소(ROS)에 의한 산화적 스트레스, ATP 고갈(depletion), 무산소상태(anaerobic condition) 등에 의한 허혈손상, 그리고 TNF-α, IL-1β 등과 같은 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokines)이나 iNOS 등과 같은 염증성 매개자(inflammatory mediators)에 의한 염증반응 등이 세포사멸의 주요 원인으로 알려져 있다. 그 중에서도 염증반응은 병변 초기뿐만 아니라 장시기에 걸쳐 지속되며 특히 서행적으로 일어나는 세포 사멸이나 축삭 퇴화에서의 소교세포에 의한 염증반응은 척수 손상뿐만 아니라 대부분의 신경 질환에서 공통적으로 나타나는 병리학적 특징으로, 이의 조절은 신경계 질환의 확장을 막는데 중요하다고 알려져 있다.
한편, 한국공개특허 제2009-0082480호에서는 신경돌기 성장의 향상, 뉴런 성장, 회복 또는 재생의 촉진으로부터 유익한 결과를 얻을 수 있는 질병 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조 시에 PirB/LILRB 길항제의 용도를 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 뇌졸중 또는 척수손상 등과 같이 중추신경계 손상 관련 질환 치료에 유용하게 이용될 수 있는 CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CCL2의 발현 프로파일을 이용하여 중추신경계 손상 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 CCL2 발현 또는 활성을 촉진시키는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCL2[chemokine (C-C motif) ligand 2]을 포함하는 중추신경계 손상 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 중추신경계 손상은 뇌졸중 또는 척수손상 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 CCL2 또는 CCL2 효능제는 축삭 재생 효과를 가지며, 상기 중추신경계 손상 관련 질환은 뇌졸중 또는 척수손상 중에서 선택될 수 있다.
상기 CCL2 효능제는 폴리펩타이드, 항체, 재조합 단백질 및 GPCR(Ggycoprotein coupled receptor) 리간드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 중추신경계 손상 우려가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 CCL2의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 CCL2의 발현 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CCL2 발현 또는 활성을 촉진시키는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보약물은 축삭 재생 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, CCL2는 뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하여 컨디셔닝 손상(CI)으로 인한 축삭 재생을 촉진하는 효과를 나타내므로, 뇌졸중이나 척수손상과 같은 중추신경계 손상 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며, CCL2 발현 또는 활성을 촉진시키는 후보약물을 선별하여 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약제를 스크리닝 할 수 있다.
도 1은 배근 신경절(dorsal root ganglia, DRG) 감각뉴런에서의 뉴런-대식세포 간 상호작용을 나타낸 모식도이고,
도 2는 CI 후 얻은 DRG 시료에서 케모카인 어레이를 수행하여 손상된 뉴런과 대식세포를 연결시키는 분자가 CCL2인 것을 확인한 결과이고,
도 3은 뉴런-대식세포 공배양 또는 대식세포 컨디션 배지(CM)에서의 CCL2 중화 항체 처리에 따른 축삭 재생 효과 변화를 나타낸 것이고,
도 4는 신경절 내 CCL2 중화 항체 주입에 따른 CI 유도 신경돌기 과성장 촉진 효과 변화를 나타낸 것이고,
도 5는 재조합 CCL2(rCCL2) 처리에 따른 대식세포 증가 및 축삭 재생 효과를 나타낸 것이고,
도 6는 대식세포를 유인하는 다른 케모카인인 프렉탈카인(fractalkine)의 축삭 재생 여부를 확인한 것이고,
도 7은 신경절 내 AAV5-CCL2 주입에 따른 축삭 재생 효과를 나타낸 것이고,
도 8은 CI를 대신하여 신경절 내 AAV5-CCL2 주입 후 중추신경계 손상을 주었을 때의 축삭 재생을 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면의 실험결과를 근거로 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
도 1에서는 배근 신경절(dorsal root ganglia, DRG) 감각뉴런에서의 뉴런-대식세포 간 상호작용을 나타낸 모식도로서, 원래 DRG 감각신경의 중추가지는 자발적으로 재생되지 않지만, 중추손상 전에 말초가지가 손상(conditioning injury, CI)되면 중추가지의 재생이 유도된다. 이러한 재생 효과는 대식세포 불활성화제인 미노싸이클린에 의해 거의 완전하게 사라진다. 한편, 신경절 내 cAMP 주입은 CI 유도 감각 축삭 재생과 흡사한 효과를 나타내며, 신경절 내 cAMP 주입은 대식세포 증가를 초래하며, 미노싸이클린 처리에 의해 cAMP-주입 DGR의 증가된 신경돌기 과성장이 억제되므로, 축삭 재생에 대한 cAMP 효과는 대식세포에 의해 매개되는 것으로 확인되었다. 그러나, cAMP로 처리된 대식세포 컨디션 배지(CM)는 신경돌기 성장 활성을 나타내지 않는 반면, 뉴런-대식세포 공배양으로부터 얻어진 CM에 cAMP를 처리한 경우에는 유의성 있게 신경돌기 과성장을 촉진하므로, 뉴런-대식세포 간 상호작용에 의해 축삭 재생 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하는 신호를 규명하기 위하여, CI 후 얻은 DRG 시료에서 케모카인 어레이를 수행한 결과, 도 2와 같이 손상된 뉴런과 대식세포를 연결시키는 분자가 CCL2인 것을 확인하였다. CCL2 발현이 손상된 DRG 뉴런에서 증가하였고, cAMP가 DRG 뉴런 배양물에서 CCL2 발현을 상향조절하였다.
도 3과 같이 뉴런-대식세포 공배양에서 CCL2 중화 항체로 중화시키면 CM의 재생효과가 감소되는 반면, 대식세포 컨디션 배지(CM)에서는 CCL2 중화 항체를 처리하여도 신경돌기 성장 활성에 어떠한 변화를 나타내지 않았다.
도 4와 같이 CCL2 중화 항체를 신경절 내로 주입하면 CI 유도 신경돌기 과성장 촉진 효과가 억제되었고, 도 5와 같이 재조합 CCL2(rCCL2)는 대식세포를 증가시키고, 축삭 재생 효과를 촉진시켰다.
도 6과 같이 대식세포를 유인하는 다른 케모카인인 프렉탈카인(fractalkine)은 CCL2와 달리 축삭 재생 효과를 나타내지 못하였다.
도 7과 같이 DRG 신경세포 내에서 CCL2의 발현을 증가시키기 위하여, CCL2를 재조합한 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입하였을 경우, 대조군 rAAV5-GFP를 주입하였을 때와 비교하여, DRG 신경세포의 축삭성장이 매우 증가한 것을 확인하였다.
도 8과 같이 CI를 대신하여 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입하고 7일 후 중추신경계 손상(척수손상)을 주었을 때, 콜레라 독소B 서브 유닛(CTB)에 의하여 추적되는 DRG 신경세포 유래 재생 축삭이 손상 받은 부위를 통과하여 머리 쪽으로 뻗어나가는 것을 확인하였다. 반면, 대조군 rAAV5-GFP를 주입한 경우, 손상부위의 꼬리쪽에서 축삭의 성장이 멈추어 있으며, 축삭의 말단이 곤봉모양을 형성하여 재생능력이 상실되는 모습을 나타내었다. 또한 척수손상 후 하루가 지나서 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입한 경우, 축삭재생이 확인됨에 따라, CCL2가 치료적으로 활용이 가능함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명자는 CCL2이 뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하여 CI-유도 축삭 재생 촉진 효과에 중요한 역할을 수행함을 밝혀내었으며, 또한, CCL2를 신경세포에 처리하게 되면 CI가 존재하지 않아도 DRG 감각신경세포가 중추신경 손상 이후 축삭재생 능력이 항진됨을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 CCL2을 포함하는 중추신경계 손상 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오마커의 검출은 인간의 조직 또는 체액으로부터 이차원 전기영동으로 바이오마커 단백질의 존재를 직접 검출하거나, 인간의 조직 또는 체액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오마커 단백질의 존재를 간접적으로 확인함으로써 수행할 수 있다. 항원항체반응으로서, 면역분석법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 마그네틱 입자를 이용한 마그네틱 입자법, 항체결합 라텍스를 이용한 라텍스 입자법 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 CCL2에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 중추신경계 손상 진단 키트를 제공한다.
상기 분자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 리간드 또는 보조인자(cofactor)일 수 있으며, 바람직하게는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
상기 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.
상기 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 ELISA 방법을 사용하여 모노클노날 항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 CCL2 또는 CCL2 효능제는 축삭 재생 효과를 가지며, 상기 중추신경계 손상 관련 질환은 뇌졸중 또는 척수손상 중에서 선택될 수 있다.
상기 CCL2 효능제는 폴리펩타이드, 항체, 재조합 단백질 및 GPCR(Ggycoprotein coupled receptor) 리간드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 재조합 단백질은 rAAV5-CCL2일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학조성물 중 유효성분의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 질병의 정도, 질병의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　따라서, 이러한 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 중추신경계 손상 우려가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 CCL2의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 CCL2의 발현 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CCL2 발현 또는 활성을 촉진시키는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보약물은 축삭 재생 효과를 가질 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
1. 동물 및 수술절차
성체 암컷 랫(Sprague Dawley rats, 250-300g)을 사용하였으며 모든 동물 실험은 아주대학 동물실험 관련 위원회에 의해 정해진 규칙에 따라 수행되었고, 모든 수술은 클로랄 하이드레이트(400 mg/kg, i.p.)를 사용하여 마취하여 진행하였다. 좌골 신경 손상(sciatic nerve injury, SNI)은 오른쪽 좌골신경을 끊어 유도하였는데 1일, 3일 그리고 면역염색을 위한 고정 7일 전과 축삭생성 분석을 위한 DRGs의 제거 7일 전에 시행하였으며, 또한 생체 재생 분석을 위하여 척수 등쪽의 편측절단 7일 전에 신경손상을 유도하였다.
먼저, 오른쪽 뒷다리 대퇴골을 덮고 있는 피부를 세로방향으로 절제하여 허벅지 근육을 노출시킨 후, 무딘 팁을 가진 외과용 수술가위를 좌골 신경이 노출되도록 근육 사이에 삽입시켰다. 세 갈래의 좌골신경을 몸의 중심 가까이로 묶고 미세 외과용 수술가위로 묶여진 부분 아래를 잘랐다.
척수 등쪽 기둥의 병변을 만들기 위해, 흉부 척수가 노출되는 T9로 척추후궁절제술을 시행하고 중간 절개하여 경막을 열고 측면 기둥과 인접하여 쌍을 이루는 등쪽 기둥을 홍채절개용 수술가위을 이용하여 1.5mm 깊이로 삽입하여 잘라냈다. 등쪽 기둥의 완벽한 절단을 위해서 반드시 진공 흡입하여 남아있는 조직의 잔해를 제거하고 근위와 말단의 병변 사이에 빈공간을 만들었다. 그리고 작은 조각의 겔폼 거즈를 사용하여 즉각적으로 병변자리의 출혈을 막고 근육과 근막의 층을 맞추어 봉합하고 피부는 스템플링 하였다.
등쪽 기둥의 축삭돌기 재생을 관찰하기 위해, 2 μl (0.1% in PBS)의 비복합 콜레라 독소B 서브 유닛(CTB; List Biological Laboratories, Grand Hyatt, San Francisco, CA, USA)을 희생되기 3일 전에 절개 후 남은 근위부 좌골신경에 주사하였다.
L5 DRG의 신경절내에 1) 사이클릭 AMP 유도체 다이부티릴-cAMP (db-cAMP; Calbiochem, Darmstadt, Germany; 100 mM in PBS), 2) 재조합 CCL2 (250 ㎍/ml; R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), 3) 항-CCL2 중화항체 또는 아메리칸 햄스터 IgG (250 ㎍/ml; eBioscience, Sandiego, CA, USA)를, 그리고 대조군으로 4) 재조합 프렉탈카인 (250 ㎍/ml; R&D)을, 5) rAAV5-CCL2(10E12, UNC vector core service; The University of North Carolina at Chapel Hill), 대조군으로 6) rAAV-eGFP (10E12, UNC vector core service; The University of North Carolina at Chapel Hill)를 분당 0.5 μl 속도로 마이크로피펫으로 구성된 해밀턴 주사기를 사용하여 주사하였다.
2. 생체 내 미노싸이클린 관리
미노싸이클린 관리를 위하여 좌골 손상시 경막내로 알제트 삼투성 미니펌프를 삽입하고 폴리에틸렌 튜브(PE-10)를 L6/S1 부분의 척추 뼈 오른쪽 아래로 지나가게 하고 카테터를 약하게 가열하여 튜브 팁이 L5 DRG에 정확하게 위치하도록 구부린 후, 카테터는 안전하게 위치하도록 L6/S1 부분의 뼈에 접합시켜 묶었다. 또한 삼투성 미니펌프는 척추 옆 근육에 접합시켜 봉합시켰다. 펌프는 미노싸이클린(Sigma, 50 μg/ul; Saint Louis, MO, USA) 또는 PBS (카테터 관련 변수의 대조군)를 시간당 1 μl의 속도로 7일간 운반하였는데, 사전 실험을 통하여 50 μg/μl농도의 미노싸이클린이 독성없이 대식 세포의 침투를 효과적으로 막는 것으로 나타났다.
이 외의 별도의 실험으로 대식세포는 SNI후 21일에서 28일까지는 비활성적이고 미노싸이클린 펌프는 SNI후 21일까지 설치 가능하다.
3. 조직 처리 및 면역조직화학 분석
랫을 과량의 클로랄 하이드레이트로 마취시키고 헤파린이 첨가된 PBS를 관류시킨 후, 0.2M 포스페이트 버퍼에 녹인 4% 파라포름알데하이드 관류시키고, 병변 부위가 포함된 DRGs와 척수조직을 절개하여 2시간 동안 4% PFA로 고정시켰다. 그 후에 수크루즈 용액으로 DRGs는 20㎛ 두께로 항냉동 시켰고, 척수 조직은 시상옆면과 1:10의 비율로 동결절편(20㎛ 두께)하고 조직을 수퍼 프로스트 플러스 슬라이드 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)위에 올려 놓고 -20℃에서 사용 전까지 저장하였다.
면역조직화학은 조직부분에 10% 정상 고트 혈청과 0.3% 트리톤 X-100을 1시간 동안 처리한 후, 1차 항체를 블로킹 용액에 용해시켜 4℃에 하룻밤 동안 처리하였다. 1차 항체로는 마우스 항-ED1 (1:500; Serotec, Kidlington, UK), 래빗 항-Iba1 (1:500; Wako, LA, CA, USA), 래빗 항-GAP43 (1:500; Millipore, Danvers, MA, USA), 마우스 항-판 뉴로필라멘트 (1:400; Covance, Hornby, ON, Canada), 고트 항-CTB 항체 (1:10000; List Biological Laboratories), 래빗 항-CCL2 (1:1000; Millipore, Danvers, MA, USA)와 래빗 항-GFAP (1:500; Dako, Carpinteria, CA, USA)를 사용하였다.
조직부분을 세척하고 알렉사 플루오르 488와 594가 태그되어 있는 각각의 1차 항체에 적합한 2차 항체(1:500; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 실온에서 1시간동안 인큐베이션 하였다.
CTB 추적신호를 관찰하기 위해, 바이오티닐이 결합된 항-고트 IgGs (Vector; Burlington, CA, USA)를 1차 항체 인큐베이션 후에 사용하였으며, 척수 조직부분에는 알렉사 594 스트렙타아비딘 결합체(Molecular Probes)와 인큐베이션하였다.
그 후에 커버슬립을 슬라이드 위에 글리세롤을 기본으로 하는 마운팅 액(Biomeda, Foster City, CA, USA)을 사용하여 올려놓고 FV 300 공초점현미경(confocal microscope, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지화 하였다.
4. 정량적 역전사 중합 효소 연쇄반응
트라이졸(Gibco, Gland Island, CA, USA)을 사용하여 DRGs에서 전체 RNAs를 추출하였다. RNA총량은 260nm의 분광학을 이용하여 결정하였으며, 2㎍의 RNA를 표준 RT 프로토콜을 이용하여 cDNA로 역전사 시켰다.
cDNA 1㎕에 10pM의 상보적인 프라이머 쌍과 PCR반응 예비혼합물(GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 첨가하였다.
이때, 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.
18S rRNA, 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3' (정방향, 서열1), 5'-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-3' (역방향, 서열2);
IL-6, 5'-ATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAA-3' (정방향, 서열3), 5'-GTGCATCATCGCTGTTCATACA-3' (역방향, 서열4);
IL-1β, 5'-TCTGTGACTCGTGGGATGAT-3' (정방향, 서열5), 5'-GGCAGCCTTGTCCCTTGA-3' (역방향, 서열6);
TNF-α, 5'-GCCACCACGCTCTTCTGT-3' (정방향, 서열7), 5'-GGCAGCCTTGTCCCTTGA-3' (역방향, 서열8);
LIF, 5'-TCAACTGGCTCAACTCAACG-3' (정방향, 서열9), 5'-ACCATCCGATACAGCTCGAC-3' (역방향, 서열10);
CNTF, 5'-CACCCCAACTGAAGGTGACT-3' (정방향, 서열11), 5'-ACCTTCAAGCCCCATAGCTT-3' (역방향, 서열12);
oncomodulin, 5'-AGGCGTGACTGCAGAAGAAT-3' (정방향, 서열13), 5'-ACTTGGCTGGCAGACATCTT-3' (역방향, 서열14);
BDNF, 5'-GGGTGAAACAAAGTGGCTGT-3' (정방향, 서열15), 5'-ATGTTGTCAAACGGCACAAA-3' (역방향, 서열16);
NT-3, 5'-GATCCAGGCGGATATCTTGA-3' (정방향, 서열17), 5'-AGCGTCTCTGTTGCCGTAGT-3' (역방향, 서열18);
NGF, 5'-CCTGCCAGAGTCCTTTTCTG-3' (정방향, 서열19), 5'-GGTTCAGGCCACAAAGTGTT-3' (역방향, 서열20);
CCL2, 5'-TCTCTTCCTCCACCACTATGCA-3' (정방향, 서열21), 5'-TGCTACAGGCAGCAACTGTGA-3' (역방향, 서열22).
qRT-PCR은 Applied Biosystem SYBRㄾ Green PCR 키트의 프로토콜을 따라 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 시행하였다.
증폭은 94℃에서 30초 동안, 55-64℃에서 31초 동안, 72℃에서 60초 동안 34주기로 수행되었으며, 융용커브(Melting curves)는 마지막 증폭단계에서 발생되었으며 CT 값은 Applied Biosystem 7500 소프트웨어에 의해 정량되었다. 규격화는 18s ribosomal RNA를 내적 대조군으로 사용하여 시행하였다.
5. 대식세포 분리를 위한 자성활성 세포 분류기(magnetic-activated cell sorting, MACS) 분석
좌골신경 부상 7일 후, 랫을 클로랄 하이드레이트로 마취시키고 차가운 PBS를 먼저 동물의 심장 내로 주입하여 관류시키고 L4와 L5 DRGs 동쪽 부상부위를 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)으로 해리시켰다.
세포를 1500rpm에 3분간 4℃ 원심분리 후, MACS 버퍼(0.5% BSA, 2가 이온이 없는 PBS가 포함된 2mM EDTA, pH 7.2)로 세척하였다.
그리고 세포 현탁액에 바이오틴이 결합된 CD68 1차 항체 (1:100; Abcam, Cambridge, UK)를 넣고 얼음 위에서 15분간 인큐베이션하고 이를 통하여 마이크로파지계 세포의 세포질 과립을 찾아냈고 아비딘이 결합된 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 함께 얼음위에서 10분간 인큐베이션시켰다.
그 후 세포 현탁액을 MACSㄾ Cell Separation kit (Miltenyi Biotec)의 미니 컬럼으로 흘려서 통과시켜 CD68 음성 세포를 수집하였고, 컬럼을 MACS 버퍼로 다시 한 번 세척하여 남아있는 음성세포를 2차로 수집하였다.
미니 컬럼에 흡착되어 있는 CD68 양성세포를 용리버퍼(elution buffer) 500㎕를 사용하여 분리시켰다. 두 번째 용리로 모아진 CD68 양성세포는 2차 양성 부분이라고 라벨링하였으며, 그렇게 모아진 2차 양성세포와 음성세포는 MACS 분리의 효과를 비교할 대조군으로 사용하였다.
또한 각각의 세포군에서 전체 RNA를 추출하였다.
6. ELISA
L4와 L5 DRGs를 절개하고 용해시켜 cAMP enzyme immunoassay kit (Assay Designs, Ann Arbor, MI, USA)을 사용하여 cAMP를 즉시 측정하였다.
각각의 웰에 20 μg/μl 농도의 DRG 용해물 100 μl를 넣었으며 각 실험은 3배씩 3회 반복하여 수행하였다.
배양액에 첨가하기 위한 온코모듈린의 농도는 랫 온코모듈린 (catalogue number, MBS908312; Mybiosource, San Diego, CA, USA)을 ELISA kit을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정했다.
측정된 조건의 배양액을 각 well당 100μl씩 넣고 각각의 조건으로 배양하였다.
7. 해리된 성체 DRG 뉴런의 초대배양
4번 5번 요추 척수부분의 성체 DRGs를 절개해내고 125U/ml 타입 ⅩⅠ콜라겐분해효소(Sigma)를 처리하여 DMEM(Hyclone, Logan, UT, USA)으로 용해시킨 후 37℃에서 90분 동안 가볍게 교반시키고 DMEM으로 5번 세척하였다.
세포를 파이펫 팁을 사용하여 해리시키고 1,500rpm으로 3분간 원심분리하였다.
세포 펠렛을 B-27 (Gibco)이 들어있는 뉴로바살-A (Gibco)에 재부유시켜 0.01% 폴리-D-라이신 (Sigma)와 3μg/ml 라미닌 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)이 미리 코팅된 8-well 배양 슬라이드(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)위에 분주하였다.
배양기간은 부상 없는 대조군의 최소 축삭생성을 보인 15시간으로 엄격히 제한하였으며, 축삭생성을 확인하기 위해, 마우스 항-베타 Ⅲ 튜불린(1:1000; Promega, Madison, WI, USA)과 알렉사 594가 결합된 항-마우스 2차 항체를 이용하여 면역염색을 진행하였다.
8. 초대 마이크로파지 배양과 뉴런-마이크로파지의 공배양
성체 암컷 랫(Sprague Dawley rats, 250-300g)에 과량의 클로랄 하이드레이트로 마취시키고, 즉시, 자궁을 전위시킨 동물을 안락사시킨 후 복강 안을 차가운 PBS 50 ml로 세척하여 복강 안의 대식세포를 수확하였다.
세척한 용액을 1500rpm으로 10분간 4℃로 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었고, 세포 펠렛에 5ml RBC 용해 버퍼(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 실온에서 3분 동안 재부유시키고 PBS로 3번 세척하였다.
마지막 세척 후에 세포를 10% 태아소혈청(FBS)이 보충된 RPMI-1640 (Hyclone)에 재부유시켜 0.01% 폴리-D-라이신(Sigma)이 코팅된 100mm 배양 디쉬(BD Bioscience)에 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 유지시켰다.
분주 4시간 후, 배양된 마이크로파지에 db-cAMP (100 μM) 또는 지모산(12.5 ㎍/ml)과 미노싸이클린(10 ㎍/μl)을 함께 또는 단독으로 24시간 동안 처리하고, 24시간 후에 배양 배지를 B-27 (Gibco)가 들어간 신선한 DMEM으로 교체하였다. 72시간 동안 배지 교체 없이 배양한 후, 배지를 1500rpm에 5분간 원심분리하고 배양액을 0.2 μm 필터(BD Bioscience)를 통과시켜 남아있었던 세포잔해를 제거하였다. 용해된 DRG 뉴런의 초대 배양은 상기 설명된 방법으로 실행되었으며, 배양 디쉬에 자리잡도록 2시간 동안 유지시키고 각 조건의 배지로 교체하여 15시간 동안 배양하였다.
고정된 세포에 축삭생성을 확인하기 위해, 베타 Ⅲ 튜불린으로 면역염색하고 뉴런-마이크로파지의 공배양을 위하여 뉴런을 B-27 (Gibco)이 들어있는 DMEM (Gibco)에 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 복강내 대식세포를 뉴런위에 1:5(neurons to macrophages)의 비율로 분주하고 4시간 동안 처리한 후, 배지를 수거하여 세포 배양 삽입(BD Bioscience)을 이용한 뉴런-대식세포 공배양을 수행하였는데 먼저, 세포 배양 삽입 6-well에 뉴런을 분주하고 4시간 후에 복강내 대식세포를 분주하였다.
수거된 배양 배지안의 IL-6, LIF와 온코모듈린의 잠재적 활성을 무효화시키기 위해, IL-6 (20 ㎍/ml; R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), LIF (20 ㎍/ml; R&D) 와 온코모듈린(20 ㎍/ml; kindly provided by Dr. Benowitz at Harvard University)무효화 항체를 첨가하였으며, 대조군에는 같은 양의 고트 또는 래빗 IgG (R&D)를 첨가하였다.
뉴런-마크로파지의 공배양에서 CCL2의 영향을 무효화시키기 위해, CCL2 중화 항체(1 ㎍/ml; eBioscience, Sandiego, CA, USA)를 처리하였다.
1) 뉴런-마크로파지의 공배양은 상기 설명된 방법으로 실행되었으며 분주 4시간 후, 배양된 뉴런과 마이크로파지에 db-cAMP (100 μM) 또는 PBS와 CCL2 중화항체 또는 아메리칸 햄스터 IgG를 함께 또는 단독으로 24시간 동안 처리한 후에 배양 배지를 B-27 (Gibco)가 들어간 신선한 DMEM으로 교체하여 24시간 동안 배지 교체 없이 배양한 후 배지를 1500rpm에 5분간 원심분리하고 배양액을 0.2 μm 필터(BD Bioscience)를 통과시켜 남아있었던 세포잔해를 제거하였다.
2) 상기 설명된 방법을 통해 실행 된 dc-cAMP 또는 PBS 첨가 뉴런-마크로파지 공배양의 배양액을 이용하여 해리된 성체 DRG 뉴런의 초대배양시 CCL2 중화항체 또는 아메리칸 햄스터 IgG를 첨가하였다.
9. 배양시 축삭생성과 생체 내 대식 세포 수와 축삭돌기재생의 정량
축삭생성 분석을 위해, 뉴런당 평균 신경돌기 길이를 측정하고 다른 실험 조건들과 축삭생성 정도를 비교하였다.
신경돌기 길이는 이미지 분석 소프트웨어 Image J (publicly available from http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html)의 Neuron J plugin을 이용하여 가늘고 긴 구조물을 추적하고 정량하였다. 각 실험 조건의 배지당 4 well 반복 측정하였으며, 각 well을 4등분으로 나누어 각 부분의 중심을 기준으로 200× 확대된 이미지를 얻었다.
각 이미지의 모든 뉴런 신경돌기를 추적하였고 이미지당 DRG 뉴런의 수를 측정하였다. 그 결과, 한 이미지당 20 뉴런이 측정되었고 각 well당 80뉴런을 측정하였다.
각 well의 뉴런 당 평균 신경 돌기 길이는 약 80 뉴런의 전체 신경 돌기의 길이를 뉴런의 수로 나누어 계산 하였다.
각 배양조건당 4 well의 값으로 평균을 내었고 뉴런당 신경돌기 길이의 평균 그룹 값에는 3-4개의 독립적 배양의 평균 값이 포함되었다.
DRGs안의 대식세포 침투를 정량하기 위해서 Iba1 면역 염색된 조직부분의 이미지를 200× 확대하여 DRGs안 대식세포의 수를 정량하였다.
동물당 4개 이미지로 대식세포를 계수하였고 단위면적당 대식세포 수를 얻기 위해서 전체 대식세포 수를 이미지된 DRGs 영역으로 나누었다.
Iba1 양성 대식세포는 신경섬유 양성 DRG뉴런과 가까이 위치하는데, 이 두 세포 사이에는 주목할 만한 배경신호가 없어 대식세포는 뉴런과 물리적 연관이 있음을 간주할 수 있다.
물리적 연결을 나타내는 대식세포의 수를 DRG뉴런과 연관된 대식세포의 백분율을 포함한 같은 이미지 속 전체 대식세포 수로 나누었다.
부상 후 등쪽 기둥 축삭돌기의 성장 정도를 정량하기 위해, CBT추적 신호를 포함하는 모든 10번째 측시상동 척수 부위(200 ㎛ 교차 구간)를 이용하여 분석하였다. CTB로 염색된 병변 부위의 미측 5 mm에서 문측 5 mm까지 이미지로 얻었고 미측 병변 경계를 GFAP염색하여 식별한 후 낮은 병변 경계부터 계산 단위를 기술하여 100 ㎛ 간격으로 세로 축에 수직선을 나타내었는데, 단위 이름은 병변 경계와 가장 짧은 거리로 나타내었다. 예를 들어 +100 과 +200 사이의 축삭돌기 수는 +100 값으로 기록되었다.
연속 선 사이의 CTB 양성 축삭돌기 수 측정하여, 단위 안에 축삭돌기 수를 기록하였으며, 각 동물에서 축삭돌기가 보여지는 부분으로 평균값을 계산하였다.
그밖에 미측 병변 경계를 넘어 먼 거리에서 재생된 축삭돌기도 기록하였다.
10. 케모카인 분석
과량의 클로랄 하이드레이트로 동물을 마취시켜 희생시킨 후, 차가운 살린을 관류시켜 조직에서 혈액 성분들을 제거했다.
배근 신경절(Dorsal root ganglia)조직을 신속히 절개하고 RNase-free DNase set chemokine array tissue mini kit (Qiagen, Hilgen, Germany)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 전체 RNA를 분리하였다.
케모카인 분석을 위해 RNA표본의 농도를 Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)을 이용하여 정량하고 2㎍ RNA을 표준 RT 프로토콜을 이용하여 cDNA로 역전사하였다.
RT2 Profiler PCR Array kit (Qiagen, Hilgen, Germany)에 1㎕의 cDNA를 사용하였고 정량적 Real-Time PCR은 RT2 Profiler PCR Array kit에서 제공한 프로토콜에 따라 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 90℃에서 10분, 60℃에서 1분 동안 전체 40주기로 수행하였다. 마지막 증폭 단계에서 용융곡선이 나타났으며 CT 값은 Applied Biosystem 7500 software로 정량하였다.
표적 유전자의 발현은 내부 대조군으로 산성 리보솜 단백질 60S의 발현과 관련하여 규격화하였다.
11. 재조합 AAV5 ( Recombinant adeno - associate virus serotype 5)의 제작
CCL2의 cDNA를 pAAV-CAG-GFP 벡터에 서브클로닝(subcloning)을 시행한 후, 이를 항원형 5 (serotype 5)의 AAV 바이러스로 제작하였다 (Viral vector core service, The University of North Carolina at Chapel Hill, USA). 대조군으로는 같은 항원형인 AAV5에 형광표지자를 붙인 rAAV5-eGFP를 제작하였다.
12. 통계 분석
모든 값은 평균±SEM으로 표현하였다. 평균값의 통계 비교는 Tukey's posthoc 테스트을 따르는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행하였으며 이원배치분산분석(two-way ANOVA)의 반복 측정은 중심에서 먼 거리의 축삭돌기 수를 비교하는 데 사용되었다.
정량 그래프는 GraphPad Prism version 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 나타냈다.
13. 실험결과
도 1에서는 배근 신경절(dorsal root ganglia, DRG) 감각뉴런에서의 뉴런-대식세포 간 상호작용을 나타낸 모식도로서, 원래 DRG 감각신경의 중추가지는 자발적으로 재생되지 않지만, 중추손상 전에 말초가지가 손상(conditioning injury, CI)되면 중추가지의 재생이 유도된다. 이러한 재생 효과는 대식세포 불활성화제인 미노싸이클린에 의해 거의 완전하게 사라진다. 한편, 신경절 내 cAMP 주입은 CI 유도 감각 축삭 재생과 흡사한 효과를 나타내며, 신경절 내 cAMP 주입은 대식세포 증가를 초래하며, 미노싸이클린 처리에 의해 cAMP-주입 DGR의 증가된 신경돌기 과성장이 억제되므로, 축삭 재생에 대한 cAMP 효과는 대식세포에 의해 매개되는 것으로 확인되었다. 그러나, cAMP로 처리된 대식세포 컨디션 배지(CM)는 신경돌기 성장 활성을 나타내지 않는 반면, 뉴런-대식세포 공배양으로부터 얻어진 CM에 cAMP를 처리한 경우에는 유의성 있게 신경돌기 과성장을 촉진하므로, 뉴런-대식세포 간 상호작용에 의해 축삭 재생 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하는 신호를 규명하기 위하여, CI 후 얻은 DRG 시료에서 케모카인 어레이를 수행한 결과, 도 2와 같이 손상된 뉴런과 대식세포를 연결시키는 분자가 CCL2인 것을 확인하였다. CCL2 발현이 손상된 DRG 뉴런에서 증가하였고, cAMP가 DRG 뉴런 배양물에서 CCL2 발현을 상향조절하였다.
도 3과 같이 뉴런-대식세포 공배양에서 CCL2 중화 항체로 중화시키면 CM의 재생효과가 감소되는 반면, 대식세포 컨디션 배지(CM)에서는 CCL2 중화 항체를 처리하여도 신경돌기 성장 활성에 어떠한 변화를 나타내지 않았다.
도 4와 같이 CCL2 중화 항체를 신경절 내로 주입하면 CI 유도 신경돌기 과성장 촉진 효과가 억제되었고, 도 5와 같이 재조합 CCL2(rCCL2)는 대식세포를 증가시키고, 축삭 재생 효과를 촉진시켰다.
도 6과 같이 대식세포를 유인하는 다른 케모카인인 프렉탈카인(fractalkine)은 CCL2와 달리 축삭 재생 효과를 나타내지 못하였다.
도 7과 같이 DRG 신경세포 내에서 CCL2의 발현을 증가시키기 위하여, CCL2를 재조합한 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입하였을 경우, 대조군 rAAV5-GFP를 주입하였을 때와 비교하여, DRG 신경세포의 축삭성장이 매우 증가한 것을 확인하였다.
도 8과 같이 CI를 대신하여 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입하고 7일 후 중추신경계 손상(척수손상)을 주었을 때, 콜레라 독소B 서브 유닛(CTB)에 의하여 추적되는 DRG 신경세포 유래 재생 축삭이 손상 받은 부위를 통과하여 머리 쪽으로 뻗어나가는 것을 확인하였다. 반면, 대조군 rAAV5-GFP를 주입한 경우, 손상부위의 꼬리쪽에서 축삭의 성장이 멈추어 있으며, 축삭의 말단이 곤봉모양을 형성하여 재생능력이 상실되는 모습을 나타내었다. 또한 척수손상 후 하루가 지나서 rAAV5-CCL2를 신경절에 주입한 경우, 축삭재생이 확인됨에 따라, CCL2가 치료적으로 활용이 가능함을 확인할 수 있었다.
따라서, CCL2는 뉴런-대식세포 간 상호작용을 매개하여 CI-유도 축삭 재생 촉진 효과에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 또한, CCL2를 신경세포에 처리하게 되면 CI가 없어도 DRG 감각신경세포가 중추신경 손상 이후 축삭재생 능력이 항진됨이 밝혀졌다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for treating CNS injury related diseases comprising CCL2 or CCL2 agonist <130> ADP-2014-0397 <150> KR 10/20130113083 <151> 2013-09-24 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggctaccac atccaaggaa 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgctggcacc agacttgccc tc 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atatgttctc agggagatct tggaa 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgcatcatc gctgttcata ca 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctgtgactc gtgggatgat 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcagccttg tcccttga 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gccaccacgc tcttctgt 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggcagccttg tcccttga 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcaactggct caactcaacg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 accatccgat acagctcgac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caccccaact gaaggtgact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 accttcaagc cccatagctt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aggcgtgact gcagaagaat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acttggctgg cagacatctt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gggtgaaaca aagtggctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 atgttgtcaa acggcacaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gatccaggcg gatatcttga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agcgtctctg ttgccgtagt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cctgccagag tccttttctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggttcaggcc acaaagtgtt 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tctcttcctc caccactatg ca 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgctacaggc agcaactgtg a 21

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. CCL2 또는 CCL2 효능제를 유효성분으로 함유하며, 축삭 재생 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 척수손상 치료용 약학조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 CCL2 효능제는 폴리펩타이드, 항체, 재조합 단백질 및 GPCR(Ggycoprotein coupled receptor) 리간드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 척수손상 치료용 약학조성물.
  7. 중추신경계 손상 우려가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 후보약물을 처리하고 CCL2의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 CCL2의 발현 프로파일과 비교하여 CCL2 발현 또는 활성을 촉진시켜 축삭을 재생시키는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 축삭재생용 약제 스크리닝 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
KR1020140119233A 2013-09-24 2014-09-05 Ｃｃｌ２ 또는 ｃｃｌ２ 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학조성물 KR101723267B1 (ko)

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US20210244845A1 (en) * 2020-02-10 2021-08-12 Leslie MARCELIN Method Of Processing Amnion To Form A Suture

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