KR101719101B1 - A root hairs specific promoter and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 단자엽 식물의 뿌리털 특이적 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a root hair specific promoter of monocotyledonous plants and uses thereof.
벼(Oryza sativa)는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여년 동안 꾸준히 수량 증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70% 이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화 현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 유용 유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로서 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.Rice (Oryza sativa) is one of the most important food crops in the world. It has been steadily increasing its yields over the past two decades, but by 2020 it will have to produce more than 70% have. However, the agricultural land where rice is cultivated is getting smaller and smaller as the industrialization phenomenon of each country in the world, and the new genetic resource which is the subject of breeding is depleted and the introduction of the foreign useful gene is required. Fortunately, the development of molecular biology has enabled the isolation and manipulation of exogenous useful genes, transforming useful genes into many plant cells, including rice, to obtain transformants with new genes, Research has become a good source of breeding as well. The production of new varieties using this transformation will not only become a high value - added industry in the coming 21st century, but it will also solve some of the food problems that are highlighted as the greatest problems of mankind.
현재까지 알려진 형질전환 방법으로, 80년대 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium) 이용법도 많이 이용되고 있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다. Many transgenic plants have been obtained by using polyethylene glycol (PEG) and electroporation in the protoplasts of the 1980s as a known transformation method. In the late 1990s, Agrobacterium, which has been widely used in the art, is also widely used. Other methods include pollen pathway and microinjection method.
프로모터는 유전자의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체 부위로서 이에 연결된 구조 유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 주변으로부터의 환경적 요인 또는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화될 수도 있다.The promoter is a genomic region connected to the upper side of the gene, and plays a role of regulating transcription of a structural gene linked to the promoter to mRNA. Since the proteins necessary for basic metabolism must maintain a certain concentration in the cells, the promoter linked to these genes is always activated by the action of a common transcription factor. Conversely, proteins that do not have a role in normal times and that require function only under specific circumstances may be activated by binding environmental transcription factors or specific transcription factors activated by external stimuli.
즉, 프로모터(promoter)는 외래 유전자의 발현을 필요에 따라 식물체의 전신 또는 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성할 수 있으며 기능에 따라 아래와 같은 프로모터들을 포함할 수 있다. That is, a promoter can achieve the purpose of transformation by limiting the expression of a foreign gene to a whole body or a specific tissue of a plant as necessary, and may include the following promoters depending on function.
첫째로 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(참조: 등록번호 10-0429335). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체 내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다. First, systemic expression-inducible promoters can be mentioned. As a plant systemic expression-inducing promoter, a promoter of 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus (CaMV) is used as a typical promoter for dicotyledonous plants. Actin and maize ubiquitin gene promoters have been mainly used as promoters for the expression of the whole plants in rice plants and rice plants. Recently, a promoter of the rice cytochrome C gene (OsOc1) has been developed by domestic researchers, (Cf. Reg. No. 10-0429335). They are already inherent in inducing the expression of antibiotics, herbicide resistance genes and reporter genes used as selection markers in the plant transgenic carrier. From a research point of view, Promoters considered.
둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼의 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터, 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도 특허출원(참조: 특허출원번호 10-2006-0000783) 사례가 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.Second, seed-specific promoters can be mentioned. As a representative example, the rice glutelin promoter used for the development of golden rice as promoters of major storage protein genes of rice has been widely used to induce seed-specific expression of monocotyledonous plants to date, Promoter of soybean-derived lectin, napin promoter derived from Chinese cabbage, and gamma-tocopherol methyl transferase (gamma-TMT) in the seeds of Arabidopsis thaliana (Patent Application No. 10-2006-0000783) inducing seed-specific expression of carrot-derived DC-3 promoter and perilla originated oleosin promoter used in the study promoting the production of vitamin E by inducing gene expression, There is an example. The seed-specific promoters are mainly used for the purpose of accumulating useful proteins and producing beneficial substances in major crops in which seed itself is used as a food, a food, or a raw material for food.
셋째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터 등이 있다.Third, other tissue specific promoters such as leaves may be mentioned. (RbcS: ribulose bisphosphate carboxylase / oxygenase small subunit) promoter which induces expression of a strong gene only in photosynthetic tissues such as leaves, RolD promoter inducing expression of plant roots derived from Agrobacterium, potato-derived tuber A specific expression-inducible patatin promoter, and a tomato-derived fruit maturation-specific expression-inducing PDS (phytoene synthase) promoter.
넷째로 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록(대한민국 등록번호 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바 있다. Fourth is root specific expression promoter. (IbMADS) and sugar-induced adipose-glucose pyrophosphatase (AGPase) genes were isolated from the sweet potato-derived rice paddy rice, and the peroxidase (prxEa) (Korean Registration Nos. 10-0604186 and 10-0604191), confirming that the promoter induces specific expression in roots and induces root-specific transient expression in carrot and radish.
위와 같이, 큰 부류로 특이적 발현을 위한 프로모터들이 알려져 있지만, 보다 더 기관 특이적 발현을 목적으로 하는 프로모터들이 개발될 필요성이 있다. As described above, although a large number of promoters for specific expression are known, there is a need to develop promoters for further organ-specific expression.
예를 들어, 뿌리 중 뿌리털은 뿌리의 표피 세포로부터 만들어지는 원통형의 돌출부위이다. 뿌리털은 뿌리의 표면적을 효과적으로 넓히며, 수분 및 영양분의 흡수, 식물체와 미생물간 상호작용, 대기의 질소 고정 및 근권으로 혼합물의 분비에 중요한 역할을 한다. 주요 영양소, 중금속 그리고 확산 제한적 이온들의 흡수에 대한 능력을 고려하면, 뿌리털은 농업, 환경 및 인간 건강 안전에 큰 기여를 한다. 즉, 뿌리에 있어서도, 뿌리 털 특이적으로 발현되어야 할 유전자들이 존재하며, 이에 따라 특이성이 보다 더 증대된 프로모터들이 개발될 필요성이 있다. For example, the root of the root is a cylindrical protruding part made from the epidermal cells of the root. Root hair effectively spreads the surface area of roots, plays an important role in absorption of water and nutrients, plant-microbial interactions, nitrogen fixation in the atmosphere, and rhizosphere. Considering the ability to absorb major nutrients, heavy metals and diffusion limited ions, root hair contributes greatly to agricultural, environmental and human health safety. That is, even in the root, there are genes to be expressed specifically in the root coat, and accordingly, there is a need to develop more specific promoters.
즉, 개발자의 의도에 따라 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터, 예컨대 특정한 기관에서만 발현되어야 하는 유전자 (예: 화색, 응성 불임, 화형, 특정 대사관련 물질, 방어물질 등)를 형질 전환시킬 경우, 특정 기관이나 시기에만 작동하는 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.That is, a new promoter capable of regulating the location of the gene expression more precisely according to the intention of the developer, for example, a gene which should be expressed only in a specific organ (for example, a flower color, infertility, When switched, there is a need to continue to develop promoters that work only at specific institutions or periods.
본 발명은 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신이 아닌 뿌리털에 우선적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포, 이 발현 벡터 또는 형질전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물, 이로 형질전환된 단자엽 식물체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다. The present invention relates to a method for producing a recombinant vector, which comprises the step of expressing a foreign gene in a plant, a promoter capable of preferentially expressing the gene in the root of the plant, an expression vector containing the promoter, a transformant transformed with the expression vector, A composition for inducing preferential expression of a foreign gene comprising a foreign gene, a terminal plant transformed with the same, and a method for producing the same.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 식물의 조직 또는 기관 특이적인 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터들을 발굴함으로써, 식물의 특정 조직 또는 기관에 국한시켜 목적 유전자를 특이적으로 발현 또는 저해할 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 이 과정에서 벼의 LOC_Os02g46500의 프로모터가 뿌리털에서 우선적으로 발현을 유도함을 확인하였다. 이에 따라, 상기 프로모터를 확보하여 이를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 이를 식물에 도입하여 형질 전환시킨 형질 전환체에서 뿌리털 우선적으로 리포터 유전자가 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.In order to achieve the above object, the inventors of the present invention have discovered that promoters capable of regulating plant tissue or organ-specific gene expression can be identified, thereby specifically expressing or inhibiting a gene of interest, And to establish a system with In this process, it was confirmed that the promoter of LOC_Os02g46500 of rice induces preferential expression in the root hair. Accordingly, the present invention has been accomplished by securing the promoter, preparing an expression vector containing the promoter, and then introducing the expression vector into a plant to confirm that the reporter gene is expressed preferentially in the root of the transformant.
보다 상세하게, 본 발명자들은 벼의 뿌리털을 사용하여 어질런트 어레이 (agilent array)를 수행하였으며, 공개된 벼 어질런트 (agilent) 자료인 GSE21494와 병합하였다. GSE21494는 209가지의 벼 발달단계별 시료를 이용하여 실험된 어질런트 (agilent) 자료로, 13개의 기관별 발현 분석이 가능한 상당히 높은 재현성을 보여주는 자료이다. 본 발명자들이 수행한 뿌리털 어질런트 어레이 (agilent array) 자료 역시 뿌리털에서의 유전자 발현을 잘 대변하고 있다. 어질런트 어레이(agilent array)는 한 번의 실험으로 45151 종의 프로브에 의해서 대변되는 유전자 발현을 분석 가능케 한다. 이 자료의 발현 패턴별 분석을 통해서 뿌리털에서 우선적으로 발현되는 유전자들이 분리되었다. In more detail, we performed agilent arrays using rice bulb roots and merged with published rice agilent data, GSE21494. GSE21494 is agilent data of 209 rice development step-by-step samples. It is a very high reproducibility that can be analyzed by 13 different tissues. Agilent array data from the roots of the present inventors also represent gene expression in root hair. Agilent arrays enable the analysis of gene expression expressed by 45151 probes in a single experiment. Through the analysis of the expression patterns of these data, genes expressed preferentially in the root hair were isolated.
상기 방법을 통해서, 409 종의 유전자가 다른 유전자들와 대비하여 뿌리털에서 높은 발현 양상을 보여 주었다. Through this method, 409 genes showed higher expression patterns in root hair compared to other genes.
상기 유전자 중 LOC_Os02g46500의 프로모터와 관련하여, 염기서열 해독 정보를 참고로 하여 LOC_Os02g46500의 -1522부터 +750까지의 프로모터 영역과 첫 번째 exon의 일부를 포함하는 영역을 게놈 DNA PCR를 통해서 분리하고 pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다. Regarding the promoter of LOC_Os02g46500 among the above genes, the promoter region from -1522 to +750 of LOC_Os02g46500 and the region including a part of the first exon were separated by genomic DNA PCR with reference to the base sequence decode information, and pGEM T- And cloned into an ejaculatory vector to decode the base sequence.
이렇게 분리된 프로모터를 pGA3519 벡터에 넣어, 형질전환된 식물체를 제작하였다. 형질전환된 식물체에서 GUS 반응을 검증함으로써, 해당 프로모터를 이용하여 식물의 뿌리털 우선적 유전자 발현을 유도하여 본 발명을 완성하였다.The thus isolated promoter was inserted into the pGA3519 vector to prepare a transformed plant. By verifying the GUS reaction in the transformed plants, the present invention was completed by inducing the expression of the root hair preferential gene of the plant using the corresponding promoter.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 뿌리털 우선적 발현 프로모터를 제공한다. The present invention provides a root hair preferential expression promoter comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
본 발명에 따른 상기 뿌리털 우선적 발현 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 벼의 LOC_Os02g46500의 프로모터를 포함하여 뿌리털에서 우선적으로 외래유전자를 발현시킨다. The root hair preferentially expressing promoter according to the present invention includes a promoter of LOC_Os02g46500 of rice, which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and preferentially expresses a foreign gene in root hair.
프로모터는 유전자의 환경적, 시기적 및 조직적 발현을 조절하는 필수적인 요소로서, 본 발명에 따른 뿌리털 우선적 발현 프로모터를 사용하여 식물체 내에서 외래 유용 유전자의 발현 부위를 뿌리털에 우선적으로 유도할 수 있다. 본 발명은 벼의 LOC_Os02g46500의 프로모터로서, 외래 유전자의 발현이 뿌리털에 우선적으로 이루어지도록 유도하는 뿌리털 우선적 발현 프로모터(이하 '본 발명의 프로모터'라 함)를 제공한다.The promoter is an essential element to regulate the environmental, temporal, and systemic expression of the gene, and the expression site of the foreign useful gene in the plant can be preferentially induced in the root hair using the root hair preferential expression promoter according to the present invention. The present invention provides a promoter of LOC_Os02g46500 of rice and a promoter of a root hair preferential expression (hereinafter, referred to as 'promoter of the present invention') which induces expression of foreign genes preferentially to root hair.
본 발명에 있어서 "우선적"이란, 본 발명에 따른 프로모터에 의한 고발현성, 특이성 등을 모두 포함하여 식물 일부에서 우선적 발현 증가를 의미한다. 예컨대 본 발명에 따른 프로모터가 결여된 식물체와 대비하여 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 5배 이상 또는 그 이상의 발현 증가를 의미한다. In the present invention, "preferential" means a preferential expression increase in a part of a plant including all of the high specificity and specificity by the promoter according to the present invention. For example, 50% or more, 100% or more, 200% or more, 5-fold or more, or more, as compared with a plant lacking the promoter according to the present invention.
LOC_Os02g46500은 U-Box domain을 포함하는 E3 ubiquitin ligase인 OsPUB36을 암호하며, 한 개의 exon으로 구성되어 있다. LOC_Os02g46500 encodes OsPUB36, an E3 ubiquitin ligase containing the U-Box domain, and consists of one exon.
426개의 아미노산으로 구성된 본 LOC_Os02g46500의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.The promoter of this LOC_Os02g46500 composed of 426 amino acids has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
또한 본 발명은 상기 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.The invention also provides an expression vector comprising said promoter and an operably linked foreign gene.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.The term "vector" refers to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which transfers into a cell, which can be cloned and independently reprogrammed in host cells. "Expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. The expression vector may generally be derived from a plasmid or viral DNA, or may contain both elements. Thus, an expression vector refers to a recombinant DNA or RNA construct, such as a plasmid, phage, recombinant virus, or other vector that, upon introduction into an appropriate host cell, results in the expression of the cloned DNA. Suitable expression vectors are well known to those skilled in the art and include those that replicate in eukaryotic and / or prokaryotic cells and those that remain as episomes or that are integrated into the host cell genome.
상기 통상의 벡터는 본 발명의 프로모터를 도입할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하나, 바람직하게는 pCAMBIA계열, pGA계열, pGWB계열, 예컨대, pGA3519, pCAMBIA3301, pCAMBIA3300, pGA3426, pGA3780, pGWB12, pGWB14와 같은 Ti-plasmid 및 이에 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 프로모터 및 외래 유전자를 포함하며 뿌리털 우선적으로 외래 유전자 발현에 현저한 효과를 가진다. Such a vector may be any vector as long as it can introduce the promoter of the present invention. Preferably, the vector may be a pCAMBIA family, a pGA family, a pGWB family such as pGA3519, pCAMBIA3301, pCAMBIA3300, pGA3426, pGA3780, pGWB12, pGWB14 Ti-plasmid, and vectors derived therefrom. These vectors contain the promoter and the foreign gene of the present invention and have a remarkable effect on expression of the foreign gene preferentially in the root hair.
본 발명의 발현 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산, 그와 기능적으로 동등한 절편을 포함한다.The expression vector of the present invention includes a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a functionally equivalent fragment thereof.
"본 발명의 프로모터"와 "기능적으로 동등한 절편"은 본 발명의 프로모터와 실질적으로 동등한 효과를 나타내는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 조각 또는 일부분을 의미한다. 이러한 핵산 절편은 서열번호 1에 기재된 염기서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지며, 이러한 핵산 절편은 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다. 또한, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 프로모터와 일부 유전자 영역은 공개된 벼 게놈 서열 상, LOC_Os02g46500 앞쪽과 유전자의 일부를 포함하는 서열로, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 중 일부가 치환, 삽입 또는 삭제되더라도 공개된 벼 게놈 서열 상 LOC_Os02g46500의 프로모터와 일부 유전자 영역에 위치한 서열과 상동성이 유지되어 실질적으로 동등한 효과를 나타낸다면 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. Means a fragment or a fragment of a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which exhibits substantially equivalent effect to the promoter of the present invention. These nucleic acid fragments are 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% or more of sequence homology. Such a nucleic acid fragment can be easily prepared by molecular biological methods well known in the art. In addition, the promoter shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention and a part of the gene region are located in front of LOC_Os02g46500 in the published rice genome sequence, and some of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, inserted Deletion or deletion may be included in the scope of the present invention if the same homology with the promoter of LOC_Os02g46500 on the published rice genome sequence is maintained and the sequence located in some gene region exhibits substantially equivalent effect.
본 발명의 발현 벡터는 3' 방향에 목적 단백질에 대한 외래 유전자가 발현되도록 한다. 바람직하게는 상기 발현벡터는 뿌리털에 우선적으로 발현시키고자 하는 유용한 외래 유전자를 포함할 수 있다.The expression vector of the present invention allows expression of a foreign gene for the target protein in the 3 'direction. Preferably, the expression vector may comprise a useful foreign gene that is preferentially expressed in the root hair.
식물이 생장하기 위해서는 양분과 물의 흡수가 중요하며 그 역할을 뿌리털이 주요하게 담당한다. 또한, 식물체를 고정시키고, 이차대사산물을 합성하는 역할을 수행한다. 따라서, 상기 외래 유전자는 뿌리털의 앞서 언급된 기능 및 뿌리털의 특성과 관련된 것이면 무엇이든 도입될 수 있다. 예컨대 뿌리털 발달과 관련된 유전자로서 벼의 ROOT HAIRLESS1, EXPA17 등이 도입될 수 있다. 또한, 뿌리털의 발달에 관여하는 CSLD1이나 양분 흡수에 관여하는 OsPT1 유전자들이 도입될 수 있으며, 이러한 외래 유전자에 관한 예시로 도입가능한 유전자의 종류가 한정되는 것은 아니다. For plants to grow, the absorption of nutrients and water is important and their role is dominated by root hair. In addition, it plays a role of fixing plants and synthesizing secondary metabolites. Thus, the foreign gene can be introduced whatever is related to the aforementioned function of the root hair and the characteristics of the root hair. For example, ROOT HAIRLESS1 , EXPA17, etc. of rice can be introduced as a gene related to root hair development. In addition, CSLD1 involved in the development of root hair and OsPT1 genes involved in nutrient absorption can be introduced, and examples of such foreign genes are not limited to the types of genes that can be introduced.
상기 발현벡터는 통상의 벡터에 본 발명의 프로모터를 도입한 것일 수 있으며, 이처럼 본 발명의 프로모터를 도입하여 발현벡터를 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 방법에 따라 용이하게 실시 가능하다.The above expression vector may be one in which the promoter of the present invention is introduced into a conventional vector, and the expression vector may be prepared by introducing the promoter of the present invention into such a manner as will be readily apparent to those skilled in the art. It is possible.
또한 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포를 제공한다. The present invention also provides a transformed cell transformed with said vector.
상기한 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.Such recombinant vectors may be introduced into host cells cultured using well known techniques such as infection, transfection, transfection, electroporation and transformation. Representative examples of the host include bacterial cells such as E. coli, Streptomyces and Salmonella typhimurium cells; And plant cells.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 임의의 식물 세포가 이용가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 줄기, 잎, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.Any plant cell can be used as "plant cell" used for transformation of a plant. The plant cell may be any type of cultured cell, cultured tissue, cultured organ or whole plant, preferably cultured cell, cultured tissue or culture organ, and more preferably cultured cell. "Plant tissue" refers to a tissue of a differentiated or undifferentiated plant, such as, but not limited to, stem cells, leaves, cancer tissues, and various types of cells used in culture, such as single cells, protoplasts, Callus tissue.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터 또는 상기 형질 전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물을 제공한다. 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물은 단자엽 식물체에 외래 유전자를 도입하여 단자엽 식물체의 뿌리털에서 외래 유전자의 발현을 우선적으로 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 단자엽 식물체는 본 발명의 일 실시양태에 따른 벼(Oryza sativa)를 포함하여 단자엽 식물로 구분되는 식물체 모두를 제한 없이 포함한다. 본 발명에 있어서, 뿌리털 우선적 발현 유도는 단자엽 식물체의 뿌리털에 우선적 발현을 의미한다. The present invention also provides a composition for inducing preferential expression of the expression vector or a foreign gene comprising the transformed cell. The composition for inducing the primary expression of the root hair can induce the expression of the foreign gene preferentially in the root hair of the terminal leaf by introducing the foreign gene into the terminal leaf. In the present invention, the monocotyledonous plant includes, without limitation, all of the monocotyledonous plants including rice (Oryza sativa) according to one embodiment of the present invention. In the present invention, induction of preferential expression of the root hair means the preferential expression in the root hair of the terminal plant.
또한 본 발명은 상기 벡터, 상기 형질전환 세포 또는 이를 포함하는 외래 유전자의 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물로 형질 전환된 단자엽 식물체를 제공하며, 바람직하게 단자엽 식물체는 벼이다. 이러한 형질 전환 단자엽 식물체는 도입된 외래 유전자가 단자엽 식물체 뿌리털에 우선적으로 발현되는 특성을 나타낸다. The present invention also provides a terminal plant transformed with the vector, the transformed cell or a composition for inducing preferential expression of the root of the transformed cell or a foreign gene comprising the same, wherein the terminal plant is preferably rice. These transgenic monocotyledonous plants exhibit the preferential expression of introduced foreign genes in the terminal plant root hair.
"본 발명의 형질전환 단자엽 식물체"와 "기능적으로 동등한 형질전환 단자엽 식물체"는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 변이체와 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 이용하여 제조된 형질 전환 단자엽 식물체로써, 단자엽 식물체 전신에서 프로모터 효과가 실질적으로 동등한 특징을 가지는 형질전환 단자엽 식물체이다.65%, 70%, 75%, 80% or more of the variants of the nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 "and" functionally equivalent transgenic plant of the present invention " , 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology As a terminal plant, it is a transgenic terminal plant having a characteristic that the promoter effect is substantially equivalent in the whole plant of the terminal plant.
본 발명의 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D.et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen.Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 이러한 변이체는 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.Transformation of a plant of the present invention can be carried out by any method known in the art for transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. For example, the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373) (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. (Klein et al., 1987, Nature 327, 70), infiltration of plants or mature pollen of various plant elements (DNA or RNA-coated) And infection by (non-integrative) viruses in Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (EP 0301316). Such mutants can be easily produced by molecular biological methods well known in the art.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터로 단자엽 식물체를 형질 전환시켜 외래 유전자를 단자엽 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는, 외래 유전자를 뿌리털 우선적으로 발현하는 형질 전환 단자엽 식물체의 제조 방법을 제공한다. The present invention also encompasses a step of transfecting a monocotyledonous plant with a vector comprising a promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a foreign gene operably linked thereto, and expressing the foreign gene in the monocotyledonous plant Which expresses a foreign gene in the root of the plant.
바람직하게, 상기 발현 벡터 또는 상기 형질 전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 단자엽 식물체 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물을 제조하는 단계; 단자엽 식물체에 상기 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 조성물이 도입되어 단자엽 식물체 뿌리털에 외래유전자가 우선적 발현되는 형질전환 단자엽 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 형질 전환 단자엽 식물체의 제조 방법을 제공한다. Preferably, the method comprises the steps of: preparing a composition for inducing preferential expression of a terminal plant of a terminal plant of a foreign gene comprising the expression vector or the transformed cell; Introducing said composition into a terminal plant; And selecting the transgenic monocotyledonous plants to which the composition is introduced and in which the foreign gene is preferentially expressed in the terminal root of the monocotyledonous plant.
본 발명의 프로모터는 뿌리털에 우선적으로 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터로써, 뿌리털 형질 개선에 필요한 유전자 발현을 조절하여 벼를 포함하는 단자엽 식물 내지 주요 곡물의 뿌리털에 의한 양분의 흡수능 증진 등의 뿌리털 형질 개선에 유용하게 이용될 수 있다.The promoter of the present invention is a promoter capable of preferentially expressing a foreign gene in root hair, and it can regulate gene expression necessary for improvement of root hair characteristic, and thus, it is possible to control the root expression of nutrients And can be usefully used for improvement.
도 1은 히트맵(heatmap)으로 뿌리털에서 우선적 발현을 보이는 분리된 유전자와 그 발현 양상을 나타내는 도이다.
도 2는 LOC_Os02g46500 유전자의 뿌리털에서 우선적 발현을 나타내는 마이크로 어레이 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 LOC_Os02g46500 프로모터와 유전자의 일부를 포함하는 GUS 식물체 제조를 위해 사용한 벡터의 다이어그램을 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환 식물체에서 LOC_Os02g46500 프로모터가 뿌리털에서 우선적으로 발현을 보이는 GUS 염색 결과를 나타내는 도이다.Fig. 1 is a heat map showing the isolated gene showing preferential expression in the root hair and its expression pattern.
2 is a diagram showing a microarray result showing preferential expression in the root hair of the LOC_Os02g46500 gene.
Figure 3 is a diagram of a vector used for the production of GUS plants containing the LOC_Os02g46500 promoter and part of the gene.
Fig. 4 is a diagram showing the result of GUS staining showing that the LOC_Os02g46500 promoter in the transgenic plant expresses preferentially in the root hair.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 아래의 실시예는 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following embodiments are only examples for helping understanding of the invention, and thus the scope of the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 뿌리털에 우선적으로 발현되는 벼 유전자 대량 선별 1> Large-scale selection of rice genes preferentially expressed in root hair
뿌리털에 우선적으로 발현하는 유전자를 선별하기 위하여, 벼의 뿌리털을 사용하여 어질런트 어레이 (agilent array)를 수행하였으며, 공개된 마이크로어레이 데이터베이스인 NCBI GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 벼 어질런트 (agilent) 자료인 GSE21494와 병합하여 검토를 수행하였다. 이를 이용하여 뿌리털을 포함한 14개 기관별/조직별로 유전자 발현 분석이 가능하다.In order to select genes expressing preferentially in the root hair, an agilent array was carried out using the root hair of rice, and an open microarray database NCBI GEO (http://www.ncbi.nlm.nih. gov / geo /) with the agilent data GSE21494. Using this, it is possible to analyze gene expression by 14 tissues / tissues including root hair.
상기 분석용 데이터 베이스를 표 1에 나타내었다. The above analysis database is shown in Table 1.
표 1. 기관별/조직별로 재구성된 유전자 발현 분석용 데이터베이스Table 1. Database for gene expression analysis reconstructed by institution / organization
K-means clustering 분석 방법을 이용하여, 상기 표 1에 제시된 유전자 발현 분석용 데이터베이스 중 뿌리털에서 발현이 높은 유전자 그룹을 분리하였다. Using the K-means clustering analysis method, gene groups having high expression in the root hair of the database for gene expression analysis shown in Table 1 were isolated.
이는 마이크로어레이 자료 분석용 소프트웨어인 MeV의 K-means clustering 분석 방법을 사용하여 수행하였으며, 기관별/조직별 발현 분석용 데이터베이스 중 뿌리털에서 발현이 우선적인 409종의 유전자가 분리되었다.This was performed using the K-means clustering analysis method of MeV, a microarray data analysis software, and 409 genes having preferential expression in the root hair among the databases for expression / organization-specific expression analysis were isolated.
그 결과를 도 1에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 1에 나타낸 바와 같이, 노란색에 가까울수록 강한 발현을 보이는 유전자에 해당하며 파란색에 가까울수록 발현이 낮아지게 된다. 뿌리털은 뿌리에 포함되는 기관이므로 뿌리털에서 발현이 뿌리보다 2배 높은 유전자들은 뿌리에서 발현이 보이더라도 뿌리털 우선적인 유전자로 분류되었다. 즉, 14개 기관별/조직별 데이터베이스에서 뿌리털에서 우선적 발현을 보인 409종의 유전자를 확인하였다.As shown in Fig. 1, a gene which shows stronger expression toward yellow is closer to blue, and the expression becomes lower toward blue. Since the root hair is an organ contained in the root, the genes whose expression in the root hair is two times higher than the root are classified as the root-dominant gene even if they are expressed in the root. In other words, we identified 409 genes that showed preferential expression in root hair in 14 institutions / organization databases.
<< 실시예Example 2> 마이크로 어레이 데이터 분석을 통한 조직별 발현 분석 2> Analysis of tissue expression by microarray data analysis
마이크로어레이 데이터베이스 분석을 통한 LOC_Os02g46500 유전자의 조직별 발현 양상을 분석하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. The expression pattern of LOC_Os02g46500 gene was analyzed by microarray database analysis and the results are shown in FIG.
도 2에 나타낸 바와 같이, 뿌리털 조직에서 노란색을 띄는 것을 확인 할 수 있으며, 이는 LOC_Os02g46500 프로모터에 의한 유전자의 조직별 발현이 뿌리털 우선적으로 일어남을 보여준다. As shown in FIG. 2, it can be confirmed that the root tissue has a yellow color, indicating that the expression of the gene by the LOC_Os02g46500 promoter is preferentially in the root.
<< 실시예Example 3> 뿌리털 우선적 발현을 위한 프로모터의 3> promoter for preferential expression of root hair 클로닝Cloning
LOC_Os02g46500의 프로모터를 클로닝하기 위하여 작성된 프라이머들과 동진 벼 (Oryza sativa L. japonica cultivar-group) 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. 주형 DNA는 100 ng로 사용하였고, 각 프라이머는 5 pmol로 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분 후; 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 68℃에서 300초를 4회 반복한 후; 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 68℃에서 300초를 35회 반복하고 마지막으로 68℃, 10분으로 하였다. PCR 산물은 전기영동하여 크기를 확인하고, pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다. 클로닝한 DNA를 Hpa1과 Xba1으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 pGA3519 벡터(promoter-GUS cloning용 벡터)와 라이게이션을 14℃에서 12시간 진행하였다. 라이게이션 산물을 Top10 E.coli 컴피턴트 셀 200㎕과 혼합하여 1.5 ml 튜브에 옮긴 다음 얼음에 15분 방치하였다. 이어서, 37℃ 오븐에 1분을 다시 방치한 후 1 ml의 LB 액체 배지를 추가로 튜브에 넣은 다음 3시간 동안 37℃ 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체 배지에 도말하고 12시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1mL의 LB 액체 배지에서 세포 배양 후 미니 프렙하였다. 미니 프렙으로 얻은 DNA를 제한 효소 Hpa1과 XbaI을 사용하여 효소 절단 후 전기영동에서 아가로즈 젤을 분리하고 밴드를 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 클로닝 DNA를 다시 염기 서열 분석을 하여 에러가 발생하지 않은 DNA를 선택하였다. 염기서열 분석은 capillary sequencing 법으로 하였으며(마크로젠 의뢰), 염기서열분석은 NGUS1과 프로모터 내 서열을 이용한 프라이머들을 사용하였다.PCR was performed using the primers prepared to clone the promoter of LOC_Os02g46500 and the genomic DNA of Oryza sativa L. japonica cultivar-group. Template DNA was used at 100 ng and each primer was used at 5 pmol. PCR conditions were 5 min at 95 ° C; Repeating 4 times at 95 캜 for 30 seconds, at 56 캜 for 30 seconds and at 68 캜 for 300 seconds; 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 62 ° C, and 300 seconds at 68 ° C for 35 times and finally 68 ° C for 10 minutes. The PCR product was electrophoresed to confirm its size and cloned into a pGEM T-EG vector and sequenced. The cloned DNA was digested with Hpa1 and Xba1, followed by ligation with a pGA3519 vector (vector for promoter-GUS cloning) digested with the same restriction enzyme at 14 DEG C for 12 hours. The ligation product was mixed with 200 [mu] l of Top10 E. coli competent cells, transferred to a 1.5 ml tube, and left on ice for 15 minutes. Subsequently, the plate was allowed to stand in a 37 ° C oven for 1 minute, and then 1 ml of LB liquid medium was further placed in the tube and left in a 37 ° C shaking incubator for 3 hours. Then, the cells were plated on tetracycline-resistant LB solid medium and the resulting colonies were awaited for 12 hours and then mini-prepared after cell culture in 1 mL of LB liquid medium. The DNA obtained as miniprep was digested with restriction enzymes Hpa1 and XbaI, and the agarose gel was separated by electrophoresis and the band was confirmed. The cloning DNA thus obtained was subjected to base sequence analysis again to select DNA that did not cause an error. Nucleotide sequencing was performed by capillary sequencing (Macrogen), and primers using NGUS1 and promoter sequences were used for the nucleotide sequence analysis.
프로모터 클로닝용 프라이머 및 염기 서열 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.Primers for promoter cloning and primers used for base sequence analysis are shown in Tables 2 and 3 below.
표 2. LOC_Os02g46500의 프로모터 클로닝용 프라이머Table 2. Primers for cloning promoter of LOC_Os02g46500
표 3. 염기 서열 분석을 위한 프라이머Table 3. Primers for sequencing
상기에서 분석된 서열을 서열번호 1에 나타내었으며, LOC_Os02g46500의 -1522부터 +750까지의 프로모터영역과 첫 번째 exon의 일부를 포함하는 영역이 프로모터 서열로 사용되었다. The sequence analyzed in the above is shown in SEQ ID NO: 1, and a promoter region from -1522 to +750 of LOC_Os02g46500 and a region including a part of the first exon were used as a promoter sequence.
<< 실시예Example 4> 형질전환 세포의 제작 4> Production of transformed cells
상기 실시예 3에서 제작한 식물 발현용 벡터를 추출하였다.The plant expression vector prepared in Example 3 was extracted.
아그로박테리움 컴피턴트 셀(Agrobacterium tumefaciens LB4404) 50㎕와 2㎍의 식물발현용 벡터를 혼합하여 얼음에 15분 방치하였다. 이어서, 액체질소에 75초 넣은 후, 37℃ 오븐에 5분을 다시 방치한 후 1 ml의 LB 액체 배지를 넣은 다음 3시간 동안 28℃ 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체 배지에 도말하고 36시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1mL의 LB 액체 배지에서 세포 배양 후 미니 프렙한 후, Hpa1과 Xba1을 사용하여 효소 절단 후 사이즈를 확인하였다.50 아 of Agrobacterium tumefaciens LB4404 and 2 의 of plant expression vector were mixed and left on ice for 15 minutes. Subsequently, the substrate was placed in liquid nitrogen for 75 seconds. Then, the substrate was allowed to stand in an oven at 37 ° C for 5 minutes. Then, 1 ml of LB liquid medium was added thereto, followed by incubation in a 28 ° C shaking incubator for 3 hours. Then, the cells were plated on a tetracycline-resistant LB solid medium and incubated for 36 hours. The resulting colonies were cultured in 1 mL of LB liquid medium, mini-preparations were performed, and Hpa1 and Xba1 were used to confirm the size after enzymatic cleavage.
상기 생성된 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 벼의 형질 전환 실험에서 사용하였다.The resulting transformed Agrobacterium was used for transgenic rice transformation experiments.
<< 실시예Example 5> 형질전환 식물체의 제작 5> Production of Transgenic Plants
N6D 고체 배지에서 동진벼 종자를 7일 정도 28℃ 생장실에서 키워서 벼의 캘러스를 생성하였다. 생성된 캘러스를 상기 실시예 3에서 얻은 식물 발현용 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움을 72시간 키운 세포와 혼합하여 N6D-Acetosyringone 을 포함한 배지에서 22℃ 암처리 생장실에 방치하였다.In the N6D solid medium, Dongjinbyeon seeds were grown in a 28 ℃ growth chamber for 7 days to produce calli of rice. The resulting callus was mixed with the cells cultured for 72 hours with Agrobacterium transformed with the plant expression vector obtained in Example 3, and then placed in a culture medium containing N6D-Acetosyringone at a temperature of 22 占 폚.
아그로박테리움에 오염된 캘러스를 3차 증류수로 깨끗이 5번 정도 헹구어 낸 다음 N6D 고체 배지에서 hygromycin 선발을 1차(hygromycin 30 mg/L), 2차 (hygromycin 40 mg/L)에 걸쳐서 계대 배양을 통해 진행하였다. 선발은 28℃ 생장실에서 각각 2주 씩 합해서 4 주 동안 이루어졌다. 분열된 캘러스를 재분화 배지인 MSR (hygromycin 40 mg/L) 고체배지에 옮겨 4주 28℃ 광조건 생장실에서 재분화를 유도한 후, 식물체를 MS 고체 배지로 옮기고 7일 28℃ 광조건 생장실에서 키우고 온실로 옮겨서 재분화 식물체를 키웠다.The callus contaminated with Agrobacterium was rinsed 5 times with tertiary distilled water. Subsequently hygromycin selection was performed in N6D solid medium (hygromycin 30 mg / L) and subculture (hygromycin 40 mg / L) . Selection was made in the 28 ℃ growth room for 2 weeks each for 4 weeks. The divided callus was transferred to the MSR (hygromycin 40 mg / L) solid medium for regeneration and induced to regenerate in a light condition growth chamber for 4 weeks at 28 ° C. The plants were transferred to MS solid medium, grown in a light condition growth room for 7 days, To grow regenerated plants.
<< 실시예Example 6> 형질전환 식물체를 이용한 뿌리털 우세한 발현 검증 6> Validation of predominant expression of root hair using transgenic plants
재분화된 식물체의 기관 특이적 GUS 발현을 확인하기 위하여, 수확한 종자를 10개씩 28℃에서 7일간 배양한 후 모든 개체를 GUS 염색 처리하였다.In order to confirm the organ specific GUS expression of regenerated plants, 10 seeds harvested were cultured at 28 ° C for 7 days and all individuals were stained with GUS.
GUS 용액은 0.5M sodium phosphate buffer 200ml, 12.5mM potassium ferricyanide 100ml, 12.5mM potassium ferrocyanide 100ml, 0.5M EDTA 20ml, 10% Triton X-100 50ml, 10ml 의 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹인 X-gluc 1g과 Methanol 200ml을 넣고 증류수로 1L의 부피를 맞추어 제조되었다. 각 계통의 식물체를 모두 15ml의 GUS 염색액에 24시간 처리한 후 70% 에탄올과 100% 에탄올을 순차적으로 이용하여 상온에서 탈색하였다.The GUS solution was prepared by mixing 200 ml of 0.5 M sodium phosphate buffer, 100 ml of 12.5 mM potassium ferricyanide, 100 ml of 12.5 mM potassium ferrocyanide, 20 ml of 0.5 M EDTA, 50 ml of 10% Triton X-100, 1 g of X-glucin dissolved in 10 ml of DMSO, 200 ml of distilled water was added to make 1 L volume. Each plant was treated with 15 ml of GUS staining solution for 24 hours, followed by decolorization at room temperature using 70% ethanol and 100% ethanol sequentially.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (A)는 발아 후 7일째의 식물체 뿌리를 나타내며, (B)는 뿌리털을 자세히 관찰한 사진이다.The results are shown in Fig. Fig. 4 (A) shows plant roots on day 7 after germination, and Fig. 4 (B) shows photographs of root hair closely observed.
도 4에 나타낸 바와 같이, 형질전환 식물체들은 다른 부위에서 GUS 발현이 약한 것과는 달리 뿌리털에서 우세한 GUS발현은 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 4, it was confirmed that the transgenic plants showed predominant GUS expression in root hair, unlike GUS expression in other regions.
상기 도 2 및 도 4의 결과를 토대로 LOC_Os02g46500의 프로모터는 뿌리털 우선적으로 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. Based on the results of FIG. 2 and FIG. 4, it was confirmed that the promoter of LOC_Os02g46500 was preferentially expressed in root hair.
즉, 상기 분석 결과를 통해 LOC_Os02g46500의 유전자의 -1522부터 +750까지의 프로모터영역과 첫 번째 exon의 일부를 포함하는 서열이 뿌리털 우선적 발현 프로모터로 작용할 수 있음을 확인하였다. That is, it was confirmed from the above analysis result that the sequence including the promoter region from -1522 to +750 and the part of the first exon of the gene of LOC_Os02g46500 could act as a root hair preferential expression promoter.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A root hairs specific promoter and use thereof <130> P16-053-KHU <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2272 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(2272) <400> 1 aagtgacact ctgagattac aaatgtgtgc actcaattct gaaactgcat gcttgttcca 60 accggatttc ccagctcaat tcaactttca accgtttgat ctgaaatgga tagttgcaac 120 cgaactccat aagattgacc tgcagtcatc tatgtaatcc attcatcccc agtttcaaag 180 tcattgcaaa gatcaggtaa accttgtaac ggaggaatcc caagatgaag atatcaaatc 240 tttgagatac tctagcctat ggttggatct ttaggtaaca agaaatttac aggagaaatc 300 acttgtacga ctagcacgat ctcttggcag attagtacga agcatctgat gatatattat 360 aatggcttta cgatcggtga taattcttag gatgcatttt atatgtgcat tagtcaacgt 420 ctggaatgat tcttagcgat catgagctgc gtttaaatag tcctttgata aatttttttt 480 caaggatttg aaagccatct gcttgtgacg tacctactgg ctactgagat acgaatcgca 540 ttacagggtc aatgcgaaca tgatctgaga ggtatagtgc gttccatgta tacttatgca 600 tcctcagatc agagagtttt tctattggtg tattgcacgt tagctcagcg tacacaattg 660 tgcaaacaaa acataatcac ctttctaatt attttcgtct gcatcactgc aaagacgttt 720 gagattttca gtacggaatc cgttcttgaa aggaaatggt atcttgttct tgacttgtaa 780 atgttaagaa ctttcggcgt ttgacttgag caagtggtgg tatcttactt gtttactccg 840 aggagcttag agcgcgcgcg tctcacttct aggacaggaa acatcgtcgt gcgaagcgct 900 caaccgcctg caactaaaat catatgaact gtaagcaaaa gagttcaaca atatacagcc 960 ttgcaagaga aaagcatgaa aatccttaaa aatcaacacc aataatcgga agatatctgc 1020 cgtccacacc caaagtgtct gccgtctcca tttaacaatt catgatatgc atatcacatt 1080 tgtcattttc ttatgttttt tgttttaaat taataccatg catattgcat agtctcctcc 1140 taactactcc agtaaaattt aattagtgga gatattagga ttgcacttgg tcatcatttg 1200 tcaagtatgg ccacaaacat ttccaatttc catcagattt atggatgtgg catggcatac 1260 atatctcgaa aaatactaca taatactata tactatgttt tagaaaatgg aaatgttttg 1320 cacgtcactt gaaaaagtcc aatttacagg tcacatcaag cttccatgag accatgacct 1380 tctcaccact aattgcaagc atctcttacc tttgactatt gacttgcaca cttgccagcc 1440 catatgcccc tacaagtata tataatgagc ccaccgtgtc attacttgct cagcttcagc 1500 tctgtgactg cgacgcgaac ccatggccgc catggacgag cctcctcagc tattcctctg 1560 cccgatctcc atggagctca tggaggatcc ggtgacggtg tccaccggcg tgacgtacga 1620 ccgccggagc atcgaggagt ggctcttcgt ctacggccgg accacctgcc cggccaccat 1680 gcagcctctc tccaacttcg acctcactcc caaccacact ctcaagcgcg tcatctcgtc 1740 gtggctcgat cgcggctcgt cgtcgtcgtc gtcttcgtcg ccgtcgacgt cgacgctgtc 1800 gagcccgatc cacgagctgg cgacgccgct gtcgcgcgcg ctggagcagg agcggttgct 1860 ggctgcgctg gccgagctgg aggagacgcc gttcaaggtg accaagctga agagcatgag 1920 ggcccgcatg gcgggcgacg tggcaatgca gggggagttc gtcgcctcgg gcggggtgcg 1980 cgtggtgggg cgcgtgatgg cgcaggcgct ggcggagagc ggcggcgact tctcggcgtt 2040 cgccgcgtgc gaggaggctg ccgcggtgct cgccgcgctc ccgctctcgg acgaggcgtc 2100 ggtgcgggtc gtccttgcgc cggagtgcat caggcccgtc atggcgctgc tccagcgcgg 2160 cggcgccgag gcgaggctgc acgccatgga catcctcacc aagatctcca gctccggatc 2220 aggcggcgac tggaccgccg gcgtcgacat cgacgacgtg atcaagtccc tc 2272 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 proF hpa1 <400> 2 gttaacaagt gacactctga gattac 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 proR XhaI <400> 3 tctagacgga gggacttgat cacgtcgt 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGUS1 <400> 4 aacgctgatc aattccacag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 seq1 <400> 5 cttcagctct gtgactgcga 20 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A root hairs specific promoter and use thereof <130> P16-053-KHU <160> 5 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 2272 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter ≪ 222 > (1) .. (2272) <400> 1 aagtgacact ctgagattac aaatgtgtgc actcaattct gaaactgcat gcttgttcca 60 accggatttc ccagctcaat tcaactttca accgtttgat ctgaaatgga tagttgcaac 120 cgaactccat aagattgacc tgcagtcatc tatgtaatcc attcatcccc agtttcaaag 180 tcattgcaaa gatcaggtaa accttgtaac ggaggaatcc caagatgaag atatcaaatc 240 tttgagatac tctagcctat ggttggatct ttaggtaaca agaaatttac aggagaaatc 300 acttgtacga ctagcacgat ctcttggcag attagtacga agcatctgat gatatattat 360 aatggcttta cgatcggtga taattcttag gatgcatttt atatgtgcat tagtcaacgt 420 ctggaatgat tcttagcgat catgagctgc gtttaaatag tcctttgata aatttttttt 480 caaggatttg aaagccatct gcttgtgacg tacctactgg ctactgagat acgaatcgca 540 ttacagggtc aatgcgaaca tgatctgaga ggtatagtgc gttccatgta tacttatgca 600 tcctcagatc agagagtttt tctattggtg tattgcacgt tagctcagcg tacacaattg 660 tgcaaacaaa acataatcac ctttctaatt attttcgtct gcatcactgc aaagacgttt 720 gagattttca gtacggaatc cgttcttgaa aggaaatggt atcttgttct tgacttgtaa 780 atgttaagaa ctttcggcgt ttgacttgag caagtggtgg tatcttactt gtttactccg 840 aggagcttag agcgcgcgcg tctcacttct aggacaggaa acatcgtcgt gcgaagcgct 900 caaccgcctg caactaaaat catatgaact gtaagcaaaa gagttcaaca atatacagcc 960 ttgcaagaga aaagcatgaa aatccttaaa aatcaacacc aataatcgga agatatctgc 1020 cgtccacacc caaagtgtct gccgtctcca tttaacaatt catgatatgc atatcacatt 1080 tgtcattttc ttatgttttt tgttttaaat taataccatg catattgcat agtctcctcc 1140 taactactcc agtaaaattt aattagtgga gatattagga ttgcacttgg tcatcatttg 1200 tcaagtatgg ccacaaacat ttccaatttc catcagattt atggatgtgg catggcatac 1260 atatctcgaa aaatactaca taatactata tactatgttt tagaaaatgg aaatgttttg 1320 cacgtcactt gaaaaagtcc aatttacagg tcacatcaag cttccatgag accatgacct 1380 tctcaccact aattgcaagc atctcttacc tttgactatt gacttgcaca cttgccagcc 1440 catatgcccc tacaagtata tataatgagc ccaccgtgtc attacttgct cagcttcagc 1500 tctgtgactg cgacgcgaac ccatggccgc catggacgag cctcctcagc tattcctctg 1560 cccgatctcc atggagctca tggaggatcc ggtgacggtg tccaccggcg tgacgtacga 1620 ccgccggagc atcgaggagt ggctcttcgt ctacggccgg accacctgcc cggccaccat 1680 gcagcctctc tccaacttcg acctcactcc caaccacact ctcaagcgcg tcatctcgtc 1740 gtggctcgat cgcggctcgt cgtcgtcgtc gtcttcgtcg ccgtcgacgt cgacgctgtc 1800 gagcccgatc cacgagctgg cgacgccgct gtcgcgcgcg ctggagcagg agcggttgct 1860 ggctgcgctg gccgagctgg aggagacgcc gttcaaggtg accaagctga agagcatgag 1920 ggcccgcatg gcgggcgacg tggcaatgca gggggagttc gtcgcctcgg gcggggtgcg 1980 cgtggtgggg cgcgtgatgg cgcaggcgct ggcggagagc ggcggcgact tctcggcgtt 2040 cgccgcgtgc gaggaggctg ccgcggtgct cgccgcgctc ccgctctcgg acgaggcgtc 2100 ggtgcgggtc gtccttgcgc cggagtgcat caggcccgtc atggcgctgc tccagcgcgg 2160 cggcgccgag gcgaggctgc acgccatgga catcctcacc aagatctcca gctccggatc 2220 aggcggcgac tggaccgccg gcgtcgacat cgacgacgtg atcaagtccc tc 2272 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 proF hpa1 <400> 2 gttaacaagt gacactctga gattac 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 proR XhaI <400> 3 tctagacgga gggacttgat cacgtcgt 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGUS1 <400> 4 aacgctgatc aattccacag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os02g46500 seq1 <400> 5 cttcagctct gtgactgcga 20
Claims (8)
서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 외래 유전자의 뿌리털 우선적 발현 유도용 조성물을 제조하는 단계;
단자엽 식물체에 상기 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 조성물이 도입되어 단자엽 식물체 뿌리털에 외래유전자가 우선적으로 발현되는 형질전환 단자엽 식물체를 선별하는 단계.A method for producing a transgenic monocotyledonous plant wherein the foreign gene is preferentially expressed in the root of the monocotyledonous plant comprising the steps of:
Preparing a composition for inducing preferential expression of a foreign gene of a foreign gene, the vector comprising a promoter consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a foreign gene operatively linked thereto;
Introducing said composition into a terminal plant; And selecting the transgenic monocotyledonous plants to which the composition is introduced and the foreign gene is preferentially expressed in the root of the monocotyledonous plant.
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