KR101639880B1 - A seed preferential promoter in monocotyledones and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단자엽 식물의 종자 우선적 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터는 벼의 종자의 형질 개선에 필요한 유전자 발현을 우선적으로 조절하여 벼를 포함하는 주요 곡물의 종자 성분을 개량하거나, 종자의 환경 스트레스에 대한 내성을 증대시키는 등 종자 작물의 농업적 형질을 개량하는데 이용될 수 있다.The present invention relates to seed-preferential promoters of monocotyledonous plants and their uses.
The promoter of the present invention is a promoter that regulates gene expression necessary for improvement of the trait of rice seeds to improve the seed composition of the main cereals including rice and increase the tolerance to environmental stress of seeds, Lt; / RTI >
Description
본 발명은 단자엽 식물의 종자 우선적 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to seed-preferential promoters of monocotyledonous plants and their uses.
벼(Oryza sativa)는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여년 동안 꾸준히 수량 증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70% 이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화 현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용 유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용 유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 유용 유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로서 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에는 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.Rice (Oryza sativa) is one of the most important food crops in the world. It has been steadily increasing its yields over the past two decades, but by 2020 it will have to produce more than 70% have. However, the agricultural land where rice is cultivated is getting smaller and smaller as the industrialization phenomenon of each country in the world, and the new genetic resource which is the subject of breeding is depleted and the introduction of the foreign useful gene is required. Fortunately, the development of molecular biology has enabled the isolation and manipulation of exogenous useful genes, transforming useful genes into many plant cells, including rice, to obtain transformants with new genes, Research has become a good source of breeding as well. The production of new varieties using this transformation will not only lead to a high value-added industry in the coming 21st century, but will also solve some of the food problems that are the biggest problem of humanity.
현재까지 알려진 형질전환 방법으로, 80년대 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽 식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium) 이용법도 많이 이용되고 있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다.Many transgenic plants have been obtained by using polyethylene glycol (PEG) and electroporation in the protoplasts of the 1980s as a known transformation method. In the late 1990s, Agrobacterium, which has been widely used in the art, is also widely used. Other methods include pollen pathway and microinjection method.
프로모터는 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신 또는 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성할 수 있으며, 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.The promoter can achieve the transformational purpose by locating the expression of the foreign gene only at the whole body of the plant or a specific tissue, and can be classified as follows according to its function.
첫째로 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C 유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(참조: 등록번호 10-0429335). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체 내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.First, systemic expression-inducible promoters can be mentioned. As a plant systemic expression-inducing promoter, a promoter of 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus (CaMV) is used as a typical promoter for dicotyledonous plants. Actin and maize ubiquitin gene promoters have been mainly used as promoters for the expression of the whole plants in rice plants and rice plants. Recently, a promoter of the rice cytochrome C gene (OsOc1) has been developed by domestic researchers, (Cf. Reg. No. 10-0429335). They are already inherent in inducing the expression of antibiotics, herbicide resistance genes and reporter genes used as selection markers in the plant transgenic carrier. From a research point of view, Promoters considered.
둘째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터 등이 있다.Second, other tissue-specific promoters such as leaves may be mentioned. (RbcS: ribulose bisphosphate carboxylase / oxygenase small subunit) promoter which induces expression of a strong gene only in photosynthetic tissues such as leaves, RolD promoter inducing expression of plant roots derived from Agrobacterium, potato-derived tuber A specific expression-inducible patatin promoter, and a tomato-derived fruit maturation-specific expression-inducing PDS (phytoene synthase) promoter.
셋째로 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록(대한민국 등록번호 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바 있다.Third, it is a root specific expression promoter. (IbMADS) and sugar-induced adipose-glucose pyrophosphatase (AGPase) genes were isolated from the sweet potato-derived rice paddy rice, and the peroxidase (prxEa) (Korean Registration Nos. 10-0604186 and 10-0604191), confirming that the promoter induces specific expression in roots and induces root-specific transient expression in carrot and radish.
넷째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼에서는 종자 배유 저장단백질인 gluterin, prolamin, globulin 및 albumin 유전자의 포로모터를 배유 우선적 유전자 발현을 위해 사용하고 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다. 그러나 이 모두가 저장 단백질의 프로모터인 관계로 활용에 있어서 잠재적 제약이 예상된다. 따라서 다양한 배유 연관 형질의 최적화를 위해서는 이의 활용에 필요한 배유 우선적 프로모터의 다양화가 필요하다.Fourth, seed-specific promoters can be mentioned. As a representative example, captor motor of gluterin, prolamin, globulin and albumin genes, seed-storage proteins in rice, are used for expression of preferential gene expression in rice. The seed-specific promoters are mainly used for the purpose of accumulating useful proteins and producing beneficial substances in major crops in which seed itself is used as a food, a food, or a raw material for food. However, since all of these are promoters of the storage proteins, potential limitations in their application are anticipated. Therefore, in order to optimize a variety of endosperm-related traits, it is necessary to diversify the endogenous promoters necessary for its use.
그 외에도 현재 개발이 계속 진행 중이지만, 개발자의 의도에 따라 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터, 예컨대 특정한 기관(꽃잎, 뿌리, 잎, 줄기, 종자 등)에서만 발현되어야 하는 유전자(예, 화색, 응성 불임, 화형, 특정 대사관련 물질, 방어물질, 종자의 생성 발달 등)를 형질 전환시킬 경우, 특정 기관이나 시기에만 작동하는 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.In addition, although the development is currently underway, new promoters that can control the location of gene expression more precisely according to the intention of the developer, for example, genes that should be expressed only in specific organs (petals, roots, leaves, stems, Promoting activity to be performed only in specific organs or periods needs to be continuously developed when transforming plants, flowers, infertility, burning, specific metabolism-related substances, defensive substances, seed production and the like.
본 발명은 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신이 아닌 종자에 국한하여 발현시킬 수 있는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포, 이 발현 벡터 또는 형질전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 종자 우선적 발현 유도용 조성물, 이로 형질전환된 단자엽 식물체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다. The present invention relates to a method for producing a recombinant vector, which comprises expressing a foreign gene by expressing the expression of the foreign gene locally to a non-systemic plant, an expression vector containing the promoter, a transformed cell transformed with the expression vector, A composition for inducing seed-preferential expression of a foreign gene, a transgenic transgenic plant, and a method for producing the transgenic plant.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 식물의 조직 또는 기관 우선적인 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터들을 발굴함으로써, 식물의 특정 조직 또는 기관에 국한시켜 목적 유전자를 우선적으로 발현 또는 저해할 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 이 과정에서 벼의 LOC_Os05g23910의 프로모터가 잎, 뿌리 등의 기관에서는 발현되지 않고 종자에서 우선적으로 발현이 이루어짐을 확인하였고, 이에 따라 상기 프로모터를 확보하여 이를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 이를 식물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체에서 종자에서 우선적으로 리포터 유전자가 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.In order to achieve the above object, the inventors of the present invention have found that promoters capable of regulating plant tissue or organ-preferential gene expression can be identified, thereby allowing preferential expression or inhibition of a target gene by locating it in a specific tissue or organ of a plant System. In this process, it was confirmed that the promoter of LOC_Os05g23910 of rice was not expressed in organs such as leaves and roots, and the expression was preferentially in seeds. Thus, the promoter was secured and an expression vector containing the promoter was prepared, Thus, the present inventors have completed the present invention by confirming that the reporter gene is preferentially expressed in the seeds of the transformant.
보다 상세하게 본 발명자들은 공개된 벼 에피메트릭스(affymetrix) 자료 1150종을 수집하였고, 이들을 17개 기관별로 재분류를 하였다. 에피메트릭스 어레이(affymetrix array)는 한 번의 실험으로 57000 종의 프로브에 의해서 대변되는 유전자 발현을 분석 가능케 하며, 대규모로 수집된 에피메트릭스 어레이(affymetrix array) 자료의 재구성을 통해서 만들어진 기관별 발현 양상은 상당히 높은 재현성을 보여 주었다. 이 자료의 발현 패턴별 분석을 통해서 다양한 기관 및 조직 우선적 유전자들이 분리되었다. 그 중에서 본 발명자들은 종자에서 중요한 형질 발현에 필요한 프로모터 발굴에 관심을 가졌다. In more detail, we collected 1150 species of published rice affymetrix data and reclassified them into 17 organelles. The affymetrix array allows the analysis of gene expression represented by 57,000 probes in a single experiment and the organ-specific expression pattern produced by reconstruction of the large-scale collection of affymetrix arrays is quite high Reproducibility. Through analysis of the expression patterns of these data, various organ and tissue priority genes were isolated. Among them, the present inventors have been interested in finding promoters necessary for expressing important traits in seeds.
상기 방법을 통해서, 300여종의 유전자가 다른 유전자들과 대비하여 종자에서 높은 발현 양상을 보여 주었다. Through this method, more than 300 kinds of genes showed high expression patterns in seeds as compared with other genes.
이러한 유전자에 의해서 조절되는 유전자 발현양상은 이들 프로모터 3' 방향에서 GUS reporter 유전자를 발현시켜 그 활성을 식물체 내에서 측정함으로써 정밀하게 분석되었다. The gene expression pattern regulated by these genes was precisely analyzed by expressing the GUS reporter gene in the 3 'direction of these promoters and measuring its activity in the plant.
염기서열 해독 정보를 참고로 하여 LOC_Os05g23910의 ATG 앞 프로모터 영역을 게놈 DNA PCR를 통해서 분리하고 pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다. With reference to the nucleotide sequence decode information, the ATG forward promoter region of LOC_Os05g23910 was isolated by genomic DNA PCR and cloned into pGEM T-Ease vector to decode the base sequence.
이렇게 분리된 프로모터를 pGA3383 벡터에 넣어, 형질전환된 식물체를 제작하였다. 형질전환된 식물체에서 GUS 반응을 검증함으로써, 해당 프로모터를 이용하여 식물의 종자에서 우선적으로 유전자 발현을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.The thus isolated promoter was inserted into pGA3383 vector to prepare a transformed plant. By verifying the GUS response in the transformed plant, it was found that the promoter can be used to preferentially induce gene expression in the seed of the plant.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 벼의 LOC_Os05g23910의 프로모터를 포함하는 종자에 우선적으로 외래 유전자를 발현시키는 프로모터를 제공한다. The present invention provides a promoter that preferentially expresses a foreign gene in a seed containing a promoter of LOC_Os05g23910 of rice, which is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
프로모터는 유전자의 환경적, 시기적 및 조직적 발현을 조절하는 필수적인 요소로서, 본 발명에 따른 종자 우선적 프로모터를 사용하여 식물체 내에서 외래 유용 유전자의 발현 부위를 종자 우선적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명의 프로모터는 종자의 배유에 우선적으로 외래 유전자를 발현시키는 프로모터이다. A promoter is an essential element for regulating the environmental, temporal, and systemic expression of a gene. Using the seed-preferential promoter according to the present invention, the expression site of the foreign useful gene can be preferentially induced in the plant. According to one embodiment of the present invention, the promoter of the present invention is a promoter that preferentially expresses a foreign gene in the endosperm of seed.
본 발명은 벼의 LOC_Os05g23910의 프로모터로서, 외래 유전자의 발현이 종자에 우선적으로 이루어지도록 유도하는 종자 우선적 프로모터(이하 '본 발명의 프로모터'라 함)를 제공한다.The present invention provides a promoter of LOC_Os05g23910 of rice and a seed-preferential promoter (hereinafter, referred to as 'promoter of the present invention') which induces the expression of foreign genes to be preferentially in seeds.
LOC_Os05g23910은 histone-like transcription factor와 archaeal histone를 암호화하는 것으로 예상되며, 한 개의 exon으로 구성되어 있다. 327개의 아미노산으로 구성된 본 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.LOC_Os05g23910 is expected to encode a histone-like transcription factor and archaeal histone, and is composed of one exon. The promoter of this gene consisting of 327 amino acids has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
또한 본 발명은 상기 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.The invention also provides a vector comprising said promoter and operatively linked foreign genes.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.The term "vector" refers to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which transfers into a cell, which can be cloned and independently reprogrammed in host cells. "Expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. The expression vector may generally be derived from a plasmid or viral DNA, or may contain both elements. Thus, an expression vector refers to a recombinant DNA or RNA construct, such as a plasmid, phage, recombinant virus, or other vector that, upon introduction into an appropriate host cell, results in the expression of the cloned DNA. Suitable expression vectors are well known to those skilled in the art and include those that replicate in eukaryotic and / or prokaryotic cells and those that remain as episomes or that are integrated into the host cell genome.
상기 통상의 벡터는 본 발명의 프로모터를 도입할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하나, 바람직하게는 pCAMBIA계열, pGA계열, pGWB계열, 예컨대, pGA3383, pCAMBIA3301, pCAMBIA3300, pGA3426, pGA3780, pGWB12, pGWB14와 같은 Ti-plasmid 및 이에 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 프로모터 및 외래 유전자를 포함하며 종자 우선적으로 외래 유전자 발현에 현저한 효과를 가진다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명의 벡터는 종자의 배유에 우선적으로 외래 유전자를 발현시키는 벡터이다. Such a vector may be any vector as long as it can introduce the promoter of the present invention. Preferably, the vector may be a vector such as pCAMBIA family, pGA family, pGWB family such as pGA3383, pCAMBIA3301, pCAMBIA3300, pGA3426, pGA3780, pGWB12, pGWB14 Ti-plasmid, and vectors derived therefrom. These vectors contain the promoter and the foreign gene of the present invention, and have a remarkable effect on expression of the foreign gene preferentially in the seed. According to one embodiment of the present invention, the vector of the present invention is a vector that preferentially expresses a foreign gene in the endosperm of seed.
본 발명의 발현 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산, 그와 기능적으로 동등한 절편을 포함한다.The expression vector of the present invention includes a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a functionally equivalent fragment thereof.
"본 발명의 프로모터"와 "기능적으로 동등한 절편"은 본 발명의 프로모터와 실질적으로 동등한 효과를 나타내는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 조각 또는 일부분을 의미한다. 이러한 핵산 절편은 서열번호 1에 기재된 염기서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지며, 이러한 핵산 절편은 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다. 또한, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 프로모터는 공개된 벼 게놈 서열 상, LOC_Os05g23910의 앞쪽에 위치하는 서열로, 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 중 일부가 치환, 삽입 또는 삭제되더라도 공개된 벼 게놈 서열 상 LOC_Os05g23910의 앞에 위치한 서열과 상동성이 유지되어 실질적으로 동등한 효과를 나타낸다면 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. Means a fragment or a fragment of a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which exhibits substantially equivalent effect to the promoter of the present invention. These nucleic acid fragments are 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% or more of sequence homology. Such a nucleic acid fragment can be easily prepared by molecular biological methods well known in the art. In addition, the promoter represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention is a sequence located in front of LOC_Os05g23910 on the published rice genome sequence. Even if some of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, inserted or deleted, It can be included in the scope of the present invention if homology with the sequence located before the sequence LOC_Os05g23910 is maintained and exhibits substantially equivalent effect.
본 발명의 발현 벡터는 3' 방향에 목적 단백질에 대한 유전자가 발현되도록 한다. 바람직하게는 상기 발현벡터는 종자에 우선적으로 발현시키고자 하는 유용한 외래 유전자를 포함할 수 있다.The expression vector of the present invention allows the gene for the target protein to be expressed in the 3 'direction. Preferably, the expression vector may comprise a useful foreign gene which is intended to preferentially express in the seed.
상기 외래 유전자는 종자 생성, 발달 등과 같은 종자의 특성과 관련된 것이면 무엇이든 무방하다. 작물의 가장 중요한 형질 중 하나는 종자의 미질 조절인데, 종자 특히, 종자의 대부분을 차지하는 배유에서 우선적으로 발현되는 프로모터를 활용함으로써 관련 형질의 세밀한 조절 및 최적화가 가능하다. The foreign gene may be of any kind related to seed characteristics such as seed production, development, and the like. One of the most important traits of crops is the control of seed quality, which allows fine control and optimization of related traits by using preferentially expressed promoters in the seeds, especially in the endosperms that occupy the majority of seeds.
상기 발현벡터는 통상의 벡터에 본 발명의 프로모터를 도입한 것일 수 있으며, 이처럼 본 발명의 프로모터를 도입하여 발현벡터를 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 방법에 따라 용이하게 실시 가능하다.The above expression vector may be one in which the promoter of the present invention is introduced into a conventional vector, and the expression vector may be prepared by introducing the promoter of the present invention into such a manner as will be readily apparent to those skilled in the art. It is possible.
또한 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포를 제공한다. The present invention also provides a transformed cell transformed with said vector.
상기한 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.Such recombinant vectors may be introduced into host cells cultured using well known techniques such as infection, transfection, transfection, electroporation and transformation. Representative examples of the host include bacterial cells such as E. coli, Streptomyces and Salmonella typhimurium cells; And plant cells.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 임의의 식물 세포가 이용가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 줄기, 잎, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.Any plant cell can be used as "plant cell" used for transformation of a plant. The plant cell may be any type of cultured cell, cultured tissue, cultured organ or whole plant, preferably cultured cell, cultured tissue or culture organ, and more preferably cultured cell. "Plant tissue" refers to a tissue of a differentiated or undifferentiated plant, such as, but not limited to, stem cells, leaves, cancer tissues, and various types of cells used in culture, such as single cells, protoplasts, Callus tissue.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터 또는 상기 형질 전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 종자 우선적 발현 유도용 조성물을 제공한다. 종자 우선적 발현 유도용 조성물은 단자엽 식물체에 외래 유전자를 도입하여 단자엽 식물체의 종자에서 외래 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 단자엽 식물체는 본 발명의 일 실시양태에 따른 벼(Oryza sativa)를 포함하여 단자엽 식물로 구분되는 식물체 모두를 제한없이 포함한다. 본 발명에 있어서, 종자 우선적 발현 유도는 단자엽 식물체의 종자에 외래유전자의 우선적 발현을 의미한다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명의 종자 우선적 발현 유도용 조성물은 종자의 배유에 우선적으로 외래 유전자의 발현을 유도한다. The present invention also provides a composition for inducing seed-preferential expression of a foreign gene comprising the expression vector or the transformed cell. The composition for inducing seed preferential expression can specifically induce the expression of a foreign gene in a seed of a terminal plant by introducing a foreign gene into a terminal plant. In the present invention, the monocotyledonous plant includes, without limitation, all of the monocotyledonous plants including rice (Oryza sativa) according to one embodiment of the present invention. In the present invention, induction of seed preferential expression means preferential expression of a foreign gene in the seed of a terminal plant. According to one embodiment of the present invention, the composition for inducing seed-preferential expression of the present invention preferentially induces the expression of a foreign gene in the endosperm of seed.
또한 본 발명은 상기 벡터, 상기 형질전환 세포 또는 이를 포함하는 외래 유전자의 종자 우선적 발현 유도용 조성물로 형질 전환된 단자엽 식물체를 제공하며, 바람직하게 단자엽 식물체는 벼이다. 이러한 형질 전환 단자엽 식물체는 도입된 외래 유전자가 단자엽 식물체 종자에 우선적으로 발현되는 특성을 나타낸다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명의 도입된 외래 유전자가 단자엽 식물체 종자의 배유에 우선적으로 발현되는 특성을 가진다. The present invention also provides a transgenic plant transformed with the vector, the transgenic cell, or a composition for inducing seed-preferential expression of the transgenic cell comprising the transgenic cell or the transgenic cell. Preferably, the transgenic plant is rice. These transgenic monocotyledons exhibit the preferential expression of the introduced foreign gene in the terminal seed. According to one embodiment of the present invention, the introduced foreign gene of the present invention has the property that it is preferentially expressed in the endosperm of the terminal leaf seed.
"본 발명의 형질전환 단자엽 식물체"와 "기능적으로 동등한 형질전환 단자엽 식물체"는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 변이체와 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 이용하여 제조된 형질 전환 단자엽 식물체로써, 단자엽 식물체 전신에서 프로모터 효과가 실질적으로 동등한 특징을 가지는 형질전환 단자엽 식물체이다.65%, 70%, 75%, 80% or more of the variants of the nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 "and" functionally equivalent transgenic plant of the present invention " , 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology As a terminal plant, it is a transgenic terminal plant having a characteristic that the promoter effect is substantially equivalent in the whole plant of the terminal plant.
본 발명의 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D.et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen.Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 이러한 변이체는 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.Transformation of a plant of the present invention can be carried out by any method known in the art for transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. For example, the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373) (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. (Klein et al., 1987, Nature 327, 70), infiltration of plants or mature pollen of various plant elements (DNA or RNA-coated) And infection by (non-integrative) viruses in Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (EP 0301316). Such mutants can be easily produced by molecular biological methods well known in the art.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터로 단자엽 식물체를 형질 전환시켜 외래 유전자를 단자엽 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는, 외래 유전자를 종자 우선적으로 발현하는 형질 전환 단자엽 식물체의 제조 방법을 제공한다. The present invention also encompasses a step of transfecting a monocotyledonous plant with a vector comprising a promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a foreign gene operably linked thereto, and expressing the foreign gene in the monocotyledonous plant A method for producing transgenic monocotyledonous plants expressing a foreign gene in seed preference is provided.
바람직하게, 상기 발현 벡터 또는 상기 형질 전환 세포를 포함하는 외래 유전자의 단자엽 식물체 종자 우선적 발현 유도용 조성물을 제조하는 단계; 단자엽 식물체에 상기 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 조성물이 도입되어 단자엽 식물체 종자에 외래유전자가 우선적으로 발현되는 형질전환 단자엽 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 형질 전환 단자엽 식물체의 제조 방법을 제공한다. Preferably, the method further comprises the step of preparing a composition for inducing seed-preferential expression of a terminal plant of a foreign gene comprising the expression vector or the transformed cell. Introducing said composition into a terminal plant; And selecting the transgenic monocotyledonous plants to which the composition is introduced so that the foreign gene is preferentially expressed in the transgenic plant seeds.
본 발명의 프로모터는 종자에 우선적으로 발현하는 프로모터로써, 종자의 형질 개선에 필요한 유전자 발현을 우선적으로 조절하여 벼를 포함하는 주요 곡물의 종자 성분을 개량하거나, 종자의 환경 스트레스에 대한 내성을 증대 시키는 등 종자 작물의 농업적 형질을 개량하는데 이용될 수 있다.The promoter of the present invention is a promoter that preferentially expresses seeds, and it is a promoter that preferentially regulates gene expression necessary for improving the trait of seeds to improve the seed components of major cereals including rice and to increase resistance to environmental stress of seeds Can be used to improve the agricultural traits of seed crops.
도 1은 마이크로어레이 자료를 바탕으로 종자에서 발현이 높은 유전자의 프로모터를 선발하는 과정을 나타내는 도이다.
도 2는 LOC_Os05g23910 유전자의 종자에서 우선적 발현을 나타내는 마이크로 어레이 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 LOC_Os05g23910 프로모터 GUS 식물체 제조를 위해 사용한 벡터의 다이어그램을 나타낸 도이다.
도 4는 LOC_Os05g23910 프로모터의 종자 우선적 발현을 GUS staining을 통해 형질전환 식물체에서 확인한 도이다.FIG. 1 is a diagram illustrating a process of selecting a promoter of a gene having high expression in a seed based on microarray data.
Fig. 2 is a diagram showing microarray results showing preferential expression in the seed of the LOC_Os05g23910 gene.
Fig. 3 is a diagram showing a diagram of a vector used for the production of the LOC_Os05g23910 promoter GUS plant.
Fig. 4 shows seed-preferential expression of LOC_Os05g23910 promoter in transgenic plants through GUS staining.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 아래의 실시예는 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following embodiments are only examples for helping understanding of the invention, and thus the scope of the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 종자에 우선적으로 발현되는 벼 유전자 대량 선별 1> Large-scale selection of rice genes preferentially expressed in seeds
종자에 우선적으로 발현하는 유전자를 선별하기 위하여, 공개된 마이크로어레이 데이터베이스인 NCBI GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 수집된 1150종의 벼 에피메트릭스 마이크로어레이(affymetrix microarray) 자료를 17개 기관별/조직별로 재구성하여 유전자 발현 분석용 데이터베이스를 구축하였다.To select genes that preferentially express on the seeds, 1150 species of rice epimetrex microarrays (" Nucleic Acid < RTI ID = 0.0 > affymetrix microarray) were reconstructed by 17 institutions / organizations to construct a database for gene expression analysis.
이를 표 1에 나타내었다. This is shown in Table 1.
표 1. 기관별/조직별로 재구성된 유전자 발현 분석용 데이터베이스Table 1. Database for gene expression analysis reconstructed by institution / organization
K-means clustering 분석 방법을 이용하여, 상기 표 1에 제시된 유전자 발현 분석용 데이터베이스 중 종자에서 발현이 높은 유전자 그룹을 분리하였다. Using the K-means clustering analysis method, gene groups having high expression in the seeds of the database for gene expression analysis shown in Table 1 were isolated.
이는 마이크로어레이 자료 분석용 소프트웨어인 MeV의 K-means clustering 분석 방법을 사용하여 수행하였으며, 기관별/조직별 발현 분석용 데이터베이스 중 종자, 특히 종자의 배유에서 발현이 높은 300여 종의 유전자가 분리되었다.This was performed using MeV's K-means clustering analysis method for microarray data analysis. More than 300 kinds of genes having high expression in seeds, especially in seeds, were isolated from databases for expression analysis by tissue / tissue.
그 결과를 도 1에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 1에 나타낸 바와 같이, 노란색에 가까울수록 강한 발현을 보이는 유전자에 해당하며 파란색에 가까울수록 발현이 낮아지게 된다. 즉, 17개의 재구성된 유전자 데이터베이스 중 종자, 특히 종자의 배유에서 우선적 발현을 보인 300여 종의 유전자를 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 1, a gene which shows stronger expression toward yellow is closer to blue, and the expression becomes lower toward blue. That is, among the 17 reconstructed gene databases, about 300 kinds of genes showing preferential expression in the seeds, especially in the seeds, were identified.
<< 실시예Example 2> 마이크로 어레이 데이터 분석을 통한 조직별 발현 분석 2> Analysis of tissue expression by microarray data analysis
마이크로어레이 데이터베이스 분석을 통한 LOC_Os05g23910 유전자의 조직별 발현 양상을 분석하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. The expression pattern of LOC_Os05g23910 gene was analyzed by microarray database analysis and the results are shown in FIG.
도 2에 나타낸 바와 같이, 종자의 배유에서 노란색을 띄는 것을 확인할 수 있으며, 이는 LOC_Os05g23910 프로모터에 의한 유전자의 조직별 발현이 종자 우선적으로 일어남을 보여준다. As shown in Fig. 2, it can be confirmed that the endosperm of the seed is yellowish, indicating that the expression of the gene by the LOC_Os05g23910 promoter is preferentially in the seed.
<< 실시예Example 3> 종자 우선적 발현을 위한 프로모터의 3> Promoter for seed-preferential expression 클로닝Cloning
LOC_Os05g23910의 프로모터를 클로닝하기 위하여 작성된 서열번호 2와 3을 동진 벼 (Oryza sativa L. japonica cultivar-group) 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. 프라이머 서열을 표 2에 나타내었다. 주형 DNA는 100 ng로 사용하였고, 각 프라이머는 5 pmol로 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분 후; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 300초를 4회 반복한 후; 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 68℃에서 300초를 35회 반복하고 마지막으로 68℃, 10분으로 하였다. PCR 산물은 전기영동하여 크기를 확인하고, pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다. 클로닝한 DNA를 HpaI과 SpeI으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 pGA3383 벡터(promoter-GUS cloning용 벡터)와 라이게이션을 14℃에서 12시간 진행하였다. 라이게이션 산물을 Top10 E.coli 컴피턴트 셀 50㎕과 혼합하여 1.5 ml 튜브에 옮긴 다음 얼음에 15분 방치하였다. 이어서, 37℃ 오븐에 1분을 다시 방치한 후 1 ml의 LB 액체 배지를 추가로 튜브에 넣은 다음 3시간 동안 37℃ 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체 배지에 도말하고 12시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1mL의 LB 액체 배지에서 세포 배양 후 미니 프렙하였다. 미니 프렙으로 얻은 DNA를 제한 효소 HpaI과 SpeI을 사용하여 효소 절단 후 전기영동에서 아가로즈 젤 분리 하고서 밴드를 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 클로닝 DNA를 다시 염기 서열 분석을 하여 에러가 발생하지 않은 DNA를 선택하였다. 염기서열 분석은 서열번호 4, 5, 6 및 7을 이용하여 (주)마크로젠에 의뢰하여 진행하였으며, 해당 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다.SEQ ID NOS: 2 and 3 prepared for cloning the promoter of LOC_Os05g23910 were subjected to PCR using genomic DNA of Oryza sativa L. japonica cultivar-group as a template. The primer sequences are shown in Table 2. Template DNA was used at 100 ng and each primer was used at 5 pmol. PCR conditions were 5 min at 95 ° C; Repeating 4 times at 95 캜 for 30 seconds, at 55 캜 for 30 seconds and at 68 캜 for 300 seconds; 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 62 ° C, and 300 seconds at 68 ° C for 35 times and finally 68 ° C for 10 minutes. The PCR product was electrophoresed to confirm its size and cloned into a pGEM T-EG vector and sequenced. The cloned DNA was digested with HpaI and SpeI, followed by ligation with pGA3383 vector (vector for promoter-GUS cloning) digested with the same restriction enzyme at 14 DEG C for 12 hours. The ligation product was mixed with 50 μl of Top10 E. coli competent cells, transferred to a 1.5 ml tube, and left on ice for 15 minutes. Subsequently, the plate was allowed to stand in a 37 ° C oven for 1 minute, and then 1 ml of LB liquid medium was further placed in the tube and left in a 37 ° C shaking incubator for 3 hours. Then, the cells were plated on tetracycline-resistant LB solid medium and the resulting colonies were awaited for 12 hours and then mini-prepared after cell culture in 1 mL of LB liquid medium. The DNA obtained as miniprep was digested with restriction enzymes HpaI and SpeI and then separated by agarose gel electrophoresis to confirm bands. The cloning DNA thus obtained was subjected to base sequence analysis again to select DNA that did not cause an error. Nucleotide sequencing was carried out using Macrogen (SEQ ID NOS: 4, 5, 6 and 7), and the corresponding primer sequences are shown in Table 3.
표 2. LOC_Os05g23910의 프로모터 클로닝용 프라이머Table 2. Primers for cloning promoter of LOC_Os05g23910
표 3. 염기 서열 분석을 위한 프라이머Table 3. Primers for sequencing
상기 분석 결과를 서열번호 1에 나타내었으며, LOC_Os05g23910 유전자의 ATG 앞의 약 2200bp 서열이 종자에 우선적으로 발현하는 프로모터에 해당한다.The results of the analysis are shown in SEQ ID NO: 1, which corresponds to a promoter in which the approximately 2200 bp sequence preceding the ATG of the LOC_Os05g23910 gene is preferentially expressed on the seed.
<< 실시예Example 4> 형질전환 세포의 제작 4> Production of transformed cells
상기 실시예 3에서 제작한 식물 발현용 벡터를 추출하였다.The plant expression vector prepared in Example 3 was extracted.
아그로박테리움 컴피턴트 셀(Agrobacterium tumefaciens LB4404) 50㎕와 2㎍의 식물발현용 벡터를 혼합하여 얼음에 15분 방치하였다. 이어서, 액체질소에 75초 넣은 후, 37℃ 오븐에 5분을 다시 방치한 후 1 ml의 LB 액체 배지를 넣은 다음 3시간 동안 28℃ 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체 배지에 도말하고 36시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1mL의 LB 액체 배지에서 세포 배양 후 미니 프렙 후, HpaI과 SpeI을 사용하여 효소 절단 후 사이즈를 확인하였다.50 아 of Agrobacterium tumefaciens LB4404 and 2 의 of plant expression vector were mixed and left on ice for 15 minutes. Subsequently, the substrate was placed in liquid nitrogen for 75 seconds. Then, the substrate was allowed to stand in an oven at 37 ° C for 5 minutes. Then, 1 ml of LB liquid medium was added thereto, followed by incubation in a 28 ° C shaking incubator for 3 hours. Then, the cells were plated on a tetracycline-resistant LB solid medium and incubated for 36 hours. The resulting colonies were cultured in 1 mL of LB liquid medium. After mini-preparation, HpaI and SpeI were used to cleave the enzymes.
상기 생성된 형질전환 된 아그로박테리움을 이용하여 벼의 형질 전환 실험에서 사용하였다.The resulting transformed Agrobacterium was used for transgenic rice transformation experiments.
<< 실시예Example 5> 형질전환 식물체의 제작 5> Production of Transgenic Plants
N6D 고체 배지에서 동진벼 종자를 7일 정도 28℃ 생장실에서 키워서 벼의 캘러스를 생성하였다. 생성된 캘러스를 상기 실시예 3에서 얻은 식물 발현용 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움을 72시간 키운 세포와 혼합하여 N6D-Acetosyringone 을 포함한 배지에서 22℃ 암처리 생장실에 방치하였다.In the N6D solid medium, Dongjinbyeon seeds were grown in a 28 ℃ growth chamber for 7 days to produce calli of rice. The resulting callus was mixed with the cells cultured for 72 hours with Agrobacterium transformed with the plant expression vector obtained in Example 3, and then placed in a culture medium containing N6D-Acetosyringone at a temperature of 22 占 폚.
아그로박테리움에 오염된 캘러스를 3차 증류수로 깨끗이 5번 정도 헹구어 낸 다음 N6D 고체 배지에서 hygromycin 선발을 1차(hygromycin 30 mg/L), 2차 (hygromycin 40 mg/L)에 걸쳐서 계대 배양을 통해 진행하였다. 선발은 28℃ 생장실에서 각각 2주 씩 합해서 4 주 동안 이루어졌다. 분열된 캘러스를 재분화 배지인 MSR (hygromycin 40 mg/L) 고체배지에 옮겨 4주 28℃ 광조건 생장실에서 재분화를 유도한 후, 식물체를 MS 고체 배지로 옮기고 7일 28℃ 광조건 생장실에서 키우고 온실로 옮겨서 재분화 식물체를 키웠다.The callus contaminated with Agrobacterium was rinsed 5 times with tertiary distilled water. Subsequently hygromycin selection was performed in N6D solid medium (hygromycin 30 mg / L) and subculture (hygromycin 40 mg / L) . Selection was made in the 28 ℃ growth room for 2 weeks each for 4 weeks. The divided callus was transferred to the MSR (hygromycin 40 mg / L) solid medium for regeneration and induced to regenerate in a light condition growth chamber for 4 weeks at 28 ° C. The plants were transferred to MS solid medium, grown in a light condition growth room for 7 days, To grow regenerated plants.
<< 실시예Example 6> 형질전환 식물체를 이용한 종자 우선적 발현 검증 6> Seed-preferential expression test using transgenic plants
재분화된 식물체의 종자 우선적 GUS 발현을 확인하기 위하여, 성숙한 종자의 일부는 절단하고, 일부는 10개씩 28℃에서 7일간 배양한 후 모든 개체를 GUS 염색 처리하였다.In order to confirm the seed-preferential GUS expression of the regenerated plants, some of the mature seeds were cut, and some of them were treated with GUS staining for 10 days at 28 ° C for 7 days.
GUS 용액은 0.5M sodium phosphate buffer 200ml, 12.5mM potassium ferricyanide 100ml, 12.5mM potassium ferrocyanide 100ml, 0.5M EDTA 20ml, 10% Triton X-100 50ml, 10ml 의 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹인 X-gluc 1g과 Methanol 200ml을 넣고 증류수로 1L의 부피를 맞추어 제조되었다. 각 계통의 식물체를 모두 15ml의 GUS 염색액에 24시간 처리한 후 70% 에탄올과 100% 에탄올을 순차적으로 이용하여 상온에서 탈색하였다. The GUS solution was prepared by mixing 200 ml of 0.5 M sodium phosphate buffer, 100 ml of 12.5 mM potassium ferricyanide, 100 ml of 12.5 mM potassium ferrocyanide, 20 ml of 0.5 M EDTA, 50 ml of 10% Triton X-100, 1 g of X-glucin dissolved in 10 ml of DMSO, 200 ml of distilled water was added to make 1 L volume. Each plant was treated with 15 ml of GUS staining solution for 24 hours, followed by decolorization at room temperature using 70% ethanol and 100% ethanol sequentially.
그 결과를 도 4에 나타내었으며, 도 4의 (a)는 발아 후 7일째 유묘, (b)는 잎, (c)는 성숙한 종자의 단면, (d)는 개화기전의 꽃에서의 GUS 발현 결과를 보여준다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 형질전환 식물체의 다른 기관에서 GUS 발현이 매우 낮은 것과 달리 종자에서 우세한 GUS발현을 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.The results are shown in Fig. 4. Fig. 4 (a) shows the results of GUS expression on the 7th day after germination, (b) shows the leaves, (c) shows the cross section of mature seeds, Show. As shown in FIG. 4, it was confirmed that GUS expression was dominant in the seeds, as opposed to very low GUS expression in other organs of the transgenic plants.
상기 도 2 및 도 4의 결과를 토대로 LOC_Os05g23910의 프로모터는 종자에서 우선적인 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 분석 결과를 통해 LOC_Os05g23910 유전자의 ATG 앞 쪽 약 2.2kb에 해당하는 서열이 종자 우선적 발현 프로모터로 작용할 수 있음을 확인하였다. Based on the results of FIG. 2 and FIG. 4, it was confirmed that the promoter of LOC_Os05g23910 showed preferential expression in seeds. That is, it was confirmed that the sequence corresponding to about 2.2 kb in the front of ATG of the LOC_Os05g23910 gene can serve as a seed-preferential expression promoter through the above-described analysis results.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A seed preferential promoter in monocotyledones and use thereof <130> P14-094-KHU <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2215 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(2215) <223> LOC Os05g23910 promoter <400> 1 ggttaacata ccctccaagt tgagatccct caaattccca tggaatgtct taatacaatt 60 gttcctatgt tcttgcatcc aatggtgaca aaactatttt ttgagagaaa acggtaacaa 120 catatggacc ctttcccccc tcccccaatt ctcactcaat ccctgcatta agaaaaaaaa 180 tggtaagaac agtttatacc tagactatac aaaataaatg ggaagatctt ggtactacaa 240 tgtgtccgtg ctattttact aaactagaag gtaccccgcg gcgttgctac ggaacattgt 300 agaaaaaaat tagaagaata gtttgtattg gaagtaaaag gattctaaag taagacaata 360 tgtgaatatt aatttgattg tatgataggg tacacaaaag ttttgttaga ctgaaaggga 420 actggcatat atcaaaatta tgattatttg aaagcaccta gagtatttag tttggacata 480 gtcttgacaa cggaaacagg atagaccatg attacgaaaa tagtaaacaa cggatgtgat 540 tattcggaag catctgcagt ctttaagctg tatattatgt attgacctgc aaatttcgct 600 ggacaatgta ttagaataaa tcataatcgg atttgcttgt atgatgaagc aaggcttcca 660 aacatgggtg attattaatg actaatttga tttgaactat tagatggatg atggattgat 720 ctaaggtgac caaacatggt ctacaatttt tgcttttatc tcttaaaaca tccgttacaa 780 cacacgtgcc tttatctagt tcttgttaat ttcaatcgat atgtatttgt tttttccatg 840 taaaatgtag tgaattggtt tttttagata aaaaatgaga ttttgaggga gagacgtcca 900 tccaaaaaat ttttaagaag aaattataag cgtgttgggg attgaacacg ggacctcgag 960 ttgaaaccat acatcccttg ccactgcact atcaagtgca tctctagtaa attggttttg 1020 agataaaaaa attgtagtat aattgttttt ttttgttttg gaaaccaata tcactactga 1080 ttcacccctt gaatcggcat atgatactga ccaacattgc cagttgaaca acacacaata 1140 ttaatgccta atttgatttg agctattaga tggatgatgg attgatctag ggtgaccaaa 1200 atcaggaaat gtgtattcca cagtcgtgct tcgcttaaaa tttaatcaga tagtcatgca 1260 ttgatgacaa cgtggaaagc tattatgaaa gagaatattt aatgctacat ggtgggaggc 1320 aattgtatag taatgcagga ttacaataca aggtaagata atttaagcct catttagatg 1380 ggctttattc tcagcacttc ggcccataaa aacaatgatt tagtgaaaaa caatatgcac 1440 cataacacat gtaaagtagg aaaagggctc aacatatgac ataccacgtt tggattgcag 1500 caaacaactt tattagttat gttgttacac aaaacaacac aaacaatccc ctcctctgct 1560 tacttacaac tgactatcaa tttctcaagc cttccagaag gctctttcta gcatgcggca 1620 aaatccatcg cttagcatgt acctgtacat tgataagcat tgagctagaa gaatcatcca 1680 aggatggcgt ggaggcttag accaccaagt atggaatgat gcataaaatt agtggatcgc 1740 ttgtacatca attcacaagt gtatggacat gcagtggtgc aaaaggaaag aagcaagaaa 1800 ggctaacaga accccgcaac aaacccacaa gagaacaatt agagacacct aacctcgatg 1860 ctttttcatg aatcatcgtg tctccagttg gcatccacaa tatcctttac tactttgtac 1920 tcctatataa actactttgc ttggttccca ttctctcatc gaccacacca taaattggtc 1980 acctgcttca acatcttgat ataagaaagg ttgtttatta tatcattatt atgtacttct 2040 actaattctt gagtgttagt gtaaattgtg ttagtggcta tacttccaac gagaagcaat 2100 gtagtttcta ttcaatttac atatttttac tgggaagatg aaataagttg ttgtttcaag 2160 caagtactta actgagttat tgttcatgca ttacttaaaa atgtaggagt aaaga 2215 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-pro_Hpa <400> 2 ggttaacata ccctccaagt tgagatcc 28 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-pro_Spe1 <400> 3 gactagttct ttactcctac atttttaagt aatgc 35 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGUS1 <400> 4 aacgctgatc aattccacag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB_backbone-F2 <400> 5 tcgcacggaa tgccaagca 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-seq1 <400> 6 ggtgaccaaa catggtctac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-seq2 <400> 7 gacctgcaaa tttcgctgga 20 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A seed preferential promoter in monocotyledones and use thereof <130> P14-094-KHU <160> 7 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 2215 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter ≪ 222 > (1) .. (2215) <223> LOC Os05g23910 promoter <400> 1 ggttaacata ccctccaagt tgagatccct caaattccca tggaatgtct taatacaatt 60 gttcctatgt tcttgcatcc aatggtgaca aaactatttt ttgagagaaa acggtaacaa 120 catatggacc ctttcccccc tcccccaatt ctcactcaat ccctgcatta agaaaaaaaa 180 tggtaagaac agtttatacc tagactatac aaaataaatg ggaagatctt ggtactacaa 240 tgtgtccgtg ctattttact aaactagaag gtaccccgcg gcgttgctac ggaacattgt 300 agaaaaaaat tagaagaata gtttgtattg gaagtaaaag gattctaaag taagacaata 360 tgtgaatatt aatttgattg tatgataggg tacacaaaag ttttgttaga ctgaaaggga 420 actggcatat atcaaaatta tgattatttg aaagcaccta gagtatttag tttggacata 480 gtcttgacaa cggaaacagg atagaccatg attacgaaaa tagtaaacaa cggatgtgat 540 tattcggaag catctgcagt ctttaagctg tatattatgt attgacctgc aaatttcgct 600 ggacaatgta ttagaataaa tcataatcgg atttgcttgt atgatgaagc aaggcttcca 660 aacatgggtg attattaatg actaatttga tttgaactat tagatggatg atggattgat 720 ctaaggtgac caaacatggt ctacaatttt tgcttttatc tcttaaaaca tccgttacaa 780 cacacgtgcc tttatctagt tcttgttaat ttcaatcgat atgtatttgt tttttccatg 840 taaaatgtag tgaattggtt tttttagata aaaaatgaga ttttgaggga gagacgtcca 900 tccaaaaaat ttttaagaag aaattataag cgtgttgggg attgaacacg ggacctcgag 960 ttgaaaccat acatcccttg ccactgcact atcaagtgca tctctagtaa attggttttg 1020 agataaaaaa attgtagtat aattgttttt ttttgttttg gaaaccaata tcactactga 1080 ttcacccctt gaatcggcat atgatactga ccaacattgc cagttgaaca acacacaata 1140 ttaatgccta atttgatttg agctattaga tggatgatgg attgatctag ggtgaccaaa 1200 atcaggaaat gtgtattcca cagtcgtgct tcgcttaaaa tttaatcaga tagtcatgca 1260 ttgatgacaa cgtggaaagc tattatgaaa gagaatattt aatgctacat ggtgggaggc 1320 aattgtatag taatgcagga ttacaataca aggtaagata atttaagcct catttagatg 1380 ggctttattc tcagcacttc ggcccataaa aacaatgatt tagtgaaaaa caatatgcac 1440 cataacacat gtaaagtagg aaaagggctc aacatatgac ataccacgtt tggattgcag 1500 caaacaactt tattagttat gttgttacac aaaacaacac aaacaatccc ctcctctgct 1560 tacttacaac tgactatcaa tttctcaagc cttccagaag gctctttcta gcatgcggca 1620 aaatccatcg cttagcatgt acctgtacat tgataagcat tgagctagaa gaatcatcca 1680 aggatggcgt ggaggcttag accaccaagt atggaatgat gcataaaatt agtggatcgc 1740 ttgtacatca attcacaagt gtatggacat gcagtggtgc aaaaggaaag aagcaagaaa 1800 ggctaacaga accccgcaac aaacccacaa gagaacaatt agagacacct aacctcgatg 1860 ctttttcatg aatcatcgtg tctccagttg gcatccacaa tatcctttac tactttgtac 1920 tcctatataa actactttgc ttggttccca ttctctcatc gaccacacca taaattggtc 1980 acctgcttca acatcttgat ataagaaagg ttgtttatta tatcattatt atgtacttct 2040 actaattctt gagtgttagt gtaaattgtg ttagtggcta tacttccaac gagaagcaat 2100 gtagtttcta ttcaatttac atatttttac tgggaagatg aaataagttg ttgtttcaag 2160 caagtactta actgagttat tgttcatgca ttacttaaaa atgtaggagt aaaga 2215 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-pro_Hpa <400> 2 ggttaacata ccctccaagt tgagatcc 28 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-pro_Spe1 <400> 3 gactagttct ttactcctac atttttaagt aatgc 35 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGUS1 <400> 4 aacgctgatc aattccacag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > RB_backbone-F2 <400> 5 tcgcacggaa tgccaagca 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-seq1 <400> 6 ggtgaccaaa catggtctac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os05g23910-seq2 <400> 7 gacctgcaaa tttcgctgga 20
Claims (9)
서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 외래 유전자의 종자 우선적 발현 유도용 조성물을 제조하는 단계;
단자엽 식물체에 상기 조성물을 도입하는 단계; 및 상기 조성물이 도입되어 단자엽 식물체 종자에 외래유전자가 우선적으로 발현되는 형질전환 단자엽 식물체를 선별하는 단계.A method for producing a transgenic monocot plant, wherein a foreign gene is preferentially expressed in the seed of the monocot plant, comprising the steps of:
Comprising the steps of: preparing a composition for inducing seed-preferential expression of a foreign gene, the vector comprising a promoter consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a vector comprising an operably linked foreign gene;
Introducing said composition into a terminal plant; And selecting the transgenic monocotyledonous plants to which the composition is introduced so that the foreign gene is preferentially expressed in the transgenic plant seeds.
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