KR101716632B1 - 민감성 피부 타입 유전자 다형성 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이 및 상기 마커를 이용한 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단일염기다형성 마커들은 개개인의 피부 타입에 정확한 정보를 제공하므로 개인 맞춤형 화장품 개발 및 맞춤형 유효성분을 개발할 수 있다.

Description

민감성 피부 타입 유전자 다형성 마커 및 이의 용도{Genetic polymorphic markers for determining type of sensitive skin and use thereof}

본 발명은 민감성 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이 및 상기 마커를 이용한 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 개개인마다 피부상태가 차이가 있다. 특히, 같은 연령, 같은 피부타입이라도 개개인이 처한 내적, 외적인 환경에 따라 피부상태는 많이 달라질 수 있다. 과학 문명이 발달할수록 각종 오염된 환경의 노출, 오존층 파괴로 인한 자외선 노출, 각종 스트레스 등으로 인하여 피부에 심각한 영향을 주어 피부기능이 저하되고 심지어는 피부 트러블이 발생되는 심각한 상태에 이르는 사례가 늘고 있다. 따라서 사용자들은 피부상태를 호전 또는 유지시킬 수 있는 기능성 화장품에 대한 요구가 점차 높아지고 있다.

그러나, 현재는 주로 사용자 개개인에 대한 피부상태의 판단은 단순한 피부문진 및 간단한 피부테스트를 통하여 자기 자신의 피부상태가 어떤지를 파악하는 정도이므로 피부상태 정보에 대한 완전한 신뢰를 얻기는 어렵다. 또한 현재 시판되고 있는 기능성 화장품들은 개개인을 타깃으로 하는 것이 아니라 범용적인 측면이 강하기 때문에 사용자 자신만의 적합한 화장품을 찾기에는 많은 제약이 따른다. 따라서 과학적인 근거에 접근하여 피부상태를 정밀하게 진단하여 맞춤형 화장품을 제공하는 시스템은 거의 전무후무하다고 할 수 있다.

피부특성에 따른 맞춤형 화장품에 대한 요구가 점차 증가하면서, 피부 분류의 체계적 기준 확립 및 이에 따른 제품 처방의 특성화가 요구되고 있다. 하지만 현재 피부 분류에 이용되고 있는 유수분 밸런스 분류기준으로는 정확한 피부 분류를 하지 못하는 실정이다. 또한 종래의 피부상태를 측정하여 맞춤형 화장품 제공하는 방법에는 사용자의 현재 피부상태를 검사하기 위하여 주름의 경우에는 주로 모사판을 이용하여 이미지 분석 시스템(image analyzer system)으로 피부주름의 상태를 파악하며, 피부미백의 경우에는 색차계(mexameter) 및 색채계(colorimeter)를 이용하여 홍반이나 피부색깔의 변화를 측정하고 있으며, 피부보습의 경우에는 주로 코니오메타(corneometer)를 이용하여 보습량을 측정하고 있다. 이런 측정방법들은 피부표면에 대한 물리적인 상태를 단순한 수치화로 나타내고 있으며 측정하는 프로그램에 따라 그 수치가 달라질 수 있기 때문에 피시험자의 작은 개선정도를 평가하는데 있어서는 오차가 발생할 우려가 있다. 또한, 시험자의 육안평가 및 피시험자의 설문평가의 경우에는 주관적인 측면이 크게 작용하여 피시험자의 피부상태를 객관적이고 정밀하게 평가하기에는 어려운 단점이 있다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 개체의 피부 특성을 결정하는 유전적 특징을 파악하여 과학적 피부 분류 기준을 구축하고, 이를 근거로 한 개인 맞춤형 유효성분을 개발하여, 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발에 기여하고자 예의 노력한 결과, 피부 민감성과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성 (SNP) 마커를 선별하여 피부 타입이 민감성인지 여부를 진단하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 민감성 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물을 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 확인하는 단계를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 민감성 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자 (biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어, "rs_id"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.

본 발명에서 용어, "피부 타입"이란 측정 또는 진단하고자 하는 개체의 피부 타입을 의미하는 것으로, 본 발명의 SNP로 측정할 수 있는 피부 타입은 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 민감성일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명자들은 피험자의 피부 타입을 민감한 피부 또는 민감성이 낮은 피부, 민감한 피부 중 금속에 민감한 금속 알러지가 있는 피부 또는 금속에 민감하지 않은 금속 알러지가 없는 피부로 분류하였다. 본 발명의 단일염기다형성 마커는 정확한 피부 타입을 측정할 수 있도록 하므로, 유효 성분과 접촉된 피부의 변화된 피부 타입에 대한 정보도 줄 수 있다.

바람직하게 상기 단일염기다형성 마커는 표 3 내지 표 5에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다. 상기 표 3 내지 표 5에 표시된 단일염기다형성 마커는 피부 타입이 민감성인지 여부를, 특히 상기 표 5에 표시된 단일염기다형성 마커는 민감성 피부의 하나의 척도가 될 수 있는 피부 타입이 금속에 민감한 금속 알러지인지 여부를 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 단일염기다형성 마커의 피부 타입 진단 여부는 각 마커들의 빈도 수를 측정하여 판단하였다. 이와 같은 유의성은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-value와 같은 p-값을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 p-value가 0.01 미만일 수 있으며, 더 바람직하게는 p-value가 0.001 미만일 수 있다.

본 발명의 다형성 마커는 표 3 내지 표 5에 표시된 마커로서, 개체의 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 3 내지 표 5에 표시된 민감하지 않은 피부인 대조군 (control)과 민감성 피부인 시험군 (case)의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 3 내지 표 5에 표시된 민감하지 않은 피부인 대조군과 민감성 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단할 수 있는 마커이다. 예를 들어, 개체의 6번 염색체의 153923073번째 염기가 T인 경우에는 표 3을 보면 시험군의 빈도 수가 더 높으므로 소수 대립유전자인 T가 나온 상기 개체의 피부는 시험군인 민감성 피부로 판단할 수 있는 것이다. 만약 개체의 6번 염색체의 153923073번째 염기가 다수 대립유전자인 C인 경우에는 표 3을 보면 대조군의 빈도 수가 더 낮으므로 이는 대조군인 민감하지 않은 피부로 판단할 수 있는 것이다.

민감성 피부 중 금속에 민감한 지 여부를 나타내는 금속 알러지 관련 마커를 나타내는 표 5의 경우, 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 5에 표시된 금속에 민감하지 않은 금속 알러지가 없는 피부인 대조군과 금속에 민감한 금속 알러지 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 5에 표시된 금속 알러지가 없는 피부인 대조군과 금속 알러지 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단할 수 있는 마커이다. 예를 들어, 개체의 10번 염색체의 67052074번째 염기가 G인 경우에는 표 5를 보면 시험군의 빈도 수가 더 높으므로 소수 대립유전자인 G가 나온 상기 개체의 피부는 시험군인 금속 알러지 피부로 판단할 수 있는 것이다. 만약 개체의 10번 염색체의 67052074번째 염기가 다수 대립유전자인 A인 경우에는 표 5를 보면 대조군의 빈도 수가 더 낮으므로 이는 대조군인 금속 알러지가 없는 피부로 판단할 수 있다.

더 바람직하게, 상기 표 3은 인간의 6번 염색체의 153923073번째 염기가 C 또는 T 인(rs576496), 상기 153923073번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 111003744번째 염기가 C 또는 T인(rs7021903), 상기 111003744번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 6번 염색체의 108135402번째 염기가 T 또는 C인(rs6921267), 상기 108135402번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 113245651번째 염기가 G 또는 A인(rs7650263), 상기 113245651번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 134456647번째 염기가 G 또는 A인(rs16829881), 상기 134456647번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 134467821번째 염기가 A 또는 G인(rs2321546), 상기 134467821번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 18번 염색체의 63359260번째 염기가 G 또는 C인(rs9957826), 상기 63359260번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 4268219번째 염기가 G 또는 A인(rs17018897), 상기 4268219번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 46170608번째 염기가 A 또는 T인(rs1868273), 상기 46170608번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 6번 염색체의 153943264번째 염기가 C 또는 T인(rs6920377), 상기 153943264번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 46175944번째 염기가 G 또는 C인(rs4953307), 상기 46175944번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 4번 염색체의 75476916번째 염기가 C 또는 T인(rs6446995), 상기 75476916번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 79763138번째 염기가 C 또는 T인(rs11145633), 상기 79763138번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 13번 염색체의 20125657번째 염기가 G 또는 A인(rs9506530), 상기 20125657번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 111001210번째 염기가 C 또는 T인(rs7875754), 상기 111001210번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 36732263번째 염기가 G 또는 T인(rs11883493), 상기 36732263번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입이 민감하지 않은 피부인지 또는 민감성 피부인지 여부를 판단하는 피부 타입 진단용 마커일 수 있다.

민감성 피부를 가진 사람에서 높게 관찰되는 SNP 마커가 위치하는 유전자의 기능은 각각 다음과 같다.

○ 2번 염색체

- 유전자: PRKCE (단백질 키나제 C, protein kinase C, epsilon)

- 기능: 단백질 키나제 C (PKC)는 세린 (serine) 및 트레오닌 (threonine)-특이적 단백질 키나제 패밀리(family)로서 칼슘과 2차 전달자 (second messenger)인 디아실글리세롤 (diacylglycerol)에 의해 활성화된다. PKC 패밀리는 수많은 단백을 인산화시킬 수 있기 때문에 다양한 세포내 신호전달에 관여하는데 PKC가 활성화되면 각질형성세포의 분화를 강하게 유도하게 된다. 피부의 표피층에는 적어도 5개의 PKC 이소폼 (isoform)(α, δ, ε, η, ζ)이 존재하는데 PKC가 각질형성세포의 분화에 영향을 미치고 외부물질에 대한 반응에 관여한다고 알려져 있어 민감 피부에 영향을 미치는 후보 유전자 (candidate gene)로서의 가능성이 있다.

○ 6번 염색체

- 업스트림 (Upstream) 유전자: OPRM1 (오피오이드 수용체, opioid receptor, mu 1)

- 기능: OPRM1 유전자는 μ-오피오이드 수용체를 코딩하며 모르핀 (morphine), 히로인 (heroin), 펜타닐 (fentanyl) 등의 아편계 약물이 결합하는 수용체이다. 또한 스트레스 후 분비되는 신경내분비 호르몬 중 내인성 아편제제의 일종인 β-엔도르핀 (β-endorphin)과 엔케팔린 (enkephalin)의 수용체이기도 하다. μ-오피오이드 수용체가 촉각 이질통(tactile allodynia)와 연관되는 것으로 알려져 있어 민감 피부에 영향을 미치는 후보 유전자로서의 가능성이 있다.

따라서 민감 피부 또는 피부 기능을 고려하였을 때 연관성이 있을 것으로 생각되는 SNP 마커로 2번 염색체에 위치한 rs1868273, rs4953307, 6번 염색체에 위치한 rs576496, rs6920377를 민감 피부에 영향을 미치는 것임을 알 수 있다.

본 발명자들은 상기 SNP가 피부 타입 진단용 마커임을 다음과 같은 입증을 통하여 확인하였다. 구체적으로, 민감성 피부 여부는 Sting potential test에서 sting potential을 기준으로 Sting grade 0.4 이상은 민감 피부 시험군, Sting grade 0.4 미만은 대조군으로 분류하였고, 금속 알러지 피부는 민감성 피부 중 금속 (니켈)에 과민한 피부 여부를 통상적인 패치 테스트법에 따라 분류하였다. 상기 분류된 개체로부터 타액 또는 혈액으로부터 gDNA를 추출하고, 유전자형 분석 실험을 Axiom(TM) ASI array plate로 수행하였다 (도 1). 그 결과, 민감성의 피부 타입에 유의성을 갖는 SNP를 분류하였다 (표 3 내지 표 5). 이와 같은 피부 타입이 민감성인지 여부를 분류할 수 있는 SNP는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브"는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 피부 타입이 민감성인지 여부를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 피부 타입이 민감성인지 여부를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 피부 타입을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물을 포함하는 피부 타입 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 피부 타입 진단용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 피부 타입을 진단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 피부 타입 진단용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 피부 타입 진단용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 피부 타입 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 피부 타입 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 2530 ℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 피부 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "개체"란 피부 타입이 민감성인지 여부에 대한 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다. 상기 검체에서 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.

상기 (b) 단계의 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (c)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어, "SNP 칩"은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 정보의 제공 방법은 (d) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 3 내지 표 5에 표시된 민감하지 않은 피부인 대조군과 민감성 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 3 내지 표 5에 표시된 민감하지 않은 피부인 대조군과 민감성 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게, 상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커가 표 5에 표시된 단일염기다형성 마커인 경우에는 피부 타입이 민감성 피부 중 금속에 민감한 금속 알러지인지 여부를 판단하는 것인, 피부 타입에 대한 정보의 제공 방법일 수 있다. 이때, 더욱 바람직하게는 (d) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 5에 표시된 금속에 민감하지 않은 금속 알러지가 없는 피부인 대조군과 금속에 민감한 금속 알러지 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 5에 표시된 금속 알러지가 없는 피부인 대조군과 금속 알러지 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 단일염기다형성 마커는 각각의 개체에 대한 피부 특성을 진단할 수 있는 마커로, 개체에 대한 정확한 피부 타입에 대한 정보를 줄 수 있어서, 피부 특성에 따른 맞춤형 화장품을 제공할 수 있다. 아울러, 화장품 소비자의 피부 특성을 과학적으로 분류하여 개인에 따른 맞춤형 유효성분을 개발하여 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발을 할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 Axiom(TM) ASI array plate를 이용한 유전자 분석의 개략도를 나타낸 도이다.
도 2는 민감성에 대한 각 SNP 마커들의 빈도에 대한 p-value의 로그값과 SNP의 염색체상 위치를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 피부의 특성 분류 및 유전자 채취

본 발명자들은 유전자 타입별 피부 분류 기준 확립 및 개인 맞춤형 유효성분 개발을 위하여 20~50세의 건강한 여성 피험자를 대상으로 이들의 피부 특성을 분류하기 위해서 피부 생리 요인 중 중요한 요소인 민감성 피부 및 금속 알러지 피부에 대하여 ㈜더마프로가 보유하고 있는 피험자의 기초 데이터 중 본 발명의 피험자 선정 기준에 부합하는 피험자 81명과 경상대학교병원 피부과에서 미백 피부 분류가 완료된 20명을 선정한 다음 피부특성을 분류한 후 샘플을 채취하였다 (표 1). 샘플은 타액 또는 혈액을 의미한다. 예를 들어 타액 채취는 두 번에 걸쳐 이루어졌으며, 1차 타액은 피험자로 하여금 채취 1시간 전에 금식하도록 한 후 채취하였고, 2차 타액은 아침 기상 직후 피험자가 채취한 타액을 수득하였다.

각 분류는 다음과 같은 기준으로 수행하였다.

○ 피부 민감도 분류 : 민감도는 Sting potential test에서 sting potential을 기준으로 분류하였고, Sting grade 0.4 이상은 민감 피부 시험군, Sting grade 0.4 미만은 대조군으로 사용하였다.

분류	대조군 (control)	시험군 (case)
피부 민감도	Sting grade 0.4 미만	Sting grade 0.4 이상

상기 피험자 중 ① 임신, 수유 중 또는 6 개월 이내에 임신을 계획하고 있는 경우, ② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1 개월 이상 사용한 경우, ③ 동일한 시험에 참가한 뒤 6 개월이 경과되지 않는 경우, ④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우, ⑤ 시험부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 경우, ⑥ 시험시작 3 개월 이내에 시험부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우, ⑦ 시험부위에 시술(피부 박피술, 보톡스, 기타 피부관리)을 받거나 6 개월 이내 계획한 경우, ⑧ 만성 소모성 질환이 있는 경우 (천식, 당뇨, 고혈압 등), ⑨ 아토피 피부염을 가지는 경우, ⑩ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우는 피험자에서 제외하였다.

실시예 2: 피부의 특성에 따른 유전자형 분석

Affymetrix Axiom(TM) ASI array plate를 이용하여 피부타입별 시료들의 유전자형 분석 (geno-typing)을 수행하였다.

피부타입은 상기 실시예 1의 기준에 의해서 민감성 여부를 판단하기 위하여, 각 군은 시험군 10명, 대조군 10명 총 20명으로 구성하였고, 대부분 40대 여성으로 타액에서 gDNA를 추출하였다.

각 군에 해당하는 여성들의 타액 혹은 혈액은 QIAmp mini gDNA prep kit (QIAGEN, Korea)을 이용하여 gDNA를 추출하였고, OD 260/280 > 1.7, 10ng/㎕이상, 1xTAE 1% 아가로스 겔에서 intact gDNA 밴드를 확인한 후 유전자형 분석 실험을 진행하였다. Axiom ASI plate를 이용한 유전자형 분석 실험은 매뉴얼을 따라 진행하였으며, Axiom ASI plate kit에 포함된 시약을 이용하여, gDNA 증폭, DNA 단편화 (fragmentation), 품질관리 (quality control), 혼성화 (hybridizaion), 염색 (staining), 스캐닝 (scanning)의 과정을 거쳐 수행하였다. 칩의 이미지는 GeneTitan MC(Affymetrix) 시스템과 CeneChip Command Console Software(AGCC)를 이용하여 스캔하였고, 스캔한 이미지인 dat 파일은 AGCC에 의해 자동으로 cel 파일로 변환되었다. 각 칩에 대한 cel 파일은 genotyping console 4 프로그램을 이용하여 data quality control 및 genotype call을 수행하였다. 이와 같은 Affymetrix Axiom(TM) ASI array plate를 이용한 유전자 분석 실험 방법의 전체적인 개략도를 도 1에 나타냈다.

총 20개 시료의 genotyping chip 실험이 진행되었고, 대조군의 1개 시료가 QC를 통과하지 못하여 유전자형 분석 결과가 생성되지 않았다. QC 기준은 Axiom Chip의 DISHQC value가 0,82 이상, genotype call rate이 97% 이상이면 통과된다.

실시예 3: 피부 타입별 유전자형 분석을 이용한 민감성 피부 타입 관련 유전자형 검출

피부 타입과 연관된 유전자형을 검출하기 위하여 각 군들에서 시험군/대조군들의 SNP 마커를 이용한 연관분석을 수행하였다. 이를 위해 PLINK 1.07 프로그램을 사용하였으며, 각 마커들의 QC를 위한 파라미터로서, MAF(Minor Allele Frequency) > 0.1, HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) > 0.001로 설정하였다.

각각 시험군/대조군을 비교하였고, 비교에 사용된 데이터 개수는 다음과 같다 (표 2). 피부 타입에 관련될 것으로 추정되는 최종 주요 SNP 마커들은 각 대립유전자 (allele)에 대한 카이제곱테스트의 유의수준이 p < 0.0001 이하이거나 혹은 p < 0.01이면서 Affymetrix SNP annotation이 피부 타입과 관련된 것들만 선택하였다.

	시험군 (case)	대조군 (control)	SNP 개수
민감	10	9	24

아울러, 민감성 및 금속 알러지에 관하여 카이제곱테스트의 유의수준이 p < 0.01인 것을 선택하였다.

3-1: 민감성 피부의 유전자 다형성 조사 및 유의적 SNP 선별

민감성과 관련된 연관분석 결과에 있어 각 마커들의 빈도에 대한 p-value의 로그값과 SNP의 염색체상 위치를 도 2에 나타냈다. 그 결과, 높은 유의성을 보이는 SNP 마커들은 염색체 전반에 걸쳐 산발적으로 존재하는 것을 확인하였다. 이와 같은 민감성과 유의하게 관련된 주요 SNP 마커 리스트는 하기 표 3에 나타냈다.

상기 표 3에서 민감 피부를 가진 사람에서 높게 관찰되는 SNP 마커 중 염색체 2번에 위치한 rs1868273, rs4953307의 minor allele, 3번 염색체에 위치한 rs7650263의 minor allele, 6번 염색체의 업스트림 및 다운스트림에 위치한 rs576496, rs6921267, rs6920377의 minor allele, 9번 염색체에 위치한 rs7021903 들이 시험군 (민감 피부)에서 높은 빈도로 존재하는 반면, 대조군 (민감하지 않은 피부)에서는 비교적 낮은 빈도로 검출되었다 (표 3). 따라서 이들 SNP 마커의 minor allele이 민감 피부와 높은 연관이 있을 것으로 추정된다. 민감 피부를 가진 사람에서 높게 관찰되는 SNP 마커 중 염색체 2번에 위치한 rs1868273, rs4953307의 minor allele, 3번 염색체에 위치한 rs7650263의 minor allele, 6번 염색체의 업스트림 및 다운스트림에 위치한 rs576496, rs6921267, rs6920377의 minor allele, 9번 염색체에 위치한 rs7021903 들이 시험군 (민감 피부)에서 높은 빈도로 존재하는 반면, 대조군 (민감하지 않은 피부)에서는 비교적 낮은 빈도로 검출되었다 (표 3). 따라서 이들 SNP 마커의 minor allele이 민감 피부와 높은 연관이 있을 것으로 추정된다.

민감성과 유의하게 관련된 p < 0.01인 SNP 마커 리스트는 하기 표 4에 나타냈다.

3-2: 금속 알러지 피부의 유전자 다형성 조사 및 유의적 SNP 선별

민감성 피부 중 금속 알러지와 관련된 연관분석 결과에 있어 유의하게 관련된 p < 0.001인 SNP 마커 리스트는 하기 표 5에 나타냈다. 피부 금속 알러지 분류는 통상적인 패치 테스트 법으로 확인하였다.

Claims (5)

1. 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물로서,
   상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 6번 염색체의 108135402번째 염기가 T 또는 C인(rs6921267), 상기 108135402번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 조성물.
   
2. 제1항의 조성물을 포함하는 피부 타입의 민감성 여부 진단용 키트.
   
3. 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마이크로어레이로서,
   상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 6번 염색체의 108135402번째 염기가 T 또는 C인(rs6921267), 상기 108135402번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 마이크로어레이.
   
4. (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터, 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계로서,
   상기 피부 타입의 민감성 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 6번 염색체의 108135402번째 염기가 T 또는 C인(rs6921267), 상기 108135402번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법.
   
5. 제4항에 있어서, (d) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 C인 경우 민감성 피부를 지니는 것으로 판단하며, 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 T인 경우 민감하지 않은 피부를 지니는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 피부 타입의 민감성 여부에 대한 정보의 제공 방법.
   

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