KR101716415B1 - 금 나노입자의 응집 유도를 통한 잔류 유기인계 농약 검출 센서 시스템 - Google Patents

금 나노입자의 응집 유도를 통한 잔류 유기인계 농약 검출 센서 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자와 이미다졸 또는 GFP을 이용한 잔류 유기인계 농약 검출 센서 시스템에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유기인계 농약과 이미다졸 또는 GFP의 반응으로 금 나노입자를 응집시키고, 이에 따른 흡광 스펙트럼의 변화를 이용하여 유기인계 농약을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 잔류 농약 검출 시스템은 유기인계 농약의 존재에 따른 시약의 광학적 변화가 월등히 뛰어나고 검출속도가 빠르며, 검출한계 농도의 범위가 넓어 현장 분석용 잔류 농약 바이오센서로 유용하다.

Description

금 나노입자의 응집 유도를 통한 잔류 유기인계 농약 검출 센서 시스템{Sensor System for Detecting Organophosphorous Residues By Inducing Coagulation of Gold Nanoparticles}
본 발명은 금 나노입자의 응집 유도를 통한 잔류 유기인계 농약 검출 센서 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유기인계 농약과 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)또는 유기화합물의 반응으로 금 나노입자를 응집시키고, 이에 따른 흡광 스펙트럼의 변화를 이용하여 유기인계 농약을 검출하는 방법에 관한 것이다.
유기인계 농약은 가장 널리 사용되고 있는 농약으로, 해충구제를 위한 살충제의 목적으로 시판되고 있다. 유기염소계에 비해 지속성이 약해 잔류의 위험이 적으며 살충력이 강하지만, 사람과 가축에 대한 독성이 강한 약제가 많으며, 지속성이 약해서 비교적 많은 양의 사용을 필요로 한다. 유기인계 농약의 종류로는 디아지논(diazinon), 이프로벤포스(iprobenfos), 에디펜포스(edifenphos), 디클로로보스(dichlorovos), 파라티온(parathion), 말라티온(malathion) 또는 EPN(o-ethyl-o-(p-nitrophenyl)-phenyl phosphothioate) 등이 많이 사용되고 있다.
잔류 농약은 저분자 유해화학물질로, 적은 양으로도 체내에 농축되고 독성을 나타내어 인간의 건강 및 생태계에 좋지 않은 영향을 준다. 따라서 농약의 존재를 감시하기 위한 지속적인 분석 및 환경 모니터링이 반드시 필요하며 이를 위한 시스템의 도입이 요구된다.
그러나 기존의 잔류농약의 분석은 고가의 장비와 전문적인 인력이 필요하며, 대부분 시간과 돈이 많이 드는 기기분석적인 방법이기 때문에 현장에서 간단하고 편리하며 무엇보다 신속하게 잔류농약을 검출할 수 있는 바이오센서 시스템의 개발이 요구된다.
종래 기술인 AChE(acetylcholinesterase)나 OPH(organophosphate hydrolase)를 이용한 유기인계 잔류농약 검출 시스템은 고가의 효소와 복잡한 실험 과정, 그리고 다수의 시료 용액을 각각 준비해야 하고 효소와 기질의 반응 시간이 소요되는 등의 단점이 있다.
예를 들어, 리포좀(liposome)을 이용한 살균제 검출 나노-바이오센서(Vicky Vamvakakiet al.,Biosens. Bioelectron., 22(12): 2848~2853, 2007)는 AChE이 나노 크기의 리포좀 복합체를 가수분해하여 형광 신호를 발생시키고, 농약에 의해 효소 활성이 저해되면 가수분해의 정도가 감소함에 따라 형광의 세기 또한 감소되어 이러한 형광의 변화를 측정하는 원리를 이용한 것이다. 그러나, 리포좀 복합체를 형성하는 과정이 복잡하고 완충용액, 액체질소, 5,5'-디티오비스-니트로벤조산(5,5'-dithiobis-nitro-benzoic acid, DTNB)등 많은 종류의 시약이 소모된다는 단점이 있다.
또한, OPH(organophosphate hydrolase)와 금 나노입자를 이용한 유기인계 화합물 검출 광학 바이오센서(AL Simonianet al., Anal. Chim.Acta., 534(1):69~77, 2005)도 형광 검출법을 이용한 것이다. 에스터를 이용하여 OPH-금 나노입자 접합체를 형성하고, 이 접합체에 7-하이드록시-9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온(7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one, DDAO phosphate)를 첨가하면 OPH와 결합을 하게 되며, OPH에 접합되어 있는 금 나노입자에 의해 DDAO 포스페이트는 형광을 나타내게 된다. 이 때, 유기인계 농약이 존재하게 되면 OPH가 농약과 결합하면서 DDAO포스페이트와 멀어지게 되고, 동시에 금 나노입자와도 거리가 멀어지면서 형광의 세기가 감소하게 되어 이러한 형광의 변화를 측정하는 원리를 이용한 것이나, 금 나노입자에 OPH를 접합하기 위해 시약과 시간이 필요하고 낮은 검출 수준을 나타낸다는 단점이 있다.
한편, 금 나노입자는 바이오센싱 분야에서 가장 널리 사용되는 나노 물질로, 일반적인 유기 물질에서 보이지 않는 여러 특이 성질을 가지고 있어 이를 이용하여 많은 센서 시스템이 개발되고 있다. 금 나노입자는 일반적인 유기 염료에 비하여 103-105 정도 큰 흡광계수(extinction coefficient)를 가지고 있어 특유의 UV/vis 스펙트럼을 가지며 그 세기와 민감도가 뛰어나 나노입자 간의 거리에 따라 색깔 변화가 빨간색에서 파란색으로 급격히 일어나고, 눈으로 확인할 수 없는 정도의 작은 색 변화를 스펙트럼의 측정을 통하여 가능하게 한다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, AChE나 OPH와 같은 효소를 사용하는 대신, 유기화합물인 이미다졸(imidazole) 또는 형광 단백질인 GFP(Green Fluorescent Protein)에 유기인계 농약을 처리해주면 금 나노입자의 응집크기가 증가하게 되어 적은 농도의 농약에서도 변화 차이가 크게 나타나게 되어, ppb 단위까지의 농약을 검출하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다.
아울러, 입자 간의 거리에 따라 미세한 광학적 변화를 나타내는 금 나노입자의 성질에 착안하여 적은 농도의 유기인계 농약을 더 빠르고 쉽게 검출할 수 있도록 하기 위해 예의 노력한 결과, 유기인계 농약과 금 나노입자가 혼합된 용액에 이미다졸 용액을 첨가하면, 첨가된 이미다졸에 의해 금 나노입자가 응집함에 따라, 금 나노입자의 흡광 스펙트럼이 급격하게 변화하여 유기인계 농약의 존재를 가시적으로 쉽게 인식할 수 있다는 점을 확인하고,본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 적은 농도의 유기인계 농약을 더 빠르고 쉽게 검출할 수 있으며, 검출한계 농도의 범위가 넓고 현장 분석이 가능한 유기인계 농약을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 측정된 흡광도를 기반으로 농약의 농도를 정량하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하는 단계를 포함하는 유기인계 농약의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계; (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 흡광도를 기반으로 농약의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 유기인계 농약의 정량방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 금 나노입자 용액; 및 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액;을 포함하는 유기인계 농약 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 잔류 농약 검출 시스템은 유기인계 농약의 존재에 따른 시약의 광학적 변화가 월등히 뛰어나고 검출속도가 빠르며, 검출한계 농도의 범위가 넓어, 현장 분석용 잔류 농약 바이오센서로 유용하다.
도 1은 금 나노입자 용액에 농약과 이미다졸을 순차적으로 첨가했을 때 흡광 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 이미다졸을 첨가하였을 때, 특정 성분에 의한 흡광 스펙트럼의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 디아지논, 에디펜포스, 이프로벤포스,말라티온, 테부코나졸, 아세타미프리드, 페니트로티온, 그리고 펜티온 각각에 대하여 농도를 달리한 후, 금 나노입자 및 이미다졸을 첨가했을 때의 흡광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 디아지논, 에디펜포스, 이프로벤포스 각각에 대하여 농도를 달리한 후, 금 나노입자 및 이미다졸을 첨가했을 때 670nm에서 측정된 흡광도를 나타낸 표준곡선 그래프이다.
도 5는 비농약 화합물과 세 가지 유기인계 농약에 각각 금 나노입자 및 이미다졸을 첨가했을 때 670nm에서 측정된 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 이미다졸을 첨가하였을 때, 금 나노입자의 제타 전위 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 이미다졸을 첨가하였을 때, 금 나노입자의 응집으로 인한 입자 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 유기인계 농약, 금 나노입자, 이미다졸 혼합물의 pH변화에 따른 흡광도 변화를 670nm에서 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 ９는 금 나노입자 용액에 농약과 EGFP를 순차적으로 첨가했을 때 흡광 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.
도10은 유기인계 농약이 EGFP의 활성에 주는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 EGFP를 첨가하였을 때, 어느 요소에 의해 흡광 스펙트럼의 변화가 일어나는지를 나타낸 그래프이다.
도 12는 디아지논, 에디펜포스, 이프로벤포스 각각에 대하여 농도를 달리한 후, 금 나노입자 및 EGFP를 첨가했을 때의 흡광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 13은 디아지논, 에디펜포스, 이프로벤포스 각각에 대하여 농도를 달리한 후, 금 나노입자 및 EGFP를 첨가했을 때 670nm에서 측정된 흡광도를 나타낸 표준곡선 그래프이다.
도 14는 비농약 화합물과 세 가지 유기인계 농약에 각각 금 나노입자 및 EGFP를 첨가했을 때 670nm에서 측정된 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 15는 농도가 다른 유기인계 농약, 금 나노입자, EGFP 혼합물의 시간에 따른 흡광도 변화를 670nm에서 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 EGFP를 첨가하였을 때, 금 나노입자의 응집으로 인한 입자 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 유기인계 농약, 금 나노입자, EGFP 혼합물의 pH 변화에 따른 흡광도 변화를 670nm에서 측정하여 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 유기인계 농약에 금 나노입자 용액과 이미다졸 용액 또는 GFP 용액을 첨가하여 광학측정기로 흡광 스펙트럼의 변화를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 유기인계 농약과 이미다졸 또는 GFP가 금 나노입자의 응집을 유도하여, 600~700nm에서 가장 강한 흡광도(peak)를 나타내는 새로운 스펙트럼이 생성됨을 확인할 수 있었고, 이로 인한 가시적인 변화로 유기인계 농약을 쉽고 빠르게 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하는 단계를 포함하는 유기인계 농약의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 농약 오염 샘플은, 잔류 농약에 의한 오염이 의심되는 농작물 등으로부터 얻어지는 샘플을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서 금 나노입자는 사염화금(?)산의 시트르산 환원법으로 합성할 수 있다. 이와 같이 액상에서 금 나노 입자를 제조하는 방법에는 템플릿(template)을 이용하지 않고 고온의 조건에서 금속염을 환원시키는 방법과 템플릿을 이용하여 상온에서 합성하는 방법이 있다.
템플릿을 이용하지 않는 방법은 용매에 금속염을 녹인 후 끓는점 이상에서 강한 교반(stirring) 조건에서 시트레이트(citrate) 등의 강한 환원제를 첨가하여 금속 나노 입자를 얻는다. 또 다른 방법으로 금 나노입자 형성 시 열역학적으로 불안정한 상태를 극복하기 위해 표면 안정제나 템플릿을 사용하기도 한다. 경우에 따라 중형기공 알루미나와 실리카, 탄소나노튜브(CNT) 등의 하드 템플릿(hard template)과 계면활성제(surfactant)와 같은 소프트 템플릿(soft template)을 사용한다. 템플릿을 이용하여 나노입자를 제조하는 방법에는 시드(seed)와 성장 용액(growth solution)을 이용하는 시드기반(seed-mediated) 결정성장 방법과 폴리올 방법(polyol process) 등이 있다.
금 나노입자는 바이오센싱 분야에서 가장 널리 사용되는 나노 물질이다. 금 나노입자는 일반적인 유기 염료에 비하여 103-105 정도 큰 흡광계수(extinction coefficient)를 가지고 있어 특유의 UV/vis 스펙트럼을 가진다. 가시광선 하에서 금 나노입자는 특유의 색을 가지고 있고, 특정 시료를 측정하면서 발생하는 특이적 결합으로 금 나노입자의 자체의 응집을 유발하는데, 이는 금 나노입자 표면의 유전율의 변화를 유발하며, 결국 국소 표면 플라즈몬(LSP) 흡수 조건이 바뀌게 되어 가시광선 하에서 금 나노입자 용액 자체의 색이 변하게 된다. 즉 나노입자의 간격이 가까워지면서 광의 흡수 파장이 적색 전이(red-shift)가 발생하여 원래의 붉은 색에서 반응이 진행됨에 따라 점점 푸른색으로 변하게 된다.
본 발명에서는 유기인계 농약, 이미다졸, 금 나노입자 간의 특이적 반응이 있을 때 나타나는 용액 자체의 색 변화를 이용하여 특별한 분석 장비 없이 눈으로도 대상 시료를 측정할 수 있는 비색 센서(colorimetric sensor)를 개발하고자 하였다.
금 나노입자는 UV/vis 스펙트럼 측정 시에 519nm에서 가장 강한 흡광도(peak)를 가지고 있는 것이 특징이다. 그러나 금 나노입자가 이미다졸의 농약에 대한 반응의 결과로 응집되고, 600 내지 700nm, 바람직하게는 670nm의 파장에서 가장 강한 흡광도(peak)를 갖도록 스펙트럼이 변화하는 것을 광학측정기(UV/vis spectrophotometer)로 측정하여 규명하였다.
본 발명에서 사용되는 GFP는 녹색형광단백질로, 바람직하게는 본 발명의 실시예에서와 같이 EGFP(Enhanced green fluorescent protein)를 사용할 수 있다. EGFP는 GFP 형광단백질의 일종으로, GFP에서 1~2개 아미노산이 다른 것으로 치환된 강화된 녹색형광단백질을 의미한다. 일반적인 GFP보다 강한 형광을 나타내는 특성을 가지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서, EGFP를 얻기 위해 EGFP 유전자의 재조합 DNA를 형질전환시킨 대장균으로부터 EGFP 발현을 유도하고 정제하여 사용하였다. 유기인계 농약 및 금 나노입자와 반응하는 형광단백질은 반드시 GFP 또는 EGFP에만 한정되는 것은 아니며, RFP(red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), ERFP(enhanced red fluorescent protein), 또는 EBFP(enhanced blue fluorescent protein)를 포함하는 다양한 형광단백질로 대체 가능할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계; (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 흡광도를 기반으로 농약의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 유기인계 농약의 정량방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 유기인계 농약에 금 나노입자 용액과 이미다졸 용액 또는 EFGP 용액을 혼합하였을 때, 포함된 농약의 농도에 따라 흡광도(absorbance)에 차이가 크게 나타났으며, 670nm 파장에서 그 차이가 가장 확실하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 도 4 및 도 13에 나타난 바와 같이, 흡광도 670nm 파장에서의 값을 이용하여 농약의 농도에 따른 표준 곡선을 나타냈으며, 3시그마법(평균치의 상하에 표준편차의 3배의 폭을 잡아 한계를 판단하는 방법)을 이용한 최소 검출 한계는 각각27.9ppb 또는 17ppb로 계산되었고, 3ppm 근처 농도에서 플래토(plateau)를 보이므로 상기 유기인계 농약에 대한 검출 가능범위는 0.01~3ppm인 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명을 이용한 유기인계 농약 정량 결과와 HPLC(High-performance liquid chromatography)를 이용한 유기인계 농약 정량 결과를 비교했을 때, 금 나노입자와 이미다졸 또는 GFP을 이용한 본 발명의 농약 정량방법이 HPLC만큼 정확하면서, HPLC보다 신속하고 효율적인 방법으로서 HPLC 정량법을 대체할 수 있음을 확인할 수 있었다.
흡광도를 이용하여 농약의 구체적인 농도를 계산할 때에는 A = εLc 공식을 이용한다. 여기서 A는 흡광도(absorbance)이며 A =-log(I/I0)로 정의된다. I0는 시료를 통과하기 전의 빛의 세기이며 I는 시료를 통과한 후의 빛의 세기이다. L은 빛이 시료가 담긴 용기(cuvette)을 통과한 거리이며 ε는 그 물질의 고유한 몰흡광계수(molar absorbity)이며, c는 그 시료의 몰농도(molar concentration)이다. L과 ε를 알고 있을 때 용액의 흡광도(A)를 측정함으로써 용질의 농도를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 농약 오염 샘플을 메탄올, 에탄올, 또는 이들의 수용액에 희석시키는 전처리단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유기인계 농약을 금 나노입자와 이미다졸 용액 또는 EFGP 용액과 반응시키기 전에, 10% 메탄올에 녹이는 전처리과정을 거쳤다. 이는 농약 오염 샘플로부터 유기인계 농약을 추출해 내기 위함이다. 메탄올 대신 비슷한 성질을 가지는 용매인 에탄올을 이용하거나, 메탄올 또는 에탄올의 수용액을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자의 직경은 10~50nm인 것을 특징으로 할 수 있다. 금 나노입자의 크기가 10~50nm일 때 붉은색을 나타내어, 유기인계 농약과 이미다졸로 인해 금 입자가 응집되는 경우 색전이 현상을 가장 잘 관찰할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기인계 농약은 디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos) 또는 이프로벤포스(iprobenfos)일 수 있다. 유기인계 화합물은 알킬 또는 아릴기와 인 원자(P)가 결합한 화합물로, 디클로로보스(Dichlorovos), 파라티온(parathion), 말라티온(malathion), 테부코나졸(Tebuconazole), 아세타미프리드(acetamiprid), EPN, 페니트로티온(fenitrothion), 또는 펜티온(fenthion) 등과 같은 유기인계 화합물에도 본 발명의 검출방법 및 정량방법이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자 용액의 농도는 8~12nM이고, 이미다졸 용액의 농도는 0.1~0.4mM일 수 있고, 상기 유기인계 농약의 검출 농도는 0.01~3ppm일 수 있으며, 상기 유기인계 농약 검출의 최적 pH는 7.4~8.9, 더욱 바람직하게는 7.4~8.4인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 금 나노입자 용액의 농도를 10nM로 하고, 이미다졸 용액의 농도를 0.3mM로 하여 각각의 부피비를 1:1로 혼합하였을 때 유기인계 농약과의 반응이 가장 잘 일어났다. 또한, 혼합 용액의 pH가 8.4일 때에 유기인계 농약의 유무에 따른 흡광도 차이가 크게 나타나, 유기인계 농약의 검출에 가장 적합한 pH라는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 또 다른 관점에서 금 나노입자 용액; 및 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액;을 포함하는 유기인계 농약 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자 용액의 농도는 8~12nM이고, 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액, 히스타민 용액 및 GFP 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액의 농도는 0.1~0.4mM일 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
금 나노입자와 이미다졸을 이용한 실시예
시료 및 장비의 준비
금 나노입자의 제조에 사용되는 시트르산 삼나트륨2수화물(trisodium citrate dehydrate)은 BIO BASIC(CANADA INC.)로부터 구입하였고, 사염화금(?)산 (Gold(?) chloride hydrate, HAuCl4)은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다. 금 나노입자는 사염화금(?)산의 시트르산 환원법으로 합성하였으며, 직경이 13nm인 금 나노입자를 아래 실험에서 사용하였다.
유기인계 농약인 디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos) 그리고 인산완충염(phosphate buffered saline, tablet)는 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다.
메탄올은 Merck chemicals에서, 이미다졸은 BIO BASIC(CANADA INC.)로부터 구입하였고, Milli-Q grade water(18.2 M? cm, Millipore)가 모든 실험에서 사용되었다.
흡광도는 Biotek(Korea)로부터 구입한 Synergy H1 Hybrid Reader로 측정하였다.
실시예 1: 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 이미다졸을 첨가함에 따른 흡광 스펙트럼 변화 측정
먼저, 유기인계 농약인 디아지논(diazinon)에 대하여, 농약 10㎕를 10% 메탄올 10mL에 녹여, 농도를 1000ppm으로 맞추었다. 이를 다시 10% 메탄올로 희석하여, 1ppm의 농도로 희석한 샘플을 제조하였다.
유기인계 농약에 금 나노입자 및 이미다졸을 첨가하였을 때 급격한 흡광스펙트럼의 변화(peak의 이동)가 일어나는데, 어느 요소에 의해 이러한 변화가 일어나는지 확인하는 실험을 하였다.
1-1. 디아지논(diazinon)과 금 나노입자 용액을 반응시킨 경우
먼저, 유기인계 농약인 디아지논(diazinon)을 1ppm 농도로 희석한 용액과 10nM 금 나노입자 용액을 2:1의 부피비로 혼합하여 상온에서 반응시켰다.
그 결과, 도 2에 나타난 같이, 금 나노입자의 고유 흡광 스펙트럼은 약 520nm에서 피크(peak)를 나타내는데, 유기인계 농약인 디아지논과 금 나노입자를 반응시켰을 때에도 금 나노입자의 피크(peak) 위치가 동일하게 520nm에서 나타났다. 따라서, 디아지논 단독으로는 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 직접적으로 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 이미다졸 용액과 금 나노입자 용액을 반응시킨 경우
유기인계 농약을 제외하고, 0.3mM 이미다졸 용액과 10nM 금 나노입자 용액만을 1:1의 부피비로 혼합하여 흡광도를 측정한 결과, 도 2에서와 같이 특별한 피크의 이동이 발견되지는 않아, 이미다졸만 단독으로 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 영향을 줄 수는 없다는 점을 확인할 수 있었다.
1-3. 디아지논(diazinon), 이미다졸용액, 및 금 나노입자 용액을 모두 혼합하여 반응시킨 경우
유기인계 농약인 디아지논(diazinon)을 1ppm 농도로 희석한 용액, 0.3mM이미다졸용액, 10nM 금 나노입자 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하여 상온에서 반응시킨 후 흡광 스펙트럼을 측정하였을 때에는, 도 2에서와 같이 670nm에서 새로운 피크가 생성되었으며, 이로부터 이미다졸이 농약에 대한 반응으로 금 나노입자의 응집을 유도하고, 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 영향을 주어 유기인계 농약의 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos),말라티온(malathion), 테부코나졸(Tebuconazole), 아세타미프리드(acetamiprid), 페니트로티온(fenitrothion), 그리고 펜티온(fenthion)에 대하여도 동일한 실험을 수행하였고, 동일한 유형의 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 2: 각 유기인계 농약의 농도별 흡광도 측정
디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos),말라티온(malathion), 테부코나졸(Tebuconazole), 아세타미프리드(acetamiprid), 페니트로티온(fenitrothion), 그리고 펜티온(fenthion)각각의 유기인계 농약에 대하여, 실시예 1에서와 같은 방법으로 0.01~10.0ppm 범위의 다양한 농도를 갖는 농약 샘플을 제조하였다. 그 다음, 각 농도의 유기인계 농약 샘플, 10nM의 금 나노입자 용액, 0.3mM 이미다졸 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하여, 광학측정기로 흡광 스펙트럼의 변화를 400~700nm 범위에서 측정하고(도 3), 이를 통해 표준곡선을 얻었다(도 4).
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 흡광 스펙트럼에서 피크의 위치는 670nm로 농약의 농도에 관계없이 동일했으나, 농약의 농도에 따라 흡광도(absorbance)에 차이가 크게 나타났으며, 670nm 파장에서 그 차이가 가장 확실하게 나타났다. 따라서 도 4와 같이, 흡광도 670nm 파장에서의 값을 이용하여 농약의 농도에 따른 표준 곡선을 나타냈으며, 3시그마법(평균치의 상하에 표준편차의 3배의 폭을 잡아 한계를 판단하는 방법)을 이용한 최소 검출 한계는 27.9ppm으로 계산되었고, 3ppm 근처 농도에서 플래토(plateau)를 보이므로 상기 유기인계 농약에 대한 검출 가능범위는 0.01~3ppm인 것을 확인할 수 있었다.
비교예: 비농약 화합물 대조군을 이용한 유기인계 농약 검출 특이성 확인
금 나노입자와 이미다졸을 포함하는 농약 검출 센서 시스템이 유기인계 농약에만 특이적 반응을 보이는지 확인하기 위하여, 유기인계 농약의 화학식이 포함하고 있는 각각의 작용기로 구성된 비농약 화합물인 벤젠(benzene), 페놀(phenol), 톨루엔(toluene), 자일렌(xylene), 다이클로로벤젠(dichlorobenzene), 인산(phosphoric acid)을 각각 1ppm 농도가 되도록 10% 메탄올에 희석한 용액과, 10nM의 금 나노입자 용액, 0.3mM 이미다졸 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하였다.
670nm에서의 흡광도를 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 비농약 화합물인 벤젠, 페놀, 톨루엔, 자일렌, 다이클로로벤젠, 인산 등에 대해서는 흡광도가 0.33 이하로 현저히 낮았고, 유기인계 농약인 디아지논(Diazinon)의 흡광도만 0.41 이상으로 높게 나타나, 유기인계 농약이 특이적인 반응을 하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 유기인계 농약, 금 나노입자, 및 이미다졸 혼합물의 제타 전위 변화
금 나노입자 용액에 유기인계 농약과 이미다졸 용액을 순차적으로 첨가하였을 때(농도 및 혼합비율은 실시예 1-3에서와 동일), 각 첨가에 따른 금 나노입자의 제타전위를 제타전위 입자측정기로 측정하였다. 금 나노입자의 제타전위가 -35mV이고, 유기인계 농약을 첨가했을 때 -36mV로 변화가 거의 없었다.그러나 위의 각각의 샘플에 이미다졸을 첨가했을 때 둘 다 -12mV로 크게 증가하여, 이미다졸이 금 나노입자의 응집에 큰 영향을 미침을 실시예 1-3에 이어 다시 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 4: 금 나노입자의 입자 크기 변화
금 나노입자 용액에 유기인계 농약과 이미다졸 용액을 순차적으로 첨가하였을 때(농도 및 혼합비율은 실시예1-3에서와 동일), 각 첨가에 따른 금 나노입자의 크기를 제타전위 입자측정기로 측정하였다. 금 나노입자의 크기가 13nm이고, 유기인계 농약을 첨가했을 때에도 13nm로 크기 변화가 없었다.그러나 위의 각각의 샘플에 이미다졸을 첨가했을 때 각각 202nm, 235nm로 크게 증가하여,이미다졸이 금 나노입자의 응집에 큰 영향을 미침을 실시예1-3에 이어 다시 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 5: 유기인계 농약, 금 나노입자 및 이미다졸 혼합물의 pH에 따른 흡광도 변화
금 나노입자가 유기인계 농약과 이미다졸과 반응할 경우 용액의 pH에 영향을 받는지 알아보기 위해 pH 변화에 따른 670nm에서의 흡광도 변화를 분석하였다 (농도 및 혼합비율은 실시예1-3에서와 동일).
pH를 3.4에서 10.4까지 조절하며 흡광도를 분석한 결과, 도 8에서와 같이, pH가 높은 조건일수록 유기인계 농약 0ppm과 1ppm의670nm에서 흡광도 값의 차이가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. pH 8.4에서 가장 큰 차이를 보였다.
실시예 6: 탈이온수(deionized water) 및 수돗물(tap water)에 적용한 농약 정량 결과와 HPLC를 이용한 유기인계 농약 정량 결과의 비교
금 나노입자를 유기인계 농약 및 이미다졸과 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 탈이온수와 수돗물에서 농약의 농도를 정량한 결과를, 일반적으로 사용하는 농약 검출 방법인 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석에 의해 얻어진 정량 결과와 비교하여, 본 발명의 유기인계 농약 정량방법의 정확성을 입증할 수 있는 실험을 하였다(금 나노입자, 이미다졸 용액의 농도 및 혼합비율은 실시예1-3에서와 동일).
탈이온수(deionized water) 및수돗물(tap water)에 적용한 농약 정량 결과와 HPLC를 이용한 유기인계 농약 정량 결과를 비교하였다.
Samples 1 2 3
Diazinon conc. Added (ppm) 0.080 0.170 0.300
In deionized water
mean±SD(ppm)* 		0.080±0.024 0.173±0.056 0.295±0.042
Recovery(%) 100.4 101.6 98.3
In tap water
mean±SD(ppm)* 		0.079±0.012 0.146±0.012 0.340±0.001
Recovery(%) 98.5 86.3 113.5
HPLC
mean±SD(ppm)* 		0.082±0.002 0.149±0.004 0.263±0.064
Recovery(%) 96.2 87.6 87.7
* 3번의 결과에 대한 평균값; SD: 표준편차
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, 유기인계 농약의 농도를 0.080ppm, 0.170ppm 및 0.300ppm으로 희석한 후, 본 발명의 방법과 HPLC를 이용하여 각각 정량분석한 결과, 큰 차이 없이 비슷한 결과를 얻었다. 본 발명의 정량방법을 이용하였을 때의 평균 회복율(recovery)은 탈이온수에서는100.1%, 수돗물에서는 99.4%로서 HPLC정량법의 90.5%보다 오차율이 적었다. 이로써 본 발명의 농약 정량방법이 HPLC만큼 정확하면서, HPLC보다 신속하고 효율적인 방법으로서 HPLC 정량법을 대체할 수 있음을 확인할 수 있었다.
금 나노입자와 GFP를 이용한 실시예
시료 및 장비의 준비
금 나노입자의 제조에 사용되는 시트르산 삼나트륨 이수화물(Trisodium citrate dehydrate)은 BIO BASIC(CANADA INC.)로부터 구입하였고, 사염화금(?)산 (Gold(?) chloride hydrate, HAuCl4)은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다. 금 나노입자는 사염화금(?)산의 시트르산 환원법으로 합성하였으며, 직경이 13nm인 금 나노입자를 아래 실험에서 사용하였다.
유기인계 농약인 디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos) and phosphate buffered saline(tablet)는 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였다.
메탄올은 Merck chemicals에서 구입하였고, Milli-Q grade water (18.2MΩ cm, Millipore)가 모든 실험에서 사용되었다.
EGFP는 재조합 DNA를 형질전환시킨 대장균으로부터 발현을 유도하고 정제하여 사용하였다.
형광 및 흡광도는Biotek(Korea)로부터 구입한 Synergy H1 Hybrid Reader로 측정하였다.
실시예 7: 유기인계 농약이 EGFP의 활성에 주는 영향 확인
먼저, 유기인계 농약인 디아지논(diazinon)에 대하여, 농약 10㎕를 10% 메탄올 10 mL에 녹여, 농도를 1000ppm으로 맞추었다. 이를 다시 10% 메탄올로 희석하여, 10ppb, 100ppb, 1ppm, 10ppm의 다양한 농도로 희석한 샘플을 각각 제조했다.
유기인계 농약에 의해 EGFP의 형광의 세기가 영향을 받는지 확인하기 위해, 위에서 제조된 각각 다른 농도를 갖는 농약 샘플에 EGFP를 첨가하고 상온에서 3분이 지난 후, 10% 메탄올을 대조군으로 하여, 각각의 농도에서 EGFP 단백질의 형광의 세기를 여기(excitation) 480nm, 그리고 발광(emission) 510nm 파장에서 측정하였다(도 10).
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 농약의 농도에 따라서 EGFP가 방출하는 형광의 세기가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다. 농약의 농도가 높아질수록 형광의 세기가 강하게 나타났고, 10ppm의 농도에서 급격하게 형광의 세기가 강화되었다.
에디펜포스(edifenphos) 및 이프로벤포스(iprobenfos)에 대하여도 같은 실험을 수행하였고, 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 8: 유기인계 농약에 금 나노입자 및/또는 EGFP를 첨가함에 따른 흡광 스펙트럼 변화 측정
유기인계 농약에 금 나노입자 및 EGFP를 첨가하였을 때 급격한 흡광 스펙트럼의 변화(peak의 이동)가 일어나는데, 어느 요소에 의해 이러한 변화가 일어나는지 알아보는 실험을 하였다.
8-1. 디아지논(diazinon)과 금 나노입자 용액을 반응시킨 경우
먼저, 유기인계 농약인 디아지논(diazinon)을 1ppm 농도로 희석한 용액과 10nM 금 나노입자 용액을 2:1의 부피비로 혼합하여 상온에서 반응시켰다.
그 결과, 도 11에서와 같이, 금 나노입자의 고유 흡광 스펙트럼은 약 520nm에서 피크를 나타내는데, 유기인계 농약인 디아지논과 금 나노입자를 반응시켰을 때에도 금 나노입자의 피크 위치가 동일하게 520nm에서 나타났다. 따라서, 디아지논 단독으로는 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 직접적으로 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다.
8-2. EGFP용액과 금 나노입자 용액을 반응시킨 경우
유기인계 농약을 제외하고, 5㎍/mL EGFP용액과 10nM 금 나노입자 용액만을 1:1의 부피비로 혼합하여 흡광도를 측정한 결과, 도 11에서와 같이 특별한 피크의 이동이 발견되지는 않아, EGFP만 단독으로 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 영향을 줄 수는 없다는 점을 확인할 수 있었다.
8-3. 디아지논(diazinon), EGFP 용액, 및 금 나노입자 용액을 모두 혼합하여 반응시킨 경우
유기인계 농약인 디아지논(diazinon)을 1ppm 농도로 희석한 용액, 5μg/mL EGFP 용액, 10nM 금 나노입자 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하여 상온에서 반응시킨 후 흡광 스펙트럼을 측정하였을 때에는, 도 11에서와 같이 670nm에서 새로운 피크가 생성되었으며, 이로부터 EGFP가 농약에 대한 반응으로 금 나노입자의 응집을 유도하고, 금 나노입자의 흡광 스펙트럼에 영향을 주어 유기인계 농약의 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
에디펜포스(edifenphos) 및 이프로벤포스(iprobenfos)에 대하여도 같은 실험을 수행하였고, 동일한 결과를 얻을 수 있었다 (도 12).
실시예 9: 각 유기인계 농약의 농도별 흡광도 측정
디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos) 각각의 유기인계 농약에 대하여, 실시예7에서와 같은 방법으로 0.01~10.0ppm 범위의 다양한 농도를 갖는 농약 샘플을 제조했다. 그 다음, 실시예8에서와 같이, 각 농도의 유기인계 농약 샘플, 10nM의 금 나노입자 용액, 5㎍/mL의 EGFP 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하여, 광학측정기로 흡광 스펙트럼의 변화를 400~700nm 범위에서 측정하고(도 12), 이를 통해 표준곡선을 얻었다(도 13).
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 흡광 스펙트럼에서 피크의 위치는 670nm로 농약의 농도에 관계없이 동일했으나, 농약의 농도에 따라 흡광도(absorbance)에 차이가 크게 나타났으며, 670nm 파장에서 그 차이가 가장 확실하게 나타났다. 따라서 도 13와 같이, 흡광도 670nm 파장에서의 값을 이용하여 농약의 농도에 따른 표준 곡선을 나타냈으며, 3시그마법(평균치의 상하에 표준편차의 3배의 폭을 잡아 한계를 판단하는 방법)을 이용한 최소 검출 한계는 17ppb로 계산되었고, 3ppm 근처 농도에서 플래토(plateau)를 보이므로 상기 유기인계 농약에 대한 검출 가능범위는 0.01~3ppm인 것을 확인할 수 있었다.
비교예: 비농약 화합물 대조군을 이용한 유기인계 농약 검출 특이성 확인
금 나노입자와 EGFP를 포함하는 농약 검출 비색센서 시스템이 유기인계 농약에만 특이적 반응을 보이는지 확인하기 위하여, 유기인계 농약의 화학식이 포함하고 있는 각각의 작용기로 구성된 비농약 화합물인 벤젠(benzene), 페놀(phenol), 톨루엔(toluene), 자일렌(xylene), 다이클로로벤젠(dichlorobenzene), 인산(phosphoric acid)을 각각 1ppm 농도가 되도록 10% 메탄올에 희석한 용액과, 10nM의 금 나노입자 용액, 5㎍/mL의 EGFP 용액을 2:1:1의 부피비로 혼합하였다.
670nm에서의 흡광도를 분석한 결과, 도 14과 같이, 비농약 화합물인 벤젠, 페놀, 톨루엔, 자일렌, 다이클로로벤젠, 인산 등에 대해서는 흡광도가 0.35 이하로 현저히 낮았고, 유기인계 농약인 디아지논(Diazinon), 에디펜포스(Edifenphos), 이프로벤포스(Iprobenfos)의 흡광도만 0.41 이상으로 높게 나타나, 유기인계 농약 특이적인 반응을 하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10: 유기인계 농약, 금 나노입자, 및 EGFP 혼합물의 시간에 따른 흡광도 변화
흡광도의 변화가 가장 큰 670nm에서, 유기인계 농약의 농도가 다를 때 시간에 따른 흡광도 값의 변화를 측정하여 가장 적합한 반응 시간을 확인하는 실험을 하였다. 유기인계 농약(디아지논, 각각 0, 0.01, 0.1, 1.0 ppm 농도), 금 나노입자, EGFP가 모두 첨가된 후부터 1분 단위로 흡광도 값을 측정하였다.
그 결과, 도 15에서와 같이 반응 초기에 흡광도의 변화율이 커서 반응 속도가 급격히 일어나는 것을 확인하였고, 이에 따라 반응 시간을 짧게 하였을 때 가장 농약의 농도에 따른 흡광도 값의 차이가 크게 잘 나타난다는 점을 확인하였다. 반응 시간을 매우 짧은 시간 안에 측정하게 되어 빠른 시간 안에 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있으며, 장시간 동안 지속적으로 반응이 계속 일어나고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 11: 금 나노입자의 입자 크기 변화
금 나노입자 용액에 유기인계 농약과 EGFP용액을 순차적으로 첨가하였을 때 (농도 및 혼합비율은 실시예8-3에서와 동일), 각 첨가에 따른 금 나노입자의 크기를 나노입자 분석기로 측정하였다. 금 나노입자의 크기가 11.7nm이고, 유기인계 농약을 첨가했을 때 12nm로 크기 변화가 거의 없었지만, EGFP를 첨가했을 때 520.8nm로 크게 증가하여, EGFP가 금 나노입자의 응집에 큰 영향을 미침을 실시예8-3에 이어 다시 한 번 확인할 수 있었다(도 16).
실시예 12: 유기인계 농약, 금 나노입자, 및 EGFP 혼합물의 pH에 따른 흡광도 변화
금 나노입자가 유기인계 농약과 EGFP와 반응할 경우 용액의 pH에 영향을 받는지 알아보기 위해 pH 변화에 따른 670nm에서의 흡광도 변화를 분석하였다 (농도 및 혼합비율은 실시예8-3에서와 동일).
pH를 1.4에서 12.4까지 조절하며 흡광도를 분석한 결과, 도 17에서와 같이, 유기인계 농약이 존재하는 경우 pH가 증가할수록 670nm에서 흡광도가 증가하는 경향을 나타냈으며, pH가 증가할수록 유기인계 농약(디아지논) 유무에 따른 흡광도 값의 차이가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. pH 8.4에서 가장 큰 차이를 보였다.
실시예 13: 본 발명을 이용한 유기인계 농약 정량 결과와 HPLC 분석에 의한 유기인계 농약 정량 결과의 비교
금 나노입자를 유기인계 농약 및 EGFP와 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 농약의 농도를 정량한 결과를, 일반적으로 사용하는 농약 검출 방법인 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석에 의해 얻어진 정량 결과와 비교하여, 본 발명의 유기인계 농약 정량방법의 정확성을 입증할 수 있는 실험을 하였다 (금 나노입자, EGFP 용액의 농도 및 혼합비율은 실시예8-3에서와 동일).
유기인계 농약의 농도를 0.085, 0.170, 0.300ppm으로 희석한 후, 본 발명의 방법과 HPLC를 이용하여 각각 정량분석한 결과, 표 2에서와 같이, 0.085ppm의 경우를 제외하고 큰 차이 없이 비슷한 결과를 얻었다.
Samples 1 2 3
Diazinon conc. Added (ppm) 0.085 0.170 0.340
the present method
mean±SD(ppm)* 		0.124±0.015 0.156±0.010 0.248±0.012
Recovery(%) 145.9 91.8 82.7
HPLC
mean±SD(ppm)* 		0.082±0.002 0.149±0.002 0.263±0.014
Recovery(%) 96.2 87.6 87.7
Reliability(%) 151.6 104.7 94.3
* 3번의 결과에 대한 평균값; SD: 표준편차
본 발명의 정량방법을 이용하였을 때의 평균 recovery는 106.8%로서 HPLC 정량법의 90.5%보다 오차율이 적었다. 이로써 본 발명의 농약 정량방법이 HPLC만큼 정확하면서, HPLC보다 신속하고 효율적인 방법으로서 HPLC 정량법을 대체할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 유기인계 농약의 검출방법:
    (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액 및 히스타민 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계; 및
    (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하여 피크가 존재하는 것을 확인하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하는 유기인계 농약의 정량방법:
    (a) 농약 오염 샘플과 금 나노입자의 혼합용액에 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액 및 히스타민 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액을 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하는 단계;
    (b) 상기 금 나노입자의 응집에 따른 흡광도를 600~700nm에서 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 흡광도를 기반으로 농약의 농도를 정량하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기농약 오염 샘플을 메탄올, 에탄올 또는 이들의 수용액에 희석시키는 전처리단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 금 나노입자의 직경은 10~50nm인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기인계 농약은 디아지논(diazinon), 에디펜포스(edifenphos), 이프로벤포스(iprobenfos),말라티온(malathion), 테부코나졸(Tebuconazole), 파라티온(parathion), 아세타미프리드(acetamiprid), 페니트로티온(fenitrothion), 또는 펜티온(fenthion)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 금 나노입자 용액의 농도는 8~12nM이고, 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액 및 히스타민 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액의 농도는 0.1~0.4mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기인계 농약의 검출 농도는 0.01~3ppm인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기인계 농약 검출의 최적 pH는 7.4~8.4 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 금 나노입자 용액; 및
    이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액 및 히스타민 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액;을 포함하는 유기인계 농약 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 금 나노입자 용액의 농도는 8~12nM이고, 이미다졸 용액, 히스티딘 용액, 피라졸 용액 및 히스타민 용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액의 농도는 0.1~0.4mM인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 검출용 키트.
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