KR101715999B1 - 산화철 그래핀 구조체 및 그를 이용한 생촉매의 고정화 - Google Patents

산화철 그래핀 구조체 및 그를 이용한 생촉매의 고정화 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 나노수준과 같은 작은 입자크기를 가지면서도 반응혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있는 고정화 효소를 제조하기 위한 개선된 고정화 효소 제조 방법을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 고정화 효소 제조 방법은 자성체인 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 효소를 고정화 하여 용이하게 회수 및 재사용 할 수 있다. Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 생촉매는 안정성이 증가되며 반응성, pH 및 온도 조절이 용이할 뿐만 아니라, 식품 또는 의약관련 산업에 널리 사용될 수 있다.

Description

산화철 그래핀 구조체 및 그를 이용한 생촉매의 고정화 {Fe3O4 oxidized graphene nano-structure and its use in biocatalyst immobilization}
본 발명은 Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 이용한 효소 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소, 상기 고정화 효소의 제조방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
생물화학공정은 산업적 수요에 부응하기 위해서 대규모로 운영될 필요가 있으며, 생물화학공정을 대규모로 운영하기 위해서는 다량의 생물촉매가 필요하다. 효소를 1회용으로 소모한다면, 효소를 생체촉매로서 사용하는 생물화학공정의 경제성이 심각하게 저하될 수 있다. 따라서, 효소를 여러 번 재사용하기 위한 고정화 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다. 효소의 고정화는 효소가 생물화학공정의 반응혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있도록 하기 위하여, 담체에 효소를 담지시키는 것을 의미한다. 그에 따라, 담체에 담지된 효소를 "고정화 효소 (immobilized enzyme)"라 부른다. 담체는 입자크기가 크므로, 고정화 효소는 반응혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있으며, 또한 고정상 베드에 용이하게 고정될 수 있다. 따라서, 고정화 효소는 회분식 반응기 뿐만아니라 연속식 반응기에도 이용될 수 있다. 이러한 고정화 효소의 예가 WO 2007/104268 호 등에 개시되어 있다.
효소를 고정화시키는 중요한 목적은 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 그러나, 종래의 고정화 효소에 있어서는, 효소가 입자크기가 큰 담체에 담지됨에 따라, 담체 내부 깊숙이 담지된 효소는 반응에 참여하기가 어려워지게 된다. 결국, 종래의 고정화 효소의 실질 활성은, 담지된 효소의 총 활성보다 저하될 수 밖에 없다. 이에 본 발명에서는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 포함하는 나노구조체에 효율적으로 생촉매를 고정화하는 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 생체 촉매 고정화용 담체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 생체 촉매 고정화용 담체를 이용한 효소 고정화 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 산화철(Fe3O4 ) 산화 그래핀 구조체를 포함하는 생체 촉매 고정화용 담체 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 구조체에 효소를 고정화하는 단계를 포함하는 효소 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 라카아제 효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 구조체에 효소를 고정화한 후에 자석을 이용하여 고정화 효소를 회수하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 고정화 방법에 의하여 고정화된 효소를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 염료 폐수에 처리하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 염색폐수 염료의 효율적 탈색을 위해 라카아제 효소를 고정화시키고자 하며, Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 L-ascorbic acid로 환원하여 활성화된 담체에 상업용 라카아제 효소를 부착시킨다. 본 발명에서는 염색폐수 염료의 탈색을 위한 효소의 고정화는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해준다.
본 발명에서의 효소 고정화에 사용한 담체로는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 선택함을 특징으로 한다. Fe3O4 산화 그래핀 구조체는 흡착성 담체로, 모든 종류의 단백질에 대해 흡착력을 가진다.
상기와 같은 조건 하에서, 본 발명의 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 효소는 활성을 장기간 유지하며, 효소의 높은 안정성과 유기 용매에 내성을 확보한다.
종래의 고정화 효소에서 발생되는 문제점은, 입자크기가 작은 나노수준 크기의 담체를 사용함으로써 해결될 수 있다. 그러나 담체의 입자크기가 작아질수록, 고정화 효소의 실질 활성은 증가하겠지만, 고정화 효소를 반응혼합물로부터 분리하기가 더욱 어려워진다. 따라서 나노수준과 같은 작은 입자크기의 담체를 사용하게 되면, 재이용을 위하여 반응혼합물로부터 용이하게 분리할 수 있다는 고정화 효소 본래의 목적을 달성하기 어렵게 된다. 그리하여, 본 발명에서는, 나노수준과 같은 작은 입자크기를 가지면서도 반응혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있는 고정화 효소를 제조하기 위한 개선된 고정화 효소 제조 방법을 제공한다.
원심분리 및 필터링과 같은 분리공정으로는 나노수준의 입자크기를 갖는 고정화 효소를 효과적으로 분리하기 어렵다. 본 발명에서 제조된 고정화 효소는 우수한 활성을 발휘하며, 원심분리 및 필터링과 같은 번거로운 분리공정에 의하지 않고도, 자석에 의하여 반응혼합물로부터 신속하고 효과적으로 분리될 수 있다. 즉, 본 발명에서 제조된 고정화 효소는 나노수준의 입자크기를 갖더라도, 자석에 의하여 반응혼합물로부터 신속하고 효과적으로 분리될 수 있다. 뿐만아니라, 회수된 후에도 우수한 활성을 유지할 수 있다. 그에 따라 효소의 효과적인 재사용이 매우 용이하게 되어, 값비싼 효소의 경제적인 활용이 가능하게 된다. 본 발명에 따른 생물 촉매 고정화 담체 및 이에 고정화된 효소는 재사용이 가능하고 안정성이 증가되며 반응성, pH 및 온도 조절이 용이할 뿐만 아니라, 식품 또는 의약관련 산업에 널리 사용될 수 있다.
도 1a 및 b는 합성된 Fe3O4 산화 그래핀 구조체의 SEM, TEM 이미지이다. a: SEM, b: TEM.
도 2는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 라카아제를 고정하기 전후의 FTIR 이미지 이다. a : Fe3O4 산화 그래핀 구조체, b : Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 L-ascorbic aicd로 환원한 나노 구조체, c : 환원된 나노구조체에 고정화된 라카아제.
도 3은 자석을 이용하여 고정화된 라카아제를 분리해 내는 이미지.
도 4a는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 의해 고정화된 라카아제의 최적 반응 온도를 나타낸 그래프이다. ● : 순수 라카아제효소, ○ : Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제 효소.
도 4b는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 의해 고정화된 라카아제의 최적 반응 pH를 나타낸 그래프이다. 순수 라카아제효소 : ● Glycine-HCl (pH 2.0-3.0), ▲ sodium-citrate (pH 3.0-4.0), ■ sodium-acetate (4.0-6.0), ◆ sodium-phosphate (pH 6.0-7.0). Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제 효소 : ○ Glycine-HCl (pH 2.0-3.0), △ sodium-citrate (pH 3.0-4.0), □ sodium-acetate (4.0-6.0), ◇ sodium-phosphate (pH 6.0-7.0)
도 5는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 의해 고정화된 라카아제의 조업 횟수에 따른 효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 분무열분해 공정에 의한 Fe 3 O 4 산화 그래핀 구조체의 합성
증류수에 Fumed Fe3O4와 산화 그래핀을 분산시킨 뒤에 초음파 분무열분해 공정을 이용하여 발생된 액적들을 고온의 석영관으로 이동시킨다. 이때 액적 내에 분산되어진 Fumed Fe3O4와 산화 그래핀은 액적의 건조, 나노크기 입자의 응집 과정을 통해 Fe3O4 산화 그래핀 복합체로 전환이 된다. 이 경우에도 하나의 액적으로부터 하나의 복합체가 형성되기 때문에 수 마이크론 크기를 가진다. 다음은 복합체 제조 방법을 나타낸다.
- 산화그래핀 제조 : 흑연 5 g을 H2SO4 용액과 교반시킨다.
- 용액 제조 : 증류수에 10 g의 Fumed Fe3O4를 분산시키고, 2 g의 산화 그래핀을 넣어준 뒤, 초음파 분산기를 이용하여 잘 분산된 콜로이드 용액을 준비한다.
- 제조 조건 (분무열분해 장치 작동조건) : 반응기 온도 800˚C. 유량 10 L/min
- 사용 시약 : 흑연 (Aldrich), H2SO4 (Samchun)
위와 같이 Fe3O4 산화 그래핀 구조체는 분무열분해 공정에 의해 합성되었으며, 투과형 전자 현미경과 주사전자 현미경을 이용하여 Fe3O4 산화 그래핀 구조체를 확인하였다 (도 1).
실시예 2: 라카아제 효소의 고정화방법
물에 확산되어 있는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체 (2 mg/ml, 50 ml)에 50 mg의 L-ascorbic acid를 첨가하고 2 - 4시간 동안 환원 반응을 한다. 환원된 10 mg의 구조체를 라카아제 효소(시그마-알드리치사 제품)를 1 mg protein/ml의 농도가 되도록 sodium-acetate buffer (50 mM, pH 5)에 섞어 4℃, 150 rpm으로 4시간 동안 반응시킨다.
실시예 3: Fe 3 O 4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제의 확인
도 2는 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제의 FT-IR 흡광도 특성을 나타낸 스펙트럼이다. 554 - 600/cm 범위의 피크는 Fe-O의 진동을 보여주는데 이는 자성을 가진 구조체를 확인하는 것이다. L-ascarbic acid로 환원된 것을 확인하기 위하여 피크 1589 - 1387/cm는 카르복시기의 대칭적 스트레칭 및 반대 대칭의 신장을 나타내며, 수산기, 에폭시기, 알콕시기의 스트레치 진동은 각각 3424, 1231 그리고 1051/cm으로 확인하였다. 피크 1589 - 1387/cm는 C-O 결합을 나타내는 것으로 라카아제가 고정화되었음을 나타내는 것이다 (도 2).
실시예 4: 다양한 나노 담체에 고정화된 라카아제 효소의 고정화 효율
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, 시그마-알드리치사 제품)을 기질로 사용하여 위의 실시예에서 제조된 고정화 효소 및 다양한 담체에 고정화한 효소의 활성을 비교하였다 (표 1). 1 mM 의 ABTS과 0.05 ㎍의 고정화 효소를 1 ml 의 반응매질(50 mM 소듐 시트레이트 버퍼, pH 3.0)에 투입한 후, 25℃의 반응온도에서 5 분 동안 ABTS의 산화 반응을 진행시켰다. 5분 동안의 반응 완료 후, 반응혼합물로부터 고정화 효소를 자석을 이용하여 분리하고 (실시예 3 참조), ABTS의 산화로 생성된 생성물은 420 nm 에서 흡광도를 분석하여 수행하였다. 상용화 및 합성 담체에 라카아제를 고정화 한 후 고정화 수율 (immobilization yield: IY) 및 고정화 효율 (immobilization efficiency: IE)을 비교한 결과 고정화 수율은 18.7% - 90.6%, 고정화 효율은 18.4% - 87.5%의 값을 나타내었다. 다양한 담체 중 유사한 조건 하에서 Fe3O4 산화 graphene 구조체가 가장 우수한 86.0%의 고정화 수율과 84.8%의 고정화 효율을 나타내었다.
Nano-particles Immobilization yield (IY) % Immobilization Efficiency (IE) %
Commercial particles
Al2O3 45.5 ± 3.7 37.8 ± 3.5
SnO2 18.7 ± 1.5 24.5 ± 2.1
Fe2O3 64.2 ± 5.1 30.8 ± 2.6
Fe3O4 37.4 ± 3.2 55.6 ± 5.1
SiO2(15nm) 35.6 ± 3.0 48.4 ± 4.1
SiO2(20nm) 48.2 ± 4.2 34.8 ± 3.0
SiO2(80nm) 63.5 ± 5.3 69.0 ± 6.1
SrFe12O19 42.5 ± 3.6 30.5 ± 2.5
TiO2 53.0 ± 4.1 40.1 ± 3.2
Y3Fe5O12 45.7 ± 3.8 23.2 ± 2.0
ZrO2 26.4 ± 2.1 18.4 ± 1.4
Synthesized particles
Fe3O4 graphene 86.0 ± 6.5 84.8 ± 6.4
Fe2O3 anti-cave 44.5 ± 4.8 58.2 ± 4.6
NiO@void@SiO2 47.5 ± 4.2 52.1 ± 4.4
Co3O4(nanotube) 42.4 ± 4.0 46.1 ± 4.0
SnO2(TubeinTube) 48.6 ± 4.1 48.2 ± 4.2
NiO@void@SiO210% 53.8 ± 4.0 64.5 ± 5.1
NiO@void@SiO240% 59.1 ± 4.3 48.5 ± 3.8
표 1은 라카아제의 다양한 나노 담체에의 고정화 효율 표이다.
실시예 5: 고정화 효소의 회수
실시예 3에서는 반응이 완료된 반응혼합물로부터 자석을 이용하여 고정화 효소를 회수하였다. 도 3은 고정화 효소의 회수과정을 보여주는 사진이다. 도 3의 (a)는 반응혼합물이 담긴 용기의 외벽에 자석을 근접시킨 순간 반응혼합물의 사진이다. 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, 고정화 효소는 반응혼합물 중에 고르게 분산되어 있다. 도 3의 (b)는 반응혼합물이 담긴 용기의 외벽에 자석을 근접시킨 후 0.5 분이 경과한 반응혼합물의 사진이다. 도 3의 (b)에 나타난 바와 같이, 고정화 효소는 자석에 의하여 반응혼합물로부터 신속하고 효과적으로 분리되었다. 도 3의 (b)의 용기로부터 상청액을 제거한 후, 분리된 고정화 효소를 sodium-acetate buffer (50 mM, pH 5)로 세척한 후 재사용하였다.
실시예 6: 온도 변화에 따른 Fe 3 O 4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제의 특성
도 4a는 원래의 라카아제와 Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제의 최적 온도를 비교한 그림으로, 25 ~ 70℃의 다양한 온도에서 확인하였다. Fe3O4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제는 순수 라카아제보다 최적 온도가 5℃ 높았다. 또한 45℃ ~ 70℃에서는 고정화된 라카아제는 FLac와 순수 라카아제 보다 잔존 활성이 높았다.
실시예 7: pH 변화에 따른 Fe 3 O 4 산화 그래핀 구조체에 고정화된 라카아제의 특성
도 4b는 pH 변화에 따른 라카아제의 잔존활성을 나타낸다. 잔존활성을 확인할 때 pH에 따라 각각 Glycine-HCl (pH 2.0-3.0), sodium-citrate (pH 3.0-4.0), sodium-acetate (4.0-5.5) 및 sodium-phosphate (pH 6.0-7.0)를 사용하여 확인하였다. 최적 pH는 고정화한 효소와 순수 라카아제 모두 pH 3이었다. pH 4 ~ 7 범위에서 고정화 효소가 순수 효소보다 잔존 활성이 높았다.
실시예 8: 고정화 효소를 이용한 반응 시 라카아제의 안정성
실시예 1과 같이 고정화한 효소를 이용하여 ABTS를 반응시키고 조업 횟수에 따른 상대 활성의 변화를 측정하여 효소의 안정성을 측정하였다. 진행 방법은 실시예 1과 동일하며 1 mM의 ABTS와 0.05 μg의 고정화 효소를 사용하여, 25℃에서 반응을 진행하였다. 도 5는 조업 횟수에 따른 상대 활성 변화를 나타내며, 도 5에서 보듯이 고정화한 효소의 조업 횟수가 5회 도달했을 경우에도 고정화한 효소의 상대 활성은 81.4% 이상이었다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. a)물에 훔드(Fumed) Fe3O4와 산화 그래핀을 분산시킨 뒤에 초음파 분무열분해 공정을 이용하여 산화철(Fe3O4) 산화 그래핀 복합체를 제조하는 단계; 및
    b)상기 산화철(Fe3O4) 산화 그래핀 복합체에 라카아제 효소를 고정화하는 단계를 포함하고, 상기 b) 단계에서 고정화는 상기 산화철(Fe3O4) 산화 그래핀 복합체를 L-ascorbic acid로 환원한 후 환원된 복합체에 라카아제 효소를 반응시켜 수행되는 것인, 산화철(Fe3O4) 산화 그래핀 구조체에 라카아제 효소 고정화 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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