KR101707397B1

KR101707397B1 - 올리고(n-비닐카프로락탐)을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 조성물 및 억제방법

Info

Publication number: KR101707397B1
Application number: KR1020150071688A
Authority: KR
Inventors: 이진태; 김성철; 이진형; 김용규
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-02-17
Also published as: KR20160137821A

Abstract

본 발명은 바이오필름 억제용 조성물 및 바이오필름 형성의 억제방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물, 약학 조성물 및 바이오필름 형성의 억제방법에 관한 것이다. 상기 바이오필름 억제용 조성물은 황색포도상구균의 표면 부착을 억제하여 바이오필름 형성을 억제하는 것으로, 황색포도상구균에 의해 야기되는 질병의 예방 및 치료에 효과적이므로 건강식품, 의약, 화장품 등 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

올리고(N-비닐카프로락탐)을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 조성물 및 억제방법{Composition comprising oligo(N-vinylcaprolactam) for Inhibiting Biofilm and Methods therefor}

본 발명은 황색포도상구균의 바이오필름을 억제하며, 황색포도상구균의 약물저항성을 유도하지 않는 바이오필름 억제용 조성물 및 억제방법에 관한 것이다.

세균이 감염된 부분에는, 폴리머(polymer) 기질로 감싸인 세균의 집락인 점액질이 존재할 때가 있다. 이 세균에 의해 형성된 점액질의 세균 복합체를 바이오필름(biofilm), 균막 또는 생물막이라고 부른다. 바이오필름은 고형(solid)의 생물학적 표면(biological surface)인 세균 집락을 비생물학적 표면(non-biological surface)이며 다당류와 폴리펩타이드로 이루어진 폴리머 기질인 외막이 둘러싼 복합체이며, 바이오필름 내부에서 세균은 서로 의사소통을 하고, 외부세계에 대하여 방어를 한다. 이를 통하여 바이오필름은 항생제를 포함한 여러 환경 스트레스(environmental stress) 아래에서도 세균의 생존을 가능하게 만든다.

이런 바이오필름은 일반 자연환경 외에 세균감염성 질환과 관련하여서도 자주 발견된다. 사람의 장기에 형성되기도 하고 치아의 플라크 형태로 나타나기도 하며, 산업용 장비나 의료용 이식 기구에 생길 수도 있다. 이런 탓에 바이오필름은 치주 질환(periodontal disease)이나 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)에 동반하는 폐렴, 중이(middle ear)에 생기는 이통(earache) 등을 연구하는 학자들의 관심 대상이 되어 왔다. 미국 국립보건연구소는 2002년 보고에서 박테리아 군의 최대 80%가 이 같은 바이오필름 형성을 통해 병원균을 퍼트리고 있는 것으로 추산했다.

별개로 부유하던 세균(planktonic bacteria)에 대해 약효를 나타내던 항생제도 세균이 바이오필름을 형성하면 효능을 상실하는 경향이 커진다. 세균이 바이오필름을 형성하면 바이오필름에 존재하는 외막을 항체 등이 투과할 수 없어 숙주의 면역체계(host immune system)를 무력화시키고, 항생제에 대한 세균의 저항성이 약 1,000배까지 높아질 수 있다. 이런 바이오필름 형성에 의한 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으나 다음의 3가지 정도로 설명된다. 첫 번째는 “미생물의 생태적 변화”이다. 바이오필름이 형성된 상태에서는 세균 사이의 결착력이 강화되어 결과적으로 세균집락이 잘 퍼지지 않게 되며 따라서 세균 증식도 저하되게 된다. 이렇게 되면 주위 환경과의 교환 작용에 대한 의존성이 약화되고, 대사 작용이 느려지며, 결과적으로 항생물질에 대한 감수성이 낮아지게 된다.

두 번째는 “점액성 다당류로 구성된 외막”의 물리적 특성이다. 외막을 형성하는 점액성 다당류들은 전기적 성질을 가지고 있어 항생 물질과 결합하려는 경향을 갖고 있으며 이렇게 항생 물질과 결합함으로써 항생 물질이 퍼지는 것을 방해한다. 즉 항생 물질이 개개의 세균까지 잘 전달되지 않게 되어 그 효능을 발휘하기 어렵게 된다.

세 번째는 일반적 항생제 내성 획득 기작과 관련 있는 추정으로 “억제 인자의 생산”이다. 항생 물질의 효능을 억제하는 억제 인자로 가장 많이 알려진 물질로는 슈도모나스균(pseudomonas)에 의하여 생산되는 베타-락타메이스(β-lactamases)를 들 수 있다. 바이오필름이 형성되면 그 바이오필름 속에 존재하는 내성이 없던 세균들도 주위의 내성 세균으로부터 수평 유전자 전이(horizontal gene transfer)를 통하여 내성 인자 관련 유전자를 획득하여 내성 세균화되는 경향이 있다. 즉, 감염부위에 바이오필름이 형성되게 되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있다.

이러한 이유들로 인하여 바이오필름이 형성되면 감염증 치료에 널리 사용되던 항생제의 작용이 어렵게 되어 결과적으로 항생제에 의한 치료 효과가 약화되며, 만성적인 세균 감염 상태에 돌입하게 된다. 이 경우 상기에 기술했듯이 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의 효과가 없으며 이를 극복하기 위해 단순하게 항생제를 과다처방하면 세균의 항생제 내성만을 키우게 된다. 즉, 바이오필름이 형성된 세균 감염증은 단순히 항생제로만 치료하는 것은 더 이상 효과적 치료가 되지 못함을 의미한다. 특히 바이오필름을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성(multi-drug resistance) 균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각해진다.

따라서 상기 문제를 해결하기 위하여, 바이오필름 또는 바이오필름에 존재하는 외막을 파괴할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

1. 한국공개특허 10-20100043579호.

따라서 본 발명은 바이오필름 억제용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 바이오필름 억제용 약학 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한 본 발명은 바이오필름 형성의 억제방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 생물체 또는 비생물체의 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성의 억제방법을 제공한다.

상기 바이오필름은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 생성한 바이오필름이다.

본 발명에 따른 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물은 황색포도상구균의 바이오필름을 억제할 수 있고, 황색포도상구균의 약물저항성을 유도하지 않아 다양한 질환의 예방 또는 치료에 유용할 수 있기에 이를 건강식품, 의약, 화장품 등 다양한 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 폴리(D,L-락티드-코글리콜라이드)(biodegradable poly(D,L-lactide-coglycolide, PLGA) 및 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam), OVCL)의 화학 구조를 나타낸 이미지이며,
도 2는 세 종류의 황색포도상구균 균주의 바이오필름 형성에 있어서 OVCL(MW 679)의 온도에 따른 영향을 확인한 결과이며,
도 3은 세 종류의 황색포도상구균 균주의 바이오필름 형성에 있어서 올리고-(N-아이소프로필아크릴아마이드)(oligo(N-isopropylacrylamide), ONIPAM)의 온도에 따른 영향을 확인한 결과이며,
도 4는 OVCL(MW 679)의 존재하에서 세 종류의 황색포도상구균 균주의 플랑크톤 세포(Planktonic cell)의 성장을 확인한 결과이며,
도 5는 세 종류의 황색포도상구균 균주의 바이오필름 형성에 있어서 다른 분자량을 갖는 5개의 OVCL의 온도에 따른 영향을 확인한 결과이며,
도 6은 황색포도상구균의 바이오필름 형성에 있어서, OVCL(MW 679)의 온도에 따른 조절을 확인한 결과이며,
도 7은 세포 표면이 친수성인 황색포도상구균 ATCC 6538의 성장에 있어서, OVCL의 온도에 따른 영향을 확인한 결과이며,
도 8은 OVCL 존재 또는 부재하에 황색포도상구균의 전사 프로파일(transcriptional profiles)을 확인한 결과이며,
도 9는 PLGA 또는 OVCL과 PLGA 혼합물을 코팅시 황색포도상구균의 바이오필름 형성 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 10은 황색포도상구균에 의한 혈액 용혈에서 OVCL의 효과를 확인한 결과이며,
도 11는 황색포도상구균 ATCC 6538에 감염된 선충의 생존에서 OVCL의 효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

종래부터 사용된 항생제 및 살충제 (biocide) 처리는 인체에 유해하며 빈번히 미생물에 의한 다약제(multipledrug) 저항성을 유발하는 문제점이 있다. 이에 본 발명의 발명자는 다약제 저항성을 유발하지 않고 병원성 미생물을 저해할 수 있는 치료전략을 개발하고자 노력하던 중, 열반응성 고분자인 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 황색포도상구균에 처리시 바이오필름 형성이 억제되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상기 황색포도상구균은 그램 양성(Gram positive) 세균으로서 화농, 농양형성, 다양한 화농성 감염, 패혈증을 유발하는 병원성 미생물이다. 국내에서 조사된 항생제 메티실린에 대한 내성률이 평균 73%로 세계 최고 수준인 매우 위해한 병원균이다. 이는 항생제를 써도 죽지 않는 황색포도상구균이 73%가 된다는 뜻으로 내성이 매우 심각한 병원균이라고 할 수 있다. 또한, 황색포도상구균은 바이오필름을 형성할 수 있는 종이 많으며 바이오필름이 생성되면 약물 침투가 불가능하여 고질적인 감염 양상을 나타낸다. 이러하기 때문에, 황색포도상구균에 의한 바이오필름이 형성되면 만성적 감염증을 초래한다. 바이오필름이 형성된 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 치료는 다른 세균에 의해 형성된 바이오필름으로 인한 질환의 치료에 비해서도 특히 어렵다. 왜냐하면, 질환의 치료를 위해 약물을 사용해도 바이오필름으로 인한 약물전달의 어려움이 있을 뿐 아니라 설사 약물이 전달되었다 할지라도 내성 균주가 많은 황색포도상구균의 특성상 기존 항생제에 기반한 치료는 효과적이지 않다. 따라서 황색포도상구균에 의한 바이오필름 처치는 기존 항생제에 의존한 방법이 아닌 새로운 물질에 의한 접근이 필요하다.

상기 열반응성 고분자(Thermoresponsive polymer)는 약물 전달 및 조직 공학에서 널리 연구되고 있다. 상기 열반응성 고분자는 낮은 임계 용액 온도(Lower critical solution temperatures, LCSTs)를 보이고 LCSTs 아래에서는 물에 용해되지만 그 이상에서는 불용성이다.

현재 열반응성 고분자 중 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAM)과 폴리 (N-비닐카프로락탐)(poly(N-vinylcaprolactam, PVCL)가 생체적합성에 대해 연구되어 왔지만, 황색포도상구균의 바이오필름 형성 억제 효과에 대하여는 보고된 바 없다.

따라서 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam), OVCL)을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 조성물을 제공한다.

상기 바이오필름 억제용 조성물은 생분해성 고분자인 폴리(D,L-락티드-코글리콜라이드)(biodegradable poly(D,L-lactide-coglycolide, PLGA)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 37℃에서 상기 OVCL을 황색포도상구균에 처리할 시, 25℃에서 처리한 것보다 바이오필름 형성 억제 효과가 더 좋았다.

더불어 상기 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))은 황색포도상구균의 표면 부착력을 저해함으로써 바이오필름의 형성을 억제한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 OVCL의 바이오필름 형성 억제는 황색포도상구균의 친수성 표면과 친수성 플라스틱 표면 사이의 친수성 상호작용을 방해함으로써 발생한다는 것을 확인할 수 있다.

상기 표면은 미생물이 바이오필름을 형성할 수 있는 생물체 또는 비생물체의 표면을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 생물체 유래의 조직, 기관 또는 의료용 물건일 수 있다.

일례로, 각종 의학기구, 의학장비, 의학시설/설비와 같은 물건은 물론 상피세포, 뼈, 치아, 및 혈관내벽 등을 포함하는 각종 생체 조직/기관과 같은 생체조직 및 생체에 적용되는 각종 인공 삽입 보형물에 사용될 수 있다.

상기 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))은 바이오필름 형성의 방지 또는 저해에 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 효과적인 양은 바이오필름을 형성하는 병원성 미생물의 종류, 처리하는 표면의 종류 및 그 면적, 및 목적하는 바이오필름 형성의 감소 정도, 처리시점 등을 포함하는 조건에 맞추어 결정될 수 있으며, 당업자라면 표적 미생물의 바이오필름 형성에 관한 지식을 근거로 적절한 농도를 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 바이오필름 억제용 조성물은 가정, 산업, 의학, 및 환경분야에서의 구체적인 목적에 맞추어 액체형태, 분무형태 또는 고체형태로 다양하게 제조될 수 있다.

더불어 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 황색포도상구균에 의해 유발되는 모든 염증질환 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있으며, 바람직하게는 독소성 쇼크 신드롬(toxic-shock syndrome toxin, TSST), 패혈증, 폐렴, 염증성 장질환 또는 중증 피부감염에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 당업계에 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))은 성인기준으로 0.1㎍/kg/일 내지 500mg/kg/일, 바람직하게는 0.1 내지 50mg/kg/일로 투여할 수 있으며, 질병의 심각 정도에 따라 증감할 수 있는 것으로 본 발명의 범위가 상기 투여량에 한정되는 것은 아니다.

더불어 본 발명은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 생물체 또는 비생물체의 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성의 억제방법을 제공한다.

상기 억제방법은 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 황색포도상구균과 접촉시키거나 또는 황색포도상구균이 증식할 수 있는 또는 증식하고 있는 생물체 유래의 조직, 기관 또는 의료용 물건의 표면에 처리하여 바이오필름의 형성을 미리 예방하거나, 또는 억제할 수 있다.

상기 표면은 생체 유래의 표면은 물론, 가정, 산업, 환경, 의료 분야에서 사용되는 물건의 표면을 포함할 수 있는데, 이는 황색포도상구균이 바이오필름을 형성할 수 있는 생물체 또는 비생물체의 표면을 의미할 수 있다.

일례로, 피부, 치아와 같은 생물체 유래 조직 또는 기관의 표면일 수 있으며, 각종 의료용 설비, 장비, 기구, 임시 또는 영구용 인공삽입 보형물인 렌즈, 인공판막, 페이스메이커, 수술용 핀, 삽입 도관, 카테터 등 의료용 물건의 표면을 일컬을 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험방법

1. 열반응성 고분자 준비

N-이소프로필 아크릴아미드(N-isopropylacrylamide, NIPAM), N-바이닐카프로락탐(N-vinylcaprolactam, VCL) 및 생분해성(biodegradable) 고분자인 폴리(D,L-락티드-코글리콜라이드)(poly(D,L-lactide-coglycolide), PLGA, 도 1A)은 시그마-알드리치(Sigma-aldricih, ST.Louis, USA)에서 구입하였다.

더불어 이미 공지된 열반응성 고분자인 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam), OVCL) 및 올리고-(N-아이소프로필아크릴아마이드)(oligo(N-isopropylacrylamide), ONIPAM)도 이미 공지된 방법으로 준비하였으며(Lee et al., 2014 참고) 상기 OVCL은 도 1B와 같다. ¹H-NMR 및 말디토프 질량분석(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectroscopy, MALDI-TOF)에서 OVCL 및 ONIPAM의 크기는 각각 MW 679, MW 877로 측정되었다.

올리고머의 열 변환은 UV/VIS/NIR(Cary5000, Agilent, Korea)를 이용하여 550nm에서 가시광의 강도를 측정함으로써 확인하였다.

더불어 다른 분자량을 갖는 네 개의 상업적 열반응성 OVCLs(MW 1,300, 32,000, 54,000 또는 240,000)을 폴리머 소스(Polymer source, Inc, Dorval, Canada)에서 구입하였다.

2. 균주 및 성장 분석

메티실린-민감한 황색포도상구균 균주(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)인 ATCC 25923 및 ATCC 6538와 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA) 균주인 ATCC BAA-1707을 실험에 사용하였다.

모든 실험에서 20℃ 또는 37℃에서 용원성 배지(lysogeny broth, LB)에서 수행하였다.

세포 성장의 평가를 위하여, 광학 밀도는 멀티스칸 EX 마이크로플레이트 리더기(Multiskan EX microplate reader, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 620 nm에서 측정하였고, 콜로니-형성 단위(colony-forming unit, CFU)도 이를 통해 확인하였다.

3. 크리스탈 -바이올렛 바이오필름 분석(Crystal-Violet Biofilm assay)

고정 바이오필름 분석은 96-웰 폴리스티렌 플레이트(96-well polystyrene plates, SPL Life Sciences, Korea)에서 수행하였다.

바이오필름 형성을 정량화하기 위하여, 바이오필름을 95% 에탄올에 용해하고 크리스탈 바이올렛으로 염색시킨 후, 570nm의 흡광도(OD 570)에서 측정하였다.

바이오필름 결과는 세포 밀도에 의해 표준화(normalized)하지 않았으며, 적어도 12번의 반복 웰에 대한 평균으로 결과를 산출하였다.

4. 공초점 레이저 현미경

황색포도상구균 균주 ATCC 6538은 카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Invitrogen, Molecular Probes, Inc, Eugene, USA)를 이용하여 염색하였다.

OVCL 존재 또는 부재하에 96-웰 플레이트에 형성된 고정 바이오필름은 공초점 레이저 현미경(Nikon Eclipse Ti, Tokyo)의 Ar 레이저(Ar laser, 여기 파장 488nm, 발광 파장 500 내지 550nm)와 20x 대물렌즈를 통해 가시화하였다.

컬러 공초점 이미지는 NIS-엘리먼트 C 버전 3.2(NIS-Elements C version 3.2)를 이용하여 제적하였다.

5. 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM ) 기반의 바이오필름 분석

황색포도상구균 균주 ATCC 6538 세포는 OD600에서 0.05의 초기 탁도일 때 나일론 필터(0.5×0.5 mm)에 접종하였다.

나일론 필터 위의 세포는 OVCL(50μg/mL) 존재하에 25℃ 또는 37℃로 24시간 동안 진탕없이 배양하였다.

그런 후, 균체를 글루타르알데히드(glutaraldehyde, 최종 농도 2.5%)와 포름 알데히드(formaldehyde, 최종농도 2%)를 이용하여 고정하고, 밤새 4℃에서 배양하였다.

세포는 1% 오스뮴(osmium)으로 고정하고, 15kV에서 SEM(S-4100, Hitachi, Japan)을 이용하여 조사한 후, 10,000x로 확대하였다.

6. 세포 표면의 친수성 분석

황색포도상구균을 250rpm의 속도로 진탕하며 LB 배지에서 20시간 배양하고 모두 수거한 후 5분 동안 7,000 xg의 속도로 원심분리하였다.

수확한 세포에 헥사테칸(hexadecane, TCI chemicals, Tokyo, Japan)을 6:1의 비율로 첨가하고 90초간 볼텍싱하여 섞어주었다.

혼합물은 상분리가 가능하게끔 실온에서 20분 동안 방치하였고, 수성 상 흡광도는 OD 600에서 측정하였다.

7. RNA의 분리 및 정량 실시간 RT- PCR

전사 분석을 위하여, 황색포도상구균 ATCC 6538은 0.5의 OD600 값을 가질 때 25ml의 LB 배지에 접종하고 OVCL(50μg/mL) 존재 또는 부재하에 교반 없이 25℃ 또는 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.

RNA 분해를 방지하기 위하여 RNA 분해효소 억제제(RNase inhibitor, RNAlater, Ambion, TX, USA)를 첨가하였다.

총 RNA는 키아젠 RNeasy 미니 키트(Qiagen RNeasy mini Kit, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리하였다.

qRT-PCR은 Zinc 메탈로프로테인아제 아우레올리신(Zinc metalloproteinase aureolysin, aur), 세린 프로테아제(Serine protease, clp), 엔테로톡신 B(Enterotoxin B, seb), 쿼럼-센싱 유전자(quorum-sensing gene, agrA), RNA 폴리머라제 시그마 인자 (RNA polymerase sigma factor, sigB), 포도상구균의 부수 조절자 A(staphylococcal accessory regulator A, sarA), 세포간 부착 유전자A(intercellular adhesin gene, icaA), 당전이효소(Transglycosylase, isaA3), α-용혈 유전자(α-hemolysin gene, hla) 및 핵산가수분해효소 유전자(nuclease gene, nuc1)의 전사를 조사하는 데 사용하였다.

유전자 특이적 프라이머(Gene specific primers)와 16S rRNA 하우스키핑 유전자 프라이머(16S rRNA housekeeping gene primers)도 사용하였다(서열번호 1 내지 22 참고).

실시간 qRT-PCR은 스텝온 실시간 PCR 시스템(StepOne^TMReal-Time PCR system, Applied Biosystems, Foster City, CA)과 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green master mix, Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 수행하였다.

8. 표면 코팅과 바이오필름 억제제

두 가지 열반응성 고분자를 포함하는 바이오필름 억제제를 제조하기 위하여, 생분해성 고분자인 PLGA를 사용하였다.

OVCL(MW679, 5mg/ml, 최종 농도)를 클로로포름(chloroform)에 용해된 2% PLGA에 혼합하였고, 직경 0.7 내지 0.8cm의 코팅을 생성하기 위하여 상기 혼합물 25μL를 슬라이드-바닥이 유리로 된 디쉬(slide-glass bottomed dishes)에 도포하였다.

바닥이 유리로 된 접시는 1시간 동안 공기 건조하였고 4시간 동안 UV로 멸균하였다.

유리 표면 상단에 바이오필름 형성을 위하여 황색포도상구균 ATCC 6538 세포를 LB 배지에 1:100으로 희석하여 재접종하고 25℃ 또는 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

황색포도상구균 세포를 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(Invitrogen, Molecular Probes, Inc, Eugene, USA, Weston and Parish, 1990)로 염색한 후, 플랑크톤 세포(planktonic cells)을 폐기시키고, PBS 완충액에서 바이오필름 세포를 공초점 레이저 현미경을 통하여 가시화하였다.

9. 용혈 분석

인간 적혈구(Human red blood cell) 용해 효능은 OVCL에서 성장한 황색포도상구균의 배양물(cu℃lture)를 이용하여 측정하였다.

황색포도상구균 세포는 1:100으로 희석하여 OVCL 존재 또는 부재하에 LB 배지에 접종하고 250rpm의 속도로 16시간 동안 배양하였다.

인간 적혈구 세포는 900xg의 속도로 5분 동안 원심분리하여 PBS 완충액으로 3번 세척하였다.

세포 배양물(세포와 배양 상등액을 포함한 200μL)을 PBS 완충액에 희석한 인간 적혈구 세포에 첨가하였다(10mL PBS 완충액 당 330μL 적혈구 세포).

용혈성 활동을 확인하기 위하여, 적혈구 세포와 황색포도상구균 혼합물을 250 rpm의 속도로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

상등액은 16,600xg의 속도로 10분 동안 원심분리하여 수집하고, 상등액의 광학 밀도를 543nm에서 측정하였다.

10. 예쁜 꼬마선충 수명 분석

황색포도상구균 ATCC 6538은 OVCL(100 or 200 μg/mL) 존재 또는 부재하에 25℃ 또는 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

L4/미성숙한 성인 fer-15;fem-1(L4/young adult fer-15;fem-1) 선충은 론(lawns)에 배치하여 감염시켰고, 백금 와이어로 부드럽게 터치하여 생사 유무를 기록하였으며, 이때 배양 접시에서 벽 쪽으로 기어가는 선충은 분석에서 제외하였다.

선충의 생존은 카플란-메이어(Kaplan-Meier)법으로 분석하고, 로그-랭크 테스트(log-rank test, STATA6; STATA, College station, TX)를 이용하여 생존 차이의 유의성을 측정하였다.

< 실시예 2> 황색포도상구균의 바이오필름 형성에서 OVCL의 온도에 따른 영향 확인

25℃ 또는 37℃에서 세 종류의 황색포도상구균 균주의 바이오필름 형성에 대한 열반응성 올리고머인 OVCL과 ONIPAM의 영향을 확인하여 그 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

그 결과 25℃에서 세 균주에 의한 바이오필름 형성은 50 μg/mL의 OVCL에 의해 약 7배 증가하였다(도 2A 내지 2C).

한편, 37℃에서는 OVCL에 의해 용량 의존적으로 바이오필름 형성이 감소되었다(도 2E 내지 2G).

OVCL의 바이오필름 형성 억제 효과는 MRSA 균주에서 가장 두드러졌고, OVCL 5μg/mL에서는 MRSA의 바이오필름 형성을 80% 이상 억제하였다(도 2G).

반면, ONIPAM은 100μg/mL까지 25℃, 37℃ 모두 바이오필름 형성에 영향을 미치지 않았다(도 3).

더불어 살균작용 없이 항-바이오필름 활성을 획득하는 것이 목적이기 때문에 황색 포도상 구균의 세포 증식을 측정하였다.

200μg/mL 또는 최대 500μg/mL의 농도의 OVCL은 25℃ 또는 37℃에서 황색 포도상 구균 ATCC 6538의 성장을 억제하지 않았다(도 2D 및 2H).

더불어 ATCC 6538외의 다른 황색포도상구균 균주 ATCC 25923과 MRSA의 성장도 억제하지 않았으며, 세 종류의 황색포도상구균 균주의 플랑크톤 세포(planktonic cel)의 수도 OVCL의 존재에 의해 영향을 받지 않았다(도 4).

< 실시예 3> 황색포도상구균의 바이오필름 형성에 OVCL의 분자량 의존 효과

상기에서 합성한 OVCL(MW679)과 분자량이 다른 4개의 OVCL(MW1,300, 32,000, 54,000 또는 240,000)을 이용하여 25℃ 또는 37℃에서 바이오필름 형성을 조사하였다.

분자량 MW679의 OVCL과 유사하게, 네 개의 OVCL 모두 두 온도에서 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 조절하였으며(도 5), 특히 분자량 의존적 활성이 관찰되었다.

동일 농도(50μg/mL)에서, 제일 높은 분자량의 OVCL(MW240,000)은 제일 낮은 분자량의 OVCL보다 바이오필름 형성을 억제하는 효능이 제일 약했다. 반면, 동몰 농도(equimolar concentration)에서는 제일 높은 분자량의 OVCL(MW240,000)이 37℃에서 가장 높은 바이오필름 형성 억제를 보였다(도 5D 내지 5F).

< 실시예 4> 바이오필름 조절의 현미경 관찰

공초점 레이저 현미경 및 SEM을 OVCL 존재에 따른 황색포도상구균의 바이오필름 형성에서의 변화를 분석하기 위해 사용하였다.

상기 도 2의 결과와 동일하게, 25℃에서 OVCL은 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 증가시키나, 37℃에서는 감소시키는 것을 확인하였다(도 6A).

또한, 일부의 바이오필름 세포는 OVCL(50μg/mL)의 존재하에 나일론 필터에 부착하였다(도 6B).

상기 도 2H의 결과 및 현미경의 결과를 통해, OVCL의 바이오필름 형성 억제 활성은 다른 항균 활성 때문이 아닌 것임을 확인하였다.

< 실시예 5> 세포 표면 친수성의 온도에 의존한 조절 확인

세균 표면의 친수성이 바이오필름 형성에 중요한 역할을 한다고 보고된 바 있다(An and Friedman, 1998; Dunne, 2002).

따라서 OVCL에 의한 황색포도상구균 바이오필름 형성의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 세포 표면 친수성 분석(cell-surface hydrophilicity assay)을 수행하였다.

그 결과, 25℃에서 OVCL은 친수성을 약간만 변형시킨 반면(도 7A), 37℃에서 OVCL의 첨가는 극적으로 더 친수성이 될 세포를 야기하였다(도 7B).

이는 37℃에서 96웰 플레이트의 OVCL의 바이오필름 형성 억제는 박테리아 세포의 친수성 표면과 친수성 플라스틱 표면 사이의 친수성 상호작용을 방해함으로써 발생한다는 것을 보여주었다.

< 실시예 6> 황색포도상구균 세포에서 OVCL에 의한 바이오필름 관련 유전자의 전사 변경 효과 확인

황색포도상구균의 바이오필름 형성 억제를 담당하는 분자의 메커니즘을 조사하기 위하여, qRT-PCR을 사용하여 OVCL 존재 유무에 따른 선택된 바이오필름-관련 유전자(selected biofilm-related genes, 서열번호 1 내지 서열번호 22 참고)의 발현 차이를 조사하였다.

그 결과 25℃와 37℃에서 각 유전자의 발현은 많은 차이를 보였다(도 8).

특히, 37℃에서 OVCL은 aur, agrA, sigB 및 icaA의 발현을 억제하였지만, 하우스키핑 유전자인 16S 리보솜 RNA(16S ribosomal RNA)의 발현은 억제하지 않았다(도 8B).

ica 유전자의 하향 조절은 황색포도상구균의 바이오필름 억제에 있어서 공지된 메커니즘이므로, 이 결과는 OVCL이 ica 유전자의 발현을 억제함으로써 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 억제한다는 것을 보여주었다.

< 실시예 7> 두 생체 적합성 고분자에 의한 고체 표면의 바이오필름 조절

고체 표면의 바이오필름 형성을 방지하기 위하여, OVCL와 PLGA 폴리머를 혼합하였다.

그 결과 유리 표면의 OVCL과 PLGA 혼합물의 코팅은 25℃에서 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 증가시켰으나, 37℃에서는 감소시켰다(도 9).

이러한 결과는 열반응성 고분자인 OVCL과 표면 코팅 기술을 결합시킬 수 있음을 보여주었다.

< 실시예 8> OVCL에 의한 용혈 감소 효과 확인

황색포도상구균은 용혈을 야기하고 바이오필름 형성에 기여하는 α-톡신(α-toxin)을 생성한다.

상기 도 8B에서 OVCL이 황색포도상구균의 α-톡신(α-toxin) 생성에서 중요한 조절 유전자(agrA 및 sigB)를 억제하는 것으로 확인되었기 때문에 황색포도상구균에 의한 혈액 용혈에서 OVCL의 효과를 조사하였다.

OVCL은 25℃에서는 영향이 없었지만, 37℃에서는 황색포도상구균에 의한 인간 적혈구의 용혈을 농도 의존적으로 억제하였다(도 10).

이러한 결과는 OVCL이 용혈성 활동과 바이오필름 형성을 억제하여 황색포도상구균 독성을 감소시킬 수 있음을 보여주었다.

< 실시예 9> OVCL에 의한 황색포도상구균의 독성 감소 확인

황색포도상구균은 예쁜 꼬마 선충을 죽이기 때문에, 25℃ 또는 37℃에서 감염된 예쁜 꼬마 선충의 생존율을 확인하여 OVCL의 효과를 확인하였다.

그 결과 OVCL은 25℃에서 황색포도상구균의 독성을 감소시켰으며, 특히 37℃에서 더 큰 독성 감소 효과를 보였다(도 11).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Composition comprising oligo(N-vinylcaprolactam) for Inhibiting Biofilm and Methods therefor <130> ADP-2015-0192 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aur Forward primer <400> 1 accgtgtgtt aattcgtgtg cta 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aur reverse primer <400> 2 atggtcgcac attcacaagt tt 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clp forward primer <400> 3 caggtaccat cacttcatc 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clp reverse primer <400> 4 ggttcacaaa ttgatgacaa cg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seb forward primer <400> 5 tgttcgggta tttgaagatg g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seb reverse primer <400> 6 cgtttcataa ggcgagttgt t 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA forward primer <400> 7 tgataatcct tatgaggtgc tt 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA reverse primer <400> 8 cactgtgact cgtaacgaaa a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sigB forward primer <400> 9 aagtgattcg taaggacgtc t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sigB reverse primer <400> 10 tcgataacta taaccaaagc ct 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sarA forward primer <400> 11 caaacaacca caagttgtta aagc 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sarA reverse primer <400> 12 tgtttgcttc agtgattcgt tt 22 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icaA forward primer <400> 13 ctggcgcagt caatactatt tcgggtgtct 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icaA reverse primer <400> 14 gacctcccaa tgtttctgga accaacatcc 30 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> isaA3 forward primer <400> 15 gctcaaatca tggctcaacg t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> isaA3 reverse primer <400> 16 ttgattcacg agcgatgatt g 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hla forward primer <400> 17 cggcacattt gcaccaataa ggc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hla reverse primer <400> 18 ggtttagcct ggccttcagc 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuc1 forward primer <400> 19 cacctgaaac aaagcatcct aa 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuc1 reverse primer <400> 20 tatacgctaa gccacgtcca t 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA forward primer <400> 21 tgtttgacga tgtttgagca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA reverse primer <400> 22 ccttcctcca gttcagatgc 20

Claims

수평균분자량이 679, 1300, 32000, 54000 및 240000으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 유효성분으로 포함하며, 상기 올리고(N-비닐카프로락탐)이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는, 바이오필름 억제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 바이오필름 억제용 조성물은 폴리(D,L-락티드-코글리콜라이드)(biodegradable poly(D,L-lactide-coglycolide, PLGA)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름 억제용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 표면 부착력을 저해함으로 바이오필름의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 바이오필름 억제용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 표면은 생물체 유래의 조직, 기관 또는 의료용 물건의 표면인 것을 특징으로 하는 바이오필름 억제용 조성물.
수평균분자량이 679, 1300, 32000, 54000 및 240000으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 유효성분으로 포함하며, 상기 올리고(N-비닐카프로락탐)이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는, 바이오필름 억제용 약학 조성물.
수평균분자량이 679, 1300, 32000, 54000 및 240000으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고(N-비닐카프로락탐)(oligo(N-vinylcaprolactam))을 인간을 제외한 생물체 또는 비생물체의 표면에 처리하는 단계;를 포함하며, 상기 올리고(N-비닐카프로락탐)이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는, 바이오필름 형성의 억제방법.