KR101763518B1 - 안트라퀴논 유도체를 포함하는 바이오필름 억제용 조성물 - Google Patents

안트라퀴논 유도체를 포함하는 바이오필름 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물에 대한 것으로, 상기 알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린은 황색포도상구균이 형성한 바이오필름을 억제하며, 황색포도상구균의 용혈 활성을 억제하므로 이를 바이오필름에 의해 유발되는 감염성 질환 치료용 약학 조성물, 항생제 또는 항균제의 항균효과 증진용 조성물, 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 또는 의료기기, 의료용 재료, 의료용 이식물을 코팅할 수 있는 코팅용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

안트라퀴논 유도체를 포함하는 바이오필름 억제용 조성물{Composition for inhibiting biofilm comprising anthraquinone derivatives}
본 발명은 병원성 미생물의 바이오필름 형성을 억제할 수 있는, 안트라퀴논 유도체를 포함하는 바이오필름 억제용 조성물에 대한 것이다.
세균이 감염된 부분에는, 폴리머(polymer) 기질로 감싸인 세균의 집락인 점액질이 존재할 때가 있다. 이 세균에 의해 형성된 점액질의 세균 복합체를 바이오필름(biofilm), 균막 또는 생물막이라고 부른다. 바이오필름은 고형(solid)의 생물학적 표면(biological surface)인 세균 집락을 비생물학적 표면(non-biological surface)이며 다당류와 폴리펩타이드로 이루어진 폴리머 기질인 외막이 둘러싼 복합체이며, 바이오필름 내부에서 세균은 서로 의사소통을 하고, 외부세계에 대하여 방어를 한다. 이를 통하여 바이오필름은 항생제를 포함한 여러 환경 스트레스(environmental stress) 아래에서도 세균의 생존을 가능하게 만든다.
이런 바이오필름은 일반 자연환경 외에 세균감염성 질환과 관련하여서도 자주 발견된다. 사람의 장기에 형성되기도 하고 치아의 플라크 형태로 나타나기도 하며, 산업용 장비나 의료용 이식 기구에 생길 수도 있다. 이런 탓에 바이오필름은 치주 질환(periodontal disease)이나 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)에 동반하는 폐렴, 중이(middle ear)에 생기는 이통(earache) 등을 연구하는 학자들의 관심 대상이 되어 왔다. 미국 국립보건연구소는 2002년 보고에서 박테리아 군의 최대 80%가 이 같은 바이오필름 형성을 통해 병원균을 퍼트리고 있는 것으로 추산했다.
별개로 부유하던 세균(planktonic bacteria)에 대해 약효를 나타내던 항생제도 세균이 바이오필름을 형성하면 효능을 상실하는 경향이 커진다. 세균이 바이오필름을 형성하면 바이오필름에 존재하는 외막을 항체 등이 투과할 수 없어 숙주의 면역체계(host immune system)를 무력화시키고, 항생제에 대한 세균의 저항성이 약 1,000배까지 높아질 수 있다. 이런 바이오필름 형성에 의한 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으나 다음의 3가지 정도로 설명된다. 첫 번째는 “미생물의 생태적 변화”이다. 바이오필름이 형성된 상태에서는 세균 사이의 결착력이 강화되어 결과적으로 세균집락이 잘 퍼지지 않게 되며 따라서 세균 증식도 저하되게 된다. 이렇게 되면 주위 환경과의 교환 작용에 대한 의존성이 약화되고, 대사 작용이 느려지며, 결과적으로 항생물질에 대한 감수성이 낮아지게 된다.
두 번째는 “점액성 다당류로 구성된 외막”의 물리적 특성이다. 외막을 형성하는 점액성 다당류들은 전기적 성질을 가지고 있어 항생 물질과 결합하려는 경향을 갖고 있으며 이렇게 항생 물질과 결합함으로써 항생 물질이 퍼지는 것을 방해한다. 즉 항생 물질이 개개의 세균까지 잘 전달되지 않게 되어 그 효능을 발휘하기 어렵게 된다.
세 번째는 일반적 항생제 내성 획득 기작과 관련 있는 추정으로 “억제 인자의 생산”이다. 항생 물질의 효능을 억제하는 억제 인자로 가장 많이 알려진 물질로는 슈도모나스균(pseudomonas)에 의하여 생산되는 베타-락타메이스(β-lactamases)를 들 수 있다. 바이오필름이 형성되면 그 바이오필름 속에 존재하는 내성이 없던 세균들도 주위의 내성 세균으로부터 수평 유전자 전이(horizontal gene transfer)를 통하여 내성 인자 관련 유전자를 획득하여 내성 세균화되는 경향이 있다. 즉, 감염부위에 바이오필름이 형성되게 되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있다.
이러한 이유들로 인하여 바이오필름이 형성되면 감염증 치료에 널리 사용되던 항생제의 작용이 어렵게 되어 결과적으로 항생제에 의한 치료 효과가 약화되며, 만성적인 세균 감염 상태에 돌입하게 된다. 이 경우 상기에 기술했듯이 세균들의 항생제에 대한 감수성이 낮아져 항생제를 사용해도 거의 효과가 없으며 이를 극복하기 위해 단순하게 항생제를 과다처방하면 세균의 항생제 내성만을 키우게 된다. 즉, 바이오필름이 형성된 세균 감염증은 단순히 항생제로만 치료하는 것은 더이상 효과적 치료가 되지 못함을 의미한다. 특히 바이오필름을 형성하고 있는 세균에 의한 감염은 여러 가지 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성(multi-drug resistance) 균에 의한 경우가 많아 더욱 문제가 심각해진다.
따라서 상기 문제를 해결하기 위하여, 바이오필름 또는 바이오필름에 존재하는 외막을 파괴할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
1. 한국등록특허 10-0781669호.
따라서 본 발명은 바이오필름 억제용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 항생제 또는 항균제의 항균효과 증진용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상과 항생제를 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항생제 또는 항균제의 항균효과 증진용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물을 제공한다.
본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물에 대한 것으로, 상기 알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린은 황색포도상구균이 형성한 바이오필름을 억제하며, 황색포도상구균의 용혈 활성을 억제하므로 이를 바이오필름에 의해 유발되는 감염성 질환 치료용 약학 조성물, 항생제 또는 항균제의 항균효과 증진용 조성물, 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 또는 의료기기, 의료용 재료, 의료용 이식물을 코팅할 수 있는 코팅용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 560개 생리활성물질(phytochemical)을 각각 처리한 후, 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 확인한 히스토그램이고,
도 2는 황색포도상구균 및 표피포도상구균에 대한 알리자린의 항바이오필름 활성을 확인한 결과이고,
도 3은 대장균 및 녹농균에 대한 알리자린의 항바이오필름 활성을 확인한 결과이고,
도 4는 균주의 슬라임(slime) 생성에 대한 알리자린의 억제 활성을 확인한 결과이고,
도 5는 다양한 농도의 알리자린 존재하에 황색포도상구균 세포의 성장을 확인한 결과이고,
도 6은 바이오필름 형성에 대한 안트라퀴논 유사 화합물의 억제 활성을 확인한 결과이고,
도 7은 균주인 MSSA 25923와 MRSA MW2에 의한 바이오필름 형성에 있어서, 안트라퀴논 유사 화합물의 억제 활성을 확인한 결과이고,
도 8은 황색포도상구균에 의한 바이오필름 형성에 대한 칼슘과 알리자린의 영향을 확인한 결과이고,
도 9는 알리자린 및 다른 안트라퀴논 유도체의 항용혈 활성을 확인한 결과이고,
도 10은 세포 응집에 대한 알리자린 및 다른 안트라퀴논 유도체의 영향을 확인한 결과이고,
도 11은 알리자린을 처리 또는 비처리한 황색포도상구균의 전사 프로필(Transcriptional profiles)을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 형성한 바이오필름을 억제하는 방법에 대하여 연구하던 중, 안트라퀴논 유도체인 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin)이 황색포도상구균의 바이오필름 형성과 용혈 현상을 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
상기 황색포도상구균은 그램 양성(Gram positive) 세균으로서 화농, 농양형성, 다양한 화농성 감염, 패혈증을 유발하는 병원성 미생물이다. 국내에서 조사된 항생제 메티실린에 대한 내성률이 평균 73%로 세계 최고 수준인 매우 유해한 병원균이다. 이는 항생제를 써도 죽지 않는 황색포도상구균이 73%가 된다는 뜻으로 내성이 매우 심각한 병원균이라고 할 수 있다. 또한, 황색포도상구균은 바이오필름을 형성할 수 있는 종이 많으며 바이오필름이 생성되면 약물 침투가 불가능하여 고질적인 감염 양상을 나타낸다. 이러하기 때문에, 황색포도상구균에 의한 바이오필름이 형성되면 만성적 감염증을 초래한다. 바이오필름이 형성된 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 치료는 다른 세균에 의해 형성된 바이오필름으로 인한 질환의 치료에 비해서도 특히 어렵다. 왜냐하면, 질환의 치료를 위해 약물을 사용해도 바이오필름으로 인한 약물전달의 어려움이 있을 뿐 아니라 설사 약물이 전달되었다 할지라도 내성 균주가 많은 황색포도상구균의 특성상 기존 항생제에 기반한 치료는 효과적이지 않다. 따라서 황색포도상구균에 의한 바이오필름 처치는 기존 항생제에 의존한 방법이 아닌 새로운 물질에 의한 접근이 필요하다.
따라서 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름 억제용 조성물을 제공한다.
상기 바이오필름은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 생성한 바이오필름이다.
또한, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 감염성 질환은, 충치, 치주염, 중이염, 근골계 감염, 괴사성 근막염, 담관계 감염, 골수염, 세균성 전립선염, 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 농가진, 균혈증, 심내막염, 장염, 낭포성 섬유증 폐렴, 멜로이도시스 (meloidosis), 병원내 감염 (nosocomial infection), ICU 폐렴, 요로 카테터 방광염 (urinary catheter cystitis), 복막 투석 (CAPD) 복막염 및 담도 배액관 폐쇄 (biliary stent blockage)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상과 항생제를 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항생제는 페니실린(penicillin)계, 세팔로스포린(cephalosporin)계, 모노박탐(Monobactam)계, 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계, 마크로라이드(macrolide)계, 테트라사이클린(tetracycline)계, 글리코펩티드(glycopeptide)계, 린코마이신(lincomycin)계 및 퀴놀론(quinolone)계로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 유효성분인 안트라퀴논 유도체의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항생제 또는 항균제의 항균효과 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품에는 상기 물질 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있으며, 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등의 형태로 제조될 수 있다. 일례로, 껌이나 차와 같은 형태로 제조되어 구강내 바이오필름 형성을 억제하여, 치아의 부식 예방, 치석 형성 예방, 잇몸 질환 예방 및 개선, 및 입 냄새 개선의 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 알리자린(Alizarin), 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물에 코팅될 수 있다. 일례로, 상기 코팅용 조성물로 피부, 치아와 같은 생물체 유래 조직 또는 기관을 코팅할 수 있으며, 각종 의료용 설비, 장비, 기구, 임시 또는 영구용 인공삽입 보형물인 렌즈, 인공판막, 페이스메이커, 수술용 핀, 삽입 도관, 카테터 등 의료용 물건을 코팅할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 참고예 1> 화합물
한국 화학 은행(Korea Chemical Bank, http://www.chembank.org, Daejeon, Republic of Korea)의 천연 제품 라이브러리(Natural Product Library)에 예치된 560개의 식물 유래 화학 물질의 라이브러리를 설립했다.
테르페노이드(terpenoids), 플라보노이드(flavonoids), 폴리페놀(polyphenol) 및 사포닌(saponins)을 포함하는 다양한 식물 소스(sources)로부터 상기 560개의 화합물을 정제하였고, 모든 화합물은 디메틸 설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해하였다.
알리자린(Alizarin), 안트라플라빅산(anthraflavic acid), 안트라퀴논(anthraquinone), (+)-카테킨((+)-catechin), 1,8-디히드록시안트라퀴논(1,8-dihydroxyanthraquinone), 1-히드록시안트라-9,10-퀴논(1-hydroxyanthra-9,10-quinone), 히드로퀴논(hydroquinone), 푸르푸린(purpurin), 피로카테콜(pyrocatechol) 및 퀴날리자린(quinalizarin)를 포함하는 9개의 다른 안트라퀴논-유사 화합물(anthraquinone-related compounds)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)에서 구매하였다.
< 참고예 2> 균주 준비
메티실린-민감성 황색포도상구균 균주(methicillin-sensitive S. aureus strains (MSSA; ATCC 25923 및 ATCC 6538), 메티실린-저항성 황색포도상구균 균주(methicillin-resistant S. aureus strain (ATCC BAA-1707, MRSA MW2)), 표피포도상구균(S. epidermidis (ATCC 14990)), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa PAO1, P.aeruginosa PAO1(ATCC 15692)) 및 대장균(Escherichia coli O157:H7, E.coli O157:H7(ATCC 43895, EDL933))을 본 실험에 사용하였다.
두 MSSA 균주, 표피포도상구균, 녹농균 PAO1, E.coli O157:H7은 37℃에서 LB 배지로 배양하였고, MRSA 균주는 0.2% 글루코스(glucose)를 포함하는 LB 배지로 배양하였다.
< 실시예 1>
1. 균주의 성장 측정
균주의 성장 측정을 위해, 콜로니 형성 유닛(colony forming uints, CFUs)은 LB 아가(agar) 플레이트에 형성된 세포 배양을 확인하였다.
최소 저지 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 실험을 위해, 세포를 LB 배지에 접종하였고, 1:100으로 희석한 후 37℃에서 밤새 배양하였다.
순차 희석(serial dilution) 후에, LB 아가 플레이트에 배양물(cultures)을 도말하고, 37℃에서 24시간 배양한 후 세포 콜로니를 계수하였다.
2. 크리스탈 -바이올렛 바이오필름(Crystal-violet biofilm assay) 분석
6 종류 균주의(MSSA 6538, MSSA 25923, MRSA MW2, 표피포도상구균, 녹농균 PAO1 및 E.coli O157:H7) 고정된 바이오필름 형성 분석은 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences, Korea)에서 수행하였다.
600nm에서 초기 탁도(initial turbidity) 0.05일때 세포들을 LB 배지에 접종하였다(총 볼륨 300 μl).
접종 시작 단계에서 다양한 안티바이오필름(antibiofilm) 시약을 다양한 농도로 첨가한 후, 진탕없이 37℃에서 24시간 배양하였다.
바이오필름 형성을 수량화하기 위해, 바이오필름을 크리스탈 바이올렛으로 20분간 염색하였고, 95% 에탄올의 300 μl에 용해하였고, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(OD570).
96웰 플레이트에서 세포 성장은 620nm에서 측정하였다(OD620). 바이오필름 형성 및 고정된 세포의 성장의 결과는 12개의 복제 웰과 두 개의 독립적인 배양의 평균을 통해 확인하였다.
3. 바이오필름 세포 카운팅 분석( Biofilm cell counting assay)
바이오필름 억제 효과를 확인하기 위해, 바이오필름 세포에 대한 생존(viable) 세포를 계수하였다. 바이오필름 세포를 알리자린(alizarin) 포함 또는 비포함하에 96웰 플레이트에서 배양하였고, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다.
바이오필름 세포를 PBS 300μl에 재현탁시킨 후, 60초간 강하게 파이펫팅하고 30초간 볼텍싱(vortexing)하여 바이오필름을 깨뜨렸다.
그 후, 시리얼 희석을 수행하였고, LB 아가 플레이트에 분주하였다. 밤새 37℃에서 배양한 후, CFU를 계수하였다.
바이오필름 세포를 확실히 파괴하기 위해, 강한 파이펫팅 후 크리스탈-바이올렛 바이오필름 분석을 수행하였다.
4. 콩고 레드 아가(Congo red agar, CRA )를 사용한 슬라임 (Slime) 분석
콜로니 형태(morphologies)와 표현형(phenotypic) 변화를 CRA를 이용하여 확인하였다.
CRA는 37 g/L의 BHIB(brainheart infusion broth, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), 36 g/L의 수크로스(sucrose, Sigma, St. Louis, MO, USA), 15 g/L의 아가(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 및 0.8 g/L의 콩고 레드(Sigma, St.Louis, MO, USA)로 구성되었다.
황색포도상구균 세포(MSSA 6538, MSSA 25923, MRSA MW2 및 표피포도상구균)를 알리자린 포함 또는 비포함하에 CRA에 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후, 이미지를 촬영하였다.
5. 공초점 레이저 현미경 및 COMSTAT 분석
유리 표면에서 황색포도상구균(MSSA 6538, MSSA 25923 및 MRSA MW2)의 바이오필름 형성을 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy, Nikon Eclipse Ti, Tokyo)을 이용하여 측정하였고, 배지에서 성장한 황색포도상구균에 의한 바이오필름과 비교하였다. 황색포도상구균 세포는 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Catalog #:C34554 Invitrogen, Molecular Probes, Inc, Eugene, USA)로 염색하였다.
세포 내부에 수동적으로 확산될 때까지 미미한 형광을 띄었지만, 에스테라아제(esterase)의 절단된 아세틸기(acetyl group) 및 분자는 현저하게 형광을 띄었다.
따라서, 상기 형광염료는 바이오필름 구조에서 생존 세포를 표적한다는 것을 알 수 있었다.
진탕없이 24시간동안 37℃에서 바이오필름을 96웰 플레이트에 형성한 후, 세포들을 2차례 PBS로 세척하였다. 이를 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(PBS 내 2.8 μg/ml)로 37℃에서 20분간 염색하였다.
염색된 세포는 PBS로 2회 세척하였고, 현미경으로 관찰하였다. 샘플들을 40x 대물렌즈(objective) 및 Ar 레이저(여기 파장(excitation wavelength) 488 nm 및 방사 파장(emission wavelength) 500 - 550 nm)를 이용하여 가시화하였다.
동일한 균주의 모든 공초점 이미지는 같은 조건하에서 캡쳐하였다.
컬러 공초점 이미지는 NIS-Elements C 버전 3.2(NIS-Elements C version 3.2, Nikon eclipse)를 이용하여 얻었다.
각 실험의 경우, 현미경 분석을 위해 3개의 독립적인 배양에서 최소 4개의 임의의 위치를 선택하였다.
바이오필름 형성과 컬러 공초점 이미지(20 이미지 스택(image stacks))를 정량화하기 위해, 이미지 J(Image J)를 사용하여 회색 스케일로 전환하였다.
COMSTAT 바이오필름 소프트웨어는 바이오매스(biomass, μm3 per μm2), 평균 두께(mean thicknesses, μm) 및 하층의 적용 범위(substratum coverages(%)를 결정하기 위해 사용하였다.
임계값(Thresholding)은 모든 이미지 스택(image stacks)을 위해 고정하였고, 적어도 4 개의 위치와 위치 당 20 평면 화상(planar images)을 분석하였다.
6. 용혈분석( Hemolysis assay)
용혈 분석은 영남 대학교의 윤리 위원회(Yeungnam University, Gyeongsan, Korea)를 통해 승인되었고, 윤리 위원회의 지침을 따라 수행하였다.
모든 참가자는 혈액 수집 및 연구를 위한 동의서를 작성하였고 제공했다.
바이오필름 저해제의 존재하에 전체 배양물에서 황색포도상구균 성장을 확인하여 인간 적혈구 용해 효능(Human red blood cell lysis efficacies)을 측정하였다.
황색포도상구균 세포(MSSA 6538)를 LB 배지에서 1:100으로 희석하고 본 발명에 따른 화합물 존재 또는 비존재하에 250rpm으로 20시간 배양하였다.
세포 배양물(세포 및 상등액)을 희석된 인간 적혈구 세포에 첨가하였다(890xg로 2분간 원심분리하여 분리한 후, PBS로 3번 세척(330 μL의 적혈구 세포/10 ml의 PBS 버퍼)).
용혈성 활동을 결정하기 위해 혈액과 황색포도상구균(세포 배양액 200 μL)의 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. 배양물을 16,600 xg로 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였고, 543nm에서 광학 밀도(optical densities)를 측정하였다.
7. 세포 응집 분석(cell aggregation assay)
황색포도상구균 세포(MSSA 6538)를 알리자린-유사 화합물(alizarin-related compounds) 존재 또는 비존재하에 2ml LB 배지에 접종하였고 250rpm으로 진탕하며 20시간 배양하였다.
16,600 xg로 2분간 원심분리하여 1ml의 세포 배양물을 회수하였고, 세포들을 PBS로 3번간 세척하였다. 세척된 세포들을 3ml의 PBS에 재현탁하고 실온에서 20시간 동안 세워두었다.
세워두었던 튜브 상단의 세포 혼탁도(turbidity)를 분광광도계(spectrophotometer, UV/Vis, spectrophotometer, Optizen, Korea)를 이용하여 OD600에서 측정하였다.
8. RNA 추출
qRT-PCR(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)실험을 위해, 황색포도상구균 세포의 RNA를 다음 절차에 따라 분리하였다.
황색포도상구균 세포(MSSA 6538)를 25ml의 LB 배지에 접종하고 밤새 배양하였고, 이를 1:100 으로 희석한 후 250rpm으로 3시간 진탕하여 배양하였다.
중요한 항바이오필름(antibiofilm)과 항용혈(antihemolytic) 활성을 보인 20μg/ml의 알리자린을 첨가하고 추가로 2시간 더 배양하였다.
샘플을 수집하기 전, RNase 억제제(Ambion, TX, USA)를 플랑크톤 세포에 첨가하였고, RNA 디그레데이션(degradation)를 예방하기 위해, 즉시 95% 에탄올 및 드라이 아이스를 이용해서 30초동안 냉각하였다.
세포들을 16,600 xg로 1분 동안 원심분리하였고, 세포 펠렛을 즉시 드라이아이스로 냉각하고 80℃에서 저장하였다.
RNA는 퀴아젠 RNeasy 미니 키트(Qiagen RNeasy mini kit, valencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. 모든 DNA를 제거하기 위해, 정제된 RNA에 DNase Ⅰ의 30 유닛(units)과 15분간 처리하였다. RNA의 질은 NanoVue Plus(Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 사용하여 평가하였다.
9. 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)
황색포도상구균 세포(MSSA 6538)에서 중요한 바이오필름-관련된 유전자(agrA, aur, cidA, cidB, cidR, clfB, clp9, coa, hla, icaA, icaD, icaR, isaA, lrgA, lrgB, nuc1, nuc2, psmα, rbf, sarA, sigB 및 spa)의 전사체적 레벨을 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다.
이러한 유전자에 대한 특이적인 프라이머와 16s rRNA(하우스키핑 대조군(housekeeping control)에 대한 적절한 프라이머를 사용하였다(표 1 및 표 2).
유전자 명칭 서열 방향 서열
번호
16S
rRNA 		A component of ribosomes 5'-TGT TTG ACG ATG TTT GAG CA-3' 정방향 1
5'-CCT TCC TCC AGT TCA GAT GC -3' 역방향 2
agrA
Quorum-sensing regulator A 5'-TGA TAA TCC TTA TGA GGT GCT T-3' 정방향 3
5'-CAC TGT GAC TCG TAA CGA AAA-3' 역방향 4
aur Zincmetalloproteinase aureolysin 5'-ACC GTG TGT TAA TTC GTG TGC TA-3' 정방향 5
5'-ATG GTC GCA CAT TCA CAA GTT T-3' 역방향 6
cidA
Holin-like protein 5'-AGC GTA ATT TCG GAA GCA ACA TCC-3' 정방향 7
5'-TAC CGC TAA CTT GGG TAG AAG ACG-3' 역방향 8
cldB
Holin-like protein 5'-TGT TTT TGT TGA CTG TCG TT-3' 정방향 9
5'-TCA TGT GAC ACT TCG ATA CC-3' 역방향 10
cidR
LysR-type regulator 5'-TGG TGC ATT CCA TCA ACA AT-3' 정방향 11
5'-ATT TTG CGA GTC GAT GCT CT-3' 역방향 12
clfB
Clumping factor B 5'-TGC AAG ATC AAA CTG TTC CT-3' 정방향 13
5'-TCG GTC TGT AAA TAA AGG TA-3' 역방향 14
clp9
Serine protease 5'-CAG GTA CCA TCA CTT CAT C-3' 정방향 15
5'-GGT TCA CAA ATT GAT GAC AAC G-3' 역방향 16
coa
Coagulase
 5'-CAC GGA AAT GGC CAA GTA TC-3' 정방향 17
5'-TCG GAC GAG CTC CAT ATG AT-3' 역방향 18
hla
α-Hemolysin
 5'-CGG CAC ATT TGC ACC AAT AAG GC-3' 정방향 19
5'-GGT TTA GCC TGG CCT TCA GC-3' 역방향 20
icaA
Intercellular adhesion A 5’-TGA ACC GCT TGC CAT GTG-3’ 정방향 21
5’-CAC GCG TTG CTT CCA AAG A-3’ 역방향 22
icaD
Intercellular adhesion D 5'-ACC CAA CGC TAA AAT CAT CG-3' 정방향 23
5'-GCG AAA ATG CCC ATA GTT TC-3' 역방향 24
icaR
Intercellular locus regulator 5'-TCG AAC TAT TCA ATT GAT GCT TTA-3' 정방향 25
5'-CAG AAA ATT CCT CAG GCG TA-3' 역방향 26
isaA
Transglycosylase 5'-GCT CAA ATC ATG GCT CAA CGT-3' 정방향 27
5'-TTG ATT CAC GAG CGA TGA TTG-3' 역방향 28
lrgA
Anti-hollin-like protein 5'-TGA AAC AAC AAA AAG ACG CAT CAA AAC CAG-3' 정방향 29
5'-ACT TCG CCT AAC TTA ACA GCA CCA G-3' 역방향 30
유전자 명칭 서열 방향 서열
번호
lrgB
Anti-hollin-like protein 5'-TCG GAG GTA TTG GTA TCG-3' 정방향 31
5'-CTG CTT GAG GTA ACA TTG A-3' 역방향 32
nuc1
Nuclease
 5'-CAC CTG AAA CAA AGC ATC CTA A-3' 정방향 33
5'-TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT-3' 역방향 34
nuc2
Nuclease 5'-ATG GAC GTG GCT TAG CGT AT-3' 정방향 35
5'-TGA CCT GAA TCA GCG TTG TC-3' 역방향 36
psmα
Phenol soluble modulins α 5'-ACC CAT GTG AAA GAC CTC CTT TGT-3' 정방향 37
5'-ATG GGT ATC ATC GCT GGC ATC-3' 역방향 38
rbf Regulator of biofilmformation 5'-TTA GAA GGA ATC TTT AAA ACC TTA TTG AAT AA-3' 정방향 39
5'-TTG TGA ATT TTT CTT CTT CGG ACA-3' 역방향 40
sarA Transcriptional regulator 5'-GAG TTG TTA TCA ATG GTC-3' 정방향 41
5'-GTT TGC TTC AGT GAT TCG-3' 역방향 42
sigB
RNA Polymerase sigma factor 5'-AAG TGA TTC GTA AGG ACG TCT-3' 정방향 43
5'-TCG ATA ACT ATA ACC AAA GCC T-3' 역방향 44
spa
Protein A
 5'-ACC AGA AAC TGG TGA AGA AAA TCC-3' 정방향 45
5'-TAA CGC TGC ACC TAA GGC TAA TG-3' 역방향 46
16s RNA의 발현 레벨은 목적하는 유전자의 발현을 정규화하기 위해 사용하였다.
qRT-PCR은 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green master mix, Applide Biosystems, Foster City, USA) 및 ABI스텝온 리얼-타임 PCT 시스템(ABI StepOne Real-Time PCR system, Applied Biosystems)를 이용하여 이미 공지된 방법(PloS one 7, e41075 (2012))을 따라 수행하였다.
각 유전자에 대한 여섯 개의 qRT-PCR 반응물과 3개의 독립적인 배양을 이용하여 발현 레벨을 결정하였다.
10. 결과
1) 알리자린의 황색포도상구균 및 표피포도상구균에 의한 바이오필름 형성 억제 효과 확인
96 웰 폴리스티렌 플레이트에서 황색포도상구균 MSSA 6538에 대한 항바이오필름 활동에 대하여 560개의 정제된 식물성 화학물질을 스크리닝한 결과, 도 1과 같이, 10μg/ml의 알리자린이 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 가장 억제하였다.
560개의 화학물질 중 20개가 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 60% 이상 억제하였고, 9개는 바이오필름 형성을 60% 이상 강화하였다.
더불어 균주 배양 시작 시 알리자린(0, 1, 2, 5, 10, 50 및 100 μg/ml)의 추가는 세 종류의 황색포도상구균 균주(MSSA 6538, MSSA 25923 및 MRSA MW2)와 표피포도상구균(ATCC 14990) 균주의 바이오필름 형성을 농도 의존적으로 억제하였다(도 2A 내지 2D).
특히 10μg/ml의 알리자린은 3 종류 황색포도상구균 균주의 바이오필름 형성을 90% 이상 억제하였고, 50μg/ml에서는 표피포도상구균의 바이오필름 형성을 70% 이상 억제하였다.
반면, 그람-양성균(Gram-positive bacteria)와 달리, 두 종류의 그람-음성균(Gram-negative bacteria)인 E.coli O157:H7 및 녹농균 PAO1에 의한 바이오필름 형성은 알리자린 100μg/ml까지도 영향을 받지 않았다(도 3).
유리 표면의 바이오필름 형성과 폴리스테린 플레이트를 이용해 수득한 96-웰 바이오필름 데이터 및 라인에서의 변화를 분석하기 위해 공초점 레이저 현미경을 사용하였다. 형광 이미지를 통해 알리자린(0, 2 및 10μg/ml)이 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다(도 2E).
COMSTAT 바이오필름 분석을 통해 바이오필름 억제를 확인하였다. 10μg/ml의 알리자린은 처리하지 않은 대조군에 비해, 3 종류 황색포도상구균 균주의 바이오필름 파라미터(생물량(biomass), 평균 두께(mean thickness) 및 기질 범위(substratum coverage))를 80% 이상 저해하였다(표 3).
균주 알리자린 부피/영역
(Volume/Area, μm 3 μm -2 ) 		평균 두께( μm ) 기질 범위( % )
MSSA 6538

 없음 12±1 11±1 99±1
2μg/ml 7.3±0.9 6.7±0.7 84±9
10μg/ml 0.9±0.2 0.7±0.1 32±9
MSSA 25923

 없음 4.0±0.5 3.8±0.6 88±10
2μg/ml 2.5±0.3 2.7±0.3 66±4
10μg/ml 0.8±0.3 0.9±0.3 24±9
MRSA MW2

 없음 5.5±0.6 5.8±0.9 91±7
2μg/ml 1.7±0.3 2.8±0.5 35±5
10μg/ml 1.6±0.2 1.9±0.2 37±7
MSSA 6538의 바이오필름 생물량(biomass)은 10μg/ml 알리자린 존재하에 12 μm3 μm-2 에서 0.9 μm3 μm- 2 로 감소되었다.
바이오필름 세포에 대한 생존 세포 개수 확인도 알리자린에 의한 바이오필름 억제를 확인하기 위해 수행하였다(표 4).
균주 없음 알리자린
2μg /ml 		알리자린
10μg /ml 		알리자린
100μg /ml
MSSA 6538 159±10×106 86±13×106 21±2×106 N/A
MSSA 25923 167±11×106 102±15×106 49±5×106 N/A
MRSA MW2 41±6×106 10±4×106 4±1×106 N/A
표피포도상구균 40±6×106 N/A 12±2×106 5±1×106
다른 바이오필름 분석과 마찬가지로, 알리자린은 4 종류의 황색포도상구균의 바이오필름에서 생존 세포의 수를 농도의존적으로 감소시켰다.
10μg/ml 알리자린 존재하에 MSSA 6538 및 MRSA MW2의 바이오필름에서 생존 세포의 개수는 처리하지 않은 대조군에 비해 7배 이상 감소되었다.
종래 바이오필름 형성 황색포도상구균을 검출하는데 사용되는 콩고 레드 플레이트를 이용한 점액 검출을 통해, 황색포도상구균 균주에 의한 점액 생산이 20 μg/ml 알리자린에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 4).
특히, 표피포도상구균은 적은 점액을 생산하는 반면, 2 종류의 황색포도상구균 균주(MSSA 6538 및 MRSA MW2)는 많은 양의 점액을 생산하였다.
이상적인 바이오필름 억제제는 균주의 약에 대한 내성을 이끌 수도 있기 때문에 균주를 죽이지 않는 것이 좋다. 따라서, 알리자린의 항균성 활성을 MIC 측정을 통해 확인하였다.
황색포도상구균에 대한 MIC는 항바이오필름 활성에 필요한 농도(10 μg/ml)보다 100배 더 높았다. 또한 알리자린은 20μg/ml의 농도까지 황색포도상구균 플랑크톤 세포의 성장을 지연시키지 않았다(도 5).
이를 통하여 알리자린에 의해 감소된 바이오필름 형성은 항균 활성이 아닌 항바이오필름 활성에 의한 것임을 알 수 있었다.
2) 안트라퀴논 유도체의 항바이오필름 활성 확인
알리자린(1,2-dihydroxyanthraquinone)은 안트라퀴논의 일종이기 때문에, 11 종의 다른 안트라퀴논 유사 화합물의 항바이오필름 활성을 조사하였다(도 6A).
11종의 안트라퀴논 유사 화합물 중 알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린은 10μg/ml 농도에서 황색포도상구균 MSSA 6538의 바이오필름 형성을 대조군에 비해 70%이상 억제하였다(도 6B).
흥미롭게도, 황색포도상구균에 대한 항바이오필름 활성은 히드록실 유닛(hydroxyl units)의 수 및 위치와 밀접한 관련이 있다는 것을 알 수 있었다(도 6).
알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린 모두 C-1 및 C-2 위치에서 두 개의 히드록시기(hydroxyl)를 보유하고 있으므로, 항바이오필름 활성에 대해 중요한 역할을 할 것으로 예상되었다(도 6A).
그러나 벤젠 구조이며 2개의 히드록시기 유닛을 가지는 피로카테콜(pyrocatechol, 1,2-dihydroxybenzene)은 이러한 항바이오필름 활성을 보이지 않았다. 따라서 안트라퀴논 백본(backbone)과 C-1 및 C-2 히드록시기 유닛은 항바이오필름 활성에서 중요하다는 것을 확인하였다.
두 황색포도상구균인 MSSA 25923 및 MRSA MW2에 대한 항바이오필름 활성도 같은 경향으로 관찰되었다(도 7).
알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린 중 알리자린이 가장 큰 항바이오필름 활성을 보였다.
3) 알리자린의 바이오필름 형성 억제 활성 및 Ca 2 + 의 영향
Ca2 +의 첨가는 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 알려져 있으며(Colloid Surface B 103, 448-454 (2013)), 알리자린은 칼슘/알루미늄(calcium/aluminum) 복합체를 형성한다(도 8A).
따라서, 황색포도상구균 MSSA 6538의 바이오필름 형성에 대한 알리자린과 칼슘의 영향을 확인한 결과, CaCl2 및 Ca(NO3)2는 농도 의존적으로 황색포도상구균의 바이오필름 형성을 억제하였으며, 특히 알리자린의 항바이오필름 활성은 Ca2 +에 의해 증가되었다(도 8B).
더욱이, Ca2 +의 바이오필름 억제 활성은 칼슘-특이적 킬레이트 시약인 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)에 의해 사라진 반면, EGTA 단독으로는 바이오필름 형성에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 8C).
또한, 알리자린 존재하에 EGTA를 추가하면 알리자린의 항바이오필름 활성이 감소되었다.
그러므로 황색포도상구균에 대한 알리자린의 항바이오필름 활성은 Ca2 +가 관여한다는 것을 확인하였다.
4) 황색포도상구균에 대한 알리자린 및 다른 안트라퀴논의 항용혈 활성(Anti-hemolytic activity) 확인
황색포도상구균은 α-톡신(α-toxin)을 생산하며, 이는 용혈을 야기하고, 바이오필름 형성에 기여한다. 따라서 황색포도상구균에 의한 혈액 용혈에서 알리자린 및 10개의 다른 안트라퀴논 유사 화합물의 영향을 조사하였다.
황색포도상구균 MSSA 6538에서 앞서 항바이오필름 활성을 보인 알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린은 10μg/ml의 농도에서 70% 이상의 용혈 활성 억제 효과를 보였다(도 9A).
1-히드록시안트라-9,10-퀴논(1-hydroxyanthra-9,10-quinone) 및 1,8-디히드록시안트라퀴논(1,8-dihydroxyantraquinone) 또한 항욜혈 활성을 보였다. 따라서 황색포도상구균의 용혈 활성에 대한 억제효과에서 안트라퀴논의 C-1에서 히드록시기 유닛이 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
알리자린, 푸르푸린 및 퀴날리자린에 의한 바이오필름 억제는 황색포도상구균의 용혈 활성의 억제와 연관이 있을 가능성도 예상되었다.
따라서, 알리자린(0, 5, 10, 및 20 μg/ml)은 황색포도상구균의 용혈을 농도 의존적으로 감소시켰고, 20 μg/ml의 알리자린(84μM)은 황색포도상구균 용혈 활성을 완벽하게 차단하였다(도 9B).
5) 세포 응집에 대한 영향 확인
폴리페놀은 단백질에 결합하여 불용성 응집체(insoluble aggregates)의 형성을 야기하기 때문에, 응집 유도에 대하여 11개의 안트라퀴논 유사 화합물의 영향을 조사하였다.
그 결과, 알리자린 및 퀴날리자린은 황색포도상구균 MSSA 6538의 응집을 야기하였다(도 10A).
더불어, 알리자린은 농도 의존적으로 세포 응집을 증가시켰다(도 10B).
알리자린 및 퀴날리자린의 응집 결과와 항용혈 활성 및 항바이오필름 활성은 부분적으로 유사한 패턴을 보였다.
6) 바이오필름- 및 독성-관련 유전자 발현에 대한 알리자린의 영향 확인
황색포도상구균 MSSA 6538에 대한 알리자린의 항바이오필름 및 항용혈 활성에 대한 메커니즘을 조사하기 위해, 실시간 qRT-PCR(Real-time qRT-PCR)을 통해 플랑크톤 황색포도상구균 세포의 22개 바이오필름- 및 독성-관련 유전자의 발현 차이를 확인하였다.
그 결과 알리자린은 많은 유전자의 발현을 변경하였다(도 11).
앞서 확인한 알리자린의 항용혈 활성과 마찬가지로, 알리자린은 α-헤모실린 유전자(α-hemolysin, hla)의 발현을 9배 이상 억제하였다(도 11A).
더불어 바이오필름 관련된 유전자인 psmα(phenol soluble modulins α), rbf(clumping factor B), 및 spa(surface protein A)의 발현을 크게 억제하였다(도 11A).
더욱이, 알리자린은 홀린-안티홀린 시스템(holin-antiholin system)에 기여하는 것으로 알려진 유전자 cid/lrg의 발현을 차단하였다. cidB(holin-like protein)의 발현을 13배 이상 유도하였고, lrgAB(antigolin protein)의 발현을 억제하였다(도 11B).
그러나, 세포간 부착 로커스 유전자(intercellular adhesion locus genes)인 icaA , icaD, 및 icaR와 단백질 분해효소(proteases) 유전자인 aur 및 clp9와 같은 다른 바이오필름 관련 유전자와 바이오필름 레귤레이터(biofilm regulators)인 clfB, coa isaA, 및 sarA는 알리자린에 영향을 받지 않았다.
더불어, 알리자린은 agaA와 핵산가수분해효소(nuclease) 유전자인 nuc1 및 nuc2의 발현을 억제하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Composition for inhibiting biofilm comprising anthraquinone derivatives <130> ADP-2016-0057 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA forward primer <400> 1 tgtttgacga tgtttgagca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA reverse primer <400> 2 ccttcctcca gttcagatgc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA forward primer <400> 3 tgataatcct tatgaggtgc tt 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agrA reverse primer <400> 4 cactgtgact cgtaacgaaa a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aur forward primer <400> 5 accgtgtgtt aattcgtgtg cta 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aur reverse primer <400> 6 atggtcgcac attcacaagt tt 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cidA forward primer 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Claims (10)

  1. 알리자린(Alizarin)을 포함하며, 상기 알리자린이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름 형성을 억제하는, 바이오필름 억제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름 억제용 조성물.
  3. 알리자린(Alizarin)을 포함하며, 상기 알리자린이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름 형성을 억제하는, 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 감염성 질환은, 충치, 치주염, 중이염, 근골계 감염, 괴사성 근막염, 담관계 감염, 골수염, 세균성 전립선염, 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 농가진, 균혈증, 심내막염, 장염, 낭포성 섬유증 폐렴, 멜로이도시스 (meloidosis), 병원내 감염 (nosocomial infection), ICU 폐렴, 요로 카테터 방광염 (urinary catheter cystitis), 복막 투석 (CAPD) 복막염 및 담도 배액관 폐쇄 (biliary stent blockage)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 알리자린(Alizarin)을 포함하며, 상기 알리자린이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름 형성을 억제하는, 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 건강기능식품은 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름에 의해서 유발되는 감염성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 알리자린(Alizarin)을 포함하며, 상기 알리자린이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 바이오필름 형성을 억제하는, 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 조성물은 푸르푸린(Purpurin), 퀴날리자린(Quinalizarin) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 조성물은 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물에 코팅되는 것을 특징으로 하는 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코팅용 조성물.








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