KR101705811B1 - Compositions for culuring and Promoting Cell Proliferation Comprising Sclareol - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 생리활성물질인 스클라레올(sclareol)을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 세포 증식 촉진, 동물성 혈청을 대신한 세포 배양용 조성물, 및 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 상처 재생 또는 피부 재생을 위한 피부 상태 개선용 조성물의 용도를 가진다.The present invention relates to a composition comprising sclareol, which is a novel physiologically active substance, and relates to a composition for promoting cell proliferation, a composition for cell culture in place of animal serum, and a composition for improving cell proliferation, A composition for improving skin condition for wound regeneration or skin regeneration.
Description
본 발명은 스클라레올(sclareol)을 포함하는 세포 배양용 조성물 및 이를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 스클라레올을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 스클라레올 또는 상기 세포 배양용 조성물을 이용하여 배양된 세포 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for cell culture comprising sclareol and a cell culture medium containing the same. The present invention also relates to a composition for promoting cell proliferation comprising the sclareol. The present invention also relates to a skin condition improving composition comprising the cell culture medium cultured using the sclareol or the cell culture composition.
생물의약품의 여러 생산기술 가운데 하나인 동물세포 산업화 기술은 유전자가 조작된 인간 및 동물세포를 대량으로 배양하여 고부가가치의 생물의약품을 생산하는 기술로 각광받고 있으며, 최근 유전자 치료(gene therapy) 및 세포 치료(cell therapy) 기법의 개발로 인해 산업화 기술로서의 중요성이 더욱 강조되고 있다. 일반적으로 동물세포 유래 의약품 생산 공정 개발은 생산 제품의 안전성 확보와 세포 생산성에 의한 높은 생산비의 절감 등에 역점을 두고 있다. 현재까지 사용되고 있는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 하며 가장 널리 사용되는 혈청으로 Fetal Bovine Serum (FBS) 나 Fetal Calf Serum (FCS)이 있다. 이들 첨가 성분의 기능은 명확하진 않지만 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 성분이 배제된 경우에는 세포배양 자체가 거의 안 되는 필수 성분이다. 그러나 고가의 혈청은 배지가격을 상승시키고 또한 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 혈청은 동물 유래이기 때문에 배양과정 중에 세포들이 바이러스나 감염성 프리온 등에 오염될 가능성이 상존한다. 소혈청에 감염된 프리온은 사람에게 그대로 전이될 수 있으므로 동물세포 배양은 여러 가지 안전장치를 하고 있음에도 여전히 감염가능성은 존재한다고 해야 할 것이다. 통상 혈청 사용시 다음과 같은 문제점을 수반한다: i) 혈청의 조성 변이 때문에 세포에 대한 성장촉진 능력에 있어서 변이가 크다; ii) 인간에게 사용될 세포 생산물의 제조 시, 혈청이 감염물질에 의한 오염 잠재성을 가지고 있다; iii) 상업적으로 제조된 FBS나 FCS에서 박테리오파아지(bacteriophage)와 보바인 바이러스(bovine virus)가 검출된다; iv) 박테리아 오염 때문에 생긴 각종 독소(toxin)로 인해 세포배양 억제 물질도 함유된다; v) 여과(filteration) 전에는 오염으로 인한 세균성 독소(bacterial toxin)가 존재한다; vi) 세포배양에 있어 생물학적 오염원(mycoplasmas, bacteriophages, viruses)이 되기도 한다; vii) 감마-글로불린 분획에 배양액과 교차반응(cross reaction)하는 항체 및 세균이 분비한 독소를 함유한다; viii) 열 불활성화(heat inactivation)는 면역글로불린의 세포독성(cytotoxin) 작용을 감소시키지만 불안정한 구성물질까지 파괴되어 열처리하지 않은 혈청보다 만족한 결과가 항상 나타나는 것은 아니다; ix) 혈청 단백질의 흡착/결합에 의한 세포표면의 변형이 유도된다; x) 세포생산물의 분리 시 방해의 원인이 된다; xi) 1차 배양시에 섬유아세포의 과도한 성장이 조장된다.Animal cell industrialization technology, which is one of the various production technologies of biologics, is attracting attention as a technology to produce high value-added biologics by cultivating large quantities of genetically engineered human and animal cells. Recently, gene therapy and cell The importance of industrial technology has been emphasized by the development of cell therapy techniques. Generally, the development of pharmaceutical production process based on animal cells is focused on securing the safety of production products and reducing the high production cost by cell productivity. In animal cell culture methods used up to now, serum must be supplied to the cell culture medium for growth. Fetal Bovine Serum (FBS) and Fetal Calf Serum (FCS) are the most widely used serum. Although the function of these added components is not clear, it is known that it plays a role of growth promoting action, supply of nutrients, protection of cells from oxidation or toxin, and when these components are excluded, it is an essential ingredient which cell culture itself hardly occurs. However, expensive sera not only raises the price of the medium but also makes it difficult to purify the recombinant protein due to the complex components thereof, and there is a possibility that different results are produced every time the experiment is performed because of the difference in the components in each process. Since the serum is derived from an animal, there is a possibility that the cells are contaminated with viruses and infectious prions during the culturing process. Prions infected with bovine serum may be transferred to humans, so animal cell culture should be said to be susceptible to infection even though it has several safeguards. The usual use of serum involves the following problems: i) the variability of the composition of the serum is highly variable in its ability to stimulate growth of cells; ii) In the production of cell products to be used in humans, the serum has a potential for contamination by infectious agents; iii) Bacteriophages and bovine viruses are detected in commercially produced FBS or FCS; iv) cell culture inhibitors are also contained due to various toxins caused by bacterial contamination; v) Before filtration there is a bacterial toxin due to contamination; vi) it is also a source of biological contaminants (mycoplasmas, bacteriophages, viruses) in cell culture; vii) gamma-globulin fractions contain antibodies and bacterial secreted toxins cross-reacting with the culture medium; viii) Heat inactivation reduces the cytotoxic action of immunoglobulins, but does not always result in satisfactory results than serum that has been destroyed by unstable constituents and not heat-treated; ix) induction of cell surface deformation by adsorption / binding of serum proteins; x) causes disturbances in the separation of cell products; xi) Over-growth of fibroblasts is promoted during primary culture.
1950년대에 합성배지로 자연배지를 부분적으로 대체할 수 있다고 보고된 이후로 혈청없이 세포배양을 하려는 시도를 하게 되었고, 현재는 특정목적을 위하여 일부의 경우에 혈청없이 세포배양을 하고 있다. 그러나, 이들 무혈청배지는 특정세포만 잘 자라게 하고 혈청 대신에 사용하는 단백질성 세포성장인자 등이 너무 고가인데다 혈청을 포함한 배지에서보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못하다고 보고되고 있다. 또한 무혈청배지는 줄기세포의 배양에는 적용이 불가능한 것으로 알려져 있다. 줄기세포를 상업적으로 이용한 분야에서 가장 중요한 분야가 세포치료제로써 인체에서 얻어진 줄기세포를 시험관에서 배양한 후 다시 환자에게 투입하는 방식의 치료기술이다. 이러한 분야에서는 반드시 줄기세포 배양과정을 거치게 되는데 가능한한 동물성배지나 혈청을 피하는 것이 중요하다. 질병 치료 목적으로 줄기세포를 이식하는 경우 얻는 치료 이득을 고려할 때 이에 따르는 감염 위험은 감수될 수 있으나, 미용목적의 시술인 경우에는 줄기세포 등의 이식으로 얻어지는 이득보다 감염위험에 노출되는 위험이 더 크게 부각될 수 있다. 따라서 줄기세포 배양분야에서 동물성 혈청대체제를 찾는 일은 상업적으로 매우 의미있다.In the 1950s, it was reported that the natural medium could be partially replaced with the synthetic medium. Since then, it has been attempted to cultivate cells without serum, and now, in some cases, cells are cultured without serum for specific purposes. However, these serum-free media have been reported to grow only well on specific cells, and the proteinaceous cell growth factors used in place of serum are too expensive and the growth and production of the products are not stable compared with the medium containing serum. It is also known that serum-free medium can not be applied to the culture of stem cells. The most important field in the field of commercial use of stem cells is a cell therapy agent, which is a therapeutic technique in which a stem cell obtained from a human is cultured in a test tube and then injected into a patient. In such a field, stem cell culturing is necessarily performed, and it is important to avoid animal sex slaughter or serum as much as possible. Considering the therapeutic benefit of transplanting stem cells for the purpose of treating diseases, the risk of infection can be reduced, but in the case of cosmetic procedures, there is a greater risk of exposure to the risk of infection than stem cell transplantation. Can be greatly highlighted. Therefore, finding an animal serum substitute in the field of stem cell culture is commercially meaningful.
한편, 피부에서 줄기세포가 자리하고 있는 곳은 크게 두 세 곳이다. 첫째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리우는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재한다. 둘째는 모낭(hair follicle)이다. 이곳은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 세포가 존재한다. 셋째는 피하지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다. 이처럼 피부에 존재하는 줄기세포는 피부의 건강과 직결된 전체적인 역할을 담당하고 있어 피부건강과 관련하여 가장 중요한 세포군이라 할 수 있다. 줄기세포들은 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 즉 피부의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열능력이 떨어지고 점차 비활성화됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다. 따라서 피부에 존재하는 줄기세포를 활성화시킬 수 있다면 줄기세포의 노화를 막고 활성을 다시 복원할 수 있을 것이다.
On the other hand, there are two or three places where stem cells are located in the skin. The first is found in the basal cell layer of the epidermis, called the interfollicular epidermis, between the hair follicle and the hair follicle. The second is a hair follicle. It is a cell before cell differentiation occurs, and there is a cell that plays the most important role in epidermal regeneration. The third is fat-derived stem cells present in the subcutaneous fat layer. Thus, the stem cells present in the skin play an overall role directly linked to the health of the skin, which is the most important cell group related to skin health. Stem cells are known to regenerate and regenerate troubled areas by inhibiting aging of cells due to harmful environment by sustaining proliferation and various cell activating substances by activating the surrounding cells through continuous cell division during the living. However, because stem cells are also a cell group, their functions gradually disappear with age. In other words, stem cells of the skin gradually decrease in activity due to aging, so that the cell division ability is inferior and gradually becomes inactive, thereby causing various problems such as wrinkles, black spots, slow wound healing and slow repair due to aging. Therefore, if stem cells present in the skin can be activated, stem cells can be prevented from aging and the activity restored.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 스클라레올(sclareol)을 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하는 것에 있다.Therefore, one object of the present invention is to provide a composition for cell culture comprising sclareol.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 세포 배양용 조성물을 포함하는 세포 배양용 배지를 제공하는 것에 있다.It is another object of the present invention to provide a culture medium for cell culture comprising the composition for cell culture.
본 발명의 다른 하나의 목적은 스클라레올(sclareol)을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것에 있다.It is another object of the present invention to provide a composition for promoting cell proliferation comprising sclareol.
본 발명의 다른 하나의 목적은 스클라레올(sclareol) 또는 상기 세포 배양용 조성물을 이용하여 배양된 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.It is another object of the present invention to provide a composition for improving skin conditions comprising, as an active ingredient, a cell culture solution cultured using sclareol or the composition for cell culture.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 세포 배양용 조성물 또는 상기 세포 배양용 조성물을 포함하는 세포 배양용 배지에 세포를 접촉시켜 세포를 배양하는 방법을 제공하는 것에 있다.It is another object of the present invention to provide a method for culturing cells by contacting the cells with a culture medium for cell culture comprising the composition for cell culture or the composition for cell culture.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 피부 상태 개선용 조성물을 피부학적으로 허용 가능한 범위에서 개체에 투여하여 개체의 피부 상태를 개선하는 방법을 제공하는 것에 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for improving the skin condition of an individual by administering the skin condition improving composition to an individual in a dermatologically acceptable range.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 스클라레올(sclareol)을 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for cell culture comprising sclareol.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포 배양용 조성물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a cell culture medium comprising the composition for cell culture.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 스클라레올(sclareol)을 포함하는 세포 증식촉진용 조성물을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a composition for promoting cell proliferation comprising sclareol.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 스클라레올 또는 상기 세포 배양용 조성물을 이용하여 배양된 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a composition for improving skin conditions comprising, as an active ingredient, a cell culture fluid cultured using sclareol or the composition for cell culture.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포 배양용 조성물 또는 상기 세포 배양용 조성물을 포함하는 배지에 세포를 접촉시켜 세포를 배양하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for culturing a cell by contacting the cell with the culture medium for the cell culture or the composition for cell culture.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 피부 상태 개선용 조성물을 피부학적으로 허용 가능한 범위에서 개체에 투여하여 개체의 피부 상태를 개선하는 방법을 제공한다.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for improving the skin condition of an individual by administering the composition for improving skin condition to a subject in a dermatologically acceptable range.
본 발명자들은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 세포, 특히 줄기세포 및 동물세포가 배양되고, 증식을 촉진할 수 있는 물질을 식물성 소재로부터 찾기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과 스클라레올(sclareol)이 동물성 혈청을 대체 가능할 정도로 세포를 배양시키고, 증식을 촉진할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have made intensive researches in order to find substances capable of promoting proliferation from plant materials, in which cells, particularly stem cells and animal cells, are cultured in serum-free medium instead of animal serum. As a result, the present inventors have completed the present invention by experimentally confirming that sclareol can promote cell proliferation and promote proliferation to such an extent that animal serum can be replaced.
본 발명에 있어서, 스클라레올(sclareol)은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 디페르펜 알코올 화합물이다. 이의 IUPAC 명은 (1R, 2R, 8AS)-데카하이드로-1-(3-하이드록시-3-메틸-4-펜테닐)-2, 5, 5, 8A-테트라메틸-2-나프톨((1R, 2R,8AS)-decahydro-1-(3-hydroxy-3-methyl-4-pentenyl)-2, 5, 5, 8A,-tetramethyl-2-naphthol)이다.In the present invention, sclareol is a diphenyl alcohol compound having a structure represented by the following formula (1). Its IUPAC name is (1R, 2R, 8AS) -decahydro-1- (3-hydroxy-3-methyl- 2R, 8AS) -decahydro-1- (3-hydroxy-3-methyl-4-pentenyl) -2,5,5,8A -tetramethyl-2-naphthol.
상기 스클라레올은 자연원(natural source)으로서 꿀풀과에 속하는 꿀풀(Prunella Vulgaris), 깨꽃(Salvia splendens Ker), 클라리 세이지(Salvia Sclarea) 등의 전초, 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 과피 등으로부터 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 하나의 예로서, 건조 및 마쇄한 식물을 탄화수소로 추출한 후 방향족 탄화수소, 방향족 및 지방족 할로겐화 탄화수소, 디알킬에테르, 디알킬레톤, 알칸올, 카복실산 및 이들의 에스테르 디메틸포름아미드와 디메틸 설폭사이드 등의 용매로 추출하고 추출물을 증발시켜 잔류물을 수득한 다음, 잔류물을 알칸올로 처리하고 현탄액을 여과하여 알칸올성 용액을 수득하거나 잔류물을 한쌍의 수불혼화성 용매(이중 하나만이 소기의 유효성분을 용해시킬 수 있음)에 분배시킨 다음, 알칸올성 용액이나 소기의 물질을 함유한 용액을 증발시켜 잔류물을 수득하고 이 잔류물을 컬럼 크로마토그래피한 후 소기의 물질이 함유된 크로마토그라피 획분을 증발시켜 잔류물을 수득한 후 이 잔류물을 재결정시킨다.As a natural source, the sclareol is a natural source, and it is a natural source. It is a natural source, which is derived from plant, stem, leaf, roots, fruit and rind of Prunella Vulgaris, Salvia splendens Ker, and Salvia Sclarea belonging to Lamiaceae. Can be obtained using various extraction methods known in the art. As one example, the dried and crushed plants are extracted with hydrocarbons, and thereafter, a solvent such as aromatic hydrocarbons, aromatic and aliphatic halogenated hydrocarbons, dialkyl ethers, dialkyl retones, alkanols, carboxylic acids and their ester dimethylformamide and dimethylsulfoxide And the extract is evaporated to obtain a residue. The residue is treated with an alkanol, and the present saline is filtered to obtain an alkanol solution. Alternatively, the residue is dissolved in a pair of water-immiscible solvents (only one of which is the desired active ingredient , And then the solution containing the alkanol solution or the desired substance is evaporated to obtain a residue. The residue is subjected to column chromatography, and then the chromatographic fraction containing the desired substance is evaporated To obtain a residue, and the residue is recrystallized.
본 발명의 스클라레올은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 추출 용매 외에 요구되는 구체적인 추출 조건(온도, 시간 등)은 상기 추출 용매의 성질에 따라 당업자가 자명하게 선택 및 조절할 수 있다.It will be apparent to those skilled in the art that the sclareol of the present invention can be obtained not only with the above-mentioned extraction solvent but also with another extraction solvent, which exhibits substantially the same effect. The specific extraction conditions (temperature, time, etc.) required in addition to the extraction solvent can be selected and adjusted by those skilled in the art depending on the properties of the extraction solvent.
본 발명의 스클라레올을 수득하기 위한 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. The extract for obtaining sclareol of the present invention includes not only the extract obtained by the above-mentioned extraction solvent, but also the extract obtained through ordinary purification process. For example, by separation using an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatographies (made for separation by size, charge, hydrophobicity or affinity), and the like, Fractions are also included in the extract of the present invention.
본 발명의 스클라레올은 상기한 방법 이외에도 화학적으로 합성하여 제조할 수도 있고, 상업적으로 제조된 상품(예를 들어, SIGMA 사의 Sclareol)일 수 있다.
The sclareol of the present invention may be chemically synthesized in addition to the above-mentioned methods, or may be a commercially produced product (for example, Sclareol from SIGMA).
본 발명의 스클라레올은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 세포를 배양할 수 있고, 세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질을 찾기 위해 예의 연구 노력한 결과물이다. 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 스클라레올은 줄기세포, 각질세포, 및 섬유아세포 등의 피부 내 세포의 증식 및 활성을 증가시키는 효능을 가지고 있음이 본 발명자들에 의하여 확인되었다.The sclareol of the present invention is a result of intensive research in order to find a substance capable of culturing cells in serum-free medium instead of animal serum and promoting cell proliferation. As a specific example, the inventors of the present invention have confirmed that the sclareol of the present invention has an effect of increasing the proliferation and activity of cells in the skin such as stem cells, keratinocytes, and fibroblasts.
따라서, 본 발명의 스클라레올은 세포의 증식을 촉진하기 위한 조성물 및 동물성 혈청을 대신하여 세포의 배양을 위한 조성물로서 유효하게 사용될 것이다.
Therefore, the sclareol of the present invention is effectively used as a composition for promoting cell proliferation and as a composition for culturing cells instead of animal serum.
본 발명에서 사용되는 용어, "무혈청 배지"는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 동물세포 배양 배지를 의미한다. 상기 적절한 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있는데, 이로 한정되는 것은 아니지만, 예로 DMEM 배지, HAM 배지, IMDM 배지, RPMI 1640 배지 등이 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하고 있다. 또한, 이들 배지는 세포를 배양함에 있어서 일반적으로 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 사용하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나 본 발명의 배지는 세포의 성장을 위하여 필요한 동물 유래 혈청을 대체하여 본 발명에 따른 스크라레올(sclareol)을 첨가함으로써 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 우수한 세포의 성장 및 증식을 촉진한다.As used herein, the term "serum-free medium" means any animal cell culture medium that does not contain more than a certain amount of serum derived from an animal, including a human. The appropriate cell culture medium is known to those skilled in the art, including, but not limited to, DMEM medium, HAM medium, IMDM medium, RPMI 1640 medium, and the like. These media include salts, vitamins, buffers, energy sources, amino acids and other substances. In addition, these culture media generally use about 5 to 20% of animal-derived serum to cultivate cells, thereby providing general nutrients for growth of cells to be cultured. However, the medium of the present invention promotes the growth and proliferation of cells, which are superior to the animal-derived serum, by adding the sclareol according to the present invention in place of the animal-derived serum necessary for cell growth.
본 발명에서 사용되는 용어 "동물성 혈청을 대신(대체)하여"는 동물세포의 배양을 위한 조성물에 포함되어 있는 동물성 혈청의 함량의 10% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 더 바람직하게는 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 100%가 본 발명의 스클라레올으로 교체되어 세포의 배양용 조성물 내 동물성 혈청의 기능, 예를 들어 세포의 증식을 스클라레올이 대체하는 것을 말한다. As used herein, the term " replacing (replacing) an animal serum "means that the content of animal serum contained in the composition for culturing animal cells is at least 10%, more preferably at least 30% More preferably at least 40%, more preferably at least 50%, most preferably at least 100% is replaced by the sclareol of the present invention, so that the function of the animal serum in the composition for culture of cells, .
본 발명에서 사용되는 용어 "세포의 증식 촉진"은 세포의 성장, 생장 및 활성을 증가시켜 세포의 수 및/또는 세포 자체의 기능이 향상되는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 이러한 증가 및 향상은 본 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포의 생존능이나 세포의 특정 물질 생산능 등이 스클라레올이 포함되지 않은 무처리 조건과 대비하여 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상, 보다 더 바람직하게는 20% 이상 증가하는 것을 의미한다.
As used herein, the term "promoting cell proliferation" means that the number of cells and / or the function of the cell itself is improved by increasing the growth, growth and activity of the cells. More specifically, such increase and improvement can be attained by increasing the cell viability or the specific substance production ability of the cells to 5% or more, preferably 5% or more, in comparison with the non-scra- 10% or more, more preferably 15% or more, and even more preferably 20% or more.
본 발명에 있어서, 세포는 인간을 포함한 동식물체로부터 기원한 기능적 및 구조적 기본 단위로서, 인간을 포함한 동식물로부터 기원한 세포이면 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명의 세포는 이로 제한되는 것은 아니나, 줄기세포, 근육세포, 생식세포, 피부에 존재하는 세포(예로, 섬유아세포, 각질세포) 등을 포함한다.In the present invention, the cells are functional and structural basic units originating from the same plant including humans, and are included in the scope of the present invention if they originate from animals and plants, including humans. Accordingly, the cells of the present invention include, but are not limited to, stem cells, muscle cells, germ cells, cells existing in the skin (e.g., fibroblasts, keratinocytes) and the like.
상기 줄기세포는 스스로 세포분열할 수 있고 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 하나의 구체적 일 양태로서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 및 성체줄기세포를 모두 포함하나, 바람직하게는 동물 유래의 성체줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 성체줄기세포이다. 상기 성체줄기세포는 배아발달단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 분화되지 않고 세포분열에 의해 증식하여 사멸된 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 이러한 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)을 가지고 있다. 이들 성체줄기세포의 예로는, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 탯줄, 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래한다.The stem cell is a cell capable of cell division by itself and capable of differentiating into a very specific type of specific cell type. In one specific embodiment, the stem cell includes both embryonic stem cells and adult stem cells, but is preferably an adult stem cell, more preferably a human-derived adult stem cell. The adult stem cell refers to a stem cell that plays a role of replacing dead cells and regenerating damaged tissues by proliferation by cell division without being differentiated, which is found in the adult body even after embryonic development. These adult stem cells have a site-specific differentiation that differentiates the cells themselves to the characteristics of the surrounding tissues. Examples of these adult stem cells are derived from various adult cells such as bone marrow, blood, brain, skin, fat (i.e., adipose tissue or fat cells), umbilical cord, umbilical cord blood, umbilical cord blood wharton's jelly.
하나의 구체적 실시에서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포(인간 탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포(human cord blood-derived stem cells, CBMCSs)), 피부 유래 줄기세포(skin derived stem cells), 또는 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, ADSCs)이다.In one specific embodiment, the adult stem cells are selected from the group consisting of mesenchymal stem cells (human cord blood-derived stem cells (CBMCSs)), skin derived stem cells, Derived adipose-derived stem cells (ADSCs).
다른 하나의 구체적 실시에서, 상기 성체줄기세포로서 피부 유래 줄기세포는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.
In another specific embodiment, the adult stem cells as the adult stem cells are selected from the group consisting of stem cells existing in the basal layer of the interfollicular epidermis between the hair follicle and the hair follicle, stem cells present in the hair follicle, It is an existing fat-derived stem cell.
본 발명의 세포배양용 조성물 및 세포 증식 촉진용 조성물은 스클라레올 이외에 세포를 증식 또는 활성화하는데 필요한 공지의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 공지의 물질의 예로는 염, 비타민, 완충액, 글루타민 등의 산화영양소, 소디움 피루베이트 등의 에너지 공급원, 아미노산, 페니실린-스트렙토마이신 등의 항생제, 암포테리신 B 등의 항진균제, 타일로신(tylosin), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등의 마이코플라스마 억제제 등이 있다. 또한, 필요에 따라, 세포의 부착을 위한 피브로넥틴 등의 부착인자 및/또는 인터루킨, GM-CSF, G-CSF 등의 세포의 성장을 보조하는 성장인자 등을 포함할 수 있다. 이와 같이 추가로 포함되는 물질 및 그 함량의 배양하고자 하는 목적 세포의 종류 및 특성에 따라 당업자에 의하여 용이하게 조절할 수 있을 것이다.
The composition for cell culture and the composition for promoting cell proliferation of the present invention may further include known substances necessary for cell proliferation or activation in addition to sclareol. Examples of the known substances include oxidative nutrients such as salts, vitamins, buffers and glutamine, energy sources such as sodium pyruvate, antibiotics such as amino acids, penicillin-streptomycin, antifungals such as amphotericin B, tylosin ), Gentamicin, ciprofloxacin, azithromycin, and the like. In addition, if necessary, it may include an adhesion factor such as fibronectin and / or a growth factor for assisting the growth of cells such as interleukin, GM-CSF and G-CSF for adhesion of cells. Such substances and their contents may be easily controlled by those skilled in the art depending on the type and characteristics of the target cells to be cultured.
또한, 본 발명은 상기 세포배양용 조성물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 본 발명의 세포 배양 배지는 상술한 바와 같이 동물성 혈청을 대신하여 스크라레올이 포함되어 있으며, 상기 스클라레올이 식물로부터 유래하였음에도 배양 배지 내 세포의 성장 및 증식을 촉진한다. 이러한 배지의 사용은 통상의 배지와 동일하게 사용될 수 있음은 물론이다.
The present invention also provides a cell culture medium comprising the composition for cell culture. As described above, the cell culture medium of the present invention includes sclare instead of animal serum, and promotes growth and proliferation of cells in the culture medium even when the sclareol is derived from the plant. It goes without saying that the use of such a medium can be used in the same manner as a conventional medium.
한편, 본 발명은 상기 동물성 혈청을 대신하여 스클라레올이 포함된 세포 배양용 조성물 또는 이를 포함하는 배지에 목적하는 세포를 접촉시켜 세포를 배양하고 증식을 촉진하는 방법을 제공한다. Meanwhile, the present invention provides a method for culturing a cell and promoting proliferation by contacting a desired cell with a composition for cell culture containing sclareol or a culture medium containing the same, in place of the animal serum.
본 발명의 상기 접촉은 세포가 세포 외 물질의 세포 내 유입을 가능하게 할 정도로 접하고 있는 것을 의미하며, 상기 세포는 상술한 바와 같다.The contact of the present invention means that the cell is in contact with the cell to such an extent as to enable intracellular introduction of the extracellular substance, and the cell is as described above.
본 발명의 상기 세포 배양 및 증식 촉진 방법에 의하여 목적하는 세포의 성장 및 증식을 촉진시키고, 특히 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 세포를 제공할 수 있게 된다.
The method of promoting cell culture and proliferation of the present invention promotes growth and proliferation of a target cell, and particularly prevents contamination of animal substances generated by using animal serum in a medium, thereby providing safer cells do.
본 발명의 스클라레올은 상술한 바와 같이 매우 우수한 세포, 바람직하게는 줄기세포 및 피부세포 증식 촉진능이 있다. 따라서, 본 발명의 스클라레올을 인체에 적용하는 경우 피부에 존재하는 세포, 보다 바람직하게는 줄기세포, 보다 더 바람직하게는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있다. 여기서, 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다. 또한, 상기 피부에 존재하는 세포는 각질세포 및 섬유아세포일 수 있다.
The sclareol of the present invention has excellent cell, preferably stem cell and skin cell proliferation promoting ability as described above. Therefore, when the sclareol of the present invention is applied to the human body, the skin condition can be improved by promoting or activating the cells present in the skin, more preferably stem cells, more preferably adult stem cells. Here, the adult stem cells present in the skin include, for example, stem cells existing in the basal layer of the interfollicular epidermis between the hair follicle and the hair follicle, stem cells present in the hair follicle, or fat existing in the subcutaneous fat layer Derived stem cells. In addition, the cells present in the skin may be keratinocytes and fibroblasts.
이에 따라, 본 발명은 스클라레올 또는 상기 세포배양용 조성물에서 배양된 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물로 제공한다.
Accordingly, the present invention provides a skin condition improving composition comprising, as an active ingredient, a cell culture liquid cultured in a composition for scleral or cell culture.
본 발명에서 세포 배양액은 상술한 세포 배양용 배지에서 세포를 배양한 후 배양된 세포를 제거하고 남은 배양액을 의미한다. 이러한 배양액을 제조하는 방법은 공지된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포를 배양한 후 세포배양액을 회수하고, 회수된 배양액을 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과함으로써 세포가 제거된 배양액을 얻을 수 있다. 마이크로 필터의 세공 크기(pore size)는 세포를 제거할 수 있는 크기 내에서 적절하게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10㎛이다.In the present invention, the cell culture medium refers to the culture medium after culturing the cells in the cell culture medium described above, and then removing the cultured cells. The method for producing such a culture can be carried out using known methods. For example, after the cells are cultured, the cell culture solution is recovered, and the recovered culture solution is filtered using a micro syringe filter to obtain a culture solution from which the cells have been removed. The pore size of the microfilter can be suitably selected within a range that allows removal of cells, and is preferably 0.1 to 10 mu m.
본 발명에서 사용된 용어 "피부상태 개선"은 피부 상태의 모든 형태의 호전 및 양호화를 의미하며, 바람직하게는 피부의 주름 개선, 피부 노화의 억제, 피부 탄력의 개선, 상처의 재생, 또는 피부의 재생을 의미한다.
The term "improvement of skin condition" as used in the present invention means improvement and improvement of all forms of skin condition, and preferably includes improvement of skin wrinkles, inhibition of skin aging, improvement of skin elasticity, Lt; / RTI >
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 스클라레올은 전체 피부상태 개선용 조성물을 기준으로 하여 0.0001 내지 30.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 15 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%로 조성물에 포함될 수 있다. 상기 스클라레올의 함유량이 전체 피부상태 개선용 조성물에 대해 0.0001중량% 미만이면 피부 상태 개선 효과를 볼 수 없고, 30중량%를 초과하여 포함되면 증가되는 함유량에 비해 증가된 개선 효과를 얻기 어려우며 제조 비용이 증가하는 단점이 있다.
In a preferred embodiment of the present invention, the sclareol is present in the composition in an amount of 0.0001 to 30.0% by weight, more preferably 0.0001 to 15% by weight, and most preferably 0.0001 to 10% by weight, based on the total skin condition improving composition . If the content of the sclareol is less than 0.0001% by weight based on the composition for improving the overall skin condition, improvement of the skin condition can not be attained. If the content exceeds 30% by weight, There is an increased disadvantage.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부에 직접 적용되는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.As a preferred embodiment of the present invention, the skin condition improving composition of the present invention can be provided as a cosmetic composition directly applied to the skin.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분인 스클라레올 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수도 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.The ingredients contained in the cosmetic composition of the present invention may additionally contain ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient, sclareol, and may contain conventional ingredients such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, Adjuvants, and carriers.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant- , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a soft lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray or a powder.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. When the formulation of the present invention is a paste, a cream or a gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, Can be used.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. In the case of a spray, in particular, / Propane or dimethyl ether.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 용매로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜, 가용화제 또는 유화제로서 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component. Examples of the solvent include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 1,3-butyl glycol, glycerol aliphatic esters as solubilizing or emulsifying agents, fatty acid esters of polyethylene glycol or sorbitan.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트검 등이 이용될 수 있다. In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tragacanth gum, etc. may be used.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
바람직한 또 다른 구현예로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.In another preferred embodiment, the skin condition improving composition of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition.
본 발명의 피부상태 개선용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미결정 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.When the skin condition improving composition of the present invention is manufactured from a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil no. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국소 투여(topical application) 방식으로 적용된다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and is preferably applied by parenteral administration, more preferably topical application by application.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is within the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis. When the composition is an external preparation, it is preferably applied in an amount of 1.0 to 3.0 ml on an adult basis once to five times a day, and continued for 1 month or more. However, the dose is not intended to limit the scope of the present invention.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 상기 언급된 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated using the above-mentioned pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or may be manufactured by inserting into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
바람직한 또 다른 구현예로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.In another preferred embodiment, the skin condition improving composition of the present invention can be provided as a food composition.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 스클라레올 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.When the composition of the present invention is prepared as a food composition, it contains not only sclareol as an active ingredient but also components which are ordinarily added at the time of food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, . Examples of the above-mentioned carbohydrates are monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Natural flavors such as tau Martin and stevia extract (e.g., rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be used as flavorings.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 스클라레올 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
For example, when the food composition of the present invention is prepared as a drink, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, juice, mulberry extract, jujube extract and licorice extract may be further added in addition to the sclareol of the present invention have.
한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 스클라레올에 대한 급성경구독성시험 결과 스클라레올은 천연물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 스클라레올은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.In the meantime, acute oral toxicity test of sclareol in a specific example of the present invention revealed that sclareol is a harmless substance as a natural substance. Therefore, the sclareol of the present invention scarcely exhibits toxicity and side effects, so that it can be safely used for a long period of use, and can be safely applied to cosmetic, pharmaceutical and food compositions as described above.
또한, 본 발명에서 사용되는 스클라레올로서, 상기 화학식 1의 스클라레올 화합물뿐만 아니라 이러한 스클라레올에 당업계에서 통상적으로 실시되는 치환기의 부가 또는 치환을 통해 얻어지는 유도체 중 동물성 혈청을 대신하여 세포의 증식 및 활성을 증가시키거나, 피부 노화의 억제 효과, 피부 탄력의 개선 효과, 상처의 재생 또는 피부의 재생 효과를 나타내는 유도체가 모두 포함한다는 것은 당업계의 기술 수준을 고려하여 당업자에게 명확하다. 보다 상세하게는, 스클라레올은 상기 화학식 1의 화합물뿐만 아니라, 상기 화학식 1의 구조를 핵(nucleus)으로 하여 당업계에 공지된 다양한 치환체 및 치환체 결합 반응을 통하여 얻어진 화학식 1의 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 화학식 1에 아세틸기, 히드록실기, 할로기, 니트로기 또는 탄소수 1-3의 알킬기가 결합되어도 화학식 1의 스클라레올과 동일 또는 유사한 효능을 발휘할 것으로 판단되며, 이러한 치환 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.
As the sclareol used in the present invention, not only the sclareol compound of the above formula (1) but also a derivative obtained through addition or substitution of a substituent commonly used in the art to such sclareol, It is obvious to those skilled in the art that the derivatives include all those that increase activity, inhibit skin aging, improve skin elasticity, and regenerate scars or regenerate skin. More specifically, the sclareol is not only a compound of the above formula (1), but also a derivative of the formula (1) obtained through various substitution and substitution reactions known in the art with the structure of the above formula (1) ≪ / RTI > For example, when an acetyl group, a hydroxyl group, a halo group, a nitro group, or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is bonded to the formula (1), the same or similar effect as that of the sclareol of the formula (1) And are included in the scope of the invention.
본 발명은 또한 상기 피부상태 개선용 조성물을 개체에 투여하여 개체의 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력, 상처 재생, 피부 재생 등과 같은 피부상태를 개선하거나 억제하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for improving or suppressing skin conditions such as skin wrinkles, skin aging, skin elasticity, wound regeneration, skin regeneration, etc., by administering the composition for improving skin condition to an individual.
본 발명에 있어서, '개체'는 피부의 불량한 상태, 예를 들어 주름, 노화, 상처, 피부 등을 개선 또는 예방하고자 하는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어 개, 돼지, 말, 소 등을 의미한다. In the present invention, 'an individual' means a mammal including a human, such as a dog, a pig, a horse, a cattle, etc., for improving or preventing a poor condition of the skin such as wrinkles, aging, do.
본 발명에 있어서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.In the present invention, "administering" means introducing a predetermined substance into an individual by any appropriate method, and the administration route of the composition of the present invention is either oral or parenteral ≪ / RTI > The composition of the present invention may also be administered by any device capable of transferring the active substance to a target subject, for example, a cell.
본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 피부 주름; 피부 노화; 피부 탄력; 상처; 피부의 불량(피부가 거칠거나 매끈하지 않는 등의 상태) 등과 같은 피부상태 또는 이들로부터 발생하는 질환, 질병 또는 이상은 본 발명의 피부상태 개선용 조성물의 개체 내 투여에 의하여 개선, 호전, 예방 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.
Skin wrinkles of the subject described above by the method of the present invention; Skin aging; Skin elasticity; Wound; A skin condition (such as skin roughness or non-smoothness), or a disease, a disease, or an abnormality resulting therefrom can be improved, improved, prevented or prevented by administration of the skin condition improving composition of the present invention It will be understood by those skilled in the art that the present invention can achieve the objects of the present invention and the like by the person skilled in the art through the above description and the embodiments described below.
본 발명의 스클라레올(sclareol)을 포함하는 무혈청 세포 배양용 조성물은 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있고, 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 세포, 특히 줄기세포를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 스클라레올을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물에 의하여 세포 증식 및 활성화를 증가시킬 수 있으므로, 스클라레올 또는 상기 세포 배양용 조성물에 의한 세포 배양액을 유효성분으로 하여 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 상처 재생 및 피부 재생 효능 등의 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.
Since the composition for serum-free cell culture containing sclareol of the present invention does not use an expensive animal serum, the production cost can be remarkably lowered and the contamination of the animal material generated by using animal serum in the medium can be reduced Thereby providing safer cells, particularly stem cells. In addition, since the cell proliferation promoting composition comprising sclareol of the present invention can increase cell proliferation and activation, it is possible to improve the skin wrinkles and improve the skin wrinkles by using the cell culture solution of the sclareol or the composition for cell culture, Exhibits an effect of improving skin conditions such as inhibition of aging, improvement of skin elasticity, wound regeneration and skin regeneration efficacy.
도 1은 본 발명의 일 실시예로서 스클라레올 함유 제형을 피부 이식편에 처리한 후 조직염색을 통해 조직의 전체적인 모습, 표피 내 줄기세포활성과 관련된 것으로 알려진 p63과 Integrin-beta1을 분석한 그림이다.FIG. 1 is an analysis of p63 and integrin-beta1, which are known to be related to the overall appearance of the tissue, the stem cell activity in the epidermis, through tissue staining after treating the skin graft with a sclareol-containing formulation as an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예 1: 스클라레올(sclareol) 함유 무혈청배지에서 줄기세포의 세포생존능 측정Example 1: Measurement of cell viability of stem cells in serum-free medium containing sclareol
1-1. 세포, 배지 및 배양방법1-1. Cell, medium and culture method
본 발명자들은 줄기세포배양용 혈청대체제를 찾기 위해 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하면서 배지에 시료를 첨가하여 양호한 줄기세포 성장이 이루어지는지를 관찰하였다.The present inventors observed whether a good stem cell growth was achieved by adding a sample to a medium while culturing stem cells in a serum-free medium to which serum was not added in order to find a substitute for serum for stem cell culture.
구체적으로, 본 실험은 시료로서 스클라레올을 사용하였으며, 줄기세포로서 표피줄기세포, 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포와 인간 지방 유래 줄기세포를 사용하였다.Specifically, in this experiment, sclareol was used as a sample, and epidermal stem cells, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and human fat-derived stem cells were used as stem cells.
본 실험에서 사용한 표피줄기세포(Epidermal stem cells; ESCs)는 대한피부연구학회지(2006;13(1):1-4)에 개재된 표피성체줄기세포 분리방법에 따라 분리하였다. 즉, 표피줄기세포(ESCs)는 피부조직 또는 피부에서 수득한 세포들로부터 제4형 콜라겐에 부착성을 갖는 세포를 분리하여 얻었다. The epidermal stem cells (ESCs) used in this experiment were isolated according to the epidermal stem cell isolation method of Korean Skin Research Association (2006; 13 (1): 1-4). That is, epidermal stem cells (ESCs) were obtained by separating cells having adherence to type IV collagen from cells obtained from skin tissue or skin.
인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(Human cord blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)는 차 의과대학교(한국, 경기도 성남)으로부터 얻었다. 세포들은 저농도의 글루코오스를 포함하고, 15％ FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)에서 37℃ 온도조건에서 배양하였다. 배지는 세포들이 컨플루언시(confluency)에 도달할 때 까지 3일 마다 교체하였다.Human cord blood-derived mesenchymal stem cells (CB-MSCs) from human umbilical cord blood were obtained from the College of Medicine of Daegu (Seongnam, Kyonggi-do, Korea). Cells were cultured in DMEM (Dulbecco ' s modified eagle medium) supplemented with 15% FBS, penicillin and streptomycin at 37 < 0 > C temperature conditions containing low concentrations of glucose. The medium was replaced every 3 days until the cells reached confluency.
인간 지방 유래 줄기세포(Human Adipose Derived Stem Cell, ADSCs)는 Gibco®(Gibco®, Rockville, MD, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 동결보존된 세포들을 37℃에서 녹인 후 곧 바로 MesenPRO RS™ Growth Supplement(Gibco®, Rockville, MD, USA)와 글루타민이 첨가된 MesenPRO RS™ Basal Medium (Gibco®)에서 37℃ 온도조건에서 배양하였다. 이어서, 세포들을 동일한 배지를 이용하여 증식시켰으며, 배지는 세포들이 컨플루언시(confluency)에 도달할 때 까지 3일 마다 교체하였다.Human Adipose Derived Stem Cells (ADSCs) were purchased from Gibco ® (Gibco ® , Rockville, MD, USA). The cryopreserved cells were dissolved at 37 ° C and immediately cultured at 37 ° C in MesenPRO RS ™ Basal Medium (Gibco ® ) supplemented with MesenPRO RS ™ Growth Supplement (Gibco ® , Rockville, Md., USA) and glutamine. Then, the cells were grown using the same medium, and the medium was replaced every 3 days until the cells reached confluency.
음성 대조군인 무혈청 조건 시험군에서는 세포 배양 배지를 무혈청 DMEM (Cat.11885-084, Gibco®)으로 교체하였다.In the serum-free conditioned test group, the cell culture medium was replaced with serum-free DMEM (Cat. 11885-084, Gibco ® ).
양성 대조군으로는 세포를 Growth Supplement (Gibco®)를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
As a positive control, cells were cultured in DMEM medium containing Growth Supplement (Gibco ® ).
1-2. 세포생존능(cell viability) 측정 1-2. Measurement of cell viability
세포생존능은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통해 측정하였다. MTT 분석은 테트라졸륨환(tetrazolium ring)을 포함하는 기질(substrate)이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것에 기초한 분석방법이다. 청색 포르마잔의 수준을 분광학적으로 측정한 후 이를 세포밀도의 간접적인 지표로 사용하였다. 간략하게 설명하면, 세포들을 37℃에서 MTT (1 mg/㎖)에 3 시간 동안 노출시킨 후, 배지를 제거하고 세포들을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 완전 용해된 후 청색 포르마잔의 존재는 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 분광학적으로 측정하였다. Cell viability was measured by MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) analysis. MTT analysis is an analytical method based on the conversion of a substrate containing a tetrazolium ring to a blue formazan by mitochondrial dehydrogenase. The level of blue formazan was measured spectrophotometrically and used as an indirect indicator of cell density. Briefly, cells were exposed to MTT (1 mg / ml) for 3 hours at 37 ° C, then the medium was removed and the cells were lysed with DMSO (dimethyl sulfoxide). After complete dissolution, the presence of blue formazan was measured spectrophotometrically by measuring the absorbance at 570 nm.
MTT 분석법을 사용하여 줄기세포의 증식에 미치는 스클라레올의 영향을 평가한 결과, 스클라레올은 성체줄기세포의 증식을 유도함을 관찰하였다(표 1 참조). 구체적으로, 스클라레올(Sclareol)은 표피줄기세포(ESCs), 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포 (CB-MSCs), 지방 유래 줄기세포(ADSCs)의 성장률을 농도 의존적으로 현저히 증가시켰다.
As a result of evaluating the effect of sclareol on proliferation of stem cells using MTT assay, it was observed that sclareol induces proliferation of adult stem cells (see Table 1). Specifically, Sclareol significantly increased the growth rate of epidermal stem cells (ESCs), cord blood-derived mesenchymal stem cells (CB-MSCs), and adipose derived stem cells (ADSCs) in a concentration-dependent manner.
실시예 2: 스클라레올(sclareol) 함유 무혈청배지에서 동물세포의 세포생존능 측정 Example 2: Measurement of cell viability of animal cells in serum-free medium containing sclareol
본 실험에서는 스클라레올이 다른 동물세포들의 증식도 촉진할 수 있는지를 알아보기 위해, 인간각질세포인 HaCaT과 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast)인 NIH3T3 세포를 스클라레올이 함유된 무혈청 배지에 배양하여 이들 세포생존능에 미치는 효과를 관찰하였다. In order to investigate whether sclareol can promote the proliferation of other animal cells, HaCaT, a human keratinocyte, and NIH3T3 cells, a mouse fibroblast, were cultured in serum-free medium containing sclareol, The effect on cell viability was observed.
구체적으로, 5％ CO2 및 37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 HaCaT와 NIH3T3 세포 2 × 104 개를 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 각각 무혈청조건과, 스클라레올이 첨가된 무혈청조건으로 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하여 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다.Specifically, 2 × 10 4 HaCaT and NIH3T3 cells cultured in DMEM medium containing 5% CO 2 and 10% FBS and 1% antibiotic at 37 ° C. were inoculated into a 12-well plate and placed , And the cells were washed once with the serum-free culture medium, and then cultured in the absence of serum and serum-free conditions supplemented with sclareol. After 72 hours, the cells were washed once with the serum-free culture medium, and then replaced with serum-free medium containing 10% MTT. After 3 hours, the OD value was measured and converted into a percentage.
하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 정상군(혈청 포함)을 100％로 환산하였을 시, 무혈청조건(HaCaT : 70.3％, NIH3T3 : 52.4%)에 비해 스클라레올(sclareol)이 각각 첨가된 조건에서 농도 의존적으로 최대 23.5％ 이상의 세포생존율의 증가를 보여 스클라레올(sclareol)이 줄기세포뿐만 아니라 일반 세포의 세포증식을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다 (표 2).
As shown in the following Table 2, when the normal group (including serum) was converted to 100%, the concentration of sclareol (sclareol) was higher than that of serum-free conditions (HaCaT: 70.3%, NIH3T3: 52.4% Dependent increase in cell viability up to 23.5%, indicating that sclareol promotes cell proliferation not only in stem cells but also in normal cells (Table 2).
실시예 3: 스클라레올(sclareol) 함유 줄기세포배양액을 이용한 피부세포의 활성화 측정Example 3: Measurement of activation of skin cells using sclareol-containing stem cell culture
스클라레올(sclareol)이 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포 배양액을 섬유아세포에 처리하여 피부세포의 활성화 정도를 측정하였다. The activity of skin cells was measured by treating fibroblasts with a culture medium of stem cells cultured in a serum-free medium supplemented with sclareol.
표피줄기세포(ESC)를 2 × 104 개로 12 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1 회 세척한 다음, 무혈청조건(SF), 스클라레올(sclareol)이 첨가된 무혈청조건(P/SF)의 실험군으로 나누어 72시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 수확하여 2uM 필터를 통해 불순물 제거하고 스클라레올이 처리된 줄기세포배양액을 준비하였다.(ESC) were inoculated into 12-well plates at a density of 2 × 10 4 , and the cells were washed once with the culture medium from which the serum had been removed. Then, serum-free conditions (SF), serum-free medium containing sclareol (P / SF) and cultured for 72 hours. Then, the culture solution was harvested, impurities were removed through a 2 uM filter, and a sclareol-treated stem cell culture solution was prepared.
사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 × 105 세포/웰) 5％ 농도의 CO2 배양기에서 37℃로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, PBS로 세척한 후 ESC 세포를 통해 상기 준비한 줄기세포배양액을 처리하고, 48 시간 동안 다시 배양하였다. 이후 섬유아세포의 활성화 정도를 MTT assay를 통해 분석하였다.Inoculated with normal fibroblasts (Human normal fibroblast, Pacific) of a person in a 96-well microplate containing DMEM medium and (2 × 10 5 cells / well) incubated for 24 hours at 37 ℃ in a CO 2 incubator at 5% concentration Respectively. After 24 hours, the medium was removed from each well, washed with PBS, treated with the prepared stem cell culture solution through ESC cells, and re-cultured for 48 hours. The degree of fibroblast activation was analyzed by MTT assay.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 정상군(CM)을 100 ％로 환산하였을 시, 무혈청조건이 처리된 실험군(SF)에 비해, 스클라레올(sclareol)이 첨가된 무혈청조건이 처리된 실험군(P/SF)에서 유의성 있게 섬유아세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
The results are shown in Table 3 below. As can be seen from the following Table 3, when the normal group (CM) was converted to 100%, serum-free conditions supplemented with sclareol were treated as compared with the control group (SF) The survival rate of fibroblasts was significantly increased in the experimental group (P / SF).
실시예 4: 스클라레올(sclareol) 함유 줄기세포배양액을 이용한 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진효과 Example 4 Promoting Collagen Synthesis Effect of Fibroblast Using a Culture Medium Containing Sclareol
섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진은 피부에 있어 주름을 방지하고 완화하는 주요 지표이다. 주름은 통상적으로 콜라겐의 생합성이 감소하고 만들어진 콜라겐이 분해되면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 진피층에 존재하는 섬유아세포의 콜라겐 합성이 촉진되면 주름억제는 물론 생성된 주름도 개선될 수 있다.Promoting collagen biosynthesis of fibroblasts is a key indicator to prevent and relieve wrinkles in the skin. It is known that wrinkles usually occur when the biosynthesis of collagen is reduced and collagen is broken down. Therefore, if the collagen synthesis of the fibroblasts present in the dermal layer is promoted, not only the suppression of wrinkles but also the generated wrinkles can be improved.
상기 실시예 3과 같이 스클라레올이 처리된 ESC 배양액을 섬유아세포에 처리하고 24시간 동안 배양을 한 후 배양액을 수집하여 콜라겐분석키트 (Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, 다카라, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과를 표 4에 나타내었다. As in Example 3, the ESC culture treated with sclareol was treated with fibroblasts and cultured for 24 hours. Then, the culture solution was collected and used with a collagen assay kit (Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, Takara, Japan) And the amount of procollagen type I C-peptide (PICP) was measured. The experiment was carried out according to the method described in the kit manual. The measured values were expressed as mean ± standard deviation, and the significance was tested by t-test using SPSS / PC + program. The experimental results are shown in Table 4.
표 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 무혈청조건이 처리된 실험군(SF)에 비해, 스클라레올(sclareol)이 첨가된 무혈청조건이 처리된 실험군(P/SF)에서 유의성 있게 콜라겐 합성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
As can be seen from the results in Table 4, collagen synthesis (P / SF) in the serum-free (P / SF) treated serum-free conditions added with sclareol was significantly .
실시예 5: 스클라레올(sclareol)을 함유한 피부상태 개선용 외용조성물 제조 Example 5: Preparation of external-use composition for improving skin condition containing sclareol
스클라레올(sclareol)을 일반적으로 화장품이나 연고 같은 피부외용제제로 만들 경우에 이용하는 Oil in Water 타입의 에멀젼 제형으로 시험제품을 만들었다. 각 시험제품의 조성은 표 5와 같았다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 다음 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 스클라레올(sclareol)을 200ppm 첨가하였다.
An oil-in-water emulsion formulation was used to make sclareol as a skin external preparation such as cosmetics or ointments. The composition of each test product was as shown in Table 5. Water, purified water, triethanolamine and propylene glycol were dissolved by heating at 70 占 폚, and a fatty acid, an oily component, an emulsifier and an antiseptic agent were heated to 70 占 폚 to dissolve and emulsify. After the emulsification was completed, the solution was cooled to 45 캜 and 200 ppm of sclareol was added.
실시예 6: EX-VIVO 조건에서 스클라레올(sclareol)의 줄기세포 활성 기능 Example 6: Stem cell activity of sclareol in EX-VIVO condition
피부 이식편(Skin explant)은 사람의 피부와 가장 유사한 환경을 제시하며, 이로 인해 시험물의 인체 효능을 가장 잘 반영할 수 있다. 상기 실시예 5를 통해 제조된 스클라레올(sclareol) 함유 제형을 피부 이식편(Skin explant)에 10일 동안 처리한 후 피부줄기세포관련 인자에 미치는 영향을 관찰하였다. 시험제형은 시험기간 동안 5회(D0:처리시작일, D2:처리시작 2일째, D4:처리시작 4일째, D7:처리시작 7일 째, D9:처리시작 9일째)에 걸쳐 2 mg/cmㅂ양으로 피부이식편 상피부분에 처리되었다. 시험이 종료된 후 조직염색을 통해 조직의 전체적인 모습, 표피 내 줄기세포활성과 관련되어 ESC(표피줄기세포)의 주요 마커로 알려진 p63과 Integrin-beta1을 분석하였다(G. Pellegrini, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Mar 13, 2001; 98(6): 3156-3161).Skin explants present the environment most similar to human skin, which can best reflect the human body's efficacy. After the sclareol-containing formulation prepared in Example 5 was treated for 10 days in a skin explant, the effect on skin stem cell-related factors was observed. The test formulation was administered at a dose of 2 mg / cm 2 over the course of the test (D0: treatment start date, D2: treatment start day 2, D4: treatment start day 4, D7: treatment start day 7, D9: treatment start day 9) To the epithelium of the skin graft. After completion of the test, p63 and integrin-beta1, which are known to be major markers of ESC (epidermal stem cells), were analyzed in relation to the overall appearance of the tissue, stem cell activity in the epidermis through tissue staining (G. Pellegrini, Proc Natl Acad Sci US A. Mar 13, 2001; 98 (6): 3156-3161).
도 1에 나타난 것처럼 면역조직염색 결과 스클라레올 함유 제형이 처리된 군에서 각질층 두께와 p63 발현(자주색염색), Integrin-beta1 발현(녹색형광)이 vehicle처리 제형(음성 대조군)과 비교하여 유의하게 증가되었다.
As shown in Fig. 1, immunohistological staining showed that the thickness of the stratum corneum, p63 expression (purple dyeing) and integrin-beta1 expression (green fluorescence) were significantly increased in the group treated with the sclareol-containing formulation .
실시예 7 : 스클라레올(sclareol) 함유 피부개선용 외용조성물의 항노화 효과 Example 7: Anti-aging effect of external composition for skin improvement containing sclareol
인체에 있어 항노화 효과는 여러 가지 기준으로 판정할 수 있으나 피부에 나타나는 주름은 손쉽게 측정할 수 있는 지표이다. 이에 스클라레올(sclareol)의 피부주름 개선효과를 상기 표 5에서 제조한 크림을 사용하여 피부 탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부 탄력의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 20명(25 내지 35세)을 대상으로 표 6의 크림 2종류와 비교 제조예의 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일/2회, 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 주름개선 효과를 측정하였으며, 판정기준은 피부 탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 6에 나타내었다.
The anti-aging effect of the human body can be judged by various criteria, but the wrinkles appearing on the skin can easily be measured. The skin wrinkle improvement effect of sclareol was evaluated by measuring skin elasticity change using the cream prepared in Table 5 above. Skin elasticity was measured in 20 healthy women (25 to 35 years old) under the condition that the temperature was kept constant at 24-26 ° C and the humidity was 38-40%, and the cream of Table 6 and the cream of the comparative example were used (Courage + Khazaka, Cologne, Germany). The criteria for the evaluation of wrinkles were 0, 1, 2, 3, In many cases, the relative value was compared with 5. The test results are shown in Table 6 below.
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 스클라레올(sclareol) 함유 크림(시험군)이 비교제조예(대조군)의 크림에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 즉, 스클라레올(sclareol) 자체만을 포함한 크림 모두 주름개선 효과가 있었다.
As shown in Table 6, it was found that the cream containing sclareol (test group) according to the present invention had much better wrinkle-reducing effect than the cream of the comparative preparation (control group). That is, all of the creams containing only sclareol itself had a wrinkle-reducing effect.
이상의 실험결과를 요약하면, 줄기세포 배양시 스클라레올(sclareol)을 사용하여 동물성 혈청의 사용을 줄이거나 대체할 수 있음을 확인하였다. 또한, 스클라레올(sclareol)이 줄기세포 촉진제로서의 역할도 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 스클라레올(sclareol)이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양한 후 얻어지는 배양액을 경피 투여하는 경우 피부 상태를 개선할 수 있음을 확인하였다.
In summary, the use of sclareol in stem cell culture has been shown to reduce or replace the use of animal serum. In addition, it was confirmed that sclareol could also serve as a stem cell promoter. In addition, it has been confirmed that the skin condition can be improved when the culture solution obtained after culture of the stem cells in the medium containing sclareol is transdermally administered.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (12)
A composition for culturing mesenchymal stem cells or skin cells, which comprises sclareol in place of 50 to 100% by weight of animal serum.
A composition for promoting proliferation of mesenchymal stem cells or skin cells comprising sclareol as an active ingredient.
A composition for wound regeneration or skin regeneration comprising sclareol as an active ingredient.
7. The composition according to claim 6, wherein the composition is used as a cosmetic composition.
The cosmetic composition according to claim 7, wherein the cosmetic composition is a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, shampoo, powder, soap, surfactant-containing cleansing oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray ≪ / RTI > wherein said composition is selected from the group consisting of: < RTI ID = 0.0 >
The composition according to claim 6, wherein the sclareol promotes proliferation or activation of skin cells.
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